Отзыв - ФГУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского"
advertisement
ОТЗЫВ официального оппонента на диссертационную работу Анастасии Александровны АЗАРЕНОК «Роль вируса гриппа и его поверхностных белков в развитии дисфункции клеток эндотелия», представленную на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности «03.02.02 – вирусология» АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ Эндотелий – одна из самых загадочных систем организма, – основной барьер, разделяющий жидкости и ткани организма и являющийся важной точкой приложения разнообразных патогенных микроорганизмов, в том числе и вирусов. В последние годы эндотелиальная дисфункция стала актуальной междисциплинарной проблемой, затрагивающей не только сердечно–сосудистые, но и иные, в том числе инфекционные заболевания. Широкий спектр ДНК– и РНК–содержащих вирусов способен поражать клетки эндотелия кровеносных сосудов организма хозяина и размножаться в них. Не является исключением и вирус гриппа. Однако, на фоне достаточно большого числа работ, посвященных взаимодействию эндотелия с разнообразными вирусами, публикации, посвященные гриппу, разрозненны и не позволяют сделать окончательный вывод о генезе связи гриппозной инфекции с патологией эндотелия. Основными мишенями, играющими важную роль в патогенезе гриппозной инфекции, являются (1) клетки эпителия верхних и нижних дыхательных путей и (2) клетки эндотелия. В последние годы возрос интерес к использованию для изучения вируса гриппа А в системе in vitro линий клеток человеческого происхождения, в частности, эндотелиальных клеток, которые играют особую роль при инфицировании высоко патогенными вирусами гриппа птиц. Из вышесказанного следует, что выбранное автором направление исследований представляется весьма своевременным и актуальным, особенно в преддверии новых гриппозных пандемий. ДОСТОВЕРНОСТЬ И НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Достоверность и объективность выносимых на защиту положений и выводов диссертации подтверждается значительным объемом исследований, большим массивом статистически обработанных данных, а также глубоким осмыслением полученных результатов. Научная новизна работы А.А. Азаренок заключается в следующем: Впервые проведен комплексный анализ развития эндотелиальной дисфункции под воздействием вируса гриппа с одновременной оценкой по таким критериям, как апоптоз, угнетение метаболизма клеток эндотелия, активация плазминогена и пр. Убедительно продемонстрировано угнетение метаболизма клеток эндотелия с одновременной активацией процесса фибринолиза под воздействием вирусом гриппа. Проведенный анализ полученных результатов позволил автору высказать предположение о том, что механизмом активации процесса фибринолиза может служить мимикрия аминокислотных последовательностей тканевого активатора плазминогена в структуре гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа. ЗНАЧЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ДЛЯ НАУКИ И ПРАКТИКИ Работа А.А. Азаренок представляет собой самостоятельный законченный научный труд, теоретическое значение которого можно квалифицировать как качественный скачок в понимании взаимосвязи патологии эндотелия с гриппозной инфекцией. Автором впервые Стр. 1 показана важная роль клеток эндотелия в патогенезе гриппозной инфекции. Убедительно доказано наличие корреляций между дисфункцией эндотелия и репродукцией вируса гриппа. Практическая значимость работы логически вытекает из основных теоретических положений, сформулированных автором. Полученные А.А. Азаренок данные подтверждают необходимость применения при гриппе комплексной терапии, а также открывают новые перспективы в создании противогриппозных препаратов, направленных непосредственно на восстановление функциональных нарушений эндотелия. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ДОСТАТОЧНОЙ ПОЛНОТЫ ПУБЛИКАЦИЙ ОСНОВНЫХ ПОЛОЖЕНИЙ, РЕЗУЛЬТАТОВ, ВЫВОДОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ Основные результаты и положения диссертации, выводы и заключение полностью отражены в 7 научных статьях, 6 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки РФ (3 – с первым авторством). Научные достижения автора были представлены на 5 международных и российских конференциях и опубликованы в виде тезисов конференций. СООТВЕТСТВИЕ АВТОРЕФЕРАТА СОДЕРЖАНИЮ ДИССЕРТАЦИИ Автореферат соответствует основному содержанию диссертации. ЗАМЕЧАНИЯ ПО ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЕ В ЦЕЛОМ. НЕДОСТАТКИ В СОДЕРЖАНИИ И ОФОРМЛЕНИИ Структура работы. Диссертация написана хорошим и четким языком, оформлена в соответствии с действующим ГОСТом. В целом работа четко и адекватно разбита на главы, разделы и подразделы. Структура диссертации традиционна. Работа состоит из «Введения», 3 глав «Обзора литературы», «Материалов и методов», 2 глав «Собственных исследований», «Обсуждения», «Выводов» и «Библиографического списка». Работа изложена на 183 страницах текста, включая библиографию, содержит 6 таблиц и 31 рисунок. Из общего числа иллюстраций 2 таблицы и 10 рисунков представлены в качестве наглядного материала в обзоре литературы, что очень его украшает. В работе процитировано 328 литературных источников, из них 49 – русскоязычных. Работа открывается Введением, в котором автор убедительно обосновывает актуальность поднятой проблемы, новизну и практическую значимость проведенной работы, а также четко формулирует основные положения, выносимые на защиту. Целью работы А.А. Азаренок явилось изучение репродукции в эндотелиальных клетках человека вируса гриппа типа А и выявление его роли в развитии дисфункции эндотелия. Название работы находится в соответствии с поставленной целью, а задачи полностью ее раскрывают. Обзор литературы легко читается, достаточно полно освещает практически все проблемы, затронутые в диссертации. Обзор подчеркивает широкую эрудицию автора, не уступая в уровне таким известным обзорам, как «Cines D.B. et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 1998; 91(10):3527–3561» или «Lemichez E. et al. Breaking the wall: targeting of the endothelium by pathogenic bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 2010; 8(2):93–104» (на которые автор, к сожалению, не ссылается) и вполне мог бы быть опубликован в виде серии обзорных статей. Хотя в целом работа А.А. Азаренок – не молекулярно–биологического профиля, в обзоре очень подробно и с самых современных позиций освещены функциональные особенности компонентов вириона вируса гриппа. Такое подробное описание функций вирусных белков характерно и для многих других диссертаций, так или иначе связанных с изучением гриппозной инфекции. Диссертаций же вирусологической направленности, посвященных эндотелию, значительно меньше, и здесь, на мой взгляд, в качестве преамбулы Стр. 2 было бы уместно вкратце рассказать об истории открытия кровеносной системы в целом (William Harvey, 1628) и об открытии эндотелия как такового. В обзоре литературы следует избегать ссылок на свои собственные исследования. В частности, в разделе 1.2. «Нейраминидаза» на странице 21 автор пишет: «Относительно функциональных доменов NA, участвующих не только в проникновении и сборке вириона, но и в регуляции ряда других биохимических процессов в клетке известно очень мало. Так, в структуре NA вируса гриппа А/Брисбейн/10/2007 (H3N2) нами выявлено 5 областей аминокислотных последовательностей, сходных с активатором плазминогена…». Это было бы уместнее при обсуждении собственных результатов. В качестве общего замечания хотелось бы также отметить, что обзор литературы выглядел бы более завершенным, если бы завершался кратким заключением, в котором стоило подвести читателя к актуальности поставленных автором задач и предварить ее описанием тех «белых пятен» в научной литературе, которые призвана была восполнить данная работа. Материалы и методы описаны в целом хорошо. Широкий спектр грамотно использованных тестов, начиная от классических вирусологических и молекулярно– биологических и кончая иммуногистохимическими методами и электронной микроскопией позволяет представить всестороннюю картину поражений эндотелия сосудов при экспериментальной гриппозной инфекции в системе in vitro и in vivo и в аутопсийном материале. В качестве замечания следует отметить, что в «Материалах и методах» отсутствует описание экспериментальной работы с лабораторными животными. Вскользь упоминается о том, в работе использовались белые беспородные крысы (раздел 1.10.2), но пропущена информация о линии, поле и возрасте использованных животных, и питомника, из которого они были получены. Отсутствует подтверждение проведения экспериментов и умерщвления подопытных животных в соответствии с действующими «Правилами лабораторной практики». Собственные исследования. Раздел состоит из двух глав, включающих в себя достоверные и логически обоснованные материалы. Четкая структурированность разделов, логичное выстраивание материала, грамотная постановка экспериментов и использование необходимых контролей не оставляет лазейки для двойного толкования полученных результатов. В качестве замечаний хотелось бы отметить следующее: (1) Как и «Обзор литературы», собственные исследования выглядели бы более завершенными, если каждая глава заканчивалась бы небольшим заключением, суммирующим представленные в ней материалы. (2) Автором получены интересные данные о различной динамике репродукции вирусов гриппа в разных клеточных системах. Мне кажется, что наглядность и репрезентативность полученных результатов только выиграла бы, если бы они были представлены не в табличной (таблица 3, стр. 84), а в графической форме. (3) Факт необходимости присутствия трипсина в культуральной среде для расщепления гемагглютинина на его тяжелую и легкую субъединицы с целью повышения инфекционной активности вируса гриппа А хорошо известен и широко освещен в научной литературе. Не совсем понятно, какую задачу ставили перед собой авторы, повторяя эти многочисленные исследования (раздел 1.1. собственных исследований). Обсуждение. В этом разделе автор обсуждает полученные данные и оценивает их с позиций мирового научного опыта, полностью отражает результаты исследования, вытекающие из них выводы и практические рекомендации и хорошо обобщает проделанную работу. Выводы из выполненной работы соответствуют поставленным задачам, подводят итог проведенным исследованиям и достаточно полно отражают результаты, полученные автором. ВОПРОСЫ ПО ДИССЕРТАЦИИ Стр. 3 По материалам диссертационной работы возникло несколько групп вопросов. (1). Токсические проявления являются основными клиническими чертами гриппа. Целым рядом исследователей проводилось изучение токсического действия вируса гриппа на сосудистую систему как на уровне экспериментов, так и в клинических исследованиях. Начатые в 1953 году Л.Я. Закстельской, эти работы были продолжены в 1970–1980 гг. В.И. Ильенко с сотрудниками. В частности, было установлено, что заражение мышей высокотоксичными штаммами вируса гриппа (например, вирусом А/Сингапур/1/57 (H2N2), вызвавшим азиатскую пандемию) приводило к развитию стремительного отека легких в результате резкого повышения проницаемости сосудов. Введенный интраорбитально краситель мгновенно распределялся по всем внутренним органам и тканям зараженных животных. Однако, это была, так сказать, констатация факта. Каковы, на Ваш взгляд, возможные механизмы поражения вирусом гриппа сосудов в аспекте повышения их проницаемости? (2). В самом общем смысле эндотелиальную дисфункцию определяют как увеличение или снижение содержания/образования в эндотелии различных биологически активных веществ по сравнению с нормой, а методом оценки выраженности эндотелиальной дисфункции является определение концентрации в крови повреждающих эндотелий факторов, уровень которых коррелирует с его дисфункцией. Эти факторы являются маркерами дисфункции эндотелия. Жаль, что автор, приведя в литературном обзоре подробный перечень этих маркеров (см. глава 3, табл. 2), при описании собственных результатов, перечисляя изученные показатели дисфункции эндотелия (в частности, активность тканевого активатора плазминогена), ни разу не называет вещества эндотелиального происхождения маркерами. Это придало бы четкости и стройности звучанию материала. В литературе широко описываются маркеры дисфункции эндотелия при целом ряде неинфекционных заболеваний, в частности, при остеоартрозе, в хирургии, у лиц, страдающих артериальной гипертензией и т. д. и т. п. Перечислите, пожалуйста, маркеры дисфункции эндотелия при неинфекционных заболеваниях. Отличаются ли они от маркеров дисфункции эндотелия при инфекционных заболеваниях, или эта дисфункция – процесс универсальный при любых, скажем так, отклонениях от нормы. Существуют ли уникальные маркеры гриппозной дисфункции эндотелия и если да, то какие? Можно ли считать, что обнаруженный Вами, в частности, факт активации каспазы–3 в клетках эндотелия при гриппе можно причислить к сугубо специфическим маркерам эндотелиальной дисфункции при гриппе? Какие еще уникальные маркеры гриппозных поражений вы можете назвать (если таковые существуют)? (3). Предположим, что у человека уже имеется определенная дисфункция эндотелия, связанная с определенным неинфекционным заболеванием – артериальной гипертензией, церебральным атеросклерозом, воздействием каких–то повреждающих агентов и т. п. Как отразится на состоянии эндотелия последующее инфицирование такого человека гриппом? Спровоцирует ли эта инфекция усиление названной дисфункции и, как следствие, развитие тяжелых поражений сердечно–сосудистой, дыхательной и других систем организма? Значит ли это, что все лица с диагностированной дисфункцией эндотелия относятся (или должны быть отнесены) к группе риска? (4) Для оценки целого ряда показателей активности вирусов и субстратов авторы используют в работе, кроме референс–штаммов, чрезвычайно сложный по структуре генома «тройной» реассортант А/курица/Курган/5/05 NS1–81/5:3 (Н5N1), содержащий гены от вирусов А/H1N1 (PR8), А/H3N2 и А/H5N1, причем основа жизнедеятельности каждого вируса гриппа – полимеразный комплекс, «разбит» на два части: РВ2 и РА гены унаследованы от вируса PR8, а ген, кодирующий субъединицу РВ1 – от относительно современного вируса H3N2; нейраминидаза и М ген унаследованы от «дикого» высоко патогенного вируса птиц А/курица/Курган/02/05 (Н5N1), а у его гемагглютинина модифицирован кливедж–сайт, видимо, для придания вирусу апатогенных свойств, хотя прямо об этом в диссертации не говорится. Стр. 4 В литературе существует целый ряд доказательств, свидетельствующих о том, что реассортантные вирусы, вероятно, за счет констелляции генов, приобретают новые, необычные биологические свойства, не характерные для родительских вирусов. Какую цель ставил перед собой автор, используя в работе подобный вирус? Насколько правомочно делать выводы на основе полученных с ним результатов? Если автор запланировал изучение определенных характеристик вирусов гриппа птиц, и речь шла о безопасности работы с патогенами III–IV группы, почему в качестве модельного штамма не был использован любой апатогенный нереассортантный вирус? Отмеченные отдельные недостатки и недочеты, разумеется, никоим образом не снижают ценности и значимости работы и существенно не влияют на ее главные теоретические и практические результаты. З А К Л Ю Ч Е Н И Е Все вышеизложенное позволяет положительно оценить диссертационную работу Анастасии Александровны Азаренок. Полученные результаты позволили автору продвинуться на пути расшифровки механизмов развития дисфункции эндотелия под воздействием вируса гриппа. А.А. Азаренок показала себя эрудированным и плодотворным исследователем этой проблемы. Полученные результаты позволили ей органично соединить результаты научных экспериментов с предложениями по их практическому применению. В диссертации А.А. Азаренок представлены результаты изучения репродукции вируса гриппа в клетках эндотелия сосудов человека и установлена роль вируса гриппа и двух его поверхностных белков – гемагглютинина и нейраминидазы – в развитии эндотелиальной дисфункции, что полностью соответствует паспорту заявленной научной специальности «03.02.02 – вирусология». Выводы достаточно полно отражают результаты, полученные автором. Существенных замечаний по содержанию работы, достоверности полученных результатов и их оформлению нет. В целом кандидатская диссертация А.А. Азаренок «Роль вируса гриппа и его поверхностных белков в развитии дисфункции клеток эндотелия», является законченной самостоятельной научно–квалификационной работой, в которой содержится решение задачи, имеющей существенное значение для медицинской вирусологии и практического здравоохранения. Работа А.А. Азаренок находится в соответствии с требованиями, предъявляемыми к диссертациям, представляемым на соискание ученой степени кандидата наук (Постановление №842 Правительства Российской Федерации от 24 сентября 2013 года «О порядке присуждения ученых степеней»), а ее автор, безусловно, заслуживает присуждения ученой степени кандидата биологических наук по специальности «03.02.02 – вирусология». Зав. лабораторией вакцинных штаммов отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, д.б.н., доцент И.В. КИСЕЛЕВА «_________» марта 2014 г. Стр. 5
