НА ПРАВАХ РУКОПИСИ Кузнецова Марина Геннадьевна ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ РЕПРОДУКТИВНОЙ

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ
Кузнецова Марина Геннадьевна
ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ РЕПРОДУКТИВНОЙ
СИСТЕМЫ САМЦОВ КРЫС ПОД ВЛИЯНИЕМ
ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
МИЛЛИМЕТРОВОГО ДИАПАЗОНА
03.00.13 – физиология
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Астрахань – 2009
2
Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии
Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская
академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию»
Научный руководитель:
Доктор медицинских наук
профессор
Николаев Александр Аркадьевич
Консультант:
доктор биологических наук
Сердюков Василий Гаврилович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
профессор
доктор биологических наук,
профессор
Ведущая организация:
Кондратенко Елена Игоревнаа
Сентябрев Николай Николаевич
ГОУ ВПО «Саратовский
государственный медицинский
Университет Росздрава»
Защита состоится «___»________ 200__ г. в «___» часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете, по адресу: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна,1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 4140000, Астрахань, пл. Шаумяна, 1.
Автореферат разослан «___» ______ 200__г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук
Нестеров Юрий Викторович
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Факторы окружающей среды способны оказывать разнообразное влияние на состояние здоровья.
И в первую очередь это относится к факторам воздействия физической природы, таким как электромагнитное излучение, которые способны воздействовать на все живое на Земле, включая
человека, приводя к тем или иным биологическим эффектам
[Девятков Н.Д. и др., 1999; Кузьмичев В.Е. и др., 2001; Бецкий
О.В., 2003]. Весьма перспективными в этом отношении оказались исследования биологических эффектов электромагнитного
излучения миллиметрового диапазона. При воздействии на биологический объект электромагнитного излучения высокой мощности или значительной продолжительности на первый план выходит неспецифическое тепловое воздействие, но значительно
больший интерес вызывает низкоинтенсивное электромагнитное
излучение способное вызывать ряд специфических биологических феноменов [Лебедева Н. Н. и др., 2000; Бецкий О. В. и др.,
2001; Петросян В. И. и др., 2003; Grundler W. et al., 2005].
Первая научная публикация, посвященная необычным эффектам воздействия низкоинтенсивных (менее 10 мВт/см2) электромагнитных волн миллиметрового диапазона на биологические объекты сделана в 1966 г. С того времени стало известно о
влияние миллиметровых волн на микроорганизмы и клеточные
культуры (изменение плазмидной и хромосомной антибиотикорезистентности, изменении пролиферативной активности и др.),
на функциональное состояние организма в целом [Гельвич Э. А.
и др., 1999; Гапеев А. Б. и др., 2000; Тамбиев А. Х. и др., 2001;
Голант М. Б. и др., 2002; Смолянская А. З. и др., 2006].
В настоящее время низкоинтенсивное электромагнитное излучение миллиметрового диапазона широко используется в различных областях практической медицины (для улучшения реологического состояния крови, стимуляции репаративных процессов, в комплексной противовоспалительной терапии и т. д.)
[Пославский М. В. и др., 1998; Моисеев В. Н. и др., 1999; Семенова С. В., 2000; Пуляева Е. Л. и др., 2002; Тарасова О. В., 2003].
Однако данных о влиянии низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на репродуктив-
4
ную систему млекопитающих, а в частности на сперму, крайне
мало. Имеющиеся данные носят противоречивый характер и в
ряде случаев вызывают сомнения из-за отсутствия адекватных
контрольных серий при проведении экспериментальных исследований.
Цель исследования. Изучить влияние низкоинтенсивного
электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на
морфо-функциональное состояние органов репродуктивной системы самцов крыс.
Задачи исследования.
1. Провести исследование морфо-функциональных характеристик семенников и эпидидимисов крыс в норме.
2. Разработать критерии оценки действия электромагнитного
излучения на морфо-функциональное состояние органов репродуктивной системы самцов крыс.
3. Провести детальное исследование влияния низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на фертильность крыс.
4. Изучить действие электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на ферментативную активность акрозина.
5. Изучить хроническое влияние низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на функциональную активность биосинтеза тестостерона, через
определение активности основного фермента биосинтеза тестостерона – 5-3-гидроксистероиддегидрогеназы.
6. Определить звенья сперматогенеза наиболее чувствительные к воздействию низкоинтенсивного электромагнитного
излучения миллиметрового диапазона.
Научная новизна. Впервые дана характеристика последствий воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на морфо-функциональное
состояние органов репродуктивной системы самцов крыс, Выявлены наиболее чувствительные звенья сперматогенеза, первыми
реагирующие на воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона. Показан двухфазный характер биологического воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона.
Исследована динамика ферментативной активности акрозина а
5
также функциональные изменения, протекающие в семенниках
крыс после подобного воздействия и оказывающие влияние на
репродуктивную функцию.
Научно-практическая значимость работы. Дана характеристика биологических эффектов низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона и показаны
основные механизмы реализации этих эффектов. Показано неблагоприятное воздействие длительного низкоинтенсивного
электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на репродуктивную систему крыс-самцов
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались
и обсуждались: на 4-й конференции «Мужское здоровье и долголетие», Москва, 2006; Faily Health in the XXI Centuri, Tayland,
2006; на итоговых научных конференциях Астраханской государственной медицинской академии, Астрахань, 2003 г.; 2004 г.;
international scientific-practical «New technology in medicine and
biology», Bangkok, 2007; на 5-й конференции «Мужское здоровье и долголетие», Москва, 2007.
Публикации: По теме диссертации опубликованы 6 научных
работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на
122 страницах, содержит 25 таблиц и 14 рисунков. Она состоит
из введения; четырех глав, включающих обзор литературы, описание методов исследования, изложения фактического материала и обсуждения полученных результатов; выводов; указателя
использованной литературы. Библиографический указатель содержит 162 отечественных и 22 иностранных источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В экспериментальной части работы использовались беспородные белые крысы. Все животные соответствовали показателям биологической нормы [Трахтенберг, Р. и др, 1978]. Возраст
крыс составлял 6-7 месяцев (половозрелые особи). Масса тела
крыс была 180-240 г.
Объектами нашего исследования была также суспензия эпидидимисов и семенников интактных беспородных белых крыс и
6
крыс, подвергавшихся воздействию низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона.
Забор семенников и эпидидимисов у крыс проводили под
эфирным наркозом (экспериментальные исследования проводились в строгом соответствии с Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным).
Хроническому воздействию низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона животные из
опытных групп подвергались в течение 70 дней по 20 мин ежедневно в затравочной камере, изготовленной из материалов неэкранирующих электромагнитное излучение.
Для создания электромагнитного поля был использован генератор монохроматических электромагнитных волн «Явь-1-7,1».
Излучаемая длина волны  = 7,1 мм, частота f = 42,194 ГГц,
плотность мощности P = 0,1 мВтсм–2 была выбрана как рекомендованная для клинического и экспериментального использования. Указанная плотность мощности, как известно, не обладает тепловым эффектом, а, следовательно, возможное биологическое действие при плотности мощности 0,1 мВтсм–2 является
специфическим.
Состояние сперматогенеза у самцов оценивали по методу
В.П. Маминой и Д.И. Семенова каждые 7 дней в течение 70 дней
воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения
миллиметрового диапазона. Исследование суспензии эпидидимиса (учитывались общее количество, морфологические и кинетические характеристики, жизнеспособные и мертвые формы
эпидидимальных сперматозоидов) проводили с использованием
счетной камеры Горяева по общепринятым методикам.
Активность 5-3-гидроксистероиддегидрогеназы (ГСД)
[Резнiков О.Г., 1989], определяли в гомогенате семенников через
каждые 7 дней в течение 70 дней облучения и 30 дней после
окончания воздействия низкоинтенсивного электромагнитного
излучения миллиметрового диапазона.
Для измерения активности ГСД применяли спектрофотометрический метод Рубина в модификации Голдмана. Активность
свободного акрозина (EC 3.4.21.10) определяли по расщеплению
ВАЕЕ по методу W.B. Schill. Общую активность акрозина определяли после быстрого оттаивания (при температуре 23С в те-
7
чение 30 минут) сперматозоидов, предварительно замороженных
до - 196С (в жидком азоте). Проферментную активность рассчитывали по формуле: ПА=ОА–СА, где ПА – проферментная
активность акрозина, ОА – общая активность акрозина, СА –
свободная активность акрозина. Активность акрозина выражали
в международных единицах на 1 миллион сперматозоидов
(мкМЕ/106 сп.).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Беспородные белые 5-6 месячные крысы c массой тела 180240 г, содержавшиеся на стандартной диете, были разделены на
две группы: контрольную (К) и опытную (О). В группу-К вошло
57 животных (42 самки и 15 самцов), в группу-О вошло 110 животных (46 самок и 64 самцов).
Группа-О в течение 70 дней по 20 мин ежедневно подвергалась воздействию низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона. После окончания затравки
проводили спаривание животных в течение 20 дней:
19 самок-К с 7 самцами-К (1 группа),
22 самки-О с 8 самцами-К (2 группа),
23 самки-К с 8 самцами-О (3 группа),
24 самки-О с 9 самцами-О (4 группа).
Полученные нами данные свидетельствуют, что в целом
хроническое воздействие низкоинтенсивного электромагнитного
излучения миллиметрового диапазона неблагоприятно сказывается на функциональном состоянии репродуктивной системы
крыс, что подтверждается ухудшением генеративных показателей в группах-2, -3 по сравнению с группой-1 и субфертильностью в группе-4. Снижение среднего числа плодов у крыс группы-3 обусловлено ухудшением оплодотворяющей способности
эякулята после хронического воздействия низкоинтенсивного
электромагнитного излучения миллиметрового диапазона. Субфертильность может проявляться в нарушении нормального
функционирования ферментативных систем спермоплазмы и
(или) в нарушении интерполимерного комплексообразования
белками спермоплазмы, Под влиянием низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона происхо-
8
дит изменение устойчивости мембран сперматозоидов. Прямым
подтверждением этому служит значительное увеличение количества мертворожденных и уменьшение выживших в течение 10
дней постнатального периода. Можно констатировать наличие
отдалённых последствий воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на крыссамцов.
Таблица 1
Показатели репродуктивной функции крыс после хронического
воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения
миллиметрового диапазона
Группы экспериментальных животных
Показатели
репродуктивного
Группа-1
Группа-2
Группа-3
Группа-4
здоровья (самки n=19, (самки n=22, (самки n=23, (самки n=24,
самцы n=7) самцы n=8) самцы n=8) самцы n=9)
Среднее
7,750,82
6,250,45
4,250,85
число пло- 8,60,85
Р>0,05
Р<0,05
Р<0,01
дов
Мёртво8,81,1
11,40,95
29,40,95
рожденные, 2,80,3
Р<0,01
Р<0,01
Р<0,01
%
Выжившие,
%
76,54,2
67,04,75
Р>0,05
55,31,2
Р<0,01
35,31,2
Р<0,01
* все достоверности относительно группы-1
Сам по себе факт резкого снижения плодовитости показывает
отрицательное влияние низкоинтенсивного электромагнитного
излучения миллиметрового диапазона на репродуктивную систему самцов крыс.
Наряду с этим возможно отрицательное воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового
диапазона на процесс сперматогенеза, на молекулярную струк-
9
туру сперматозоидов и на метаболические пути биосинтеза основного тестикулярного гормона - тестостерона.
Разработка критериев оценки действия электромагнитного
излучения на морфо-функциональное состояние органов репродуктивной системы самцов крыс основывается на оценке динамики количественных характеристик клеток сперматогенеза.
Многоступенчатый и длительный процесс трансформации
стволовых клеток в сперматозоиды делает его уязвимым для повреждающего действия экзо- и эндогенных факторов, в том числе, и низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона.
160
% от нормы
140
120
100
80
60
40
20
0
7дн
14дн
21дн
28дн
56 дн
сперматогонии
сперматоциты
сперматиды
сперматозоиды
70 дн
Рис. 1. Динамика численности клеток сперматогенеза в семеннике крыс в ходе воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения
Анализ состояния сперматогенеза у крыс из контрольной
группы (n=15) показал, что общее количество сперматогенных
клеток в семеннике составляет в среднем 5223460 млн. (). Для
разных типов сперматоргенных клеток было характерно опреде-
10
ленное достаточно устойчивое процентное соотношение: сперматогонии составлялют в среднем 22,52,0%, сперматоциты
20,72,1%, сперматиды 21,62,3%, сперматозоиды 35,22,7%.
Значительным изменениям подвергается и профиль пула
сперматогенных клеток(Рис. 1).
К концу первой недели облучения растет доля сперматогоний с 22,5% в контрольной группе до 27,8%. К концу второй
недели доля сперматогоний еще увеличивается до 29,1%. Соответственно доля других сперматогенных клеток (сперматоцитов,
сперматид и сперматозоидов) пропорционально уменьшается.
Через четыре недели после начала облучения начинается спад
концентрации сперматогоний в общем пуле сперматогенных
клеток семенника крыс. Начинают преобладать сперматоциты –
их доля через 28 дней после начала облучения впервые превышает контрольные значения (27,2% против 20,7% в контроле).
Но к концу второго месяца облучения концентрация сперматоцитов снижается до 22,8%, а к концу срока облучения (70 дней)
и вовсе падает ниже контрольных значений до 18,6%.
Прямые предшественники сперматозоидов - гаплоидные
клетки сперматиды также изменяют свою долю в пуле сперматогенных клеток под влиянием низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона первые два месяца эксперимента доля этих клеток колеблется на значениях около или ниже нормы (табл.4), а затем поднимается на 13-14%
выше нормы. Динамика изменения относительной концентрации
сперматозоидов носит неопределенный характер и, видимо, является отражением изменения доли других сперматогенных клеток..
Известно, что сперматогенез подразделяют условно на три
этапа [Райцина С.С., 1995]: 1-й этап – сперматоцитогенез, характеризуется размножением сперматогоний; 2-й этап – мейоз, приводящий к редукции хромосом вдвое и образованию из сперматоцитов сперматид; 3-й этап – спермиогенез, характеризуется
превращением сперматид в сперматозоиды.
Поскольку в каждый конкретный момент времени представлены все формы сперматогенеза, допустимо считать, что наиболее показательными и уязвимыми являются этапы митоза сперматогоний. Деление сперматогоний типа а0 приводит к образо-
11
ванию сперматогоний типа а1. Затем следует 6 митозов, что приводит к последовательному образованию сперматогоний типа а2,
а3, а4, промежуточного типа и типа в. Деление сперматогоний
типа в приводит к образованию сперматоцитов 1 порядка, что
знаменует переход к следующему этапу сперматогенеза – мейозу [Рузен-Ранге Э., 1999]. Это согласуется с нашими наблюдениями об увеличении относительного содержания сперматоцитов
спустя неделю после «всплеска» концентрации сперматогоний.
Подтверждением наибольшей чувствительности этапа генерации сперматогоний к воздействию низкоинтенсивного электромагнитного излучения является и тот факт, что этот тип
сперматогенных клеток практически единственный демонстрирует отрицательную динамику со второй недели облучения.
Воздействие мм-волн на генетический аппарат уже известно для
бактериальных клеток [Бриль Г.Е., Панина Н.П., 2000]. Выяснилось, что морфофункциональные изменения проявляются в изменении индексов генетической активности, в образовании пуфов de novo в некоторых районах хромосом [Шуб Г.М., 2004].
Излучение в диапазоне миллиметровых волн способно оказывать воздействие и на культуры клеток многоклеточных организмов. Экспериментально было показано, что низкоинтенсивное миллиметровое излучение (плотность потока мощности 0,5
мВт/см2) оказывает стимулирующее действие на культуры лимфоцитов и фибробластов человека активируя пролиферацию
клеток [Говалло В.И., Барер Ф.С., 1991].
12
160
% от нормы
140
120
100
80
60
40
20
0
7дн
14дн
28дн
56дн
70дн
Рис.2. Общее количество эпидидимальных сперматозоидов
в % от контроля в ходе воздействия низкоинтенсивного
электромагнитного излучения миллиметрового диапазона.
Стимулирующее влияние низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на сперматогенные
клетки в первые две недели облучения согласуется с приведенными данными (рис 2), но практически нет исследований касающихся хронического воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона. Длительное
воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения
миллиметрового диапазона оказывает противоположное действие, истощая ресурс пролиферации.
Морфологический и статистический анализ состояния эпидидимальных сперматозоидов до и после воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона показал (рис 2), умеренно стимулирующее влияние облучения в первые две недели и отчетливое снижение числа эпидимальных сперматозоидов к концу срока облучения на 40%.
13
400
350
% от нормы
300
250
200
150
100
50
0
7 дн
14дн
28 дн
56 дн
70дн
Рис. 3.Рост числа дефективных сперматозоидов в ходе воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона.( числ0 дефективных
сперматозоидов в контрольной группе принято за 100%)
Рост числа дефективных сперматозоидов в ходе воздействия
низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона имеет характер практически линейной зависимости от сроков облучения (рис.3.). Особенно показателен в этом
отношении индекс тератозооспермии. Если индекс тератозооспермии в контрольной группе составлял в среднем 1,130,07, то
через 70 дней воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона индекс тератозооспермии в среднем составлял уже 2,720,21. Индекс тератозооспермии является по мнению ведущих российских андрологов (Aкопян А.С., 2007) интегративным морфологическим показателем
снижения репродуктивной функции.
При оценке состояния эпидидимальных сперматозоидов после окончания воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона, выявленные морфо-
14
логические нарушения быстро исчезали и к 14 дню после окончания воздействия почти не отличались от контрольной группы.
80
71,7
69,8
70
60
50
40,4
40
30
20
10
0
контроль
28 дн по
70 дн по
% активно подвижных
Рис 4. Подвижность сперматозоидов после воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона.
Двигательные характеристики сперматозоидов являются более лабильными, поэтому можно было ожидать их значительного изменения после воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона (рис.4). Тем более, что известно регулирующее действие КВЧ-полей на функциональное состояние клеток. Однако, как показали наши исследования, уменьшение числа активноподвижных сперматозоидов достоверно происходит только после 4 недель облучения.
Причем, простой статистический анализ (см. линию тренда рис
4.) позволяет предположить суммирующий характер воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на двигательные характеристики эпидидимальных сперматозоидов крыс. В этом случае, изменению функциональной характеристики (подвижность сперматозоидов)предшествует накопление мелких дефектов функции спер-
15
матозоидов, суммирование которых и приводит к видимым и
существенным нарушениям функции.
После окончания воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона, обнаружено,
что процент активно подвижных сперматозоидов уже к 7 дню
(первый день контроля последствий воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона) практически восстанавливается и составил по нашим данным 67,43,07%. Однако, восстановление скоростных характеристик происходит значительно медленнее и не линейно. Если к
7 дню средняя скорость сперматозоидов составляет 2,950,15
мм\мин, то к 14 дню она падает до 1,860,35 мм\мин и только к
21 дню достигает 3,850,65 мм\мин.
Подобный «волнообразный» характер восстановления динамических характеристик сперматозоидов, можно объяснить, постепенным созреванием клеток сперматогенеза, находившихся в
момент облучения на разных стадиях этого процесса. Полученные данные косвенно свидетельствуют о различной чувствительности различных клеток сперматогенеза к воздействию низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового
диапазона, и, исходя из теории биологического действия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового
диапазона, о различном состоянии мембран этих клеток.
Состояние мембран сперматозоидов тесно связано функционирование одной из фундаментальных систем, обеспечивающих
реализацию сперматозоидами прокреативной функции - системой акросомального фермента акрозина.
В ряде работ предлагается определение ферментативной активности акрозина в качестве диагностического теста при фертилизации сперматозоидов in vitro [Menkveld R., Rhemrev J. P.,
1996, Jegou B., Pineau C.,Dupaix A.2004]. Однако данных о
функционировании системы акрозина при воздействии низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона в доступной нам литературе нет.
16
Таблица 2
Ферментативная активность акрозина в ходе воздействия
низкоинтенсивного электромагнитного излучения
миллиметрового диапазона
Ферментативная активность
Время прошедшее после начала
облучения
Активность
свободного
акрозина,
мкМЕ/106
сп
Общая активность
акрозина,
мкМЕ/106 сп
Проферментная
активность акрозина мкМЕ/106 сп.
Контроль n=25
1,34±0,07
5,16±0,05
3,82±0,02
7 дней
n=14
14 дней
n=10
28 дней
n=11
56 дней
n=15
70 дней
n=17
1,43±0,10
1,50±0,10
2,10±0,05
1,45±0,15
1,55±0,05
5,65±0,20
Р<0,05
6,12±0,15
Р<0,01
6,68±0,04
Р<0,001
5,10±0,18
Р>0,05
4,35±0,15
Р<0,05
4,22±0,12
4,62±0,12
4,58±0,18
3,65±0,15
2,8±0, 02
Определение активности акрозина (EC 3.4.21.10) проводили
по методу W.B. Schill. В контрольной группе активность свободного акрозина составила в среднем 1,34±0,07 мкМЕ/106 сп.,
общая активность акрозина составила в среднем 5,16±0,15
мкМЕ/106 сп., а проферментная активность акрозина была равна
в среднем 3,82±0,12 мкМЕ/106 сп. (Табл.2).
Исследование образцов эпидидимальных сперматозоидов после воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона дало интересные результаты.
Активность общего акрозина до 28 дня облучения возрастала и
увеличилась на 20% по сравнению с контрольной группой, а затем стала снижаться имежду 28 и56 сутками происходит перелом тенденции(различие уровня общего акрозина недостоверно
17
по отношению к котролю). К концу облучения активность общего акрозина составляла в среднем 77 % по сравнению с контрольной группой. (Табл. 2). Активность свободного акрозина
по сравнению с контролем достигла максимальной также к 28
дню облучения, но снижаясь к 70 дню не уменьшилась ниже
контрольных значений, а превысила их на 15%.
Проферментная активность акрозина после воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового
диапазона в целом повторяла динамику общей активности, но с
более резкими колебаниями (табл. 2).
В тоже время, проведенный нами, расчет коэффициента
«проакрозин/свободный акрозин» показал, что первые 14 суток
воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения
миллиметрового диапазона значение коэффициента по сравнению с контролем незначительно увеличивается (на 4%), после 28
суток значение коэффициента резко убывает в среднем на 24%,
и достигает к 70 суткам значения 1,810,2 или около 64% от
контроля. (табл.3)
При оценке ферментативной активности акрозина эпидидимальных сперматозоидов после окончания воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона, обнаружено, что ферментативная активность акрозина
восстанавливался к 14 суткам после окончания облучения, достигая значения 5,720,4 мкМЕ/106сп, что выше контрольных
значений почти на 10%. Полное соответствие контролю уровень
ферментативной активности демонстрирует только на 21 сутки.Коэффициент «проакрозин/свободный акрозин» имеет более
сложную динамику На первой неделе после окончания облучения коэффициент восстанавливается наибольшими темпами
(40%) и достигает 90% нормы. Затем отмечается регресс на 15%
и к 21 дню коэффициент вновь растет, даже выше нормы (на
10%), и только к 28 дню практически соответствует контролю.
18
Таблица 3
Коэффициент «проакрозин/свободный акрозин» после воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона различной продолжительности
Характеристика функционального статуса системы
акрозина
Коэффициент
«проакрозин/свободный акрозин»
Контроль
(до воздействия)
После 7 суток
облучения
После 14 суток
облучения
После 28 суток
облучения
2,850,01
2,950,05 Р<0,05
3,0840,07 Р<0,01
2,180,16 Р<0,001
После 56 суток
облучения
2,520,15 Р<0,001
После 70 суток
облучения
1,810,20 Р<0,001
Примечание: в таблице значение
контроля
Р
приведены относительно
Полученные нами данные свидетельствуют, что после воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения
миллиметрового диапазона сначала происходит увеличение коэффициента, показывающего отношение проферментной активности акрозина к активности свободного акрозина, а затем интенсивное его падение.
Другими словами непродолжительное воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона предотвращает преждевременную активацию акрозина,
что является благоприятным фактором, способствующим эффективной реализации оплодотворяющей способности сперматозоидов. Вероятно, рост проферментной активности акрозина,
за счет снижения активности свободного акрозина происходит
благодаря стабилизации акросомальной мембраны сперматозои-
19
дов под влиянием низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона.
Длительное воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона оказывает противоположное действие дестабилизируя мембраны сперматозоидов.
Определение тестостеронпродуцирующей активности семенников, то есть функционального состояния клеток Лейдига,
проводили на основании активности 5-3-гидроксистероиддегидрогеназы (ГСД)
Активность тестикулярного фермента биосинтеза тестостерона – 5-3-гидроксистероиддегидрогеназа у крыс контрольной
группы составила в среднем 237,428,1 ОУЕ.
Динамика специфической активности ГСД в целом повторяла динамику общей активности.
Выявленые изменения в семенниках общей активности 53-гидроксистероиддегидрогеназы в течение 70 дней воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона носили недостоверный характер и, можно
считать, что низкоинтенсивное электромагнитное излучение
миллиметрового диапазона практически не влияет на тестостеронпродуцирующую активность семенников
Используя ряд тестов функционального состояния сперматозоидов мы оценили динамику влияния низкоинтенсивного
электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на их
резистентность к факторам окружающей среды, что, как известно (Артифексов С.Б. и др., 2007) коррелирует с оплодотворяющей способностью.
В частности, была проведена оценка резистентности сперматозоидов к гипертоническому раствору хлорида натрия по
Милованову.
По полученным нами данным, воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона
приводило при экспозиции не более двух недель к повышению
резистентности сперматозоидов к хлориду натрия (тест Милованова) на 800 УЕ или на 18%. Более продолжительное воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона приводит к снижению резистентности до
75% исходной к 70 суткам облучения.
20
После окончания воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона восстановление исходных показателей резистентности происходит довольно
быстро – на 7 сутки после окончания облучения этот показатель
соответствует контролю
Таблица 4
Функциональные показатели сперматозоидов до и после воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения
миллиметрового диапазона
Функцио
нальные
Конпоказатроль
тели
(n=15)
спермато
зоидов
Время прошедшее после воздействия
низкоинтенсивного электромагнитного
излучения миллиметрового диапазона.
7
дней
(n=16)
Резисте
нтность к
4800,0
хлориду 4500,0
98,0
натрия
90,0
Р<0,05
по Милованову, УЕ
14
дней
(n=13)
21
28
56
70
день
дней
дней
дней
(n=14) (n=14) (n=10) (n=12)
5300,0 4300,0 3900,0 3650,0 3400,0
91,0
93,0 150,0 180,0 130,0
Р<0,01 Р<0,01 Р<0,05 Р<0,05 Р<0,01
Примечание: в таблице значение
контроля
Р
приведены относительно
После воздействия низкоинтенсивного электромагнитного
излучения миллиметрового диапазона в тесте на резистентность
сперматозоидов к уксусной кислоте (по методу Джоела) было
отмечено существенное изменение резистентности.
Если до 10 минут инкубации различия и в контроле и в
опыте были не значительные, то уже после 20-30 минут инкубации различия становились статистически значимыми.
Подвижность сперматозоидов в образцах, подвергавшихся
воздействию низкоинтенсивного электромагнитного поля миллиметрового диапазона, сохранялась первые две недели практически пропорционально контролю (рис 5).
21
Начиная с 21 дня процент подвижных сперматозоидов после 20 минут инкубации значительно снижается (на 60-85% по
сравнению с контролем). Снижение резистентности носит нелинейный характер и колеблется по срокам, например, на 56 день
этот показатель заметно хуже чем на 70 день. Тем не менее четко прослеживается общая тенденция опережающего снижения
количества подвижных форм после воздействия электромагнитного излучения миллиметрового диапазона.
% подвижных
сперматозоидов
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
время инкубации в мин.
21 день
70 день
контроль
14 день
Рис.5 Резистентность сперматозоидов к уксусной кислоте
(по методу Джоела) после воздействия электромагнитного
излучения миллиметрового диапазона
Результаты этих функциональных проб подтверждают активирующее влияние краткосрочного (не более 15 дней) облучения
низкоинтенсивным электромагнитным полем миллиметрового
диапазона на репродуктивную систему самцов крыс, которое
было показано морфологическим и биохимическим исследованием семенников крыс.
Основываясь на предположении, что основным механизмом
влияния низкоинтенсивного излучения миллиметрового диапазона является механизм поддержания в мембране клеток акустоэлектрических колебаний (колебаний Фрёлиха), можно выдвинуть следующее объяснение.
22
Наблюдающееся в течении первых недель облучения повышение резистентности сперматозоидов, снижение доли свободного акрозина, активация синтеза сперматогенных клеток является следствием усиления акустоэлектрических колебаний в
мембране клеток, которые вступают в резонансное взаимодействие с микроволновым излучением. Но, длительное воздействие монотонного излучения может вызвать уменьшение амплитуды собственных колебаний мембран клеток, спектр излучения которых меняется на разных фазах биологического цикла
(Девятков Н.Д., 1991). Эти колебания возникли в процессе эволюции живой клетки и являются одним из главных механизмов
поддержания процессов жизнедеятельности. Клетка с клеткой
«разговаривает» на языке колебаний в миллиметровом диапазоне длин волн.
И механизм синхронизации или регенеративного усиления
может быть нарушен воздействием внешнего низкоинтенсивного излучения миллиметрового диапазона, что приводит к нарушению процессов жизнедеятельности сперматозоидов.
В Ы В О Д Ы
1. Низкоинтенсивное электромагнитное излучение миллиметрового диапазона вызывает дисбаланс профиля сперматогенных клеток самцов крыс и наиболее уязвимыми являются этапы
митоза сперматогоний.
2. Продолжительность облучения крыс является ведущим
фактором влияния низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на репродуктивную систему.
Облучение в течении не более 15 дней оказывает стимулирующее влияние на сперматогенез и на функциональные и биохимические характеристики сперматозоидов.
3. Уменьшение числа активноподвижных сперматозоидов
достоверно происходит только после 4 недель облучения. Анализ динамики этих изменений позволяет предположить суммирующий характер воздействия низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на двигательные
характеристики эпидидимальных сперматозоидов крыс.
23
4. Длительное воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения миллиметрового диапазона вызывает преждевременную активацию акрозина, уменьшая коэффициент
«проакрозин/свободный акрозин» в среднем на 40 %.
5. На основании изменения в семенниках общей активности
5-3-гидроксистероиддегидрогеназы низкоинтенсивное электромагнитное излучение миллиметрового диапазона практически не влияет на тестостеронпродуцирующую активность семенников.
6. Функциональная устойчивость сперматозоидов крыс к
факторам внешней среды (тесты Милованова и Джоэла) после
двух недель облучения низкоинтенсивного электромагнитного
излучения миллиметрового диапазона достоверно повышается, а
при дальнейшем облучении значительно снижается.
ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ В ПРАКТИКУ
Результаты исследования используются в научных исследованиях и практической работе: кафедры общей и биоорганической химии и кафедры фармацевтической химии Астраханской
государственной медицинской академии; Центра планирования
семьи и репродукции человека г.Астрахани. Результаты диссертационной работы используются в качестве учебного материала
для студентов, интернов и ординаторов Астраханской государственной медицинской академии.
СПИСОК РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Эффекты КВЧ-облучения спермы ./ Николаев А. А., Сухова И.В., М.Г.Кузнецова//Успехи современного естествознания.
– 2004. – №3. – С.22-23..
2. Влияние микроволнового излучения низкой интенсивности
на функциональные показатели сперматозоидов самцов крыс./
М.Г.Кузнецова, Николаев А. А // Успехи современного естествознания. – 2007. – №4. – С.143-144.
3. Продукция ингибина злокачественными опухолями простаты. ./ М.Г.Кузнецова, Николаев А. А.//Материалы 4-й конференции «Мужское здоровье и долголетие» - Москва- 2006.
С.164-165.
24
4. Пептид семенной плазмы вызывающий активацию акрозина. ./ М.Г.Кузнецова, Николаев А. А // Рroceedings of international scientific interdisciplinary workshop. Thailand, Bangkok, 2006, p
51.
5. Influence of microwave radiation of low intensity on reproductive function of male rats. / М.Г.Кузнецова // Proceedings of international scientific-practical «New technology in medicine and biology.» Bangkok 2007- p.34-35
6.Ферментативная активность акрозина эпидидимальных
сперматозоидов крыс после воздействия низкоинтенсивного
электромагнитного излучения миллиметрового диапазона. /
М.Г.Кузнецова // Естественные науки. Журнал фундаментальных и прикладных исследований- 2007 -№5- с.67-74.
7. Влияние КВЧ- излучения на Ферментативную активность акрозина
эпидидимальных
сперматозоидов
крыс.
/
М.Г.Кузнецова, Николаев А. А// Сибирский медицинский журнал - 2007 -№ 8 - С.24-29
8. Влияние низкоинтенсивного электромагнитного излучения
миллиметрового диапазона на на функциональные показатели
сперматозоидов самцов крыс / М.Г.Кузнецова, Николаев А. А //
Успехи современного естествознания 2007-№8-с.71-72
9.Влияние воздействия низкоинтенсивного электромагнитного
излучения миллиметрового диапазона на Ферментативную активность акрозина эпидидимальных сперматозоидов крыс. /
М.Г.Кузнецова, Николаев А. А //Вопросы репродукции -2008 №1 –С.11-17
10. Влияние микроволнового излучения низкой интенсивности
на репродуктивную функцию самцов крыс / М.Г.Кузнецова,
Николаев А. А // Вестник российской военно-медицинской академии – 2008 –том 23 -№3 прил.2 –с 217-218