ГБОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская акаде
реклама
ГБОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» МЗ РФ Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Учебно-методическое пособие по иммунологии для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов (II издание, исправленное и переработанное) Махачкала 2016 Составители: зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, д.б.н., доцент Омарова С.М., к.м.н., доценты – Саидов М.С., Гаджиева А.Д., Алиева А.И., Царуева Т.В., Газиев Г.М., Саидова Б.М., Исаева Р.И.; ассистенты - Юсупова М.Т. Рецензент: зав. кафедрой патологической физиологии д.м.н., профессор Саидов М.З. Учебно-методическое пособие предназначено для студентов медицинских вузов высшего профессионального образования основной образовательной программы по направлению подготовки 31.05.01. «лечебное дело» в рамках дисциплины – иммунология. В учебно-методическом пособии представлены вопросы для подготовки и самостоятельной работы студентов на практических занятиях, а также изложены данные об иммунитете, неспецифических и специфических факторах защиты организма, строении иммунной системы. Представлены данные о норме и патологии функционирования иммунной системы, понятия об эндогенных иммунорегуляторах и их роли. Описаны методы определения иммунного статуса организма человека, серологические методы и реакции для диагностики инфекционных болезней и идентификации возбудителей заболеваний. Широко представлены различные патологии при дефектах иммунной системы, а также методы иммунопрофилактики и иммунокоррекции и т.д. В пособии представлены некоторые иммунобиологические препараты для лечения и профилактики инфекционных болезней, а также тестовые вопросы и ситуационные задачи к тематикам практических занятий. Цель учебно-методического пособия. В результате использования пособия студент изучающий предмет иммунологию должен: знать, что такое иммунная система, принцип строения и функционирования иммунной системы в норме и при различных патологических состояниях, принцип формирования специфического иммунного ответа при бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных заболеваниях; уметь ставить серологические реакции и давать заключение, читать иммунограмму при различных патологических состояниях; владеть навыками постановки серологических реакций и иммунологических тестов. Пособие рекомендовано ЦКМС ДГМА для использования в учебном процессе (протокол № 2 от « 21» ноября 2013г.) 2 Список сокращений АГ - антиген АТ – антитело АЗКЦТ – антигензависимые клетки цитотоксичности АПК – антигенпредставляющие клетки ВИД – вторичные иммунодефициты ВИЧ – вирус иммунодефицита ИЛ – интерлейкин ИФН – интерферон МНС – (Major Histocompatibility Complex) – главный комплекс гистосовместимости NK – клетки – натуральные киллеры ПИД – первичные иммунодефициты СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита СМФ – система мононуклеарных фагоцитов 3 Занятие № 1 Тема: Иммунитет. Виды иммунитета. Факторы врожденного иммунитета. Фагоцитоз. Цель занятия: Изучить виды иммунитета, механизмы и факторы врожденного иммунитета. Вопросы для обсуждения: 1.Современное понятие иммунитета. 2.Виды иммунитета. 3.Врожденный (видовой) иммунитет. Факторы врожденного иммунитета. 4.Клеточные факторы врожденного иммунитета 5.Фагоцитоз. Стадии фагоцитоза. 6.Незавершенный фагоцитоз. 7.Фагоцитарная активность, фагоцитарное число их определение. Самостоятельная работа студентов: 1.Составить таблицу – «Виды иммунитета» 2.Определение фагоцитарной активности в готовых препаратах (подсчет фагоцитарного числа и фагоцитарного показателя) 3.Изучить незавершенный фагоцитоз по готовым препаратам, зарисовать в тетради. Методические указания к самостоятельной работе: Иммунитет – это способ защиты организма от генетически чужеродных веществ – антигенов экзогенного и эндогенного происхождения, направленный на поддержание и сохранение гомеостаза, структурной и функциональной целостности организма, биологической (антигенной) индивидуальности каждого организма и вида в целом. Различают несколько основных видов иммунитета. Врожденный, или видовой, иммунитет, он же наследственный, генетический, конституциональный — это выработанная в процессе филогенеза генетически закрепленная, передающаяся по наследству невосприимчивость данного вида и его индивидов к какому-либо антигену (или микроорганизму), обусловленная биологическими особенностями самого организма, свойствами данного антигена, а также особенностями их взаимодействия. Примером может служить невосприимчивость человека к некоторым возбудителям, в том числе к особо опасным для сельскохозяйственных животных (чума крупного рогатого скота, болезнь Ньюкасла, 4 поражающая птиц, оспа лошадей и др.), нечувствительность человека к бактериофагам, поражающим клетки бактерий. Видовой иммунитет может быть абсолютным и относительным. Например, нечувствительные к столбнячному токсину лягушки могут реагировать на его введение, если повысить температуру их тела. Белые мыши, не чувствительные к какому-либо антигену, приобретают способность реагировать на него, если воздействовать на них иммунодепрессантами или удалить у них центральный орган иммунитета — тимус. Приобретенный иммунитет — это невосприимчивость к антигену чувствительного к нему организма человека, животных и пр., приобретаемая в процессе онтогенеза в результате естественной встречи с этим антигеном организма, например, при вакцинации. Примером естественного приобретенного иммунитета у человека может служить невосприимчивость к инфекции, возникающая после перенесенного заболевания, так называемый постинфекционный иммунитет (например, после брюшного тифа, дифтерии и других инфекций), а также «проиммуниция», т. е. приобретение невосприимчивости к ряду микроорганизмов, обитающих в окружающей среде и в организме человека и постепенно воздействующих на иммунную систему своими антигенами. В отличие от приобретенного иммунитета в результате перенесенного инфекционного заболевания или «скрытной» иммунизации, на практике широко используют преднамеренную иммунизацию антигенами для создания к ним невосприимчивости организма. С этой целью применяют вакцинацию, а также введение специфических иммуноглобулинов, сывороточных препаратов или иммунокомпетентных клеток. Приобретаемый при этом иммунитет называют поствакцинальным, и служит он для защиты от возбудителей инфекционных болезней, а также других чужеродных антигенов. Приобретенный иммунитет может быть активным и пассивным. Активный иммунитет обусловлен активной реакцией, активным вовлечением в процесс иммунной системы при встрече с данным антигеном (например, поствакцинальный, постинфекционный иммунитет), а пассивный иммунитет формируется за счет введения в организм уже готовых иммунореагентов, способных обеспечить защиту от антигена. Пассивный иммунитет у новорожденных детей создается иммуноглобулинами при плацентарной внутриутробной передаче антител от матери ребенку играет существенную роль в защите от многих детских инфекций в первые месяцы жизни ребенка. 5 В инфекционной и неинфекционной патологии и иммунологии для уточнения характера иммунитета в зависимости от природы и свойств антигена пользуются также такой терминологией: антитоксический, противовирусный, противогрибковый, противобактериальный, противопротозойный, трансплантационный, противоопухолевый и другие виды иммунитета. Наконец, иммунное состояние, т. е. активный иммунитет, может поддерживаться, сохраняться либо в отсутствие, либо только в присутствии антигена в организме. В первом случае антиген играет роль пускового фактора, а иммунитет называют стерильным. Во втором случае иммунитет трактуют как нестерильный. Примером стерильного иммунитета является поствакцинальный иммунитет при введении убитых вакцин, а нестерильного — иммунитет при туберкулезе, который сохраняется только в присутствии в организме микобактерий туберкулеза. Факторы врожденного иммунитета. Условно факторы неспецифической защиты можно разбить на четыре типа: физические (анатомические); физиологические; клеточные, осуществляющие эндоцитоз или прямой лизис чужеродных клеток; молекулярные (факторы воспаления). еК клеточным факторам врожденного иммунитета относятся фагоцитирующие клетки и натуральные киллеры. Одним из мощных факторов резистентности является фагоцитоз. И.И.Мечников установил, что фагоцитарными свойствами обладают зернистые лейкоциты крови и лимфы, главным образом полиморфноядерные нейтрофилы (микрофаги нейтрофилы, эозинофилы и базофилы) и по-другому обозначаются как полиморфноядерные лейкоциты, или гранулоциты, а также моноциты и различные клетки ретикулоэндотелиальной системы, которую он назвал макрофагами.В настоящее время под макрофагами понимают клетки, которые обладают высокой фагоцитарной активностью. Они различаются по форме и размерам, в зависимости от тканей, где они обнаруживаются. По классификации ВОЗ все макрофаги объединены в систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Фагоцитам присущи три функции: Защитная. Фагоцитозом уничтожаются чужеродные объекты, т.е. происходит очистка организма от инфекционных агентов, продуктов распада, отмирающих клеток, неметаболизируемых органических веществ. 6 Секреторная. Взаимодействие объекта фагоцитоза с фагоцитом стимулирует бактерицидные системы последнего. К основным системам бактерицидности относят окислительную (О2зависимую) и неокислительные (ферментные). Окислительная бактерицидная система убивает микроб за счет прямого действия продуцируемых фагоцитом О2, ОН и Н2О2 или галогенизацию. Из ферментных систем самым сильным бактериологическим потенциалом обладают лизоцим и катепсин. Кроме того фагоциты синтезируют и секретируют множество цитокинов - биологически активных веществ, необходимых для поддержания иммунного ответа организма на чужеродное вещество. Представляющая. Переработка антигена (процессинг) и представление его иммунокомпетентным клеткам, принимающим участие в формировании иммунного ответа. Процесс фагоцитоза складывается из следующих стадий: Хемотаксис- продвижение фагоцита к объекту фагоцитоза, осуществляется с помощью псевдоподий. Адгезия (прикрепление). На мембране фагоцитов размещены различные рецепторы для захвата микроорганизмов. Эндоцитоз (поглощение). Принципы поглощения бактерий идентичны таковым у амеб: захваченные частицы погружаются в протоплазму и в результате образуется фагосома с заключенным внутри объектом. Внутриклеточное переваривание. К фагосоме устремляются лизосомы, затем оболочки фагосомы и лизосомы сливаются и ферменты лизосом изливаются в фаголизосому. Фагоцитированные микроорганизмы подвергаются атаке комплекса различных микробицидных факторов (рис. 1). Рис. 1. Последовательность фагоцитоза Завершенность фагоцитарных реакций. Микробицидный потенциал фагоцитирующих клеток эффективен против большей части патогенных микроорганизмов (завершенный фагоцитоз), но некоторые возбудители резистентны к его действию и способны длительно 7 существовать внутри фагоцитов. Многие факультативные и облигатные внутриклеточные паразиты (например, гонококки, туберкулезная палочка, возбудитель ВИЧ-инфекции и др.) не только сохраняют жизнеспособность, но и способны размножаться внутри клеток. В этом случае фагоцитоз остается незавершенным (рис. 2). Рис. 2. Незавершенный фагоцитоз Определение фагоцитарного числа и фагоцитарного показателя in vitro Техника постановки: в небольшую пробирку наливают последовательно микропипеткой 0,05мл 2% р-ра цитрата натрия, 0,1мл испытуемой крови и 0,05мл 2-миллиардной взвеси S. аureus (штамм 209). Тщательно перемешивают и выдерживают 30мин. при 37ºС. После этого содержимое пробирки вновь перемешивают и готовят из него тонкие мазки, которые фиксируют метанолом или смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 20 – 30 минут. Препараты микроскопируют, передвигая мазок в одном направлении, подсчитывают число фагоцитированных бактерий в 50 лейкоцитах. Исходя из этого, определяют среднее количество фагоцитированных бактерий на один лейкоцит. Изучение незавершенного фагоцитоза в препаратах из отделяемого уретры больного гонореей. Мазки фиксируют на пламени горелки и окрашивают по Граму (или метиленовой синькой). При микроскопии мазков отмечают наличие грамотрицательных диплококков, расположенных внутри фагоцитов (лейкоцитов). Расчет показателей фагоцитоза 1. Процент фагоцитирующих нейтрофилов (% фагоцитоза) – считают процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего количества 8 посчитанных нейтрофилов. В норме процент фагоцитоза у взрослых -6090%, у детей – 30-65%. 2. Фагоцитарное число – это среднее количество поглощенных бактерий или частиц на 1 клетку (полиморфно – ядерный лейкоцит). В норме фагоцитарное число после 30 мин инкубации составляет 4,57,5. 3. Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - оценивают переваривающую функцию нейтрофилов. Это отношение количества переваренных микробов к общему числу поглощенных микробов (переваренных и непереваренных), выраженное в процентах. Норма для взрослых - 64 – 72%. 4. Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ). В норме через 30 мин начинается переваривание поглощенных микроорганизмов нейтрофилами, через 2 ч. оно должно закончиться. Поэтому процент фагоцитирующих нейтрофилов и среднее число поглощенных микроорганизмов после 2-часовой экспозиции меньше, чем после 30 – минутной, а ИЗФ - больше 1,0, что указывает на завершенность фагоцитоза. ИЗФ меньше 1, 0 свидетельствует о сниженной киллерной функции нейтрофилов. ИЗФ – среднее число поглощенных микроорганизмов через 30 мин/ среднее число поглощенных микроорганизмов через 120 мин. Занятие № 2. Тема: Врожденный иммунитет. Клеточные и гуморальные факторы врожденного иммунитета (продолжение). Цель занятия: Изучить клеточные и гуморальные факторы врожденного иммунитета. Вопросы обсуждения: 1.Врожденный иммунитет. Внешние и внутренние барьеры врожденного иммунитета. 2.Клеточные и гуморальные факторы врожденного иммунитета. 3.Что такое лизоцим? Методика определения лизоцима в слюне. 4. Комплемент, пути активации комплемента. 5.Интерферон, острофазные белки сыворотки крови. 6.Воспаление, признаки воспаления. Самостоятельная работа студентов: 1.Определить титр лизоцима в слюне по демонстрационному материалу. 9 2.Разобрать схему классического и альтернативного путей активации комплемента. 3.Поставить опыт по определению бактерицидного действия кожи. 4.Изучить комплементарную активность сыворотки крови по демонстрационному материалу. Методические указания к самостоятельной работе 1.Определение титра лизоцима в слюне Лизоцим представляет собой термостабильный белок типа муколитического фермента. Он содержится в тканевых жидкостях животных и человека- в слезах, слюне, перитонеальной жидкости, плазме, сыворотке крови, лейкоцитах, материнском молоке и др. Лизоцим продуцируется моноцитами крови и тканевыми макрофагами. Он вызывает лизис бактерий, но не активен в отношении вирусов. Для определения титра готовят ряд последовательных разведений слюны в пробирках, в каждую из которых вносят по 1 мл. суспензии суточной культуры Micrococcus lisodecticus, содержащей 1 млрд/мл микробных тел. Таблица 1 Протокол определения действия лизоцима слюны на Micrococcus lisodecticus Титр 1:10 1:20 1:40 1:80 Кс Кф Кк Ингредиенты Слюна 1 1,0 2 3 4 5 1,0 6 _ 7 _ Физ. раствор Взвесь суточной культуры Mlisodecticus 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 _ _ 1,0 _ _ 1,0 Примечание: Из 4- пробирки 1,0 мл вылить в банку с дез.раствором. После инкубации в термостате в течение 3 ч определяют титр лизоцима по последнему разведению, в котором наблюдается полный лизис бактерий – просветление. Более точную оценку активности лизоцима можно проводить, измеряя спектрофотометрическим методом изменение оптической плотности микробной взвеси после инкубации ее с разведениями лизоцима. Пользуясь калибровочными кривыми или специальными таблицами, активность лизоцима можно выразить в мкг/мл. Уровень содержания лизоцима в слюне здоровых людей колеблется от 50 до 70 мкг/мл. 10 1.Определение бактерицидного действия кожи Важным фактором неспецифической резистентности является функция кожи как механического барьера для внедрения паразита. Отторжение верхних слоев эпидермиса, секреты сальных и потовых желез способствуют их удалению с поверхности кожи. Существенную роль в элиминации микробов с поверхности кожи играют различные микробоцидные субстанции (молочные и жирные кислоты и др.), обеспечивающие ее «самоочищение». Поэтому различные микроорганизмы, не являющиеся ее постоянными обитателями, не могут в течение продолжительного времени сохраняться на коже. Бактерицидность кожных секретов зависит от их кислотности. Для определения бактерицидной активности кожи суточную бульонную культуру кишечной палочки (1:50000) наносят на внутреннюю поверхность предплечья и распределяют равномерно шпателем. Делают отпечаток на предметное стекло со средой Эндо с одного участка исследуемой кожи, а через 15 минут - со смежного. Инкубируют посевы 18-24 часа при 37° С и подсчитывают колонии на 3 см2 поверхности каждой пластины. Индекс бактерицидности (ИБ) вычисляют по формуле: ИБ=К1-К2 х100 К1 где K l - количество колоний сразу после нанесения на кожу, К 2 количество колоний через 15 минут после контакта. У здоровых людей ИБ равен 90-100% Комплемент представляет собой систему сывороточных белков. Известно не менее 18 белков, составляющих систему комплемента. Согласно номенклатуре, принятой ВОЗ, система комплемента обозначается символом С, а ее индивидуальные компоненты символами Cl , C2 ---С9. Для субкомпонентов комплемента и продуктов расщепления, к соответствующему обозначению добавляют строчные латинские буквы – С1q, C3b и т.д. Каждая белковая фракция обладает определенными свойствами. Комплемент находится в сыворотке крови различных животных и человека, но наибольшее его количество обнаружено в сыворотке крови морских свинок, поэтому в практике препарат «комплемент» отождествляется с сывороткой морской свинки. В норме фракции комплемента находятся в неактивном состоянии. Они становятся активными в процессе многоступенчатых превращений, разделяемых на классический и альтернативный пути активации. При классическом 11 пути начальным активатором комплемента является комплекс антигенантитело. Активируют систему комплемента IgM и большинство подклассов IgG (IgG1, IgG3) - в большей степени, IgG2 - в меньшей. При альтернативном пути активаторами являются полисахариды, липополисахариды (эндотоксины), агрегаты - IgA. Дальнейший ход активации аналогичен классическому пути (рис. 3). В активном состоянии комплемент участвует в специфических иммунологических реакциях организма, при бактериолизе, ускоряет специфическую агглютинацию, преципитацию, усиливает, фагоцитоз, участвует в реакциях нейтрализации. Активированные компоненты комплемента действуют в определенном порядке - в виде каскада ферментов, при этом продукт предшествующей реакции служит катализатором для включения в последующую реакцию компонента и субкомпонента. Комплемент является важным фактором гомеостаза и регулируется механизмами последнего. Комплемент отличается от иммуноглобулинов тем, что его концентрация в сыворотке крови не повышается в результате иммунизации. Содержание и уровень комплемента в крови можно использовать как тест, характеризующий состояние естественной резистентности макроорганизма: высокое содержание комплемента в крови считается благоприятным признаком; снижение уровня комплемента является отрицательным прогностическим показателем. Для определения титра комплемента исследуемую сыворотку разводят и добавляют гемолитическую систему (смесь равных объемов эритроцитов барана и гемолитической сыворотки). Таблица 2 Схема титрования комплемента Ингредиент ы 1.Физ. раствор, мл 2.Исследуе мая сыворотка (1:10), мл 3.Гемолити ческая система, мл пробирки 5 6 1 2 3 4 1,45 1, 4 0, 1 1,35 1,25 1,25 0,15 0,2 1, 5 1,5 1,5 0,05 1,5 7 8 9 10 11 1,2 1,15 1,1 1,05 1,0 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 1, 5 - 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 12 1, 5 Пробирки инкубируют при 37° С - 30 минут, встряхивая каждые 10 минут (табл. 2). Для контроля готовят разведения эритроцитов и дистиллированной воды: 0,1мл + 2,9мл (соответствует 20% гемолизу); 0,25мл + 2,75мл (соответствует 50% гемолизу); 0,35мл + 2,65мл (соответствует 70% гемолизу). Рис.3. Пути активации и физиологические функции компонентов комплемента Занятие № 3 Тема: Иммунная система. Иммунокомпетентные клетки. Происхождение Т и В лимфоцитов, их функциональное значение в иммунных реакциях. Цель занятия: Изучить центральные и периферические органы иммунной системы и свойства иммунокомпетентных клеток и их взаимосвязь в иммунном ответе. Вопросы обсуждения: 1.Центральные и периферические органы иммунитета. 2.Принцип организации иммунной системы. 3.Генез (развитие и дифференцировка) лимфоцитов и их значение в формировании клеточного и гуморального иммунитета. 4.Понятие о предшественниках Т- и В- лимфоцитов. 5.Сходство и различие Т- и В- лимфоцитов. 13 6.Рециркуляция лимфоцитов. 7.Понятие об иммунном ответе, его формы. Самостоятельная работа студентов: 1.Органы иммунитета (зарисовать с указанием центральных и периферических органов). 2. Схематически изобразить функциональную роль иммунокомпетентных клеток. Методические указания к самостоятельной работе Рис 4.Иммунная система человека В настоящее время иммунная система рассматривается как система контроля, обеспечивающая индивидуальность и целостность организма. Ее действие основывается на способности отличать собственные структуры организма от генетически чужеродных, а также разрушать и элиминировать последние. Началом каждой иммунологической реакции служит процесс распознавания антигена: если иммунная система определяет, что это не «свое», а «чужое», то включаются механизмы иммунного ответа. Истинными клетками иммунной системы (иммуноцитами) являются только лимфоциты, представленные двумя большими популяциями В-клетками и Т-клетками. Они способны 14 специфически распознавать антиген и имеют на своей поверхности антиген связывающий (распознающий) рецептор. Остальные клетки, участвующие в иммунном ответе (клетки системы крови – нейтрофилы, моноциты, базофилы, эозинофилы, клетки кровеносных сосудов, дендритные клетки и другие), лишь способствуют лимфоцитам в выполнении их функции, «сотрудничают» с ними. Лимфоидные клетки, с которыми связаны все иммунологические механизмы, появляются, созревают и функционируют в определенных органах. Анатомический синоним иммунной системы – лимфоидная система. Принцип устройства иммунной системы – органно-циркуляторный. Органы иммунной системы делятся на: ПЕРВИЧНЫЕ (центральные) и ВТОРИЧНЫЕ (периферические). В центральных органах созревание лимфоцитов происходит без влияния антигенов (антигеннезависимая дифференцировка). Развитие в периферических, напротив, непосредственно зависит от антигенного воздействия. Лишь при контакте с антигеном в них начинается развитие процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов. К центральным органам иммунной системы относят тимус и костный мозг. Оба центральных органа иммунной системы являются местами дифференцировки определенных популяций лимфоцитов: тимус поставляет тимусзависимые или Т-лимфоциты, а в костном мозге образуются В-лимфоциты. Центральные органы иммунной системы являются органами антигеннезависимого лимфопоэза. Развитие лимфоцитов в них происходит постоянно, вне зависимости от того поступил антиген в организм или нет. Костный мозг относится так же к центральным органам иммунной системы в связи с тем, что он является источником стволовых клеток лимфопоэза и других клеток крови человека, а так же тучных и дендритных клеток. К периферическим лимфоидным органам относятся: селезенка, лимфатические узлы, миндалины, а также ассоциированная с кишечником, с бронхами и кожей лимфоидная ткань (внутриэпителиальные лимфоциты слизистых оболочек). К периферическим лимфоидным органам относятся небные миндалины, аденоиды, пейеровы бляшки, червеобразный отросток – аппендикс. К моменту рождения они еще слабо сформированы, так как контакта с антигеном не было. Лимфопоэз осуществляется в них при наличии 15 антигенной стимуляции. Т.о. пролиферация и антигензависимая дифференцировка происходит только тех лимфоцитов, которые имеют антигенспецифические рецепторы к конкретным антигенам, поступившим из вне или образовавшимся в организме. Периферические органы иммунной системы заселяются Т- и Влимфоцитами из центральных органов, при этом каждая популяция лимфоцитов мигрирует в определенные области периферических органов, которые называются тимусзависимые или тимуснезависимые зоны. Большинство лимфоцитов периферических органов иммунной системы не закрепляются в них постоянно, а через некоторое время, в особенности после контакта с антигеном, включаются в рециркуляцию лимфоцитов. Клетки лимфатической системы развиваются из общей полипотентной гемопоэтической стволовой клетки (HSC). А затем клетки предшественники лимфопоэза мигрируют в соответствующие органы, где определяется их дальнейшее развитие. Развитие В- лимфоцитов происходит там же в костном мозге, а Тлимфоциты (тимические) развиваются в тимусе ( рис.5). Т-клетки ответственны за иммунный ответ клеточного типа, а В-клетки — за иммунный ответ гуморального типа. Гуморальный иммунный ответ характеризуется выработкой антител, взаимодействующих с определенным антигеном. Клеточный образованием клетокэффекторов, так называемых Т-эффекторов (цитотоксических Тлимфоцитов), которые способны разрушать клеточные антигены (опухолевые клетки, вирусинфицированные клетки, мутировавшие клетки, клетки трансплантата). Из центральных органов иммунной системы они поступают в кровяное русло, а оттуда поступают в периферические органы иммунной системы в соответствующие Тзависимые или В-зависимые зоны, или через посткапиллярные венулы проходят в любые ткани (в межклеточное вещество). В периферических органах иммунной системы лимфоциты могут задерживаться или опять поступать в кровоток, через который заселять новые периферические лимфоидные органы. Лимфоциты, попавшие в нелимфоидные ткани, проходят по межклеточным промежуткам и вместе с межклеточной жидкостью собираются в лимфатических сосудах. С током лимфы они поступают в ближайший лимфатический узел. Там они могут задерживаться или вместе с лимфой через грудной лимфатический проток поступают в кровеносную систему. Далее опять – в периферические органы иммунной системы или в нелимфоидные ткани. Все органы топографически разобщены, но образуют единую систему благодаря постоянной миграции и рециркуляции клеток в них через 16 кровь, лимфу, тканевую жидкость. Органом кроветворения у человека является костный мозг. В нем образуются и располагаются морфологически похожие на лимфоциты стволовые клетки, дающие начало всем видам клеток крови и иммунной системы. Стволовые клетки обладают способностью к многократному (до 100 раз) делению, в результате чего они составляют самоподдерживающуюся популяцию. Т-лимфоциты представляют собой сложную систему различных в функциональном отношении клеток, объединяемых происхождением и присутствием на поверхности общего антигена – тимусного человеческого лимфоцитарного антигена. Рис. 5. Т-лимфоцит человека Предшественники Т-лимфоцитов, попадая в корковый слой тимуса, быстро размножаются, превращаясь в тимоциты. При дифференцировке тимоцитов образуются ранние, или менее зрелые, Т-лимфоциты и более зрелые Т2-лимфоциты. Идентифицировать ранние стадии дифференцировки можно только специализированными методами, а именно иммуноморфологически и гистохимически. Кроме способности дифференцироваться в зрелые Т-лимфоциты, тимоциты несут определенную функциональную нагрузку в иммунном ответе. В присутствии тимоцитов иммунный ответ зрелых Т-лимфоцитов лимфатических узлов оказывается значительно более интенсивным. Количество вырабатываемых в тимусе Т-лимфоцитов очень велико – число мигрирующих за сутки из тимуса Т-клеток в 5–20 раз превышает их общее количество в периферической крови. Среди зрелых Т-лимфоцитов, образующихся после контакта с антигеном, различаются антигенреактивные клетки, хелперы, киллеры, эффекторы аллергической реакции, клетки иммунологической памяти, а также выделяется особый вид регулирующих Т-клеток, объектом действия которых являются стволовая клетка костного мозга и первые этапы ее дифференцировки. 17 Большинство зрелых Т-лимфоцитов содержат в цитоплазме различные ферменты, включая нейтральную неспецифическую эстеразу, кислую фосфатазу и β-глюкуронидазу. Т-лимфоциты отличаются от В-лимфоцитов высокой скоростью миграции, хотя постоянно рециркулирует только часть из них. Другие Т-клетки – «оседлые» и занимают свое место в периферических лимфатических органах. Кроме общих характеристик, свойственных всем зрелым Т-лимфоцитам, каждая субпопуляция Т-клеток имеет свои иммуноморфологические и функциональные особенности. В-лимфоциты представляют собой систему клеток, объединяемых происхождением из костномозгового предшественника В-лимфоцитов. В функциональном отношении В-клетки, как и Т-лимфоциты, очень разнообразны. Среди В-клеток различают антителопродуценты (синтезирующие иммуноглобулины), киллеры, супрессоры, клетки иммунологической памяти. Все В-лимфоциты несут В-антиген. В-лимфоциты, как и Т-лимфоциты, проявляют способность к иммунному ответу на различных стадиях дифференцировки, а не только на уровне зрелых плазмоцитов. Первые этапы дифференцировки В-лимфоцита происходят в структурах костного мозга и являются антигеннезависимыми. Различают несколько этапов дифференцировки от стволовой клетки и общего предшественника лимфоцитов до зрелых В-лимфоцитов, выходящих из костного мозга и мигрирующих в периферические лимфатические органы для антителозависимого созревания. Самой первой стадией считают пре-В-лимфоцит, не имеющий цитоплазматических и поверхностных иммуноглобулинов, но обладающий В-антигеном и общим антигеном, свойственным острому лимфобластному лейкозу. Следующая стадия – пре-В-лимфоцит. На следующей стадии – ранних В-лимфоцитов – появляются молекулы Ig на мембране клетки, которые принадлежат к классу М. На стадии ранних В-лимфоцитов, перестает определяться в цитоплазме. Промежуточная стадия костномозгового В-лимфоцита не имеет общего лейкозного антигена. Следующие стадии дифференцировки В-лимфоцит проходит вне костного мозга: стадия зрелого лимфоцита отличается более низкой концентрацией В-антигена и В2-антигена и способностью к смене класса синтезируемых молекул Ig; конечным этапом дифференцировки В-лимфоцитов является плазматическая клетка, лишенная всех В-антигенов и поверхностных Ig и обладающая цитоплазматическими Ig в большой концентрации. 18 Следует отметить, что все указанные стадии дифференцировки в полном объеме относятся только к В-лимфоцитам – антителопродуцентам, так как этапы созревания В-супрессоров и В-киллеров достоверно не установлены. Антигензависимая дифференцировка В-лимфоцитов происходит в периферических лимфатических органах в зародышевых центрах. Образование этих центров начинается сразу после рождения, хотя способность к синтезу антител класса М существует уже в эмбриональном периоде и проявляется при ряде внутриутробных инфекций. Подготовка к началу синтеза антител в период новорожденности заключается не только в быстром накоплении В-лимфоцитов, но и в подготовке плацдарма для их дифференцировки. Таким плацдармом становится селезенка с наибольшей относительной массой в период новорожденности, а количество фолликулов в ней быстро нарастает в течение первого года жизни. В них оседают В-лимфоциты – преимущественно «оседлые» клетки, они мигрируют меньше и значительно медленнее, чем Т-лимфоциты. Среди В-лимфоцитов наиболее многочисленны В-лимфоциты – антителопродуценты. Занятие № 4 Тема: Антигены, их классификация. Главный комплекс гистосовместимости, строение и функция. Антигенпредставляющие клетки, характеристика, основные свойства. Цель занятия: Изучить антигены, их классификацию. Вопросы для обсуждения: 1.Что такое антиген? Дайте определение. Какова химическая природа антигенов? 2.Антигены, их свойства. Полноценные и неполноценные антигены. 3.Антигенная структура микробов. Протективные антигены. Гетерогенные антигены. 4.Антигены организма человека и животных (изоантигены, аутоантигены). 5.Дайте понятие чужеродности, антигенности, иммуногенности, специфичности антигена. 6.Что такое антигенная детерминанта? Дайте определение валентности антигена. 7.Что такое гаптен? Приведите примеры. 8.Главный комплекс гистосовместимости. Что такое антигенпредставляющие клетки (АПК)? Функции АПК. 19 Самостоятельная работа студентов: 1.Составить таблицу «Виды антигенов» 2.Зарисовать структуру бактериальной клетки с указанием локализации «О», «Н» и «К» антигенов. Методические указания к самостоятельной работе Антигенами называются вещества или тела, несущие на себе отпечаток чужеродной генетической информации, те самые вещества, то «чужое», против которого «работает» иммунная система. Любые клетки (ткани, органы) не собственного организма (не свои) являются для иммунной системы комплексом антигенов, даже некоторые собственные ткани (хрусталик глаза) — так называемые забарьерные ткани: в норме они не контактируют с внутренней средой организма. Антигены обладают 2 свойствами: • антигенностью, или антигенным действием, — они способны индуцировать развитие иммунного ответа; • специфичностью, или антигенной функцией, — взаимодействовать с продуктами иммунного ответа, индуцированного аналогичным антигеном. Химическая природа антигенов различна. Это могут быть белки: • полипептиды; • нуклеопротеиды; • липопротеиды; • гликопротеиды; • полисахариды; • липиды высокой плотности;• нуклеиновые кислоты. Антигены делятся на: • сильные, которые вызывают выраженный иммунный ответ; • слабые, при введении которых интенсивность иммунного ответа невелика. Сильные антигены, как правило, имеют белковую структуру. Некоторые (обычно небелковые) антигены не способны индуцировать развитие иммунного ответа (не обладают антигенностью), но могут вступать во взаимодействие с продуктами иммунного ответа. Их называют неполноценными антигенами, или гаптенами. Многие простые вещества и лекарственные средства являются гаптенами, при попадании в организм они могут конъюгировать с белками организма хозяина или другими носителями и приобретать свойства полноценных антигенов. Для того чтобы какое-либо вещество проявляло свойства антигена, кроме главного — чужеродное, оно должно обладать еще целым рядом признаков: • макромолекулярностью (молекулярная масса более 10 тыс. дальтон); • сложностью строения; • жесткостью структуры; • растворимостью; • способностью переходить в коллоидное состояние. Молекула любого антигена состоит из 2 функциональных частей: • 1-я часть — детерминантная группа, на долю которой приходится 2—3% поверхности молекулы антигена. Она определяет чужеродность антигена, делая его именно этим антигеном, отличающимся от других; • 2-я часть молекулы антигена называется проводниковой, при ее 20 отделении от детерминантной группы она не проявляет антигенного действия, но сохраняет способность реагировать с гомологичными антителами, т. е. превращается в гаптен. проводниковой частью связаны все остальные признаки ангенности, кроме чужеродности. Любой микроорганизм (бактерии, грибы, вирусы) представляетсобой комплекс антигенов. По специфичности микробные антигены делятся: • на перекрестно-реагирующие (гетероантигены) — это антигены, общие с антигенами тканей и органов человека. Они имеются у многих микроорганизмов и рассматриваются как важный фактор вирулентности и пусковой механизм развития аутоиммунных процессов; • группоспецифические — общие у микроорганизмов одного рода или семейства; • видоспецифические — общие у разных штаммов одного вида микроорганизмов; • вариантспецифические (типоспецифические) — встречаются у отдельных штаммов внутри вида микроорганизмов. По наличию тех или иных вариантспецифических антигенов микроорганизмы внутри вида делят на варианты по антигенному строению — серовары. По локализации антигены бактерий делятся на: • целлюлярные (связанные с клеткой); • экстрацеллюлярные (не связанные с клеткой). Целлюлярные антигены: • соматический — О-антиген - глюцидолипоидо-полипепдидный комплекс; • жгутиковый — Н-антиген (белок); • поверхностные — капсульные — К-антиген, Vi-антиген. Экстрацеллюлярные антигены — это продукты, секретируемые бактериями во внешнюю среду, в том числе антигены экзотоксинов, ферментов агрессии и защиты и др. В структуре бактериальной клетки различают жгутиковые, соматические, капсульные и некоторые другие антигены (рис. 6). Жгутиковые, или Н-антигены, локализуются в их жгутиках и представляют собой эпитопы сократительного белка флагеллина. При нагревании флагеллин денатурирует, и Н-антиген теряет свою специфичность. Фенол не действует на этот антиген. Соматический, или О-антиген, связан с клеточной стенкой бактерий. Его основу составляют липополисахариды. О-антиген термостабилен и не разрушается при длительном кипячении. Однако альдегиды (например, формалин) и спирты нарушают его структуру. Капсульные, или К-антигены, встречаются у бактерий, образующих капсулу. Как правило, К-антигены состоят из кислых полисахаридов (урановые кислоты). В то же время у бациллы сибирской язвы этот антиген построен из полипептидных цепей. По чувствительности к нагреванию различают три типа К-антигена: А, В и L. 21 Рис.6.Основные бактериальные антигены Главный комплекс гистосовместимости - это группа генов и кодируемых ими антигенов клеточной поверхности, которые играют важнейшую роль в распознавании чужеродного и развитии иммунного ответа. Главный комплекс гистосовместимости человека получил название HLA . HLA был открыт в 1952 г. при изучении антигенов лейкоцитов. Антигены HLA представляют собой гликопротеиды, находящиеся на поверхности клеток и кодируемые группой тесно сцепленных генов 6-й хромосомы. Антигены HLA играют важнейшую роль в регуляции иммунного ответа на чужеродные антигены и сами являются сильными антигенами. Антигены HLA подразделяются на антигены класса I и антигены класса II . Антигены HLA класса I необходимы для распознавания трансформированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами. Важнейшая функция антигенов HLA класса II обеспечение взаимодействия между Т-лимфоцитами и макрофагами в процессе иммунного ответа. Т-хелперы распознают чужеродный антиген лишь после его переработки макрофагами , соединения с антигенами HLA класса II и появления этого комплекса на поверхности макрофага. Способность Т-лимфоцитов распознавать чужеродные антигены только в комплексе с антигенами HLA называют ограничением по HLA . Определение антигенов HLA классов I и II имеет большое значение в клинической иммунологии и используется, например, при подборе пар донор-реципиент перед трансплантацией органов. Открытие MHC произошло при исследовании вопросов внутривидовой пересадки тканей. Генетические локусы, ответственные за отторжение чужеродных тканей, образуют в хромосоме область, 22 названную главным комплексом гистосовместимости (MHC) (англ. major histocompatibility complex). Затем, первоначально в гипотетической, на основании клеточной феноменологии, а затем в экспериментально хорошо документированной форме с использованием методов молекулярной биологии было установлено, что Т-клеточный рецептор распознает не собственно чужеродныйантиген , а его комплекс с молекулами, контролируемыми генами главного комплекса гистосовместимости . При этом и молекула MHC и фрагмент антигена контактируют с ТКР. MHC кодирует два набора высокополиморфных клеточных белков, названных молекулами MHC класса I и класса II. Молекулы класса I способны связывать пептиды из 8-9 аминокислотных остатков, молекулы класса II - несколько более длинные. Высокий полиморфизм молекул MHC, а также способность каждой антигенпрезентирующей клетки (АПК) экспрессировать несколько разных молекул MHC обеспечивают возможность презентации T-клеткам множества самых различных антигенных пептидов. Следует отметить, что хотя молекулы MHC и называются обычно антигенами, они проявляют антигенность только в том случае, когда распознаются иммунной системой не собственного, а генетически иного организма, например, при аллотрансплантации органов. Наличие в МНС генов, большинство из которых кодирует иммунологически значимые полипептиды, заставляет думать, что этот комплекс эволюционно возник и развивался специально для осуществления иммунных форм защиты. Существуют еще и молекулы MHC класса III , но молекулы MHC класса I и молекулы MHC класса II являются наиболее важными в иммунологическом смысле. 23 Рис. 7.Взаимодействие Т-хелперов и Т-киллеров с МНС-комплексами. Рис.8. Презентация антигенов МНС-1 комплексом Антигенпредставляющие клетки присутствуют преимущественно в коже, лимфатических узлах, селезенке и тимусе. К ним относятся макрофаги, дендритные клетки, фолликулярные отросчатые клетки лимфоузлов и селезенки, клетки Лангерханса, М-клетки в лимфатических фолликулах пищеварительного тракта, эпителиальные клетки вилочковой железы. Эти клетки захватывают, перерабатывают и представляют Аг (эпитоп) на своей поверхности другим иммунокомпетентным клеткам, вырабатывают ИЛ-1 и другие цитокины, секретируют простагландин Е2 (PGE2), угнетающий иммунный ответ. Фагоцитарную и цитолитическую активность макрофагов усиливает у-ИФН. Дендритные клетки происходят из костного мозга и образуют популяцию долгоживущих клеток, которые запускают и моделируют иммунный ответ. В костном мозге их предшественники образуют субпопуляцию CD34+-клеток, которые способны дифференцироваться в клетки Лангерханса для эпителия и дендритные клетки для внутренней среды. Незрелые и неделящиеся предшественники дендритных клеток заселяют многие ткани и органы. Дифференцировку дендритных клеток поддерживают колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов GM-CSF и ИЛ-3. Дендритные клетки имеют звездчатую форму и в состоянии покоя несут на поверхности относительно небольшое количество молекул 24 МНС. В отличие от клеток Лангерханса, интерстициальные диндритные клетки способны стимулировать синтез Ig B-лимфоцитами. Все дендритные клетки могут вначале поступать в тимус-зависимую зону периферических лимфоидных органов, где созреваютв так называемые интердигитирующие клетки. Рис. 9.Антигенпредставляющие клетки (дендритные клетки) Молекулы МНС контролируют иммунный ответ. Так, Аг MHC-II участвуют в представлении Аг Т-клеткам и во взаимодействии Т- и Влимфоцитов. Аг MHC-I и MHC-II связываются поверхностноклеточными дифференцировочными маркёрами CD (MHC-I с CD8, MHC-II с CD4). • Профессиональные Аг-представляющие клетки. Молекулы MHC-II экспрессированы только на определённых клетках, которые называют профессиональными АПК. Таких клеток у человека 3 типа: дендритные клетки костномозгового происхождения (ДК), В-лимфоциты и макрофаги. На их мембранах, помимо молекул MHC-II и -I, присутствуют все корецепторные молекулы и цитокины, необходимые для активации Т-лимфоцита к иммунному ответу. Эндотелий тоже выполняет функции АПК, но особого предназначения. Вероятно, экспрессия комплексов «пептидные Аг — МНС» на клетках эндотелия является тем специфическим сигналом, который привлекает иммунные лимфоциты из циркулирующей крови в очаг поражения (обеспечивает Аг - специфичный хоминг). Имеется 2 разновидности дендритных АПК (ДК): - миелоидные (ДК) происходят из моноцитов. Их, вероятно, можно рассматривать как разновидность макрофагов, специализирующихся на представлении Аг Т-лимфоцитам; - лимфоидные (ДК2) происходят от 25 общей лимфоидной клетки-предшественницы, из которой развиваются также Т- и В-лимфоциты, NK. Маркёры предшественников лимфоидных ДК: экспрессия ИЛ-За (варианта Рц для ИЛ-3) и одного из двух иммуноглобулиноподобных Рц — ILT3+ или ILN1. Для ДК2 характерны маркёры лимфоцитов (CD2, CD5, CD7, м РНКацепи npe-TCR). • ДК активно и непрерывно поглощают вещества из окружающей среды. В отсутствие патогена ДК поглощают вещества собственных тканей и представляют этот материал Т-лимфоцитам без корецепторного стимула. В результате иммунное воспаление в отношении собственных тканей не развивается и поддерживается состояние иммунологической толерантности. • ДК активируются при проникновении в организм какого-либо патогена, ДК распознают патоген при помощи TOLL-подобных Рц. На ДК, (как и на макрофагах) присутствуют Рц для маннозы, Рц для ЛПС, Рц TLR2 и TLR4, распознающие продукты грамотрицательных и грамположительных бактерий. На лимфоидных ДК (ДК2) присутствуют Рц TLR7 и TLR9 (распознают вирусную и бактериальную ДНК), а также особый лектиновый Рц (связывает, например, вирус гриппа). •Активированные патогеном ДК мигрируют из покровных тканей в региональные лимфоидные органы (в частности, в паракортикальные зоны лимфатических узлов), где и представляют Т-лимфоцитам Аг вместе с корецепторными молекулами В7.1, В7.2 и CD40. Выстраивание такого межклеточного — иммунологического — синапса — обязательное условие начала развития иммунного ответа. Взаимодействие Т- и В-лимфоцитов. При первичном иммунном ответе единственные эффективные АПК для Т-лимфоцитов — ДК. Но в случае активации Т-лимфоцита Аг, представленным ДК, в иммунный ответ будут вовлекаться и рядом расположенные В-лимфоциты, которым тоже «найдётся», что распознать в сложившемся микроокружении. При этом возможны два варианта взаимодействия Т- и В-лимфоцитов. • В-лимфоциты своим иммуноглобулиновым Рц связывают растворимый Аг, поглощают его эндоцитозом, подвергают внутри себя процессингу и экспонируют на поверхность фрагменты Аг в составе комплексов с молекулами MHC-II и MHC-I. TCR Т-лимфоцита связывает Аг на поверхности В-лимфоцита, выступая в качестве АПК; кроме того, устанавливаются все необходимые и достаточные корецепторные взаимосвязи между Т- и В-лимфоцитами. Такое взаимодействие происходит в Т-зависимых зонах периферической лимфоидной ткани в начале развития иммунного ответа. 26 • В-лимфоцит распознаёт свой Аг, но недалеко окажется Т-лимфоцит, распознавший Аг на другой АПК и активированный взаимодействием с этой другой АПК. В таком случае Т-В-взаимодействие может быть более «прохладным» и ограничиться взаимодействием цитокинов Т-лимфоцита с Рц для этих цитокинов на В-лимфоците, а взаимодействие мембранных молекул между ними может в какой-то мере наступать или не наступать (по крайней мере в первичном иммунном ответе). Но при вторичном иммунном ответе обязательно происходит взаимодействие мембранной молекулы В-лимфоцита CD40 с мембранной молекулой Т-лимфоцита CD40L (кроме Т-лимфоцитов, CD40L обнаружен пока только на тучных клетках), так как без этого взаимодействия, как показывает опыт, не происходит переключение класса иммуноглобулинов с IgM на другие, а вторичный ответ В2 - лимфоцитов характеризуется обязательным переключением класса иммуноглобулинов с IgM на IgG, IgA или IgE. Эти Т-В-взаимодействия происходят уже на территории В-клеточных зон — в фолликулах лимфоидных органов. Занятие № 5 Тема: Эндогенные иммуннорегуляторы. Гормоны, цитокины, их роль в иммунитете. Апоптоз. Цель занятия: Изучить характеристику гормонов и пептидов иммунной системы. Вопросы для обсуждения: 1. Понятие о системе гормонов и цитокинов. 2. Общая характеристика гормонов и пептидов тимуса, костного мозга. 3. Классификация цитокинов (интерлейкины, интерфероны, колониестимулирующие факторы, факторы роста, хемокины, факторы некроза опухоли). 4. Цитокины противовоспалительной природы. Роль цитокинов Th1 и Th2 клеток в регуляции дифференцировки и репарации в норме и при патологии. 5. Цитокины и апоптоз. Самостоятельная работа студентов: 1. Составить таблицу «Классификация цитокинов». 2. Зарисовать рисунок взаимодействия со специфическим мембранным рецептором клетки — мишени. Методические указания к самостоятельной работе Цитокинами принято называть обширное семейство биологически активных пептидов, обладающих гормоноподобным действием, 27 обеспечивающих взаимодействие клеток иммунной, кроветворной, нервной и эндокринной систем. В отличие от гормонов, поддерживающих гомеостатический баланс, цитокины обеспечивают ответную реакцию на внедрение чужеродных тел, иммунное повреждение, а также воспаление, репарацию и регенерацию. Многие исследователи рассматривают цитокины как «микроэндокринную систему». Цитокины являются необходимыми медиаторами межклеточного взаимодействия. Они формируют сеть коммуникационных сигналов между клетками иммунной системы и клетками других органов и тканей. Цитокины впервые были описаны как полипептидные факторы, обусловливающие взаимодействие клеток иммунной системы. Эти медиаторы, секретируемые лимфоцитами и моноцитами, получили название соответственно «лимфокины» и «монокины». Позднее, когда было обнаружено, что подобные или идентичные белковые медиаторы могут секретировать не только иммунокомпетентные, но и другие клетки, эти молекулы стали называть цитокинами. В последние годы появился еще один термин «эндогенные иммуномодуляторы», объединяющий интерлейкины, лимфокины, монокины, интерфероны, гормоны тимуса, цитотоксические и супрессорные факторы. Следовательно, последний термин имеет более широкое смысловое значение, чем понятие «цитокины». Классификация и общие свойства цитокинов. Универсальное определение цитокинов отсутствует, тем не менее они рассматриваются как полипептиды и белки, которые обеспечивают развитие воспаления и иммунного ответа. Цитокины секретируются не всегда. В некоторых случаях они могут экспрессироваться на поверхности стимулированных клеток. Однако независимо от того, секретируются цитокины или только экспрессируются, все они обладают некоторыми общими свойствами: — синтезируются в процессе реализации механизмов неспецифического или специфического иммунитета; — связываются со специфическими рецепторами на клетках— мишенях; — проявляют свою активность при низких концентрациях (порядка 10—11 моль/л); — не обладают ферментативной активностью или химической реактивностью; действуют опосредованно, изменяя функциональное состояние клеток—мишеней с помощью вторичных мессенджеров (от англ. messenger — вестник, посыльный); 28 — оказывают аутокринное (на клетку — продуцент), паракринное (на соседние с клеткой—продуцентом клетки) и дистантное (на клетки, удаленные на значительное расстояние органов и тканей) действие; — служат медиаторами иммунной и воспалительной реакций; — действуют как факторы роста и факторы дифференцировки клеток (при этом вызывают преимущественно медленные клеточные реакции, требующие синтеза новых белков); — образуют регуляторную сеть, в которой отдельные элементы обладают синергическим или антагонистическим действием; — обладают полифункциональной активностью и перекрывающимися функциями. Лейкоциты являются источниками цитокинов, в то же время — и мишенью для них. В связи с этим многие из цитокинов получили название «интерлейкинов». Классификация цитокинов до определенного времени была бессистемной. Некоторые из них первоначально назвали по их доминирующему биологическому действию. С 1976 г., когда был открыт ИЛ 2, описано более 20 иммунологически активных цитокинов, оказывающих различное действие на иммунную систему в условиях in vitro. Некоторые цитокины имеют не интерлейкиновую номенклатуру, а свое первоначальное название, например, ФНО (фактор некроза опухолей), КСФ (колониестимулирующие факторы), OSM (онкостатин М), LIF (фактор, ингибирующий лейкозные клетки), NGF (фактор роста нервов), CNTF (цилиарный нейротрофический фактор). Различные цитокины могут быть сгруппированы в 5 обширных классов, объединенных по их доминирующему биологическому действию: 1) воспалительные; 2) антивоспалительные; 3) факторы, вызывающие рост и дифференцировку лимфоцитов; 4) гемопоэтические колониестимулирующие факторы; 5) факторы, вызывающие рост мезенхимальных клеток. В большинстве случаев регуляторная функция цитокинов осуществляется в местах проникновения или концентрации патогенных агентов и сводится к вовлечению клеток близлежащих тканей и крови в процесс элиминации чужеродного агента, обеспечивая иммунные и воспалительные реакции. В критические моменты, когда местная воспалительная реакция оказывается несостоятельной, цитокины появляются в крови и разносятся кровотоком в различные органы и ткани, знаменуя начало острофазового ответа организма. Иммунный процесс, воспаление и острофазовый ответ характеризуются множеством хорошо известных проявлений: лихорадкой, похуданием, сонливостью, 29 потерей аппетита, лейкоцитозом, появлением в крови белков острой фазы, активацией гипофизадреналовой системы (стрессорная реакция), болевым синдромом и т. д. Все или большинство из них являются результатом действия цитокинов. Механизмы действия цитокинов. Влияние цитокина осуществляется путем его взаимодействия со специфическим мембранным рецептором клетки—мишени. В большинстве случаев рецепторы для цитокинов представлены одной двумя или тремя пептидными или гликопротеидными цепями, встроенными в клеточную мембрану. При этом цитокин взаимодействует с внешней, экстрацеллюлярной, частью рецептора. Сигнал отакого рода взаимодействии передается внутрь клетки интрацеллюлярной частью рецептора, которая обладает ферментативной активностью. Эффективность действия рецептора зависит от его аффинности, т. е. от того, какое минимальное количество лиганда необходимо для образования прочного комплекса и, как следствие, для передачи специфического сигнала внутрь клетки. Рецепторы цитокинов обнаруживаются на различных типах клеток. Связывание цитокина с рецептором приводит к экспрессии генов и последующему синтезу молекул, характерных для данного типа клеток. Большинство генов могут экспрессироваться под действием нескольких цитокинов, взаимодействующих со своими индивидуальными клеточными рецепторами. При этом возможны различные варианты таких взаимодействий. Существует множество определений понятия "апоптоз" - явление программируемой клеточной смерти, сопровождаемой набором характерных цитологических признаков (маркеров апоптоза) и молекулярных процессов, имеющих различия у одноклеточных и многоклеточных организмов (т.е. изменений в строении и функционировании клетки, характерных для апоптоза) - форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении ее размера, конденсации (уплотнении) и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматической мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду. Суть апоптоза заключается в том, что это программируемая клеточная гибель, т.е. существуют определенные механизмы, в результате реализации которых клетка сама завершает свое существование. В многоклеточном организме апоптозом гибнут клетки в процессе эмбриогенеза, Т-клетки в процессе дифференцировки в тимусе, клетки, зараженные вирусами, измененные клетки (при недостаточной 30 интенсивности апоптотических процессов развиваются онкологические заболевания) и мн. др. Основное биологическое назначение апоптоза состоит в том, чтобы в процессе эмбрионального морфонегеза создавать органы и ткани с эволюционно закрепленными конфигурациями и размерами и затем поддерживать эти параметры с допустимыми допусками в течение жизни. Важнейшим проявлением этой функции апоптоза после окончания развития человека и других млекопитающих является его участие в процессе физиологической регенерации (обновления) клеток разных тканей и органов и поддержании клеточного гомеостаза. Другой важнейшей функцией апоптоза является контроль за внутренней средой клетки, в том числе клеточного ядра с его содержимым. Правда, сейчас показано, что апоптоз может протекать и в клетках, лишенных ядра. При возникновении в клетке нарушений, превышающие допустимые пределы, клетка подвергается самоуничтожению. Апоптоз возникает при действии различных повреждающих факторов, которые способны вызвать некроз, но действующих в небольших дозах, например, при действии высокой температуры, ионизирующего излучения, противоопухолевых препаратов. Апоптоз принимает активное участие в ряде физиологических и патологических процессов. Например, при гормонзависимой инволюции органов у взрослых, в частности, отторжение эндометрия во время менструального цикла, атрезии (заращении) фолликулов в яичниках в менопаузе и регрессии (обратном развитии) молочной железы после прекращения лактации. Велика роль апоптоза и при патологической атрофии гормонзависимых органов, например, атрофии предстательной железы после кастрации и истощении лимфоцитов в тимусе при терапии глюкокортикоидами. Или патологической атрофии паренхиматозных органов после обтурации (закупорки) выводных протоков, что наблюдается в поджелудочной и слюнных железах, почках. Гибель клеток в процессе атрофии наблюдается и в коре надпочечников при воздействии глюкокортикоидов или при атрофии эндокрин-зависимых тканей. Во многих случаях острого или хронического ишемического либо токсического воздействия гибель клеток происходит через апоптоз. Такая картина наблюдается при инсульте, инфаркте не только миокарда, но и в почках, при диабете, отдельных формах нефрита, нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона. В патогенезе токсических повреждений печени, 31 поджелудочной железы и почек активация апоптоза также имеет важное значение. Таблица 3 Сравнительная характеристика некроза и апоптоза П изнак Индукция Распространенность Биохимические изменения Распад ДНК Целостность клеточной мембран Морфология Воспалительный отве Удаление погибших клеток Апопт з Активируется физиологичес-кими или патологическими стимулами Одиночная клетка Энергозависимая фрагментация ДНК эндогенными эндонуклеазами. Лизосомы интактные. Внутриядерная конденсация расщеплением фрагмен ы Сох анена с на Некроз Различная в зависимости от повреждающего фактора Группа клеток Нарушение или прекращение ионного обмена. Из лизосом высвобождаются ферменты. Диффузная локализация в некротизированной клетке Нарушена Сморщивание клеток и фрагментация с формированием апоптотических телец с уплотненным хроматино Нет Набухание клеток Поглощение (фагоцитоз) соседними клетками Поглощение (фагоцитоз) нейтрофилами макрофагами 32 и лизис Обычно есть и Рис. 10. Последовательность ультраструктурных изменений при апоптозе и некрозе Последовательность ультраструктурных изменений при апоптозе (справа) и некрозе (слева): 1 - нормальная клетка; 2 - начало апоптоза; 3 фрагментация апоптотической клетки; 4 - фагоцитоз апоптотических телец окружающими клетками; 5 - гибель внутриклеточных структур при некрозе; 6 - разрушение клеточной мембраны. Занятие №6 Тема: Гуморальный и клеточный иммунный ответ. Антитела. Классы иммуноглобулинов. Количественное определение иммуноглобулинов. Цель занятия: Изучить основные механизмы взаимодействия клеток иммунной системы (межклеточная кооперация) при специфическом иммунном ответе гуморальном и клеточном. Изучить природу, строение, структурно-функциональные особенности иммуноглобулинов различных классов, методы их определения. Вопросы для обсуждения: 1.В чем заключается механизм клеточного и гуморального иммунного ответа? 2.Назовите основные этапы иммунного ответа по гуморальному типу с участием Т-хелперов. 3.Назовите основные этапы иммунологического ответа по клеточному типу. 33 4.Что представляют собой антитела, какова структура молекулы антител? 5. Дайте характеристику пяти классов иммуноглобулинов. Самостоятельная работа студентов: 1.Пользуясь таблицей, зарисуйте схему молекулы иммуноглобулина, обозначьте на рисунке основные структуры: Н – и L– цепи, Fab, домены, шунт, Fc-фрагмент. 2.Зарисуйте схему иммунологического ответа по гуморальному типу с участием Т-хелперов и без участия Т-хелперов. 3.Зарисуйте схему иммунологического ответа по клеточному типу. 4.Зарисуйте в тетради схему реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини, поставьте эту реакцию по демонстрационной чашке, оцените результаты реакции, дайте заключение. Методические указания к самостоятельной работе Специфический (приобретенный) иммунитет — высокоспециализированная реакция организма, направленная на определение отличия «своего» от «чужого». Выделяют два вида приобретенного иммунитета: клеточный и гуморальный. 1. Клеточный иммунитет осуществляется Т-киллерами, которые напрямую взаимодействуют с антигенами. Этот вид иммунитета формируется при трансплантации органов и тканей, инфицировании вирусами, злокачественном опухолевом росте. Распознавая антиген, Ткиллеры вступают в тесный контакт с ним и выделяют специфические медиаторы (перфорин, цитолизин и др.). Целостность «мишеней» (антигенов) повреждается, происходит их разрыв и гибель. Т-киллеры сохраняются и способны к дальнейшему действию. Рис. 11.Общая схема клеточного иммунного ответа 34 2. Гуморальный иммунитет осуществляется по принципу трехклеточной системы кооперации: макрофаг — Т-хелпер — Влимфоцит (плазмоцит). В результате во внеклеточной жидкой среде (с греческого «humor» — жидкость, отсюда название вида иммунитета) происходит контакт антигена с антителом (выработанным Влимфоцитом). Первой клеткой, вступающей во взаимодействие с антигеном, всегда является макрофаг. Он «разбирает» антигены на отдельные «блоки» и «выставляет» их на своей поверхности, которые распознают Т-хелперы, а те, в свою очередь, активируют В-лимфоциты. Плазмоциты секретируют Ig G и Ig M, которые связываются с антигенами (микробами) и уничтожают их. В процессе гуморального иммунного ответа образуются клетки памяти, которые помогают организму противостоять при повторном заражении теми же микроорганизмами. Каскад гуморального иммунного ответа регулируют супрессоры, которые контролируют активность Т-хелперов. В норме соотношение Тхелперов и Т-супрессоров 2:1. При синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИДе) это соотношение меняется на 1:2, что усиливает угнетение иммунных реакций, т. к. основной мишенью для вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) являются Т-хелперы. В результате организм не способен распознавать попадающие в него антигены, что приводит к неизбежной его гибели. Рис. 12. Схема взаимодействия клеток в гуморальном иммунном ответе Антитела (иммуноглобулины) всегда специфичны антигену, индуцировавшему их образование. Тем не менее, противомикробные иммуноглобулины по специфичности делятся на теже группы, что и 35 соответствующие микробные антигены: • группоспецифические; • видоспецифические; • вариантспецифические; •перекрестнореагирующие. В настоящее время довольно часто методами биотехнологии и/или генной инженерии получают иммуноглобулины, продуцируемые одним клоном клеток. Они называются моноклональными антителами. Их продуценты — клетки-гибридомы, являющиеся потомками, полученными при скрещивании В-лимфоцита (плазматической клетки) с опухолевой клеткой. От плазматической клетки-гибридома наследуется способность к синтезу антител, а от опухолевой клетки — способность длительно культивироваться вне организма. Помимо специфичности одним из основных свойств иммуноглобулинов является их гетерогенность, т. е. неоднородность популяции иммуноглобулинов по генетической детерминированности их образования и по физико-химическому строению. Иммунохимические характеристики АТ: 1) Аффинитет – это точность совпадения конфигурации активного центра АЬ (паротока) и антигенной детерминанты (эпитока). 2) Авидность – это сила прочности иинтенсивности связи АГ + АТ. 3) Валентность – это количество активных центров АТ, которые способны соединяться с антигенными детерминантами. 36 Таблица 4 Характеристика разных классов иммуноглобулинов Физико-химическая и биологическая характеристика Подклассы Молекулярная масса (кДа) IgG IgA IgM IgD IgE G1.G2, G3,G4 150-170 A1,A2 M1, 950 160, 380 M2 — 190 — 185 Число мономеров Изотип Число C-доменов 1 γ1-4 3 1 или 2 α1-2 3 5 μ 4 1 δ 4 1 ε 3 Валентность % от общего уровня Ig Концентрация в сыворотке, г/л Активация комплемента Проникновение через плаценту Связывание с Fc-рецептором фагоцитов 2 80 8-16 + + + 2 или 4 12 1,4-4,2 — — — 10 6 0,5-1,9 + — — 2 0-0,1 0,0030,4 — 2 0-1 0,00010,002 — — — — + — — — + + + — — + + — + Связывание с Fc-рецептором — тучных клеток Способность к нейтрализации + бактерий Секреция через эпителий сли- — зистых 37 Рис.13.Строение молекулы иммуноглобулина и ее фрагментов, полученных при ферментативном расщеплении Радиальная иммунодиффузия по Манчини. В чашку Петри (или другая плоская поверхность) заливают агар, содержащий специфичную антиглобулиновую антисыворотку. В агаре делают пункт и вносят в них испытуемые сыворотки. Диаметр колец преципитации увеличивается до тех пор, пока не истощится в образце сыворотки иммуноглобулин, который в данном случае служит антигеном. Радиальная иммунодиффузия пригодна для количественного определения любых классов сывороточных иммуноглобулинов при условии, что имеются соответствующие моноспецифические антисыворотки и стандартные антигены для калибровки системы. Образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агарового геля, который содержит антитела против, например, IgM или IgA в известной концентрации. Одновременно в ряд лунок вносят стандартный антиген (иммуноглобулин определенного класса). При этом образуются кольца преципитации антигена. Далее по калибровочному графику зависимости диаметра кольца от концентрации стандартного антигена определяют концентрацию иммуноглобулинов отдельных классов в испытуемых образцах сывороток, предварительно измерив, диаметры колец преципитации. В сыворотке крови здоровых людей содержание иммуноглобулинов колеблется в пределах (г/л): IgM – 0,65 – 1,65; Ig – 7.50 – 15.45; IgA – 1.25 – 2.50. 38 Рис.14. Схема постановки реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметров преципитантов от концентрации антигена в исследуемых растворах. Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, применяемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора из бактериальной популяции клонов с высокой степенью токсичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром , содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма. Рис.15. Простая радиальная иммунодиффузия: а - кольца преципитации;б - калибровочная кривая. 39 Занятие № 7-8 Тема: Серологическая диагностика инфекционных болезней. Классификация серологических реакций. Реакция агглютинации, ее варианты. РПГА. Цель занятия: Изучить практическое применение серологических реакций (реакций АГ + АТ in vitro) в лабораторной диагностике инфекционных, также аутоиммунных, эндокринных и других заболеваний. Изучить различные методы постановки реакции агглютинации. Вопросы для обсуждения: 1.С какой целью применяют серологические реакции при лабораторной диагностике заболеваний? 2.Назовите виды серологических реакций. Простые двухкомпонентные реакции и сложные многокомпонентные реакции. 3.Физико-химический механизм РА (образование комплекса по типу решетки). 4.Какие ингредиенты участвуют в реакции агглютинации с целью идентификации антигена? Что представляет собой диагностическая сыворотка? 5.Какие ингредиенты необходимы для обнаружения АТ в исследуемой сыворотке? Что такое диагностикум? 6.Что такое титр диагностической сыворотки, что такое диагностический титр серологической реакции? 7.Как готовят О-диагностикум и Н-диагностикум? 8.Как готовят поливалентные и моновалентные диагностические сыворотки? 9.Какие ингредиенты необходимы для постановки РПГА? Что представляет собой эритроцитарный диагностикум? 10.Какие ингредиенты используются в РОНГА, РТПГА? 11.Реакция Кумбса, ее практическое применение. 12.Реакция ко-агглютинации, реакция латекс агглютинации. Самостоятельная работа студентов: 1.Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле для определения вида микроба. Зарисовать в тетради схему реакции, по результатам реакции дать заключение. 2.Составить схему постановки развернутой реакции агглютинации. 3.Поставить развернутую реакцию агглютинации с исследуемой сывороткой. 40 4.Произвести учет развернутой реакции агглютинации (демонстрация), дать заключение. 1.Составить схему РПГА, по демонстрационным планшетам с РПГА учесть результаты, дать заключение. Методические указания к самостоятельной работе Цели применения серологических реакций в лабораторной диагностике 1.Идентификация вида АГ при помощи известных АТ. Ингредиенты: а) неизвестный АГ – микроорганизмы (также токсины, белки крови, клетки разных органов), б) известные АТ – иммунные диагностические сыворотки. 2. Определение АТ в сыворотке крови (или в других биологических жидкостях) при помощи известного АГ – серологическая диагностика. Ингредиенты: а) исследуемая сыворотка б) диагностикум – стандартный препарата с известным антигеном. Методы постановки реакции агглютинации 1. РА на стекле (ориентировочная) 2. РА развернутая (в пробирках). Таблица 5 Реакция пассивной гемагглютинации (РПГЛ) или реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) № Титры Ингредиенты 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 КС КАГ 1. 2. Физ.раствор Исследуемая сыворотка (1:10) Эритроцитар. диагностикум Учет результатов 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5 3 0,5 Заключение 41 Антительный диагностикум Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка (антительный диагностикум). Белок А имеет сродство к Fcфрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой неспецифи-чески адсорбируют антитела сыворотки, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба. Реакция ко-агглютинации Рис. 16. Реакция ко-агглютинации (РКА) Метод латекс-агглютинации. В последние годы ассортимент диагностикумов из убитых микробов дополнили так называемые суспензионные Аг и AT, сорбированные на различных инертных корпускулярных носителях. Среди них наибольшее распространение нашёл метод латекс-агглютинации, основанный на взаимодействии Аг (или AT) в образце с частицами латекса, нагруженными специфическими моноклональными AT (или Аг), что ведёт к быстрому образованию видимых агрегатов. Учёт результатов проводят через 10-15 мин при косом освещении на тёмном фоне. Разработаны коммерческие диагностикумы для выявления Аг Streptococcus pneumoniae, стрептококков группы В, Haemophilus influenzae типа b и капсулированных штаммов менингококка в различных тканевых жидкостях (СМЖ, сыворотке крови, моче). Также имеются наборы для выявления Аг стрептококков группы А в мазках из зева; для первичной экспресс-идентификации колоний стрептококков групп А, В, С, F, энтерококков, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus 42 influenzae типов a-f, золотистого стафилококка, Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae. Занятие № 9 Тема: Серологическая диагностика инфекционных болезней. Реакция преципитации, нейтрализации. Цель занятия: Изучить основы постановки реакции преципитации и ее вариантов Вопросы для обсуждения: 1. Реакция преципитации. Варианты постановки реакции (кольцепреципитация, преципитация в геле, иммуноэлектрофорез). Количественное определение Ig по Манчини. 2. Реакция преципитации, Отличие реакции преципитации от реакции агглютинации. 3. Антитоксины. Реакция нейтрализации токсина антитоксином “in vivo” и “in vitro”. Получение антитоксических сывороток. 4. Реакция нейтрализации токсина антитоксином in vitro (реакции Шика, Дика). Самостоятельная работа студентов: 1. Постановка реакции кольцепреципитации для определения видовой принадлежности кровяного пятна. 2. Поставить реакция кольцепрецепитации Асколи. 3. Поставаить и зарисовать реакцию преципитации в агаровом геле. Методические указания к самостоятельной работе Таблица 6 Схема постановки реакции преципитации Ингредиенты Преципитирующая сыворотка против белков крови человека Преципитирующая сыворотка против белков крови барана Физиологический раствор Экстракт кровяного пятна «Х» Результат (образование преципитата) 1 пробирка 2 пробирка 3 пробирка (контроль АГ) 0,2 - - - 0,2 - - - 0,2 0,2 0,2 0,2 - Техника постановки реакции кольцепреципитации. 43 Реакция преципитации (РП) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. РП ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности РП в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др. Механизм. Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата — помутнение. Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2—0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1—0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Учет реакции производят через 1—2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется. 44 Рис.17. Реакция кольцепреципитации Реакция кольцепреципитации. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется I реакциейтермопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен- по Асколи). 45 Рис.18.Реакция радиальной иммунодиффузии Реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини). Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др. Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат . f1оecus хлопья шерсти) - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин антитоксин или анатоксин антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или 46 анатоксина. Рис.19. Реакция флоккуляции Иммуноэлектрофорез - сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммуннук сыворотку, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте "встречи" с антигеном линии преципитации. Рис.20.Схема иммуноэлектрофореза Занятие № 10 Тема: Реакция антиген-антитело с участием комплемента: реакция бактериолиза, гемолиза, РСК. Цель занятия: Изучить механизм, методику постановки и 47 практическое значение реакций бактериолиза, гемолиза, связывания комплемента. Вопросы для обсуждения: 1.Лизины и реакция лизиса. Реакция бактериолиза. 2.Реакция гемолиза и ее практическое применение. 3.Реакция связывания комплемента. Практическое применение РСК для диагностики инфекционных заболеваний. Самостоятельная работа студентов: 1.Освоить технику постановки РСК. 2. Постановка и учет РСК для серологической диагностики коклюша. 3. Определение бактериолитической активности сыворотки по демонстрационным чашкам. 4. Изучение демонстрационных препаратов. Методические указания к самостоятельной работе Бактериолиз (бактерии и греч. lysis — разрушение, растворение) — растворение микробов, при котором оболочка микробной клетки разрушается и ее содержимое выходит в окружающую среду. Бактериолиз может быть неспецифическим и специфическим. Неспецифический бактериолиз может быть вызван действием различных физических и химических факторов. Специфический Бактериолиз происходит обычно под действием бактериофага (см.) или антител (см.). Бактериолиз при действии антител происходит при участии двух ингредиентов: специфического, содержащегося в иммунной сыворотке (антитела-бактериолизины), и неспецифического, содержащегося в любой сыворотке — иммунной или неиммунной (комплемент). Основной фактор — специфическое антитело, которое сенсибилизирует микробы, изменяет их поверхностные свойства и тем подготавливает их к лизирующему действию комплемента. При воздействии одного из этих факторов лизис микробов не наблюдается. Если к сыворотке, прогретой в течение 30 мин. при t° 56°, прибавить комплемент и затем внести микробы, то после выдерживания смеси в термостате при t° 37° отмечается уменьшение числа жизнеспособных микробов; при микроскопировании висячей капли из указанной смеси наблюдается лизис микробных клеток. О бактериолитическом титре иммунной сыворотки судят по конечному ее разведению, при котором отмечается бактериолитическое действие. Бактерицидную (литическую) силу 48 сывороток определяют по числу колоний, вырастающих в посевах из микробной взвеси, к которой были добавлены иммунная сыворотка и комплемент. Не все виды микробов в одинаковой степени подвержены лизису при воздействии антител и комплемента. Легко лизируются большинство грамотрицательных микробов и холерные вибрионы; грамположительные микробы лизируются с трудом или вовсе не лизируются. Важным свойством антител является их способность лизировать, растворять микробы или другие клеточные элементы. Эти антитела называют лизинами. В зависимости от характера антигена они могут быть бактериолизинами, спирохетолизинами, цитолизинами, гемолизинами. Лизины проявляют свое действие только в присутствии дополнительного фактора — комплемента. Различают реакции бактериолиза и гемолиза. Реакция бактериолиза состоит в том, что при соединении специфической иммунной сыворотки с соответствующими гомологичными ей живыми бактериями в присутствии комплемента происходит лизис микробов. Реакцию бактериолиза можно наблюдать как в пробирке (in vitro), так и в организме животного (in vivo). Эту реакцию используют при диагностике холеры. При постановке реакции бактериолиза в пробирках соединяют выделенную у больного культуру вибриона, специфическую иммунную противохолерную сыворотку и комплемент. Результаты учитывают после двухчасового выдерживания в термостате при 37°С путем посева материала, взятого из пробирки, на мясо-пептонный агар. При постановке реакции бактериолиза на морских свинках (феномен Исаева — Пфейффера) смесь выделенной культуры вибриона со специфической иммунной сывороткой вводят внутрибрюшинно. При соответствии выделенной культуры и иммунных антител происходит гибель, растворение микроба. Это можно установить микроскопией мазков, взятых из экссудата, или при посеве на мясо-пептонный агар (отсутствие роста). Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии на эритроциты специфической, иммунной по отношению к ним сыворотки в присутствии комплемента наблюдается их растворение, гемолиз. Жидкость, мутная от наличия эритроцитов, становится ярко-красной и прозрачной («лаковая» кровь). Действие иммунной, гемолитической сыворотки строго специфично. Гемолиз эритроцитов в присутствии сыворотки наступает только при 49 наличии комплемента. Реакцию гемолиза используют в лабораторной практике в диагностической реакции связывания комплемента (РСК). Реакция связывания комплемента Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента. Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает. Техника постановки РСК Вначале в 2 пробирки разливается инактивированная и разведённая 1:5 испытуемая сыворотка. Затем в 1-ю пробирку приливается антиген, во вторую — физиологический раствор. После этого во все пробирки добавляется рабочая доза комплемента. После смешивания ингредиентов штатив с пробирками помещается в термостат при 37 °С на 30 минут (горячее связывание). При холодном связывании штатив с пробирками помещается в ледник при температуре — 4ºС на 18 часов. После выдерживания в термостате во все пробирки добавляется гемолитическая система. Реакция ставится в объёме 0,5 мл. Пробирки снова помещают в термостат на 2 часа, после чего производится предварительная регистрация результатов. Пробирки остаются при комнатной температуре, а на следующий день отмечается окончательный результат. Степень интенсивности реакции оценивается в плюсах. Полная задержка гемолиза — четыре плюса (++++), неполная - три и один плюс. Полный гемолиз обозначается минусами (-). Схема РСК с сывороткой больного 50 А) Схема РСК сывороткой здорового с Б) Рис. 21. Схема РСК с сывороткой больного (А) и здорового (Б) человека Таблица 7 Выводы: В исследуемой сыворотке выявлены антитела. 51 РСК позволяет выявить антитела к любому штамму одного и того же серотипа вируса. Диагностическое значение имеет четырехкратное увеличение титра антител в парных сыворотках (в период эпидемии гриппа) и двукратное нарастание в сыворотках крови больных с характерной клинической картиной. Таблица 8 Выводы: В парных сыворотках больного выявлено четырехкратное увеличение титра антител к вирусу гриппа А. Занятие № 11 Тема: Серологические реакции с меткой антигена или антител (РИФ, ИФМ, РИМ). Цель занятия: Ознакомить студентов с серологическими реакциями иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментного анализа (ИФА). Уметь поставить и произвести учет. Вопросы для обсуждения: 1.Виды серологических реакций. 2.Реакции с участием меченых антигенов или антител. 3.РИФ. Прямой и непрямой методы. 4.Преимущества ИФА по сравнению с РИА (радиоиммунологический анализ). 5.Какие ферменты используют в качестве метки в ИФА (РЭМА)? 6.Расшифровать аббревиатуру слова «РЭМА». 7.Какие красители используют в реакции иммунофлюоресценции? 8.Варианты постановки РИФ. 52 9.Какие из серологических реакций отличаются: а) наиболее высокой чувствительностью, б) доступностью и простотой, в) универсальностью, г) применяются для экспресс – диагностики? Самостоятельная работа студентов: 1.Составить схему постановки РИФ. 2.Составить схему постановки ИФА. 3.Промикроскопировать готовые препараты с помощью люминесцентной микроскопа. 4.Оценка интенсивности окраски при ИФА визуально и с помощью спектрофотометра. Методические указания к самостоятельной работе Реакции, в которых участвуют меченые антигены или антитела (иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы) по своей чувствительности превосходят все серологические реакции. Реакция иммунофлюоресценции Кунса (РИФ) Иммунофлюоресценция – это метод, основанный на использовании специфичности и чувствительности иммунологической реакции. В отличие от других методов маркировки постановка пробы и точная локализация иммунной реакции на поверхности клетки или ткани происходит довольно быстро. Один из компонентов иммунной реакции, как правило антитело, метится флюоресцирующим красителем (маркировка, конъюгирование). После возбуждения флюоресцирующего агента положение антигена становится доступным непосредственному наблюдению вследствие развития флюоресценции. Предложенный в 1941г. Кунсом, этот метод после многочисленных усовершенствований прочно вошел в лабораторную практику. Данный метод используют для экспресс – диагностики. Различают прямой и непрямой метод. При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические флюоресцирующие антитела образуют комплексы с микробными антигенами, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов. Недостатком прямого метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток против каждого изучаемого антигена. Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки – антиглобулиновой, содержащей антитела только против кроличьих глобулинов. Поскольку 53 диагностические антисыворотки, полученные путем иммунизации кроликов, так же содержат кроличьи глобулины, они в качестве антигенов реагируют c флюоресцирующей антиглобулиновой сывороткой и, вместе с тем, в качестве антител соединяются со специфическими исследуемыми антигенами (микроорганизмов). При этом на образующемся комплексе (специфические антитела + исследуемый антиген) фиксируются флюоресцирующие антиглобулиновые антитела, вызывая его свечение при люминесцентной микроскопии. Этапы: 1. На предметном стекле готовят мазок из материала. 2. Фиксируют эталоном и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой (содержит антитела против возбудителя – антигена). 3. Помещают во влажную камеру и инкубируют при 370С в течение 15мин. (для образования комплекса антиген – антитело). 4. Промывают изотоническим раствором хлорида натрия (для удаления не связавшихся с антигеном антител). 5. На препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика. Выдерживают в течение 15мин при 370С. 6. Препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия, высушивают и исследуют методом люминесцентной микроскопии. Реакция энзим – меченых антител (РЭМА) или иммуноферментный анализ (ИФА). Английская аббревиатура «ELISA» (enzryme linked immunosorbent assеy). Иммуноферментный анализ является современным, высокочувствительным методом. Результаты реакции могут учитываться как визуально, так и инструментально. Принцип метода заключается в фиксации известного антигена или антитела на носителе с последующей обработкой его исследуемой сывороткой или исследуемым антигеном и выявлении комплекса антиген-антитело антивидовыми глобулинами, мечеными ферментом «щелочная фосфатаза» или «пероксидаза хрена». Для фиксации антигена или антитела используют полиэтиленовые пробирки или полистироловые пластинки. Сенсибилизацию лунок панелей производят антигеном или антителом при + 40С в течение 14-16 часов или при 370С в течение 30 мин. Этапы постановки ИФА 54 1. Сенсибилизация полистироловых пластинок антигеном при +4ос в течение 14-16 часов или при 370 в течение 30 мин. 2. Сенсибилизированные панели промывают от несвязавшегося белка забуферным физиологическим раствором с добавлением твин-20. 3. 3-х кратно промывают панели физиологическим раствором. 4. Высушивание панелей. 5. Затем в лунки вносят по 0,05мл исследуемой сыворотки в разведении (от1: 4 до 1: 32), инкубируют в течение 18ч. при комнатной температуре. 6. Лунки промывают забуферным физиологическим раствором (для удаления непрореагировавшегося сывороточного глобулина). 7. Обрабатывают антииммуноглобулиновой сывороткой, меченной ферментом (пероксидаза хрена, кислая или щелочная фосфатаза или глюкооксидаза). 8. Активность фермента измеряют колориметрическим путем при добавлении субстрата 5-аминосалициловая кислота + Н2О2. Занятие № 12 Итоговое занятие 1-12. 1. Тестовый контроль. 2. Разбор типовых и ситуационных задач по серологической диагностике инфекционных болезней. Занятие № 13 Тема: Иммунологическая память. Различия первичного и вторичного иммунного ответов. Особенности иммунного ответа при различных микробных и паразитарных инфекциях, вызванных бактериями, вирусами, грибами, простейшими. Цель занятия: Изучить факторы, способствующие развитию иммунного ответа при различных инфекционных процессах. Вопросы для обсуждения: 1.Что такое иммунологическая память. Первичный, вторичный иммунный ответ. 2.Особенности антибактериального иммунитета при инфекциях, вызванных грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами. 3.Особенности иммунитета при бактериальных инфекциях с внутриклеточным паразитизмом. 4.Особенности противовирусного иммунитета. 5.Интерфероны, их роль в противовирусном иммунитете. 55 6.Назовите инфекции, при которых преобладают клеточные и гуморальные факторы иммунитета. 7.Особенности иммунитета при грибковых инфекциях. 8.Особенности иммунитета при протозойных инфекциях. Самостоятельная работа студентов: 1.Составить таблицу: «Участие клеточного и гуморального иммунитета при бактериальных инфекциях» и записать в тетради. 2.Составить таблицу: «Противовирусный иммунитет» и записать в тетради. Методические указания к самостоятельной работе. Макроорганизм имеет широкий спектр средств защиты своей целостности и поддержания гомеостаза. Однако для минимизации энергетических и пластических затрат макроорганизм для устранения конкретного антигена использует лишь наиболее эффективные механизмы и факторы защиты. Поэтому при воздействии различных по природе и свойствам антигенов иммунное реагирование макроорганизма имеет свои особенности. Иммунная реакция макроорганизма в ответ на бактериальную инфекцию в значительной степени определяется факторами патогенности микроба и в первую очередь его способностью к токсинообразованию. Различают иммунитет антибактериальный - против структурных компонентов бактериальной клетки и антитоксический против белковых токсинов. Особенности иммунитета при бактериальных инфекциях. Основными факторами антибактериальной защиты являются антитела и фагоциты. Антитела эффективно инактивируют биологически активные молекулы бактериальной клетки (токсины, ферменты агрессии и др.), маркируют их, запускают антителозависимый бактериолиз и иммунный фагоцитоз. Фагоциты непосредственно осуществляют фагоцитоз, в том числе иммунный, антителозависимый бактериолиз и внеклеточный киллинг патогена при помощи ион-радикалов и ферментов. Важная роль в борьбе с грамположительными микробами принадлежит лизоциму, а с грамотрицательными - комплементу (альтернативный путь активации), кроме того, существенное значение имеют белки острой фазы (Среактивный и маннозосвязывающий протеин). Ряд бактерий, относящихся к факультативным внутриклеточным паразитам, отличается повышенной устойчивостью к действию комплемента, лизоцима и фагоцитов (незавершенный фагоцитоз). К их числу относятся микобактерии, йерсинии, бруцеллы, сальмонеллы и некоторые другие. В такой ситуации макроорганизмвынужден 56 переключать нагрузку на клеточное звено иммунитета, что ведет к аллергизации организма по механизму ГЗТ. Особое значение приобретают активированные макрофаги и естественные киллеры, осуществляющие АЗКЦТ, а также γδТ-лимфоциты. Напряженность специфического антибактериального иммунитета оценивают в серологических тестах по титру или динамике титра специфических антител, а также по состоянию клеточной иммунореактивности (например, по результатам кожно-аллергической пробы). Для антибактериального иммунитета имеет значение уровень циркулирующих антител, комплемента и функциональное состояние лейкоцитов. Антитела в сочетании с комплементом оказывают повреждающее действие, особенно на грамотрицательные бактерии. Первостепенную роль в иммунитете к бактериям образующим экзотоксин, играют антитоксины нейтрализующие токсин. Антитоксический иммунитет развивается при столбняке, ботулизме, газовой гангрене, дифтерии и других инфекциях. Таблица 9 Особенности антибактериального иммунитета № Бактерии 1 Грамположительные бактерии 2 Грамотрицательные бактерии 3 Бактерии, продуцирующие экзотоксин (дифтерийная палочка, клостридии, холерный вибрион и др) 57 Эффективные механизмы иммунитета Лизоцим, белки острой фазы, фагоцитоз, специфические антитела. Комплемент, фагоцитоз, специфические антитела. Антитела – антитоксины IgG. IgA. Может играть определенную роль в нейтрализации таких токсинов, как холерогнен Бактерии с внутриклеточным паразитизмом (микобактерии, бруцеллы, сальмонеллы и др), а так же риккетсии, хламидии, микоплазмы. NK – лимфоциты, особенно на ранних стадиях. Клеточно– опосредованный иммунитет – ЦТЛ, которые уничтожают клетки мишени. Клеточный иммунитет является основой устойчивости против большой группы инфекций, возбудители которых характеризуются внутриклеточным путем размножения. К таким инфекциям относятся туберкулез, листериоз, сальмонеллез, туляремия, бруцеллез и др. таким образом при некоторых бактериальных инфекциях преобладает гуморальное звено иммунитета, при других – клеточный иммунитет. С учетом этого заполните следующую таблицу. Таблица 10 Клеточный и гуморальный иммунитет при некоторых бактериальных инфекциях Инфекции Столбняк Дифтерия Стафилококковая инфекцияя Клеточный + + + Гуморальный ++ ++ + Стрептококковая + + + + +++ ++ ++ + Холера Дизентерия Туберкулез инфекция 58 Туляремия +++ + Бруцеллез +++ + Максимальное участие обозначается + + или + + +. Следует отметить, что такая оценка сложного антиинфекционного иммунитета весьма относительна. При вирусных инфекциях в защите макроорганизма участвуют те же факторы врожденного иммунитета, что и при бактериальных. Важной особенностью врожденного противовирусного иммунитета является выработка интерферона. Интерферон не действует непосредственно на внутриклеточный вирус, а индуцирует ферментные системы, подавляющие все биосинтетические процессы т.е. противовирусный эффект является опосредованным через изменение клеточного метаболизма. Различают: - α (альфа) - интерфероны, продуцируемые лейкоцитами - β (бетта) - интерфероны, продуцируемые фибробластами - γ (гамма) - интерфероны, продуцируемые Т- и NK – клетками В специфическом противовирусном иммунитете участвуют как гуморальные, так и клеточные факторы Антитела взаимодействуют с внеклеточными вирусами, нейтрализуют вирусные частицы. Антитела также могут вмешиваться в развитее вирусной инфекции, активируя комплемент и способствуя фагоцитозу вирусных частиц макрофагами. Внутриклеточный вирус для антител не досягаем. В этом случае в дело вступает клеточный иммунитет – цитотоксические СD8+ или ЦТЛ. Клетки инфицированные вирусом, экспрессируют антиген на ЦПМ в составе МНС 1 класса, что является сигналом для активации Т – киллеров, которые распознают клетки, зараженные вирусом и уничтожают их. Таблица 11 Противовирусный иммунитет № Форма вируса Факторы иммунитета 1 Внеклеточный вирус Секреторные IgA и IgM . Сывороточные ингибиторы Вирус нейтрализующие антитела 2 Внутриклеточный вирус NK клетки, ЦТЛ. Клеточно – опосредованный иммунитет 59 Особенности иммунитета при протозойных инвазиях. Паразитарная инвазия сопровождается формированием в макроорганизме гуморального и клеточного иммунитета. В крови определяются специфические антитела классов M и G, которые чаще всего не обладают протективным свойством. Однако они активируют АЗКЦТ с участием макрофагов, а в случае внутриклеточного паразитирования - естественных киллеров и T лимфоцитов. Паразитарные инвазии сопровождаются аллергизацией макроорганизма по механизму ГЗТ. Характер противопаразитарного иммунитета определяется биологическими особенностями паразита. Многие паразиты обладают высокой антигенной изменчивостью, что позволяет им избегать действия факторов иммунитета. Например, каждой стадии развития малярийного плазмодия соответствуют свои специфические антигены. Напряженность противопаразитарного иммунитета оценивается в серологических тестах по титру специфических антител и в кожноаллергических пробах с протозойным антигеном. Особенности иммунитета ротовой полости. Система иммунной защиты ротовой полости сочетает разнообразные неспецифические и специфические факторы, обеспечивающие эффективную защиту от кариесогенных и иных болезнетворных микробов. Клетки слизистой оболочки выполняют функции механического барьера. Особую роль имеет антимикробная активность слюны. В течение суток в организме взрослого человека вырабатывается до 2л слюны - секрета с выраженной ферментативной активностью. Это не только мощный физико- химический, но и биологический барьер. Слюна содержит широкий набор веществ, обладающих выраженными бактерицидными свойствами: лизоцим, лактоферрин, лактопероксидаза, отдельные компоненты комплемента и пр. В слюне также постоянно присутствует до 200 тысяч фагоцитирующих клеток. В соединительнотканной строме ротовой полости также обнаруживаются клеточные элементы неспецифической резистентности: активно мигрирующие тканевые макрофаги, фибробласты, гранулоциты и тучные клетки. Система специфической иммунной защиты ротовой полости представлена миндалинами глоточного кольца, с хорошо развитой системой подчелюстных, подъязычных, околоушных и шейных лимфоузлов, в тканях обнаруживаются лимфоидные скопления, а в слюне - лимфоциты и широкий спектр иммуноглобулинов. Количественно доминирует IgA. Здесь его содержится заметно больше, 60 чем в сыворотке крови. Наибольшую функциональную нагрузку несет секреторная форма IgA(sIgA). Содержание IgM, G, E в слюне несколько меньше, чем в сыворотке крови. Снижение содержания в слюне иммуноглобулинов, особенно IgA, приводит к развитию гнойновоспалительных или аллергических заболеваниий слизистой оболочки ротовой полости. Занятие № 14 Тема: Понятие об иммунологической толерантности. Трансплантационный иммунитет. Цель занятия: Изучить механизмы иммунологической толерантности. Вопросы для обсуждения: 1. Иммунологическая толерантность, ее виды: центральная, периферическая и псевдотолерантность. 2. Какие клетки участвуют в формировании иммунологической толерантности. 3. Какие существуют пути кооперации и взаимодействия между макрофагами, Т- и В- лимфоцитами 4. Иммунные механизмы отторжения. 5. Трансплантационный иммунитет. Самостоятельная работа студентов: 1. Составить таблицу «Формы иммунного ответа». 2. Составить таблицу «Виды иммунологической толерантности». Методические указания к самостоятельной работе Одним из основных достижений иммунологии последнего пятидесятилетия было открытие феномена иммунологической толерантности (Медавар, 1961). Это явление состоит в специфическом — частичном или полном — отсутствии у взрослого животного иммунной реакции на определенный антиген; в ряде случаев иммунологическая толерантность бывает вызвана внутриутробным введением соответствующего антигена. Классическими примерами такой толерантности могут служить: мозаичность эритроцитов у телят — дизиготных близнецов, заражение мышей вирусом лимфоцитарного хориоменингита и приживление кожных гомотрансплантатов у мышей при соответствующем предварительном воздействии. Механизмы трансплантационного иммунитета. 61 Наиболее изученные антигены человека, с которым связан иммунный ответ на трансплантат, — это антигены HLA (иногда их называют трансплантационными антигенами). Иммунный ответ на трансплантат обусловлен в первую очередь распознаванием антигенов HLA донора лимфоцитами реципиента. Это вызывает активацию T-хелперов, которые, в свою очередь, стимулируют пролиферацию B-лимфоцитов и цитотоксических T-лимфоцитов. Антитела к чужеродным антигенам HLA могут присутствовать в сыворотке реципиента и до трансплантации. Их выявление свидетельствует о предшествующей иммунизации антигенами HLA. Она возможна при переливании цельной крови и во время беременности. Выявление в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA донора свидетельствует о высоком риске сверхострого отторжения трансплантата. Оно обусловлено образованием комплексов, состоящих из антигенов трансплантата и антител реципиента, которые активируют свертывание крови и приводят к тромбозу сосудов трансплантата. Поскольку отторжение трансплантата вызывают чужеродные антигены HLA, лучший способ его профилактики — подбор донора, совместимого с реципиентом по антигенам HLA. Если реципиент уже иммунизирован антигенами HLA, донор должен быть полностью совместим с реципиентом. Иммунологическая толерантность – специфическая иммунологическая инертность (ареактивность). Она может рассматриваться как явление, обратное иммунному ответу, благодаря которому иммунная система в норме не реагирует на антигены собственного организма. В любой форме иммунный ответ (гуморальный, клеточный, формирование иммунологической памяти или иммунологической толерантности ) является результатом взаимодействия разных типов клеток: макрофагов, Т- и В- лимфоцитов. Отсюда вытекает представление о трехклеточной системе кооперации в иммунном ответе. Различают два пути кооперации или взаимодействия между упомянутыми клетками. Первый состоит в непосредственном действии антигена на антигенраспознающие рецепторы Т- и В- лимфоциты или в прямом контакте между кооперирующими клетками, например макрофагами и Т-хелперами (первый сигнал). Второй неспецифический сигнал активации получают через клеточные медиаторы – монокины (интерлейкин - 1) и лимфокины (интерлейкин - 2), которые являются соответственно продуктами макрофагов и Т- хелперов, активированных при воздействии с 62 антигеном. Активация Т - хелперов и секреция интерлейкина -2 (ИЛ-2) невозможны без участия интерлейкина – 1 (ИЛ-1), который продуцируется активированными макрофагами. В настоящее время достаточно точно определена роль клеток каждого типа при разных формах иммунного ответа. Иммунологическая толерантность. Это явление, противоположное иммунному ответу и иммунологической памяти. Проявляется она отсутствием специфического продуктивного иммунного ответа организма на антиген в связи с неспособностью его распознавания. В отличие от иммуносупрессии иммунологическая толерантность предполагает изначальную ареактивность иммунокомпетентных клеток к определенному антигену. Иммунологическую толерантность вызывают антигены, которые получили название толерогены. Ими могут быть практически все вещества, однако наибольшей толерогенностью обладают полисахариды. Иммунологическая толерантность бывает врожденной и приобретенной. Примером врожденной толерантности является отсутствие реакции иммунной системы на свои собственные антигены. Приобретенную толерантность можно создать, вводя в организм вещества, подавляющие иммунитет (иммунодепрессанты), или же путем введения антигена в эмбриональном периоде или в первые дни после рождения индивидуума. Приобретенная толерантность может быть активной и пассивной. Активная толерантность создается путем введения в организм толерогена, который формирует специфическую толерантность. Пассивную толерантность можно вызвать веществами, тормозящими биосинтетическую или пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток (антилимфоцитарная сыворотка, цитостатики и пр.). Иммунологическая толерантность отличается специфичностью — она направлена к строго определенным антигенам. По степени распространенности различают поливалентную и расщепленную толерантность. Поливалентная толерантность возникает одновременно на все антигенные детерминанты, входящие в состав конкретного антигена. Для расщепленной, или моновалентной, толерантности характерна избирательная невосприимчивость каких-то отдельных антигенных детерминант. Степень проявления иммунологической толерантности существенно зависит от ряда свойств макроорганизма и толерогена. 63 Важное значение в индукции иммунологической толерантности имеют доза антигена и продолжительность его воздействия. Различают высокодозовую и низкодозовую толерантность. Высокодозовую толерантность вызывают введением больших количеств высококонцентрированного антигена. Низкодозовая толерантность, наоборот, вызывается очень малым количеством высокогомогенного молекулярного антигена. Механизмы толерантности многообразны и до конца не расшифрованы. Известно, что ее основу составляют нормальные процессы регуляции иммунной системы. Выделяют три наиболее вероятные причины развития иммунологической толерантности: 1. Элиминация из организма антигенспецифических клонов лимфоцитов. 2. Блокада биологической активности иммунокомпетентных клеток. 3. Быстрая нейтрализация антигена антителами. Феномен иммунологической толерантности имеет большое практическое значение. Он используется для решения многих важных проблем медицины, таких как пересадка органов и тканей, подавление аутоиммунных реакций, лечение аллергий и других патологических состояний, связанных с агрессивным поведением иммунной системы. Иммунологическая толерантность — отсутствие активации лимфоцитов (и следовательно, продукции ими эффекторных молекул) при наличии в доступном им пространстве специфического Аг. В природе толерантность лимфоцитов (как отсутствие ответа на доступный Аг) нужна только по отношению к Аг собственных неповреждённых тканей организма. Следует дифференцировать иммунологическую толерантность от супрессии уже состоявшегося иммунного ответа: - супрессия: продуктивная активация клона начинается, реализуется, затем подавляется; - толерантность: продуктивная активация Агспецифичного клона лимфоцитов не начинается. Механизмы супрессии и толерантности одинаковы — апоптоз и подавление внутриклеточного метаболизма, но эти механизмы реализуются на разных этапах лимфопоэза и иммуногенеза лимфоцитов. Делеция клона. По механизму делеции клона, (т. е. путём апоптоза лимфоцитов, связавших Аг TCR/BCR) происходит элиминация аутореактивных В-лимфоцитов на ранних стадиях лимфопоэза и негативная селекция тимоцитов. Делеция же аутореактивных клонов на стадии лимфопоэза — установление центральной толерантности. Анергия клона. Анергией клона называют отсутствие полноразмерной 64 активации лимфоцитов, связавших Аг TCR/BCR. Анергия, вероятно, имеет несколько разных механизмов реализации. Непродуктивная активация. Долгосрочное выживание лимфоцитов в периферических тканях обеспечивается частичной активацией, «тихой» базальной пролиферацией без продукции эффекторных молекул. Такая активация происходит, когда лимфоцит связывает комплексы собственных пептидов организма и молекул МНС. Продуктивная активация лимфоцита развивается, если он связывает комплексы чужих пептидов со «своими» МНС и получает корецепторные взаимодействия с активированной АПК. Сверхпороговый уровень экспрессии костимулирующих молекул достигается только в условиях их внешней стимуляции. Наиболее очевидным фактором такой внешней стимуляции АПК является доиммунное воспаление покровных тканей, повреждённых внедрившимся внешним патогеном (в естественных условиях — инфекционным). Таким образом, если организм чист изнутри, и ни травма, ни инфекция не инициирует доиммунного воспаления, то иммунологическая толерантность лимфоцитов (с любыми Рц) к своим тканям — единственно возможное состояние лимфоцитов. Занятие № 15 Тема: Противоопухолевый иммунитет. Цель занятия: Изучить механизмы противоопухолевого иммунитета. Вопросы для обсуждения: 1. Иммунологический надзор и механизмы противоопухолевого иммунитета. 2. Что такое "онкоантиген"? 3. Охарактеризуйте группы опухолевых антигенов. 4. Назовите вещества, относящиеся к химическим канцерогенам. 5. Что понимают под гетерогенными антигенами и какова их роль в развитии опухолей? 6. Профилактика злокачественных опухолей (3этапа профилактических мер). 7. Иммунологические методы диагностики злокачественных опухолей. 8. Особенности изменений в иммунной системе у онкологических больных. 9. Современные подходы к иммунотерапии опухолей. Самостоятельная работа студентов 1) Заполните таблицу «Опухоли человека вирусной этиологии» 65 2) Заполнить таблицу - Наиболее распространенные онкомаркеры человека 3) Зарисовать рисунок - Роль ВЭБ в развитии опухолей. Методические указания Известно, что возникновение примерно 15-20% новообразований человека имеет вирусное происхождение. Среди наиболее часто встречающихся индуцированных вирусом опухолей можно назвать рак печени, рак шейки матки, рак носоглотки, лимфому Беркитта, лимфому Ходжкина и др. Наиболее распространенные опухолеспецифические и раковоэмбриональные антигены (онкомаркеры) при онкопатологии представлены в таблицах 12, 13, 14. Таблица 12 Вирусы и опухоли человека Вирус HBV Вирус папилломы человека (ВПЧ 16, 18 и других типов) ВЭБ ВЭБ Вирус 1 типа лейкоза Т- клеток человека Опухоль Рак печени Рак шейки матки Лимфома Беркитта и другие иммуноссупресии Рак носоглотки Т - клеточный взрослых лейкоз Вирус Энштейна-Барр ассоциирован с лимфомой Беркитта заболеванием, эндемичным для экваториальной Африки, и с карциномой носоглотки, эндемичной для Южного Китая. Эндемичность указывает на роль дополнительных факторов, например генетических или окружающей среды, в возникновении опухолей. Т-клеточный лейкоз взрослых распространен главным образом в Японии и в странах Карибского бассейна. 66 Таблица 13 Опухолеспецифические антигены, экспрессируемые при онкопатологии Антигены Заболевание SCC CA-125 Плоскоклеточный рак легкого, пищевода, прямой кишки Рак яичника CA-19-9 Рак ЖКТ CA-15-3 Рак молочной железы PSA Рак предстательной железы P-53 (белок с мол. массой 5,3103D) Опухоль мочевого пузыря Таблица 14 Раково-эмбриональные антигены, выявляемые при онкопатологии Антигены Заболевание Альфа-фетопротеин Первичный рак печени, рак предстательной железы РЭА Рак толстой кишки, поджелудочной железы Бета-хорионический гонадотропин Трофобластические опухоли матки, яичников, яичек Гены, кодирующие опухолеспецифические антигены, часто отличаются от нормальных генов только одной точечной мутацией. Преобладающее большинство опухолевых антигенов не являются мембранными белками клеток, а представляют собой пептиды, прошедшие процессинг в цитолизе клетки и представленные молекулами HLA- 1 класса. Иммунные реакции на опухоли На опухолевые антигены организм способен развивать как гуморальные, так и клеточные иммунные реакции. При этом следует учитывать, что развитие иммунного ответа происходит только в случае, если опухолевые клетки содержат антигены, чужеродные организму хозяина (например, опухоле-специфические антигены). Иммунные реакции развиваются как на вирус-индуцированные опухоли, так и на 67 опухоли, вызванные химическими веществами и облучением. Опухоли, экспрессирующие раковоэмбриональные антигены или опухолеассоциированные белки, которые представлены рецепторными молекулами или факторами роста, как правило, не индуцируют иммунные реакции. Основную роль в противоопухолевом иммунитете играют клеточные реакции. В эксперименте на животных показано, что опухоли способны индуцировать образование специфических эффекторных Т-киллеров, которые, распознавая опухолевые антигены на клетках, представленные в комплексе с молекулами HLA- 1 класса, вызывают их цитолиз. Лизис опухолевых клеток происходит за счет продукции лимфоцитами перфоринов, фрагментинов и индукции апоптоза через Fas-лиганды. Гуморальные иммунные реакции при опухолевом росте могут, как способствовать регрессии опухоли, так и стимулировать ее развитие. Установлено, что взаимодействие антител с некоторыми опухолевыми клетками приводит к активации комплемента и лизису опухолевых клеток. Антитела также выступают индукторами реакции антителозависимой клеточной цитотоксичности. Усиление гуморальной иммунной реакции часто способствует росту опухоли. Это отмечалось, как при попытках защитить животных от опухолевого роста с помощью активной иммунизации опухолевыми антигенами, так и при пассивной иммунизации животных путем введения специфических антиопухолевых антител. Также обнаружено, что сыворотка, полученная от животных с прогрессирующим опухолевым ростом, блокирует литическое действие лимфоцитов в реакции клеточно-опосредованной цитотоксичности. Эффект усиления опухолевого роста связывают с маскировкой антителами специфических детерминант опухолевых клеток, что блокирует развитие клеточных иммунных реакций. Установлено, что подобный эффект оказывают также иммунные комплексы (ИК), формируемые антителами с растворимыми опухолевыми антигенами. Рост опухоли может происходить: 1) либо в результате прорыва иммунной защиты организма (вирусиндуцированные опухоли); 2) либо в результате «иммунной невидимости» опухолевых клеток (большинство спонтанных опухолей, которые не несут опухолеспецифических антигенов). Установлена вирусная этиология некоторых злокачественных опухолей человека. 68 Иммунодиагностика в онкопатологии На опухолевых клетках могут быть представлены два вида антигенов: опухолеспецифические антигены и опухолеассоциированные антигены. В настоящее время иммунодиагностика опухолей основана на выявлении в сыворотке и жидкостях больного опухолеспецифических антигенов или маркеров опухолевого роста (опухолеассоциированных белков). Для их выявления используется иммуноферментный анализ. - СЕА; используется для выявления РЭА, положительный тест при карциноме толстой кишки и поджелудочной железы. - AFP; используется для выявления альфа-фетопротеина, положительный тест при первичном раке печени. - СА-125; содержит маркер рака яичника. - СА-15-3; содержит маркер рака молочной железы. - СА-19-9; содержит маркер рака ЖКТ. - СА-242; содержит маркер рака поджелудочной железы, толстой и прямой кишки. - PSA EIA; содержит специфический антиген простаты. - PSA Free; содержит специфический антиген простаты, используется для определения свободного PSA. - NSE; содержит маркер мелкоклеточного рака легких. - UBC; содержит маркер рака мочевого пузыря. - CASA; содержит маркер рака яичника. - MSA; содержит маркер рака молочной железы. - Chromogranin A; содержит маркеры опухолей эндокринного происхождения. - CD30 (Ki-1 Antigen); используется в диагностике опухолей лимфопролиферативного происхождения. Иммунотерапия больных с онкопатологией Иммунотерапия больных с онкопатологией ведется по двум направлениям: 1) коррекция иммунных расстройств, развивающихся в процессе проведения химио- и радиотерапии; 2) активация противоопухолевых иммунных механизмов. Для лечения гемо- и иммунодепрессий, развивающихся в результате токсического действия опухолей на гемопоэз и иммуногенез, а также как следствия применения высоких доз радио- и химиотерапии, в соответствии с показаниями, могут быть использованы: 69 1) трансфузия совместимого костного мозга (в том числе и криоконсервированного аутологичного костного мозга); 2) трансфузия лейкомассы и тромбоцитарной взвеси (в том числе и аутологичной); 3) иммунотропные препараты, влияющие на Т-В- и макрофагальное звено иммунитета. Для активации иммунных противоопухолевых механизмов в настоящее время активно разрабатываются следующие приемы. Таблица 15 Иммунотерапия опухолей Активная Неспецифическая Специфическая Неспецифическая Пассивная БЦЖ, Corynebacterium parvum, левамизол Профилактические вакцины из опухолевых клеток, клеточные экстракты, очищенные или рекомбинантные антигены или идиотипы ЛАК – клетки, цитокины Специфическая Антитела, чистые или конъюгированные с лекарственными средствами, пролекарствами, токсинами или радиоизотопами; биспецифичные антитела; Т – клетки Комбинированная ЛАК – антитела клетки и биспецифичные Занятие № 16 Тема: Аллергические реакции. Механизмы и факторы В и Т зависимых аллергий. Классификация аллергических реакций по Джеллу и Кумбсу. Цель занятия: Изучить механизмы и факторы развития аллергических реакций, методы выявления. Вопросы для обсуждения: 1.Аллергия. Взаимоотношение аллергии и иммунитета. Основные понятия. 2.Аллергены: классификация и свойства. Экзоаллергены и эндоаллергены. Аллергические и псевдоаллергические реакции. 3.Типы иммунологической гиперчувствительности по Gell&Coombs. Механизмы и факторы В - и Т- зависимых аллергий. 4.Реагиновый тип аллергических реакций. 70 5.Цитотоксический тип аллергических реакций. 6.Иммунокомплексный тип (тип Артюса) аллергических реакций. 7.Клеточно-опосредованный тип аллергических реакций. Самостоятельная работа студентов: 1. Составить таблицу «Основные характерные признаки ГНТ и ГЗТ». 2. Составить таблицу «Классификация экзоаллергенов». 3. Зарисовать механизм аллергической реакции 1-ого типа Аллергены 1. Эндогенные (образуются в самом организме). 2. Экзогенные: неинфекционные и инфекционные. Название групп аллергенов Биологические Что к ним относится Лекарственные Бытовые Пыльцевые Эпидермальные Пищевые Промышленные Физические Задание 1. Объясните с помощью нижеприведенной схемы механизм развития аллергического процесса. Методические указания к самостоятельной работе Классификация аллергических реакций по Джеллу и Кумбсу (рис.22). 71 Рис. 22. Классификация аллергических реакций по Джеллу и Кумбсу 72 Термин «аллергия» ввел Пирке в 1906 году (allos ergon — другое действие) для обозначения изменений чувствительности к субстанциям, с которыми организм ранее контактировал. Аллергия является неадекватным проявлением чрезмерной активности иммунной системы (гиперчувствительности) и развивается при повторном поступлении аллергена в организм. В 1969 году Джелл и Кумбс создали классификацию типов гиперчувствительности иммунной системы, которая применяется и в настоящее время. Тип I — гиперчувствительность немедленного типа. В развитии реакции гиперчувствительности основную роль играют IgE-антитела. IgEопосредованную аллергию называют также атопией. Атопия имеет наследственную предрасположенность. Тип II — опосредуется цитотоксическими антителами классов IgM и IgG совместно с комплементом. Реализуется при переливании несовместимой крови, гемолитической болезни новорожденных. Тип III — опосредуется иммунными комплексами. Проявляется при системной красной волчанке, ревматоидном артрите, феномене Артюса, хроническом громерулонефрите. Тип IV — гиперчувствительность замедленного типа. Опосредуется клетками иммунной системы (Т-лимфоцитарная активация макрофагов). Чаще всего встречаются: — аллергические реакции немедленного типа (гиперчувствительность немедленного типа). Проявляются в течение получаса; — аллергические реакции замедленного типа (гиперчувствительность замедленного типа). Проявляются через 24-72 часа. В основе аллергических реакций немедленного типа лежат гуморальные механизмы, приводящие к образованию антител класса IgE вследствие смещения равновесия Th1–Th2 и сторону Th2-клеток. В основе многих аллергических реакций замедленного типа лежат клеточные механизмы, приводящие к активации макрофагов вследствие смещения равновесия Th1-Th2 и сторону Th1-клеток. Гиперчувствительность немедленного типа 1.Вызывается аллергенами, которые являются разновидностью антигенов или гаптенов. 2.Аллергены индуцируют у наследственно предрасположенных лиц иммунный ответ в виде преимущественного образования антител класса IgE, ранее называвшихся реагинами. Антитела класса IgE, комплементарно связанные аллергенами, обладают способностью фиксироваться на тучных клетках, базофилах, 73 эозинофилах за счет наличия на их поверхности соответствующих рецепторов (Fc-рецепторы для IgE). 3.В результате взаимодействия комплексов «аллерген-антитела класса IgE» с рецепторами на поверхности клеток из последних выделяются физиологически активные субстанции (гистамин, серотонин и другие). 4.Продукты тучных клеток и базофилов, действуя на клетки-мишени, вызывают ответ, не адекватный по интенсивности и по целевой направленности исходному воздействию. Такой неадекватный ответ и обозначается как аллергическая реакция. Таким образом, в основе гиперчувствительности немедленного типа лежит многократно усиленная реакция иммунной системы на взаимодействие аллергенов с антителами класса IgE. Реакции гиперчувствительности немедленного типа развертываются в три стадии: 1) иммунологическая, 2) патохимическая (фаза биохимических реакций), 3) патофизиологическая (фаза клинических проявлений). На первой стадии происходит ответ на поступление в организм аллергена, образуются антитела класса IgE. При повторном появлении в организме аллерген связывается с IgE и клетками. Вторая стадия — реакция тучных клеток (первичных мишеней аллергии). Освобождающиеся биологически активные субстанции воздействуют на клеткимишени второго порядка — гладкие мышцы, эндотелий сосудов, эпителий слизистых поверхностей. На третьей стадии происходит сокращение гладких мышц, клеток эндотелия, раздражение эпителия. 74 Таблица 16 Особенности реакций гиперчувствительности немедленного и замедленного типа Признак Сроки проявления Гиперчувствительность типа Несколько минут немедленного Гиперчувствите льность замедленного Не ранее 5-8 типа часов Клинические проявления Анафилаксия, сывороточная болезнь, Признаки сенная лихорадка, астма, феномен патогенеза Артюса туберкулеза, туляремии, Местная аллергическая Гиперемия, отек, бруцеллеза, Гиперемия, реакция полиморфноядерная инфильтрация трансплантацио уплотнение, нного бионуклеарная Антиген Сывороточные и другие отторжения Вирусы, инфильтрация растворимые белки, пыльца и др. некоторые бактерии, трансплантационные Антитела в крови Характерный признак Нехарактерны антигены, й признак некоторые Пассивный перенос Возможен с помощью сыворотки Невозможен гаптены (антител) Адаптивный перенос Возможен Возможен Токсичность антигена для Отсутствует сенсибилизированных лимфоцитов Реакция повреждения Положительная базофилов Резко выражена Десенсибилизация Успешна Торможение противогистаминными препаратами Сильное Как правило, невозможна Слабое 75 Отрицательна я Таблица 17 Классификация экзоаллергенов Происхождение Виды аллергенов Неинфекционные аллергены Животные Эпидермальные и пищевые аллергены, насекомые, аллергены Растения Пыльцевые, пищевые аллергены Антибиотики, сульфаниламиды, иммунологические препараты Полимеры, пестициды, металлы Домашняя пыль, производственная пыль Лекарства Промышленные вещества Пыль Инфекционные аллергены Низшие грибы, бактерии, вирусы, простейшие, Споры, гельминты поверхностные аллергены, продукты жизнедеятельности Занятие № 17 Тема: Инфекционная аллергия. Аллергические реакции IV типа. Принципы диагностики, терапии, профилактики аллергий (продолжение). Цель занятия: Изучить механизмы и факторы развития инфекционных аллергических реакций, принципы диагностики, лечения и профилактики. Вопросы для обсуждения: 1. Механизм развития аллергического процесса. 2. Гиперчувствительность замедленного типа. 3. Стадии развития и клинические проявления иммунологической гиперчувствительности. Роль IgE, цитотоксических Т- лимфоцитов, гуморальных медиаторов воспаления и биологически активных аминов, комплемента, фагоцитов, эозинофилов. 4. Классификация аллергических (иммунопатологических) реакций. Стадии развития аллергических реакций. Значение Th2 и их цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-13) в патогенезе аллергий. 5. Принципы диагностики, лечения и профилактики аллергий. 76 Самостоятельная работа студентов: 1. Составить схему реакции IV типа. Зарисовать реакцию ГЗТ. 2. Заполнить таблицу аллергенов. 3. Аллергены для в/к пробы (демонстрация). Методические указания к самостоятельной работе. Реакции повышенной чувствительности замедленного типа наблюдаются при бруцеллезе, туберкулезе, туляремии, токсоплазмозе, орнитозе, а также при различных грибковых и паразитарных заболеваниях. Чувствительность организма к антигенам возбудителя усиливается в течение заболевания и сохраняется длительное время после выздоровления больного, постепенно ослабевая. При некоторых инфекциях (туберкулез, бруцеллез, туляремия) она может сохраняться до 10 лет. Повышенную чувствительность организма можно выявить при введении специальных диагностических препаратов — аллергенов. В качестве таких аллергенов используют антигены микробов, полученные различными методами; фильтраты культур микробов, их лизаты; культуры, убитые нагреванием или химическими веществами, полисахаридные и другие фракции антигена. Аллерген вводят подкожно, внутрикожно, на кожу и слизистые оболочки. Если человек чувствителен к данному аллергену,на месте введения возникают местные очаговые реакции, покраснение, отек, болезненность кожи, конъюнктивит при нанесении аллергена на конъюнктиву. У больных туберкулезом при подкожном введении аллергена — туберкулина — наблюдаются и общие реакции: слабость, депрессия, обострение процесса в легких. Реакции повышенной чувствительности используют в диагностике многих инфекционных заболеваний. Этот аллергический метод диагностики применяют при туберкулезе (проба Пирке — накожное введение туберкулина и проба Манту — внутрикожное введение туберкулина), туляремии, бруцеллезе (проба Бюрне), токсоплазмозе, орнитозе, грибковых и протозойных заболеваниях. Аллергены называют по заболеванию: туберкулин, бруцеллин, тулярин, токсоплазмин. Для диагностики инфекционного заболевания обычно применяют накожные и внутрикожные аллергические пробы. Глазную пробу с малеином используют для выявления бессимптомного сапа у лошадей. Кожные тесты. Существуют разные методы кожного тестирования с аллергенами in vivo: prick-тесты (тесты уколом), скарификационные тесты, аппликационные тесты, внутрикожные тесты. Кожное тестирование с ингаляционными и пищевыми аллергенами проводят 77 для диагностики только IgE-зависимых аллергических заболеваний. Для кожного тестирования используют стандартные серийные, содержащие 10 тыс. единиц белкового азота (PNU — Protein Nitrogen Unit) в 1 мл, водно-солевые экстракты аллергенов. Эти экстракты приготавливают из пыльцы растений, домашней пыли клещей домашней пыли, шерсти, пуха, эпидермиса животных и птиц, пищевых и других продуктов. Противопоказания для проведения кожных тестов. - Обострение основного заболевания. - Острые интеркуррентные инфекционные заболевания. - Туберкулёз и ревматизм в период обострения. - Нервные и психические заболевания в период обострения. Болезни сердца, печени, почек и системы крови в стадии декомпенсации. - Беременность и период лактации. Не рекомендуется проведение аллергологического обследования в полном объёме детям до 3-летнего возраста, больным в период лечения глюкокортикоидами и блокаторами рецепторов гистамина (снижают кожную чувствительность), а также после острой аллергической реакции, поскольку в этот период пробы могут оказаться отрицательными из-за истощения в коже сенсибилизирующих антител. Теоретически любое вещество может быть аллергеном. Это могут быть разнообразные объекты, с которыми сталкивается человек в живой и неживой природе. Различают следующие аллергены: Ингаляционные – а) растительного происхождения, например, пыльца o растений вызывает поллиноз (сенную лихорадку) в виде ринита, конъюнктивита и бронхоспазма; б) животного происхождения (перхоть, фрагменты o клещей); o в) бытовые аллергены (пыль и др.). Пищевые – яйца, молоко, рыба, мясо, шоколад, ракообразные, моллюски, бобовые, орехи, ягоды, пищевые добавки и смеси. Лекарственные – антибиотики, сульфаниламиды, гормоны (инсулин, АКТГ, ТСГ), сыворотки, витамины (тиамин и др.). Промышленные – полимеры, пестициды, металлы и др. 78 Различают - экзоаллергены и эндоаллергены. Экзоаллергены делятся по происхождению на растительные, бытовые, пищевые, инфекционные, лекарственные, химические, эпидермальные, аллергены насекомых и гельминтов. Все перечисленные выше аллергены относят к большой группе неинфекционных аллергенов. Этой группе противостоят инфекционные аллергены. К ним относят протозойные, грибковые, бактериальные и вирусные аллергены. Принципиальное отличие их от неинфекционных аллергенов заключается в том, что неинфекционные аллергены вызывают аллергические заболевания, а инфекционные, главным образом, аллергические проявления основного инфекционного заболевания. Аллергены различаются в зависимости от путей проникновения их в организм и локализации патологического процесса, вызываемого ими. Это вдыхаемые аллергены (пыльца, бытовые аллергены); пищевые аллергены; контактные аллергены, действующие на кожу и слизистые оболочки (химические низкомолекулярные вещества, антибиотики); проникающие в организм различными путями: парентерально, ингаляционно, контактно, энтерально). Основными условиями формирования повышенной чувствительности при различных инфекционных заболеваниях являются: - физико-химические свойства антигена (аллергена); - его доза; - способ существования возбудителя (внутриклеточный или внеклеточный); - состояние иммунной системы макроорганизма. В развитии аллергической реакции выделяют три стадии: - В течение иммунологической стадии в ответ на аллерген образуются антиген-чувствительные клетки, специфические антитела и иммунные комплексы. - Патохимическая стадия характеризуется образованием медиаторов воспаления и биологически активных аминов, которые играют основную роль в механизме аллергических реакций. Стимулом к их образованию является соединение аллергена с антителами или сенсибилизированными лимфоцитами в конце иммунологической стадии - В течение патофизиологической стадии проявляется клиническая картина аллергической реакции. Как правило, клинические проявления аллергии полиморфны. Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) относится к IV типу аллергии (по Джеллу и Кумбсу). Она обусловлена взаимодействием 79 антигена (аллергена) с макрофагами и Th1-лимфоцитами, стимулирущими клеточный иммунитет. Развивается главным образом через 1-3 суток после воздействия аллергена: происходит уплотнение и воспаление ткани, в результате ее инфильтрации T-лимфоцитами и макрофагами. Гиперчувствительность IV типа связана с тем, что сенсибилизированные антигеном Т-клетки при повторной встрече с тем же антигеном выделяют цитокины. Цитокины вызывают воспалительные реакции, а также активируют и привлекают макрофаги, которые высвобождают медиаторы воспаления. IV тип – гиперчувствительность замедленного типа Рис.23.Схема гиперчувствительности замедленного - IV типа Аллергические реакции IV типа опосредуются Т-лимфоцитами ГЗТ. Реакции этого типа развиваются на внутриклеточные бактерии, грибы, вирусы, внутриклеточные простейшие (лейшмании, шистосомы), тканевые антигены, ряд лекарственных и химических веществ. Лекарственные и химические вещества, как высокомолекулярные, так и низкомолекулярные, реакцию IV типа вызывают, как правило, в результате антигенной модификации макромолекул или клеток организма, которые в итоге приобретают новые антигенные свойства и служат индуктором и мишенью аллергической реакции. Следует заметить, что реакции гиперчувствительности IV типа являются важной формой защиты организма от микробов и простейших, живущих внутри клеток. Антительная защита в этих случаях является неэффективной, так как антитела не способны проникнуть внутрь клетки и там обезвреживать микроорганизмы. Вместе с тем, наблюдающееся 80 усиление фагоцитарной и метаболической активности макрофагов при этом типе (IV) реакций во многих случаях способны приводить к гибели микробов, вызвавших эту реакцию. Когда этот механизм обезвреживания патогенов оказывается малопродуктивным и патоген продолжает жить в клетках и постоянно выступать антигенным раздражителем, реакции ГЗТ приобретают хроническую форму и оказывают повреждающее действие на ткани. Основными компонентами реакции гиперчувствительности IV типа являются Т-лимфоциты ГЗТ и макрофаги. Примером такой реакции являются контактный дерматит на химические вещества (краску для волос, косметику, стиральные порошки и др.) и реакция на микобактерии туберкулеза. Проникновение химического вещества (ХВ) в кожу приводит к комплексированию его с белками кожи и формированию макромолекул со свойствами аллергена. Поглощение аллергена макрофагами (клетками Лангерганса) и последующая его презентация приводит к активации Т-лимфоцитов и формированию пула сенсибилизированных Т-лимфоцитов ГЗТ (пролиферации и дифференцировки этих клеток). Эти клетки являются субпопуляцией Тh1-клеток и формируются из Тh0-клеток (CD4+-клетки). В ряде случаев пул Т-клеток ГЗТ включает Т-цитотоксические лимфоциты (CD8+клетки). Повторный контакт сенсибилизированных Т-лимфоцитов ГЗТ с тем же аллергеном приводит к их активации и продукции целой гаммы цитокинов: ИНФγ, ИЛ-2, ФНОβ, ИЛ-3, ГМ-КСФ и хемокинов: ИЛ-8, МИФ (фактор ингибиции миграции макрофагов), МАХФ (факторы активации и хемотаксиса макрофагов). Под влиянием этих факторов происходит концентрация макрофагов в месте нахождения аллергена (раздражителя) и стимуляция их функциональной (фагоцитарной и антигенпрезентирующей) способности и метаболической активности. Под влиянием аллергена и цитокинов макрофаги продуцируют в окружающую ткань литические ферменты, кислородные радикалы, оксид азота, активные формы кислорода и другие биологические активные вещества. Воздействие этих веществ на ткань (кожу) приводит к развитию воспаления и местного дегенеративно-деструктивного процесса. Макрофаги являются главным компонентом клеточного инфильтрата воспаленной ткани. Аллергические реакции IV типа клинически проявляются через 48-72 часа от момента проникновения аллергена. Это время требуется для активации Тгзт-лимфоцитов, кумуляции макрофагов в месте 81 концентрации аллергена, их активации и продукции тканетоксических факторов. Развитие пролонгированной реакции ГЗТ способно приводить к формированию гранулемы. Гранулематозные поражения кожи наблюдаются при лепре (Mycobacterium leprae). При туберкулезе в легких в результате хронической реакции ГЗТ и экзопродукции макрофагами литических ферментов происходит формирование каверн. Для выявления ГЗТ могут быть использованы внутрикожная проба, реакция торможения миграции макрофагов, реакция бласттрансформации лимфоцитов со специфическими аллергенами (туберкулином, кандидином, трихофитином, стрептококковым антигеном и др.). Аллергия в стоматологии. Почти все пломбировочные материалы могут быть аллергенами и сенсибилизируют организм. Пломбировочные материалы, соединяясь с белками и попадая через пульпу во внутреннюю среду организма, могут вызвать аллергические реакции - ГНТ или ГЗТ. Эти реакции могут быть как общими как Квинке, анафилактический шок, так и местными стоматиты, хейлиты и другие быстротвердеющие пластмассы, соединяясь с белками, также сенсибилизируют организм. Наложение пародонтальных повязок, использование тетрациклинов и йодоформа при пломбировании корневого канала; мышьяковистая паста при пульпитах также может вызвать сенсибилизацию организма (Боровский Е.В., Леонтьев В.К., 2001). Характерные симптомы у этих больных жалобы на чувство жжения, отек в полости рта, приступы удушья. Аллергические реакции по механизму могут быть как ГНТ - отек Квинке, анафилактический шок, или ГЗТ - поражение тканей полости рта в виде стоматитов, глосситов, гингивитов и др. Из лекарственных веществ наиболее часто аллергические реакции вызывают антибиотики, чаще пенициллины, цефалоспорины, реже других групп, нестероидные противовоспалительные средства, йод и бромсодержащие препараты, местные анестетики. Эти препараты могут давать и перекрестные реакции. Например, при наличии аллергии к новокаину развивается перекрестная реакция к другим местным анестетикам - эфирам парааминобензойной кислоты как бензокаин, лидокаин, тримеклин и др. Принципы диагностики аллергических заболеваний. Диагностика направлена на выявление причин и факторов, способствующих формированию и манифестации аллергических заболеваний. Для этого 82 применяют специфические и неспецифические методы обследования. Начинают диагностику всегда с выяснения жалоб и сбора аллергологического анамнеза, особенности которых нередко позволяют предложить предварительный диагноз, изучения истории жизни и болезни, которые осуществляет врач во время осмотра пациента. Клинические методы обследования включают врачебный осмотр, клинико-лабораторные, рентгенологические, инструментальные, функциональные и другие методы исследования (по показаниям). Основной принцип специфической диагностики аллергических заболеваний — выявление причинно-значимого аллергена, для чего определяют аллергические антитела (специфические IgE) или аллергические заболевания 251сенсибилизированные лимфоциты и продукты специфического взаимодействия антигенов и антител. Специфическое аллергологическое обследование включает: • сбор аллергологического анамнеза; • проведение кожных тестов; • проведение провокационных тестов; • лабораторную диагностику. Занятие № 18 - 19 Тема: Методы исследования иммунного статуса. Первичные и вторичные иммунодефициты. Методы диагностики и коррекции иммунодефицитов. Цель занятия: Познакомиться с комплексом тестов, применяемых в клинической практике для оценки иммунного статуса организма. Изучить методы выявления и коррекции первичных и вторичных иммунодефицитов. Вопросы для обсуждения: 1. Что такое иммунный статус? 2. Сформулируйте основные подходы к оценке иммунной системы человека. 3. Тесты 1-го и 2-го уровня для оценки иммунного статуса. В чем их отличие? 4. Тесты 1-го уровня (перечислить). Что такое иммунограмма? 5. Иммунодефициты, Классификация первичных иммунодефицитов по механизму развития. 6. Вторичные иммунодефициты, основные факторы этиологии. 7. Принципы диагностики иммунодефицитов. 83 8. Принципы коррекции иммунодефицитов - первичных и вторичных иммунодефицитов. Самостоятельная работа студентов: 1. Составить перечень тестов 1-го уровня. 2. Записать нормальные показатели иммунитета у взрослого человека (иммунограмму). 3. Составить таблицу: «Классификация иммунодефицитов по механизму развития». 4. Разобрать иммунограммы больных с первичными иммунодефицитами (болезнь Брутона, синдром Ди Джорджи). 5. Разобрать и записать иммунограмму больных СПИДом. Методические указания к самостоятельной работе. Иммунный статус – комплекс количественных и функциональных показателей, отражающих конкретное состояние иммунной системы, определяемых с помощью стандартных общепринятых тестов. Различают тесты 1-го и 2-го уровня. Тесты 1-го уровня - ориентировочные, они просты в исполнении и информативны для выявления «грубых» дефектов в иммунной системе. Тесты 1-го уровня включают (по Хаитову Р.М., 2011 г.): • определение относительного и абсолютного числа лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови; классификация патологических процессов • определение основных субпопуляций лимфоцитов в крови: Т – клеток (CD 3+, CD 4+, CD 8+), В-клеток (CD 19+) и NK-клеток (CD16+); • определение содержания IgM, IgG и IgA в сыворотке крови; • определение функциональной активности фагоцитов; • анализ на ВИЧ-инфекцию. Результаты тестирования могут быть получены через 1—2 сут. Тесты 2-го уровня - аналитические, позволяющие провести углублённый анализ иммунной системы с выявлением уровня и выраженности иммунных нарушений. Тесты более трудоемкие, обладают высокой информативностью, могут быть проведены в специализированных иммунологических лабораториях. В основу углублённого анализа иммунной системы часто закладывается так называемый патогенетический подход, позволяющий оценить состояние ключевых этапов иммунного ответа: распознавания, активации, пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Тесты 2-го включают: • определение субпопуляций лимфоцитов и лейкоцитов; 84 • пролиферативные свойства лимфоцитов в культурах in vitro с митогенами или антигенами; • образование цитокинов в культуре клеток периферической крови in vitro; • активность катаболических ферментов фагоцитов; • наличие биологически активных медиаторов эозинофилов, тучных клеток в крови, мокроте или смывах со слизистых оболочек; • содержание белков острой фазы — МСЛ, СРВ; • образование белков системы комплемента; • наличие аутоантител; • при аллергических заболеваниях проводят определение общего и антигенспецифического IgE и дифференциально-диагностический анализ на аллергию; • проводят кожные пробы с аллергенами на ГНТ при аллергодиагностике; • ставят кожные пробы на ГЗТ на различные сенсибилизаторы. В таблице приведена иммунограмма в норме у взрослого человека. Таблица 18 Показатели иммунитета взрослого человека (иммунограмма) № п/п Показатели 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. количество лейкоцитов количество лимфоцитов CD 3+ (Тл) CD 4+ (Тх) CD 8+ (Тк) CD 4+/ CD 8+ CD 19+ NK Ig A Ig М Ig G ФАЛ ФЧ Наорма абс. 4300-9200 1200-3000 700-2100 300-1500 200-900 1,0-2,0 100-500 90-600 0,9-4,5 г/л 0,6-3,5 г/л 5,65-17,65 г/л 50-90% 4-15 85 % 17-41 55-83 28-60 10-40 6-20 7-31 - Нарушения иммунного статуса и способности к нормальному иммунному ответу на разные антигены называют иммунодефицитными состояниями (иммунодефицитами) Иммунодефициты – снижение количественных показателей или функциональной активности основных компонентов иммунной системы. Различают 2 вида иммунодефицитов: а) первичные (врожденные, наследственные), б) вторичные (приобретенные). • Первичные иммунодефициты — наследственные заболевания, обусловленные дефектами генов, контролирующих иммунный ответ: синдромы с дефицитом антител; синдромы с дефицитом Т-лимфоцитов; комбинированные Т- и В-клеточные иммунодефициты; синдромы с дефицитом компонентов комплемента; синдромы с дефектами NK-клеток; синдромы с дефектами фагоцитов; синдромы с дефектами молекул адгезии. Частота первичных иммунодефицитов от 1:10000 до 1:100000 новорожденных, некоторые из них, например, селективный иммунодефицит Ig A встречается чаше от 1:500 до 1:1500. По механизму развития различают следующие группы иммунодефицитов: 1-ая гр. – преимущественно гуморальные, В-клеточные; 2-ая гр. – преимущественно Т-клеточные; 3-я гр. – комбинированные, хотя при всех Т-клеточных иммунодефицитах страдает также и В – система клеток; 4-я гр. – иммунодефициты, обусловленные дефектами фагоцитоза; 5-я гр. - иммунодефициты, обусловленные дефектами комплемента. Примеры первичных иммунодефицитов по механизму развития представлены в таблице 19. Таблица 19 Классификация первичных иммунодефицитов Вид дефекта Вклеточная недостаточность (дефицит выработки антител) Тклеточная недостаточность Комбинированная Заболевание Сцепленная с агаммаглобулинемия (болезнь Брутона) Х-хромосомой Синдром Ди. Джорджи Синдром Незелофа Хронический кандидоз слизистых и кожи Тяжелый комбинированный иммунодефицит. 86 Ти Вклеточная недостаточность Патология фагоцитов Дефекты комплемента системы Синдром Вискотта-Олдрича. Синдром гипериммуноглобулинемии Е. Хронический гранулематоз. Синдром Чедиака-Хигаси. Дефициты отдельных компонентов комплемента. Дефицит ингибитора С 1 и тд. Определение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа. Фагоцитарное число – это среднее количество частиц или микроорганизмов в одном фагоците (норма для стафилококков 6-12, кандид – 2-4). Фагоцитарный индекс – это количество фагоцитов, участвующих в фагоцитозе, имеющих поглощенные частицы (норма – 60-80%). Оценка показателей через разные промежутки времени позволяет оценить динамику фагоцитоза. В норме через 90 мин фагоцитарный индекс должен быть ниже, чем через 45 мин и 60 мин, в связи с перевариванием микробов. При нарушении переваривания он не меняется. Переваривание микробов можно оценивать путем посева лизатов лейкоцитов (после инкубации с микробами) на питательные среды и подсчета выросших колоний. Метод предполагает использование в качестве объекта фагоцитоза живых микроорганизмов. После инкубирования с микробами фагоциты осаждают центрифугированием, отмывают и лизируют. Их лизаты высевают на твердую питательную среду. Переваривающую активность фагоцитов оценивают по числу выросших колоний. Метаболическую активность фагоцитов определяют в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) после окраски их 0.25% раствором данного красителя. В норме нитросиний тетразолий окрашивает (диффузно и в виде глыбок голубого цвета) 15-18% нейтрофилов, при инфекциях их число увеличивается до 40% и более. Показатели фагоцитов снижаются при соответствующих иммунодефицитах, а повышаются при благоприятном течении инфекции. • Вторичные иммунодефициты - вторичная иммунная недостаточность (ВИН) — дисфункции иммунной системы, вызванные тяжёлыми системными нарушениями иммунитета, возникшими в результате патогенных воздействий на организм. К таким воздействиям относят несколько факторов (табл. 20). 87 Таблица 20 Основные факторы этиологии ВИН (по Хаитову Р.М., 2011г.) Факторы Недостаточность питания Серьезные травмы, оперативные вмешательства, ожоги Длительные и хронические заболевания (диабет и др.) Облучение Злокачественные опухоли и их метастазы Химиопрепараты иммунодепрессанты) (включая Спленэктомия Старение Вирусные заболевания инфекционные Последствия Нарушение правильного созревания и функционирования лимфоцитов. Временные нарушения функций нейтрофилов т лимфоцитов. Сопровождаются нарушением защитных функций иммунной системы. Вызывает гибель пролиферирующих лимфоцитов и их предшественников. Сопровождаются снижением функций иммунной системы, нарушением дифференцировки всех клеток крови, включая лимфоциты. Приводит к нарушению функций лимфоцитов и подавлению их костномозговых предшественников. Приводит к нарушению процессов удаления патогенов, циркуляции и созревания Т-лимфоцитов. Сопровождается нарушениями во всех звеньях иммунной системы (тимус, селезенка, костный мозг, л/у). ВИЧ поражает СД 4+ Тх и ДК, приводя к нарушению функций клеточного иммунитета. Вирус кори подавляет клеточный иммунитет путем нарушения образования ИЛ-12. ЦМВ и вирус краснухи подавляет выработку АТ. Роль иммунодефицитных состояний в заболеваниях полости рта. Защита слизистой оболочки полости рта осуществляется в большей 88 степени иммуноглобулинами класса А, поэтому дефицит образования этого класса иммуноглобулинов представляет наибольший интерес для стоматологов. При дефектах Т- лимфоцитов больные подвергаются опасности поражения в первую очередь вирусными и грибковыми заболеваниями. Первыми признаками иммунодефицита часто является кандидозный стоматит (молочница) или тяжелое длительное течение герпетического стоматита. Врожденный дефект клеточного иммунитета с нарушением механизмов иммунорегуляции в результате преобладания Т-супрессоров может сочетаться с хроническим кожно-слизистым кандидозом ( хронический гранулемотозный кандидоз). Иммунодефицитные состояния могут быть либо причиной, либо следствием болезней гиперчувствительности или аутоиммунных заболеваний. Так, дефицит IgA способствует всасыванию через слизистую оболочку чужеродных антигенов, которые вызывают сенсибилизацию организма. Клиническими проявлениями иммунодефицитных состояний могут служить инфекции, вызванные условно - патогенными микроорганизмами, аутоиммунные заболевания, аллергические реакции, опухоли. В полости рта нередко проявляются заболевания микробной этиологии (стоматит, гингивостоматит и др.), которые являются следствием первичных и вторичных иммунодефицитных состояний. Так, у детей, страдающих иммунологической недостаточностью, слизистая оболочка рта часто поражается бактериями, вирусами или грибами в результате резкого снижения клеточной или гуморальной защиты. Такие осложнения наблюдаются у детей с первичными дефектами - врожденной дисплазией тимуса, приобретенным лимфогранулемотозом, лейкозами, избирательным дефицитом IgA, лизоцима или интерферона. Анологичные осложнения характерны для больных со вторичными иммунодефицитными состояниями, индуцированными медикаментозной терапией (глюкокортикостероидами и др.). В патогенезе кандидоза слизистой оболочки рта преобладают эндогенные причины. Главной из них являются вторичные, иммунодефицитные состояния, возникающие при диабете, лейкозах, хронических инфекциях (туберкулезе и других), в послеоперационном периоде. Все методы иммунодиагностики делятся на 2 группы: 1. Общие неспецифические методы, характеризующие состояние различных звеньев системы иммунитета: лимфоцитов, гранулоцитов, макрофагов, комплемента. Обычно их применяют для выявления дефекта в СИ, т.е. при иммунодефицитах. 89 2. Специфические методы, позволяющие выявить антитела, иммунные Т-лимфоциты, антигены в организме человека или антигены возбудителя во внешней среде. Эти методы используют для диагностики инфекций, аллергии, аутоиммунных заболеваний. Для диагностики иммунодефицитов у больного собирают анамнез и проводят общеклиническое обследование. Ведущее значение имеют лабораторные методы исследования. Важным показателем является формула крови – количество лейкоцитов разных типов: нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, моноцитов, лимфоцитов. Лейкоцитоз – увеличение общего количества лейкоцитов (более 9х109 /л) часто наблюдается при инфекциях; лейкопении – снижение их количества (менее 4 х109 /л) – при аутоаллергии; эозинофилия – увеличение количества (более 3%) эозинофилов при экзогенной аллергии и т.д. Однако этих данных обычно недостаточно и необходимо более детальное определение популяций, субпопуляций лейкоцитов и гуморальных факторов иммунитета. Иммунограмма – запись количественных показателей, отражающих состояние иммунной системы организма на данный период времени. Для различных «поломок» иммунной системы – иммунодефицитов характерны свои отличительные особенности иммунограмм. Например, агаммаглобулинемия с дефицитом В-клеток или Хсцепленная агаммаглобулинемия или болезнь Брутона. Болезнь Брутона составляет 90% всех агаммаглобулинемий, болеют в основном, мальчики. Дети страдают гнойными инфекциями, инфекциями верхних дыхательных путей. У них отмечаются пиодермии, артириты, септицемии. Их иммунограмма характеризуется отсутствием или резким снижением В-лимфоцитов, число Т-лимфоцитов в норме. Иммуноглобулины М и А отсутствуют, или их количество резко снижено. Резко снижено количество Ig G, их количество меньше 0,4-1,0 г/л. При синдроме Ди-Джорджи, характеризующимся гипоплазией или аплазией тимуса, вследствие поражения паращитовидной железы могут наблюдаться судороги. У этих больных наблюдаются аномалии развития лицевого скелета, могут быть различные пороки сердечно - сосудистой, дыхательной и других систем. Иммунограмма характеризуется значительным уменьшением Тклеток – СD 3+, СD 4+, СD 8+. Количество В-клеток и NK- в норме. Количество иммуноглобулинов в большинстве случаев в пределах нормы. Такие дети часто погибают от тяжелопротекающих инфекционных (грибковых, вирусных) заболеваний. 90 Иммунограмма при ВИЧ инфекции. ВИЧ преимущественно инфицирует СD 4+ Т-лимфоциты, а также ДК, моноциты, макрофаги и клетки микроглии мозга. При развитии ВИЧ- инфекции наблюдается значительное снижение Т-хелперов (СD 4+), возрастает количество цитотоксических Тлимфоцитов. В результате иммуно-регуляторный индекс (ИРИ) соотношение CD4+/ CD8+ уменьшается ниже 1,0. Кроме того у ВИЧинфицированных развивается поликлональная активация В-лимфоцитов, сопровождающаяся спонтанной секрецией плазматическими клетками иммуноглобулинов всех классов. Эти характерные изменения наблюдаются уже в стадии 2А-2В ВИЧ – инфекции и сохраняются в стадии 3-4Б. Для коррекции нарушенных звеньев иммунитета используют иммунотропную терапию. С лечебной целью используют как заместительную терапию, так и иммунорегуляторы, иммуностимуляторы и другие препараты для восстановления функций иммунной системы. С ними Вы ознакомитесь при изучении практического занятия №22. Занятие № 20-21 Тема: Аутоиммунные реакции и заболевания. Аутоантигены. Аутоантитела. Природа аутоиммунных заболеваний. Цель занятия: Изучить роль микроорганизмов как пусковых факторов аутоиммунитета. Вопросы для обсуждения: 1. Аутоиммунные заболевания. 2. Природа аутоантигенов, аутоантител и сенсибилизированных лимфоцитов, методы их выявления. 3. Аутоиммунитет, цитокины, воспаление. 4. CD5 В-клетки и аутоиммунитет. 5. Виды тканевых повреждений при аутоиммунной патологии. Самостоятельная работа студентов: 1. Составить таблицу «Основные формы аутоиммунных заболеваний» 2. Составить таблицу «Различия между органоспецифическими и системными аутоиммунными заболеваниями» Методические указания к самостоятельной работе 91 Аутоиммунные заболевания — это группа заболеваний, характеризующихся повреждением и разрушением органов и тканей организма под воздействием собственной иммунной системы. Механизм развития аутоиммунных заболеваний полностью не изучен. Очевидно, что аутоиммунные заболевания вызваны нарушением функции иммунной системы в целом или ее отдельных компонентов. Механизмы аутоиммунных болезней: Обходной путь толерантности Т-хелперов. Толерантность к аутоантигену часто связана с клональной делецией специфических Тлимфоцитов в присутствии полностью компетентных гаптенспецифических В-лимфоцитов. Однако толерантность может быть нарушена посредством одного из следующих механизмов: модификации молекулы или молекулярной мимикрии. Модификация молекулы. Если потенциально слабая аутоантигенная детерминанта (гаптен) связывается с новым носителем, то она может быть распознана нетолерантными Т-лимфоцитами как инородная. Кооперация видоизмененных гаптенов с гаптен-специфическими Влимфоцитами приводит к образованию аутоантител. Молекулярная мимикрия. Некоторые инфекционные агенты перекрестно реагируют с тканями человека. Образованное в результате антитело может повреждать ткани, имеющие перекрестно-реагирующие детерминанты. Поэтому ревматические заболевания сердца иногда развиваются вслед за стрептококковой инфекцией. В частности, доказано, что в развитии системной красной волчанки, миастении или диффузного токсического зоба, задействован супрессорный механизм. При этих заболеваниях наблюдается снижение функции этой группы лимфоцитов, которые в норме тормозят развитие иммунного ответа и предотвращают агрессию собственных тканей организма. При склеродермии наблюдается повышение функции Т-лимфоцитов помощников (Т-хелперы), что в свою очередь приводит к развитию избыточного иммунного ответа на собственные антигены организма. Не исключено, что в патогенезе некоторых аутоиммунных заболеваний задействованы оба эти механизма, равно как и другие типы нарушений функции иммунной системы. Функциональность иммунной системы во многом определяется наследственными факторами, поэтому многие аутоиммунные заболевания передаются из поколения в поколение. Возможно нарушение функции иммунной системы под действием внешних факторов, таких как инфекции, травмы, стресс. На данный 92 момент считается, что неблагоприятные внешние факторы, как таковые не способны вызвать развития аутоиммунного заболевания, а лишь повышают риск его развития у лиц с наследственной предрасположенностью к патологии этого типа. Классические аутоиммунные заболевания встречаются относительно редко. Гораздо чаще возникают аутоиммунные осложнения некоторых заболеваний. Присоединение аутоиммунного механизма может во многом утяжелить эволюцию заболевания и потому определяет прогноз болезни. Аутоиммунные реакции возникают, например, при ожогах, хронических ангинах, инфаркте миокарда, вирусных заболеваниях, травмах внутренних органов. Патогенез развития аутоиммунных реакции очень сложен и во многом не ясен. На данный момент достоверно известно, что некоторые органы и ткани человеческого организма развиваются в относительной изолированности от иммунной системы, поэтому в момент дифференцировки иммунных клеток, клоны способные атаковать эти типы тканей или органов не удаляются. Аутоиммунная агрессия наступает тогда, когда по каким-то причинам барьер, отделяющий эти ткани или органы от иммунной системы, разрушается, и они распознаются иммунными клетками как «чужеродные». Такое происходит с тканями глаза или яичка, которые могут подвергнуться аутоиммунной атаке во время различных воспалительных реакций (при воспалении тканевые барьеры нарушаются). Другим механизмом развития аутоиммунных болезней являются перекрестные иммунные реакции. Известно, что некоторые бактерии и вирусы, равно как и некоторые лекарства, по своей структуре схожи с некоторыми компонентами тканей человека. Во время инфекционного заболевания, вызванного данным типом бактерии или вируса, или во время приема определенного лекарства иммунная система начинает вырабатывать антитела, которые способны реагировать с нормальными тканями организма, компоненты которых схожи с антигенами, вызвавшими иммунную реакцию. Описанный выше механизм лежит в основе возникновения ревматизма (перекрестная реакция на антигены стрептококка), сахарного диабета (перекрестная реакция на антигены вируса Коксаки В и гепатита А), гемолитических анемий (перекрестная реакция на медикаменты). В ходе различных заболеваний ткани организма подвергаются частичной денатурации (изменению структуры), что наделяет их свойствами чужеродных структур. В таких случаях возможно возникновение аутоиммунных реакций, которые направлены против 93 здоровых тканей. Такой механизм характерен для повреждений кожи при ожогах, синдрома Дреслера (перикардит, плеврит) при инфаркте миокарда. В других случаях здоровые ткани организма становятся мишенью для собственной иммунной системы из-за присоединения к ним чужеродного антигена (например, при вирусном гепатите В). Еще одним механизмом аутоиммунного поражения здоровых тканей и органов является вовлечение их в аллергические реакции. Такое заболевание как гломерулонефрит (поражение клубочкового аппарата почек), развивается в результате осаждения в почках циркулирующих иммунных комплексов, которые образуются в ходе обычной ангины. Таблица 21 Различия между органоспецифическими и системными аутоиммунными заболеваниями Характеристика Механизмы срыва аутотолерантности Доступные концентрации аутоантигенов Органоспецифичность аутоантител Преобладающий тип иммунопатологии (по Coombs и Gell) Характерные сочетания клинических синдромов Органоспецифические заболевания Нарешение периферической аутотолерантности (воспаление, поликлональная стимуляция), дефицит регуляторных Т-клеток Системные заболевания Дефекты отрицательной селекции, стимуляция через рецепторы врожденного иммунитета и т.д. Низкие Обычно высокие Есть Нет IV III. Аутоиммунное воспаление органов Волчаночный синдром с гломерулонефритом, полиартрит 94 Экспериментальное моделирование Введение аутоантигена в полном адъюванте Фрейнда Линии животных соответствующими генетическими с Таблица 22 Основные формы аутоиммунных заболеваний Преобладающий тип иммунных механизмов Цитотоксический Т – клеточный Клеточный (Th17/Th1зависимый) Гуморальный (Th 2 – зависимый), связанный с аутоантителами Смешанный или точно не установленный тип Органоспецифические заболевания Системные заболевания Инсулинзависимый сахарный диабет, язвенный колит Тиреоидит Хашимото, рассеянный склероз, вульгарная пузырчатка, первичный билиарный цирроз Тяжелая миастения, токсический зоб (базедова болезнь), аутоиммунная гемолитическая и пернициозная анемии, идиопатическая, тромбоцитопеническая, пурпура Микседема, симпатическая офтальмия Нет 95 Ревматоидный артрит Системная красная волчанка, системная склеродермия Синдром Шегрена, дерматомиазит В обычных условиях функция системы иммунитета заключается в определении (распознавании) и ликвидации чужеродных структур, к которым относятся микроорганизмы, клетки опухолей, трансплантированные ткани, но в результате определенных нарушений собственные клетки начинают восприниматься ею как чужеродные. На данный момент используется классификация, согласно которой выделяется несколько групп различных аутоиммунных заболеваний по механизму их возникновения: ♦ заболевания, появляющиеся вследствие развития проницаемости сосудисто-тканевых барьеров и выхода антигенов из различных тканей организма (щитовидной железы, мозга, хрусталика и т. д.). Эти антигены вызывают развитие активного иммунного ответа с активацией Тлимфоцитов специфического класса и образованием антител; ♦ заболевания, прогрессирование которых определяется тканевыми собственными компонентами организма, претерпевшими определенные изменения под воздействием каких-нибудь внешних факторов (физических, химических, бактериальных, вирусных). При этом свойства собственных компонентов меняются до такой степени, что начинают восприниматься иммунной системой в качестве чужеродных; ♦ заболевания, возникающие в результате некоторого сходства собственных тканевых компонентов с внешними антигенами. В данном случае нормальная реакция иммунной системы, вызванная экзоантигеном, распространяется и на определенный вид собственной ткани организма; ♦ заболевания, в основе механизма развития которых лежат те или иные нарушения функции лимфоидной ткани, возникновение клеток, под воздействием которых происходит лизирование (разрушение) собственных тканей (подобные дисфункции в работе иммунной системы нередко генетически обусловлены); заболевания обусловленные индивидуальными особенностями организма; ♦ заболевания, генетически обусловленные и проявляющиеся под воздействием внешних факторов, в частности обширных травм, стрессов, некоторых химических веществ, излучения и т. д. Примеры аутоиммунных заболеваний • Тиреоидит Хашимото (сопровождается зобом). Аутоантиген — тиреоглобулин щитовидной железы. • Тиреотоксикоз (Базедова болезнь). Аутоантиген — мембранные рецепторы клеток для тиреотропного гормона. 96 • Тяжелая миастения. Аутоантиген — α-цепь ацетилхолинового рецептора. Инсулинозависимый сахарный диабет. Аутоантиген — декарбоксилаза глутаминовой кислоты - β-клеток поджелудочной железы. • Болезнь Чагаса — перекрестно-реагирующие антитела против антигенов трипаносом и антигенов сердечной мышцы. • Рассеянный склероз. Антиген — основной белок миелина. • Ревматоидный артрит. Аутоантигены — ядерный антиген RANA, белки гистосовместимости II класса, коллаген, ревматоидный фактор. • Системная красная волчанка. Аутоантиген — ДНК, гистоны, кардиолипин. Аутоиммунные заболевания в стоматологии. Наиболее часто в стоматологической практике встречаются такие аутоиммунные заболевания как болезнь Бехчета, болезнь Шегрена и др. Болезнь Бехчета характеризуется триадой симптомов: поражения полости рта (стоматит), глаз в виде конъюнктивита или увеита, воспалительный процесс урогенитальной сферы с изъязвлениями. В полости рта образуются аорты, язвы с рубцеванием. В крови обнаруживаются антитела к эпителию слизистой рта. Болезнь Шегрена - характеризуется лимфоидной инфильтрацией слюнных желез с последующей атрофией. Основной симптом сухость слизистой полости рта и глаз. При болезни Шегрена появляются аутоантитела к ткани слюнных желез. Аутоиммунные реакции могут быть вызваны несколькими причинами: какое-то вещество, которое содержится только в изолированной части организма (и поэтому скрыто от иммунной системы), попадает в общий кровоток. Например, жидкость в глазном яблоке в норме содержится только внутри глаза. Если в результате травмы глаза она выделяется в кровь, иммунная система может среагировать на нее; изменяется состав вещества, содержащегося в организме. Например, вирусы, лекарства, солнечный свет или радиация могут изменить структуру определенного белка, и он начнет казаться иммунной системе чужеродным; иммунная система реагирует на чужеродное вещество, которое похоже по строению на какое-либо вещество организма, а после этого начинает воспринимать свое вещество как чужое; один из механизмов, контролирующих выработку антител, функционирует неправильно. 97 Например, злокачественные В-лимфоциты могут вырабатывать патологические антитела, которые атакуют собственные эритроциты человека. Проявления аутоиммунной реакции бывают разными. Обычно при этом повышается температура тела, повреждаются различные ткани, например кровеносные сосуды, хрящи, кожа. Иммунная система способна атаковать практически любой орган, в том числе почки, легкие, сердце и мозг. Развивающееся воспаление и повреждение тканей может вызывать почечную недостаточность, нарушения дыхания и сердечной функции, боль, деформацию суставов, бред и даже быть причиной смерти. Аутоиммунные болезни — это группа заболеваний, в основе которых лежит развитие иммунных реакций на собственные ткани организма (аутоаллергия). Причины возникновения. Наиболее частой причиной аутоиммунных болезней являются инфекции (бактериальные, вирусные) и прием лекарственных препаратов. Так, установлено, что инсулинзависимый I тип сахарного диабета у детей может развиться после инфекций, возбудителями которых являются вирусы Коксаки B, паротита, гепатита A; ревматизм вызывается стрептококковой инфекцией; аутоиммунные болезни могут развиться после кори или герпеса. Описаны лекарственные аутоиммунные болезни, например, лекарственная аутоиммунная гемолитическая анемия и др. Однако это не означает, что аутоиммунные болезни обязательно развиваются после указанных инфекций или после приема лекарств. Для их возникновения необходимы определенные условия, в частности, генетические нарушения иммунных механизмов. Так, ряд аутоиммунных болезней сочетается с наличием или отсутствием того или иного антигена гистосовместимости. Например, при ревматоидном артрите часто выявляется DR4-антиген, при системной красной волчанке — DR2- и DR3-антигены. Диагностика. Диагноз ставится на основе клинической картины и данных лабораторных показателей. Снижается количество Tлимфоцитов, соотношение хелперы-супрессоры сдвигается в сторону уменьшения супрессорной активности, ослабляется реакция на митогены в культуре. Более информативны такие серологические показатели, как выявление циркулирующих антител, иммуноглобулинов, иммунных комплексов, криоглобулинов и комплемента. Небольшое увеличение циркулирующих аутоантител и иммунных комплексов при отсутствии 98 клинических симптомов расценивается как фактор риска. При аутоиммунных болезнях их содержание и продолжительность циркуляции значительно увеличены, и эти показатели вместе с показателями криоглобулинов могут использоваться для оценки активности воспаления и прогноза заболевания. Показатели комплемента снижены. Лечение. Главным образом патогенетическое (лечение, направленное на устранение причины) и симптоматическое (лечение проявлений заболевания), в значительной степени определяется видом и стадией заболевания. В иммунологической стадии используются гормоны вилочковой железы, иммуномодуляторы. Применяются препараты, угнетающие протеолиз (контрикал, гордокс). Широко используются кортикостероиды и особенно нестероидные противовоспалительные препараты. Полезны мероприятия, направленные на уменьшение образования аутоантигенов (ликвидация очагов хронических воспалений, стимуляция регенераторных процессов). При аутоиммунных реакциях развивается иммунная реакция против собственных антигенов. Различают три основных признака аутоиммунных заболеваний: 1) наличие аутоиммунной реакции; 2) наличие клинических и экспериментальных данных о первичном патогенетическом значении такой реакции; 3) отсутствие иных определенных причин болезни. Занятие № 22-23 Тема: Принципы иммунотропной терапии. Иммунопрофилактика, иммунотерапия. Цель занятия: Изучить основы специфической профилактики и специфической терапии инфекционных заболеваний. Вопросы для обсуждения: 1. Иммунотропная терапия. Принципы специфической терапии. 2.Иммунопрофилактика. Критерии и основы специфической профилактики. 3. Специфические методы профилактики и терапии инфекционных заболеваний. 4. Вакцины: живые, убитые, химические, анатоксин. Принципы получения. Разработка вакцин нового типа. 5.Вакцинопрофилактика. Календарь прививок у детей. Критерии оценки поствакцинального иммунитета. 6. Вакцинотерапия. Аутовакцина. 99 7.Иммунные сыворотки: лечебно-профилактические сыворотки и глобулины (получение, применение, осложнения). 8. Иммунные сыворотки: диагностические сыворотки: получение и их применение для сероидентификации микроорганизмов (агглютинирующие, преципитирующие, антитоксические, гемолитические, противовирусные, люминесцирующие). 9. Диагностикумы: получение и применение для серодиагностики инфекционных заболеваний. Самостоятельная работа студентов: 1. Составить таблицу иммунотропных (иммуномодуляторы, стимуляторы) препаратов. 2. Составить таблицу иммуносупрессантных (иммунодепрессанты) препаратов. 3. Составить таблицу вакцин. 4. Календарь прививок. Методические указания к самостоятельной работе Включение в комплекс лечения препаратов химической или биологической природы, обладающих иммунотропной активностью, с профилактической или терапевтической целью называется иммунотерапией. Иммунокоррекция– это исправление дефектного функционирования иммунной системы, т.е. активное вмешательство с целью стимуляции или супрессии всей системы или отдельных ее звеньев. Иммунопрофилактика – это воздействие на систему иммунитета с целью предупреждения первичных проявлений клинических признаков заболевания или начала рецидива при его хроническом течении. Иными словами, это иммунокоррекция лабораторных признаков дисфункции иммунной системы, выявляемых при профилактических осмотрах, при обследовании лиц с хроническими заболеваниями вне их обострения. Различают специфическую и неспецифическую иммунотерапию и иммунопрофилактику. Неспецифическое воздействие на функцию иммунной системы включает факторы, неспецифичные по отношению к возбудителю (антигену) патологического процесса. Специфическое воздействие обусловлено применением препаратов антигенов (аллергенов) или антител, специфичных к возбудителю (антигену, аллергену) болезни. Кроме того, различают активную иммунотерапию (или иммунопрофилактику), когда система иммунитета активно отвечает на введенный препарат (обычно на антигены, вакцины), и пассивную, когда в организм вводят готовые защитные иммуноглобулины. 100 В зависимости от механизма (или характера) воздействия на иммунную систему выделяют два вида иммунотерапии и иммунопрофилактики: стимулирующий и супрессирующий. Иммуностимуляция – это повышение иммунологической защиты организма. Иммуносупрессия – ослабление патологического иммунного ответа иммунодепрессантами или ионизирующим облучением. В клинической иммунологии существует еще ряд терминов, таких как иммуномодуляция, иммунопотенцирование, иммуноадаптация. Иммуномодуляция – меры по достижению сбалансированного иммунного ответа путем его стимуляции или супрессии с помощью различных воздействий на иммунную систему. Иммуномодуляторами называются препараты, влияющие на иммунную систему, и изменяющие ее работу. Иммуномодуляторы можно разделить на 2 группы: 1.Иммуностимуляторы – стимулируют иммунные реакции, повышают иммунитет. 2.Иммуносупрессанты – понижают иммунитет. Таким образом,любой иммуностимулятор относится к иммуномодуляторам, но не каждый иммуномодулятор является иммуностимулятором. Иммуномодуляторы применяются в основном для повышения защитных сил организма при различных заболеваниях: хронические, вялотекущие инфекции; аллергические заболевания; опухоли; состояния иммунодефицита. Но в некоторых случаях (при аутоиммунных заболеваниях, когда иммунитет начинает работать не против "внешних врагов", а против собственного организма), иммуномодуляторы используются для снижения иммунитета. Лечение иммуномодуляторами – не совсем правильный термин. Эти препараты не излечивают болезнь - они лишь помогают организму побороть ее. Действие иммуномодуляторов на организм человека не ограничивается периодом болезни - оно продолжается длительно, годами. Классификация иммуномодуляторов Существует несколько классификаций иммуномодуляторов. Согласно одной из них, все эти препараты разделяются на три группы: 1. Эндогенные (синтезируются в самом организме). Представитель этой группы – интерферон. 2.Экзогенные (попадают в организм из окружающей среды): 101 бактериальные: Бронхомунал, ИРС-19, Рибомунил, Имудон; растительные: Иммунал, "Эхинацея ликвидум", "Эхинацея композитум СН", "Эхинацея ВИЛАР". 3.Синтетические препараты (представители:Левамизол, Полиоксидоний, Глутоксим, Галавит, Полудан и др.). Другая классификация делит иммуномодуляторы на поколения, в соответствии с хронологическим порядком их создания: I. Препараты I поколения (созданы в 50-х годах XX века): вакцина БЦЖ, Пирогенал, Продигиозан. II.Препараты II поколения (созданы в 70-х годах XX века): Рибомунил, Бронхомунал, Бронхо-Ваксом, Ликопид, ИРС-19. III. Препараты III поколения (созданы в 90-х годах XX века): к этой группе относятся наиболее современные иммуномодуляторы – Кагоцел, Полиоксидоний, Гепон, Майфортик, Иммуномакс, Селлсепт, Сандиммун, Трансфер Фактор и др. Все эти препараты, кроме Трансфер Фактора, имеют узконаправленное применение, и пользоваться ими можно только по назначению врача. Неспецифические иммуномодуляторы и иммунодепрессанты. Ряд препаратов биологического, химического происхождения, а также физические факторы используются для неспецифической стимуляции иммунитета. I.Препараты бактериального и грибкового происхождения: вакцины (например, БЦЖ применяют для лечения рака), рибомунил, бронхомунал, пирогенал, продигиозан (липополисахариды бактерий); грибкового – нуклеинат натрия (дрожжевые нуклеиновые кислоты). Они стимулируют макрофаги, гранулоциты и лимфоциты. II.Препараты животного происхождения: тактивин, тималин (пептиды тимуса животных) стимулируют преимущественно Т- лимфоциты, миелопид (пептиды костного мозга) избирательно стимулирует Влимфоциты, синтез ими антител. III.Препараты растительного происхождения: экстракты и настойки эхинацеи, женьшеня, золотого корня, элеутерококка и других растений обладают иммуностимулирующим эффектом. IV.Природные, синтетические, генно-инженерные препараты: микроэлементы и витамины, особенно при их недостатке в организме, компенсируют возникшие при этом иммунодефициты. Мумие – комплекс микроэлементов и других природных веществ, стимулирует регенерацию тканей и иммунитет. Левамизол (декарис) – противогельминтный препарат, а также диуцифон (противолепрозный) стимулируют Т-лимфоциты и другие 102 показатели иммунитета. Дибазол, тимоген (дипептид), ликопид, полиоксидоний также оказывают благоприятное воздействие на показатели иммунитета. Интерфероны. Для профилактики и лечения вирусных инфекций используют генно-инженерные, рекомбинантные - интерфероны (реаферон, интрон А) и гамма-интерфероны. Интерфероны индуцируют в клетках синтез протеинкиназ и эндонуклеаз, блокирующих синтез вирусных белков и расщепляющих вирусную иРНК. Одновременно они являются иммуномодуляторами – активируют фагоциты, ЕК, но могут угнетать синтез антител, подавлять пролиферацию опухолевых клеток. Интерфероногены – вещества индуцирующие синтез интерферонов в организме, оказывают сходный с интерфероном эффект. Это липополисахариды, полианионы, двунитчатые РНК и др. Цитокины и интерлейкины получают генно-инженерными методами и используют для иммунотерапии. Например, ИЛ-3 применяют для лечения анемий и лейкопений, ИЛ-2 – для лечения опухолей. Физические факторы обладают иммуномодулирующими свойствами.При низких дозах лучевая и волновая энергия (ультрафиолетовые лучи, лазерное излучение, ультразвук, коротковолновые и магнитные воздействия и др.) стимулируют иммунитет, тогда как при высоких дозах (особенно рентгеновское и гамма-излучение) – угнетают его. Иммунодепрессанты – вещества, угнетающие иммунные реакции. Используются для подавления посттрансплантационных реакций для лечения аутоиммунных и аллергических заболеваний. С этой целью часто применяют глюкокортикостероиды – синтетические гормоны коры надпочечников, относительно нетоксичные препараты, подавляющие воспаление (гидрокортизон, преднизолон, метилпреднизолон и др.). Наиболее сильные иммунодепрессивные эффекты оказывают иммунотоксины: пестициды, гербициды, фосфорорганические соединения, соли тяжелых металлов, токсические радикалы. Лекарства и медикаменты в зависимости от свойств могут оказывать иммунодепрессивное и аллергенное действие. Вещества биологического происхождения чаще индуцируют реакции повышенного типа – аллергические и аутоаллергические. Все иммунотропные вещества вызывают транзиторные иммуномодуляции, особенно у генетически предрасположенных людей. 103 При дополнительных воздействиях антигенов они могут стать стойкими и привести к развитию иммунопатологии. Цитостатики различных групп – метотрексат, азотиоприн (имуран), циклофосфамид и другие подавляют синтез нуклеиновых кислот в клетках СИ и, в итоге, иммунный ответ. Применяются при аллотрансплантации органов и для лечения аутоиммунных заболеваний. Однако они высокотоксичны, угнетают кроветворение, функции почек и печени. Циклоспорин А и FK-506 (такролимус) более эффективны и менее токсичны, избирательно угнетают пролиферацию Тлимфоцитов, преимущественно Т-хелперов, а также синтез ими ИЛ-2. Термин «вакцина» произошел от французского vacca – корова. Его ввел Л.Пастер в честь Дженнера, применившего вирус коровьей оспы для иммунизации людей против натуральной оспы человека. Вакцины используют для активной специфической профилактики и для лечения инфекционных болезней. Вакцины должны обладать высокой иммуногенностью (обеспечивать надежную противоинфекционную защиту), ареактивностью (не давать выраженных побочных реакций), безвредностью для макроорганизма и минимальным сенсибилизирующим действием. По назначению вакцины делятся на: 1. профилактические; 2. лечебные. По характеру микроорганизмов, из которых они созданы, вакцины бывают бактериальные, вирусные, риккетсиозные. Все вакцины можно подразделить на живые и инактивированные. 1.Среди инактивированных вакцин различают: Корпускулярные (цельновирионные) вакцины представляют собой бактерии и вирусы, инактивированные путем химического (формалин, спирт, фенол) или физического (тепло, ультрафиолетовое облучение) воздействия. Для приготовления корпускулярных вакцин используют,как правило, вирулентные штаммы микроорганизмов, поскольку они обладают наиболее полным набором антигенов. Примерами корпускулярных вакцин являются: коклюшная (компонент АКДС и Тетракок), антирабическая, лептоспирозная, гриппозные цельновирионные инактивированные вакцины против клещевого и японского энцефалита, против гепатита А (Аваксим), инактивированная полиовакцина (Имовакс Полио или как компонент вакцины Тетракок). Помимо цельновирионных, в практике используют также расщепленные, 104 или дезинтегрированные, препараты (сплит-вакцины), в которых структурные компоненты вириона разъединены с помощью детергентов. Химические вакцины создаются из антигенных компонентов, извлеченных из микробной клетки, с использованием различных физикохимических методик. Выделяют те антигены, которые определяют иммуногенные характеристики микроорганизма. К таким вакцинам относятся: полисахаридные вакцины (менингококковые групп А и С, вакцина против гемофильной инфекции типа b (Акт-ХИБ), пневмококковая, вакцина брюшнотифозная, представленная Viантигеном), ацеллюлярные коклюшные вакцины. К этой же категории могут быть отнесены субъединичные вирусные вакцины, содержащие отдельные структурные компоненты вируса, например субъединичная гриппозная вакцина, состоящая из гемагглютинина и нейроминидазы. Важная отличительная особенность химических вакцин – их низкая реактогенность. Рекомбинантные вакцины. Примером таких вакцин может служить вакцина против вирусного гепатита В (Эувакс В и др.). Для производства этих препаратов применяют рекомбинантную технологию. Участок гена вируса гепатита В, кодирующий синтез поверхностного антигена вируса гепатита В (HbsAg), встраивают в ДНК дрожжевых клеток, которые размножаясь, осуществляют продукцию данного антигена. Белок HbsAg выделяют из дрожжевых клеток путем разрушения последних и подвергают очистке с помощью физических и химических методов. В результате последней полученный препарат HbsAg полностью освобождаются от дрожжевой ДНК и содержит лишь следовое количество белка дрожжей. Инактивированные вакцины выпускают как в сухом (лиофилизированном), так и в жидком виде. Последние, как правило, содержат консервант. Для создания полноценного иммунитета обычно необходимо двукратное или трехкратное введение инактивированных вакцин. Анатоксины представляют собой бактериальные экзотоксины, обезвреженные воздействием формалина при повышенной температуре с последующей очисткой и концентрацией. Подобная технология получения анатоксинов, сохраняя антигенные и иммуногенные свойства токсинов, делает невозможной реверсию их токсичности. Анатоксины сорбируют на различных минеральных адсорбентах, например на гидроокиси алюминия. Адсорбция значительно повышает иммуногенную активность анатоксинов. Это связано как с созданием 105 «депо» препарата в месте введения, обеспечивающим постепенное поступление антигена в систему циркуляции, так и с адъювантным действием сорбента, вызывающего местное воспаление, усиление плазмоцитарной реакции в регионарных лимфатических узлах. Для достижения напряженного антитоксического иммунитета требуются, как правило, двукратное введение препаратов и последующая ревакцинация. При этом их профилактическая эффективность достигает 95-100% и сохраняется в течение нескольких лет. Анатоксины обеспечивают развитие стойкой иммунологической памяти, этим и объясняется возможность применения анатоксинов для экстренной профилактики дифтерии и столбняка. Также анатоксины применяют для активной профилактики газовой гангрены, ботулизма, стафилококковой инфекции. 2. Живые вакцины изготовляются на основе ослабленных (аттенуированных) штаммов микроорганизма со стойко закрепленной авирулентностью (безвредностью). Вакцинный штамм, лишенный способности вызывать инфекционный процесс, может размножаться в организме привитого и вызывать вакцинальную реакцию. И хотя у большинства привитых вакцинальная инфекция протекает без выраженных клинических симптомов, тем не менее, она приводит к формированию стойкого иммунитета. Примером живых вакцин могут служить вакцины для профилактики краснухи (Рудивакс), кори (Рувакс), эпидемического паротита (Имовакс Орейон), полиомиелита (Полио Сэбин Веро), туберкулеза, гриппа (аллантоисная интраназальная). Живые вакцины, за исключением полиомиелитной, выпускаются в лиофилизированном (порошкообразном) виде, что обеспечивает их стабильность в течение относительно длительного срока. Состав. Кроме основного действующего начала в состав вакцин могут входить и другие компоненты – сорбент, консервант, наполнитель, стабилизатор и неспецифические примеси. К последним могут быть отнесены белки субстрата культивирования вирусных вакцин, следовое количество антибиотика и белка сыворотки животных, используемых в ряде случаев при культивировании клеточных культур. Консерванты входят в состав вакцин, производимых во всем мире. Их назначение состоит в обеспечении стерильности препаратов в тех случаях, когда возникают условия для бактериальной контаминации (появление микротрещин при транспортировке, хранение вскрытой первичной многодозной упаковки). Указание о необходимости наличия 106 консервантов содержится в рекомендациях ВОЗ. В качестве консерванта обычно используется мертиолат (тиомерсал). О минеральных сорбентах, обладающих адъювантными свойствами, было сказано выше. В России с этой целью применяют гидроокись алюминия, а за рубежом – алюминия фосфат. К числу других стимуляторов антителогенеза можно отнести препарат полиоксидоний, который входит в состав отечественной инактивированной тривалентной гриппозной полимер субъединичной вакцины Гриппол. Что касается веществ, используемых в качестве стабилизаторов и наполнителей, то в производстве вакцин используются те из них, которые допущены для введения в организм человека. Таблица 25 107 Календарь прививок Требования, предъявляемые к бактерийным препаратам Бактерийные препараты могут выпускаться в ампулах и флаконах различной емкости. На каждой ампуле (флаконе) должна быть наклеена этикетка со следующими обозначениями: наименование и местонахождение учреждения, где был изготовлен препарат; название препарата; количество препарата; если препарат поливалентный, то его состав; номер серии; номер и дата государственного контроля; срок годности или дата его изготовления. Препараты без этикеток или с неполными сведениями на этикетках непригодны к употреблению. Список иммунобиологических препаратов 108 1.Вакцина БЦЖ. 2.Коревая вакцина 3.Коклюшная вакцина 4.Стафилококковая вакцина 5.Дизентерийная вакцина 6. Гоновакцина 7.Дифтерийный анатоксин 8.Столбнячный анатоксин. 9.АДС 10.Секстаанатоксин 11.АКДС. 12.Противодифтерийная сыворотка 13.Противостолбнячная сыворотка 14.Антирабический гамма-глобулин 15.Агглютинирующая коли-ОВ сыворотка 16. Комплемент сухой 17. Гемолитическая сыворотка 18. Гриппозная диагностическая сыворотка тип А2 19. Люминесцирующая сыворотка для прямого метода. 20. Люминесцирующая сыворотка для непрямого метода. 21.Диагностикум из шигелл Зонне 22.Сальмонелезный О-диагностикум 23.Эритроцитарный диагностикум из шигелл Зонне 24.Эритроцитарный сыпнотифозный диагностикум 25.Стафилококковый бактериофаг 26.Брюшнотифозный бактериофаг диагностический 27.Холерный монофаг С 28.Монофаг Эль-Тор 29.Туберкулин 30.Стрептококковый аллерген 31. Лактобактерин 32.Бифидумбактерин 33.Бификол 34.Бифилакт 35.Колибактерин 36.Вианвак 37.HAVRIXTH A, культуральная, инактивированная - 1,0 в/м 38.МMR-II 39.EngerixTH –В Занятие № 24 109 Итоговое занятие по темам 13-23. 1.Тестовый контроль. 2.Разбор типовых и ситуационных задач по серологической диагностике инфекционных болезней. Методические указания: Каждый студент отвечает на два теоретических вопроса и разбирает типовую или ситуационную задачу. Тесты 1.К периферическим органам иммунной системы относятся: А.Вилочковая железа Б.Костный мозг В.Селезенка+ Г.Кровь+ Д.Лимфатические узлы+ 2.При фагоцитозе бактерии внутриклеточныйкиллинг обеспечивают: А.Антитела Б.Комплемент В.Интерферон Г.Метаболиты кислорода Д. Гидролазы лизосом+ 3.Экзотоксины: А.Обязательный продукт патогенных бактерий, грибов, вирусов Б.Являются липополисахаридами В.Являются липидами Г. Выделяются при распаде микробной клетки Д. Выделяются из живой микробной клетки в окружающую среду+ 4. Лимфопоэз осуществляется в: А. Селезенке Б. Лимфоузлах В. Костном мозге Г. Крови Д. Аппендиксе 5.К гуморальным факторам неспецифической защиты от бактерий относятся: А.Гамма-интерферон Б.Секреторные иммуноглобулины класса A В.Комплемент+ Г.Антитоксины Д. Т- лимфоциты 6. Альтернативный путь активации комплемента отличается от классического тем, что: 110 А. Активатором является комплекс антиген-антитело Б. Активатором является только антитело В. Активатором служит липополисахарид бактериальной стенки+ Г. Необходимо участие лизоцима Д. Необходимо участие интерлейкина – 1 7.В активации комплемента по классическому пути участвуют антитела класса: А. IgМиIgG+ Б. IgA секреторный В. IgA сывороточный Г. IgE Д. IgD 8. Для профилактики туберкулеза применяют: А. Живую вакцину+ Б. Генно-инженерную вакцину В. Туберкулин Г. Противотуберкулезную сыворотку Д. Гамма – глобулин 9.Для плановой профилактики кори используют: А. Живую вакцину+ Б. Убитую вакцину В. Противокоревой гамма-глобулин Г. Химическую вакцину Д. Интерферон 10.Для плановой профилактики паротита у детей используют: А.Анатоксин Б. Химическую вакцину В. Убитую вакцину Г. Живую вакцину+ Д. Субъединичную вирионную вакцину 11.Полиомиелитная вакцина используется для: А.Экстренной специфической профилактики Б.Плановой специфической профилактики+ В.Неспецифической профилактики Г.Лечения Д.Пассивной иммунизации 12.Ученый, первый разработавший метод аттенуации для получения живых вакцин, это: А. Р. Кох 111 Б. Э. Дженнер В. Л. Пастер+ Г. И.И. Мечников 13.Антитоксический иммунитет вырабатывается в организме при: А. Брюшном тифе Б. Дифтерии+ В. Гриппе Г. Кори 14. Пассивный антитоксический иммунитет развивается при введении в организм следующих препаратов: А. Бифидумбактерина Б. Противодифтерийной сыворотки+ В. АДС-М Г. Вакцины менингококковой полисахаридной групп А и С 15. Выберите из перечисленных вакцинных препаратов препарат, относящийся к группе лечебных вакцин: А. АКДС Б. БЦЖ В. Гонококковая вакцина+ Г. Гриппозная вакцина Д. Сибиреязвенная вакцина 16. Вакцина БЦЖ относится к типу: А. Инактивированных корпускулярных Б. Химических В. Синтетических Г. Живых аттенуированных+ Д. Генно-инженерных 17. Вакцина против гепатита В представляет собой: А. Генно-инженерную дрожжевую вакцину + Б. Инактивированную культуральную вакцину В. Сплит-вакцину Г. Живую культуральную вакцину Д. Субъединичную вакцину 18. Какие препараты используются для активной иммунизации: А. Менингококковая вакцина+ Б. БактериофагВ. Противодифтерийная сыворотка Г. Интерферон Д. Иммуноглобулин человека нормальный 19. Обязательная плановая вакцинация проводится для профилактики: А. Ботулизма 112 Б. Холеры В. Брюшного тифа Г. Дизентерии Д. Туберкулёза+ 20. Первичные иммунодефициты развиваются в результате: А. Генетических нарушений+ Б. Воздействия радиации В. Антибиотикотерапии Г. Действия инфекционных факторов Д. Глюкокортикоидной терапии 21. Реинфекция: А. Повторное заражение бактериями другого вида Б. Повторное заражение тем же возбудителем+ В. Возникает при заболеваниях со стойким иммунитетом Г. Возможна за счет нормальной микрофлоры Д. Заражение бактериями, выделяющими эндотоксин 22. К аллергическим реакциям немедленного типа относятся: А. Анафилактический шок+ Б. Феномен Артюса В. Аллергические состояния при инфекционных заболеваниях Г. Кожная реакция на туберкулин Д. Реакция отторжения гомотрансплантата 23.К неспецифическим гуморальным факторам иммунитета относятся: А.Агглютинины. Б. Комплемент+ В. Преципитины Г.Лактамы Д. Бактериолизины. 24.Анатоксины: А.Продукт жизнедеятельности вирулентных бактерий. Б.Используются как вакцины+ В. Вызывают пассивный антитоксический иммунитет. Г.Участвуют в реакции агглютинации. Д.Получают из эндотоксина. 25.Анатоксины: А.Получают из микробных эндотоксинов. Б.Являются липидами В.Выделяются после разрушения микробной клетки Г.Вызывают антимикробный иммунитет Д. Создают антитоксический иммунитет+ 113 26. Центральными органами иммунной системы являются: А. Тимус+ Б. Лимфоузлы В. Щитовидная железа Г. Гипофиз Д. Селезенка 27. В тимусе происходит: А. Антителообразование Б. Формирование В-лимфоцитов В. Созревание СД4 и СД8 Т- клеток (Т-лимфоцитов)+ Г. Развитие тучных клеток Д. Образование интерферона 28. Клеточный иммунитет- это: А.Количество Т и В-лимфоцитов Б.Количество естественных Т-киллеров (NK-клетки) В.Фагоцитоз Г.Антителообразование Д. Отторжение чужеродного трансплантата+ 29. Клеточные факторы неспецифической (естественной) резистентности: А. Фагоцитоз+ Б. Комплемент В. В-лимфоциты Г. β – лизины Д. Т- хелперы 30. Естественные киллеры (NK-клетки) выполнят функцию: А. Фагоцитоза Б. Антителообразования В. Распознавания опухолевых клеток+ Г. Представления (презентацию) антигена Д. Воспалительную реакцию 31. Антитела вырабатывают: А. Базофилы Б. Плазматические клетки (плазмоциты)+ В. Т- лимфоциты Г.Тимоциты Д. Гепатоциты 32. Клетки, участвующие в представлении антигена Т- лимфоцитам: А.Плазматические клетки Б.Макрофаги+ 114 В.Тромбоциты Г.Тучные клетки Д. Т- киллеры 33.Для развития специфического иммунного ответа В- лимфоциты получают информацию от: А.Эритроцитов Б.Т- лимфоцитов+ В. Гепатоцитов Г. Базофилов Д. Остеоцитов 34. Образование антител происходит в: А.Лимфатических узлах+ Б. Коже В.Кровеносных сосудах Г.Костной ткани Д. Тимусе 35.Через плаценту от матери к плоду переходят: А.IgA Б.IgG+ В.IgM Г.IgD Д. IgE 36. Для получения агглютинирующих сывороток иммунизируют: А. Мышей Б. Морских свинок В. Кроликов+ Г. Баранов Д. Лошадей 37.Для специфической профилактики гонореи используют: А.Аутовакцину Б.Антитоксическую сыворотку В.Специфический иммуноглобулин Г.Анатоксин Д. Специфическая профилактика отсутствует+ 38. Для специфической профилактики коклюша применяется: А. Убитая вакцина+ Б. Бактериофаг В. Антибиотики Г. Живая вакцина Д. Анатоксин 115 39. Для лечения столбняка используют: А. Бактериофаги Б. Интерферон В. Антимикробную сыворотку Г. Антитоксическую сыворотку+ Д. Анатоксин 40. Для лечения ботулизма используют: А. Антимикробную сыворотку Б. Поливалентную антитоксическую сыворотку+ В. Аутовакцину Г. Анатоксин Д. Бактериофаги 41.Для специфической профилактики дифтерии используется: А. Живая вакцина Б. Убитая вакцина В. Химическая вакцина Г. Анатоксин+ Д. Антимикробная сыворотка 42. Специфическая терапия дифтерии производится: А. Анатоксином Б. Антитоксической сывороткой+ В. Бактериофагом Г. Антибиотиками Д. Экзотоксином 43. Особенности противовирусного иммунитета: А. Преобладание гиперчувствительности замедленного типа Б. Преобладание клеточных механизмов защиты. В. Завершенность фагоцитарной реакции. Г. Формирование воспаления в месте входных ворот. Д. Образование интерферона+ 44.Какому типу гиперчувствительности соответствует гемолитическая болезнь новорожденных, вызванная резус конфликтом? А.Атопическому или анафилактическому Б. Цитотоксическому+ В. Иммунокомплексному Г. Замедленному 45. Классический путь активации комплемента вызывается взаимодействием С1 фракции комплемента с А. Антигеном Б.Фактором В 116 В.Комплексом антиген- IgG+ Г.Бактериальным ЛПC 47. Положительный внутрикожный тест с туберкулином (аллергическая реакция замедленного типа) указывает на А.Гуморальный иммунный ответ Б.Клеточный иммунный ответ+ В.Одновременное участие Т и В лимфоцитов Г. Активность только В системы иммунитета 48.Во время созревания В лимфоцитов, первой синтезируется тяжелая цепь: А. µ+ Б. γ В. Ε Г. Α 49. Наиболее высокая концентрация иммуноглобулинов, находящихся в крови новорожденного это: А.IgG+ Б.Ig M В.Ig A Г.IgD Д.IgE 50.Функция макрофагов в гуморальном иммунном ответе заключается А. в продукции антител Б.в цитолизе вирус-инфицированных клеток В.в активации цитотоксических лимфоцитов Г. в процессинге и презентации антигена+ 51.К центральным органам иммунной системы относятся: А. Вилочковая железа + Б. Селезенка В. Костный мозг+ Г. Надпочечники и гипофиз 52. К гуморальным факторам неспецифической защиты организма относятся: А. Комплемент+ Б. Секреторные иммуноглобулины класса А В. Антитоксины Г. Пропердин+ Д. Лизоцим+ 53. К аллергическим реакциям немедленного типа относятся: 117 А. Цитотоксические реакции+ Б. Кожно-аллергические пробы В. Сывороточная болезнь+ Г. Анафилактический шок+ 54.Клетки, участвующие в презентации антигена Т-лимфоцитам: А.Дендритные клетки+ Б.Плазматические клетки В.Макрофаги+ Г.Тучные клетки Д. Тромбоциты 55. С целью оценки иммунного статуса определяют: А.Абсолютное число лимфоцитов в крови+ Б. Концентрацию иммуноглобулина М в сыворотке крови+ В. СОЭ Г. Фагоцитоз+ Д. Антигены группы АВ0 56. Плазмоциты осуществляют функцию: А. Фагоцитоз Б. Синтез антител+ В. Синтез гармонов Г. Синтез монокинов Д. Синтез комплемента 57. Гиперчувствительность немедленного типа обеспечивается: А. IgG Б. Ig A В. Ig E+ Г. Т-киллерами Д. IgM 58. МНС IIкласса синтезируются: А. Всеми бактериями Б. Только патогенами В. Только макрофагами и В-лимфоцитами+ Г. Только хламидиями Д. Вирусами 59.Антигенным дрейфом обладают: А. Антиганы лейкоцитов Б. Антигены эритроцитов В. Антиганы вируса гриппа+ Г. Антигены ВИЧ+ Д. Тканевые антигены 118 60. Валентность секреторногоIgA А. 2 Б. 4+ В. 6 Г. 8 Д. 10 Тестовые задания 2-го уровня 1.Компоненты реакции агглютинации: а) гемолитическая сыворотка, б) эритроциты барана, в) исследуемая сыворотка, г) физиологический раствор, д) комплемент. 2.На латинском языке сыворотка называется: ……………………….. 3.Для диагностики сифилиса используют реакцию: а) Видаля, б) Хеддльсона, в) Райта, г) Вассермана, д) Борде - Жангу. 4.Для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний используют следующую реакцию: а) ИФА, б) РСК, в) РИА, г) РИФ, д) РА. 5.Для диагностики хронической формы гонореи используют реакцию: а) Вассермана, в) БордеЖангу, в) Райта, г) Видаля, д) Манту. 6.В реакции связывания комплемента участвуют две системы: 1)……………………………….система и 2) ……………………система. 7.В РСК индикарной системой является: …………………… . 8.К серологическим реакциям относятся: а) Дика, б) Шика, в) Митчини, г) Манту, д) Видаля. 9.В ИФА меткой антигена или антитела является: а) фермент, б) сыворотка, в) эритроциты барана, г) радиоактивные изотопы. 10. Реакции, протекающие с укрупнением антигена: а) РСК, б) ПЦР, в) ИФА, г) РА, д) РИА. 11.Реакции, протекающие с нейтрализацией антигена: а) связывания комплемента, б) агглютинации, в) иммуноферментный анализ, г) радиоиммунологический анализ, д) полимеразно – цепная реакция, е) флоккуляции. 12. Реакции, протекающие с участием комплемента: а) РА, б) РСК, в) РПГА, г) гемолиза, д) бактериолиза. 13.Реакции, протекающие с участием фагоцитов: а) РА, б) РСК, в) ПЦР, г) РПГА, д) ОФР. 14. Реакции, протекающие с участием меченых антигенов или антител: а) РСК, б) РА, в) РПГА, г) ИФА, д) ПЦР. 15.Мелкозернистую О-агглютинацию дают бактерии, лишенные ………. 16. Крупно-хлопьевидный осадок характерен для бактерий имеющих …… 119 17. Для постановки РПГА используют…………….. 18. При положительном результате РПГА эритроциты выпадают в осадок в виде ………………., а при отрицательном в виде………………… 19. Расшифровать аббревиатуру слов – РПГА, ПЦР, РСК 20. Варианты постановки реакции преципитации (2). 21. Реакция Кумбса иначе называется……………… тест. Используют для определения ……………………… или ………… антител. 22.Неполные антитела………….валентны, поскольку они имеют……… 23. Реакция преципитации для определения сибиреязвенного антигена иначе называется реакция ………………… или …………….по ……….. 24.Реакция преципитации применяется в……….………медицине, в……..промышленности и в ………..для диагностики инфекционных заболеваний. 25. Реакция, протекающие с нейтрализацией антигена (4). 26. Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) является одним из вариантов реакции……………………… 27. При постановке реакции Вассермана используют осадочные реакции: Какие! 28.Современные иммуно…………………, иммуно………….иммунные методы отличаются от других реакций высокой……………и…………... 29. К простым реакциям относят: а) РСК, б) РА, в) ПЦР, г) ИФА, д) РИА. 30.Иммуноблотинг – метод идентификации антигена или антител с помощью соответствующих известных……………………….. 31. Для постановки РА (реакции агглютинации) необходимо иметь: а)……раствор, б) ………….ген, в)………..нин 32. Для приготовления…………антигена к взвеси агаровой культуры микробов добавляют 0,2% формалина (инкубация при 37ОС в течение 24 часов). 33.Для приготовления О - антигенна используют прогревание пробирки со смывом агаровой культуры в……………….в течение…………..часов. 34. Ориентировочную реакцию агглютинации ставят: а) в пробирке, б) на предметном стекле, в) во флаконе, г) в колбе. 35. Лизины способны проявить свое лизирующее действие на антиген только в присутствии: а) эритроцитов, б) интерферона, в) комплемента, г) лизоцима. 36. Реакция бактериолиза иначе называется «Феномен………..» 37. Иммунные сыворотки содержат ……………… к микробам или их токсинам. 120 38. Сыворотку от больного для постановки серологической реакции получают из: а) плазмы, б) лейкоцитов, в) крови, г) ликвора. 39. Групповую принадлежность крови определяют постановкой реакции: а) связывания комплемента, б) преципитации, в) агглютинации, г) ПЦР. 40.Реакция Кумбса применяется для определения: а) полных антител, б) комплемента, в) лизинов, г) неполных антител. 41. Ингредиенты реакции агглютинации для идентификации выделенной культуры: 1)…………….., 2)…………………, 3)……………….. 42.Для постановки РПГА необходимы: 1) сыворотка больного, 2) физиологический раствор, 3)………………………… 43. Ингредиенты реакции агглютинации для обнаружения антител в сыворотке больного: 1)…………….., 2)………………, 3)……………….. 44.ИФА иначе называется: а) РА, б) РЭМА, в) РСК, г) ПЦР. 45.Для метки специфических «антиген» или «антитело» используют: а) гиалуронидаза, б) фибринолизин, в) пероксидаза, г) плазмокоагулаза. 46.Реакции между антигенами и антителами invitro называются…………… реакции. 47. Серологическая реакция характеризуется ……………. и ………………. 48. Все серологические реакции можно разделить на 5 групп: Перечислить. 49. В серологических реакциях определяют главным образом иммуноглобулины (Jg) классов …………. и …………. 50. Варианты постановки реакции агглютинации: а) РСК, б) ПЦР, в) РПГА, г) реакция Кумбса, д) реакция Кунса. Ситуационные задачи Задача 1. У больного К. 35 лет в иммунограмме выявлены следующие изменения. 121 Вопросы: 1.Какое звено иммунитета нарушено по результатам представленной ПОКАЗАТЕЛЬ В НОРМЕ У ОБСЛЕДУЕМОГО СD3+лимфоциты в% 60-80 73 CD4+ лимфоциты в% 33-50 40 CD8+лимфоциты в% 16-39 29 CD16+лимфоциты в% 3-10 7 CD20+лимфоциты в% 6-23 21 Индекс CD4+/CD8+ 1,5-2,0 1,5 Фагоцитарная активность % 50-90 68 2-9 5 Фагоцитарное число Фагоцитарный резерв % 65 IgG, г/л 0,9-4,5 6,0 IgA, г/л 8-20 2 IgM, г/л 0,6-2,5 1,8 иммунограммы? 2.Какой иммунологический диагноз Вы поставите больному по изменениям в иммунограмме? 3.Какие иммуномодуляторы можно назначить больному для коррекции выявленных изменений? 4.Когда необходимо провести повторное иммунологическое обследование после иммунокоррекции? 5.Какие наиболее часто встречаемые жалобы предъявляет больной с диагнозом иммунологической недостаточности? Ответы: 1.Гуморальное звено иммунитета. 2.Гипоиммуноглобулинемия (снижение содержания IgA). 122 3.Рибомунил, Бронхомунал, ИРС-19, Ликопид. 4.Не раньше чем через 2 недели после окончания терапии. 5.Частые простудные заболевания, длительное течение инфекционных заболеваний,наличие заболеваний, вызванных условно-патогенной флорой, частые обострения любых хронических заболеваний. Задача № 2. У больного М.Т. 2 года, страдающего частыми простудными заболеваниями, рецидивирующей пиодермией. Получена следующая иммунограмма. Вопросы: 1.Какое звено иммунитета нарушено? 2.Какой иммунологический диагноз поставите больному? ПОКАЗАТЕЛЬ В НОРМЕ У ОБСЛЕДУЕМОГО СD3+лимфоциты в% 60-80 65 CD4+ лимфоциты в% 33-50 40 CD8+лимфоциты в% 16-39 30 CD16+лимфоциты в% 3-10 5 CD20+лимфоциты в% 6-23 20 Индекс CD4+/CD8+ 1,5-2,0 1,3 Фагоцитарная активность % 50-90 60 2-9 3 IgG, г/л 0,9-4,5 0,6 IgA, г/л 8-20 - IgM, г/л 0,6-2,5 - Фагоцитарное число Фагоцитарный резерв % 3.Какую терапию предложите больному? Задача 2. Больной 20 лет обратился с жалобами на эпизоды чихания (от 10 до 30 раз подряд), на обильные выделение водянистого секрета, 123 приводящим к гиперемии – раздражению кожи крыльев носа и верхней губы, нарушение носового дыхания, зуд носа, нёба, глаз, слезотечение. Данные симптомы проявляются в летнее время и наиболее выражены с утра. Также больной отмечает легкую утомляемость, отсутствие аппетита, раздражительность. Вопросы: 1.Ваш предположительный диагноз? 2.Какой объём аллергологического обследования Вы назначите пациенту? 3.Какие группы препаратов показаны в данном клиническом случае? 4.В каком случае Вы бы назначили местную гормональную терапию в виде спрея? 5.Возможно ли проведение специфической иммунотерапии у данного больного? Ответы: 1.Аллергический ринит. 2.Общей анализ крови, иммунологическое обследование, определение IgE-общего, IgE-специфического, проведение кожных проб. 3.Антигистаминные, стабилизаторы мембран тучных клеток, применение гормональных назальных спреев, проведение СИТ. 4.В случае выраженного обострения аллергического ринита. 5.Да. Задача 3. Больной М, 53 лет, перенёс операцию по поводу гангренозноперфоративного аппендицита, диффузного перитонита. Течение послеоперационного периода осложнилось нижнедолевой левосторонней пневмонией. В иммунограмме отмечается лейкоцитоз, лимфопения, снижение показателей CD3+клеток, CD4+клеток, CD8+клеток, снижение ИРИ. Вопросы: 1.Каково иммунологическое заключение? 2.Какаяиммунокоррекция в сочетание с терапией антибиотиками показана в данном случае? 3.По какой схеме введения назначается «Имунофан» в данном клиническом случае? 4.Как быстро нужно проводить повторное иммунологическое обследование после окончания терапии? 5.Какие противопоказания Вы знаете при назначение Тиммуностимуляторов? Ответы: 124 1.Вторичная иммунологическая недостаточность по Т-клеточному звену. 2.Назначение Т-иммуностимуляторов, вариантом выбора является “Имунофан”. 3.«Имунофан» 0,005% - 1 мл, №10, внутримышечно. №5 – через день, следующие №5 – один раз в три дня. 4.Повторное иммунологическое обследование проводится не раньше чем через 2 недели. 5.Противопоказания для иммуностимуляторов: беременность, аутоиммунная патология, аллергопатология. Задача 5. Больная Б.А.Я., 63 года, поступила на лечение в ГКБ. Жалобы при поступление на боли в суставах кистей и стоп, в тазобедренных суставах, боли в суставах беспокоят при движение и в покое, утренняя скованность, ограничением подвижности суставов, сопровождающаяся плохим самочувствием, субфебрилитетом, похуданием, депрессией, слабостью. За последний год часто болела ОРЗ. Состояние при поступление относительно удовлетворительное. Кожные покровы бледные, тургор снижен. Statuslocalis : Двустороннее, симметричное поражение мелких суставов кистей и стоп, отечность пястно-фаланговых суставов 11 и 1V пальцев левой кисти и лучезапястных суставов. Ульнарная девиация пястофаланговых суставов. Положительный симптом “поперечного сжатия”. Амиотрофия тыльной поверхности правой и левой кисти. Вопросы: 1.Ваш предположительный диагноз? 2.Каков объём проводимого обследования в данном клиническом случае? 3.Какие изменения в общем анализе крови и иммунограмме можно ожидать? 4.Каков объём проводимой терапии Вы предполагаете у данного больного? 5.Какие изменения можно выявить на рентгенограмме кистей рук у данного больного? Ответы: 1.Ревматоидный артрит. 125 2.Рентгенография кистей рук, общей анализ крови и мочи, биохимия крови, определение ревматоидного фактора, иммуннологическое обследование. 3.В общем анализе крови могут быть: лейкоцитоз или лейкопения, анемия, тромбоцитоз, лимфоцитоз или лимфопения, ускоренное СОЭ, повышение концентрации С-реактивного белка. Определение РФ. В иммунограмме: снижение абс. и отн. содержания CD8+лимфоцитов, повышение абс. и отн. содержания В-лимфоцитов, всех классов иммуноглобулинов и ЦИК, повышение концентрации активированных клеток с фенотипами CD38, CD71, CD95, CD25 и HLA-DR+клеток. 4.Стандартная схема лечения включает применение иммунодепрессантов: метотрексата («золотой стандарт» в лечение РА), препаратов золота или проведение гормонотерапии, НПВС, ФТЛ, ЛФК, проведение внутрисуставных инъекций гормональными препаратами (кеналог, гидрокортизон, дипроспан) с противовоспалительными гомеопатическими препаратами. 5.На рентгенограммах суставов можно выявить остеопороз, эрозии, деструкции, кистовидные просветления, сужение суставной щели. Задача 6 О чем свидетельствует следующий результат обследования военнослужащего. И. Л. 20 лет: 1.ВП с тетанином положительная ( + + + ) . 2.РГТГА с эритроцитарным столбнячным диагностикумом положительная в разведении сыворотки 1:160. Задача 7 Подсчитайте силу анатоксина в реакции флоккуляции, если сила антитоксической сыворотки равна 200 АЕ_ Инициальная флоккуляция произошла во второй пробирке, где прореагировало 0,15 мл сыворотки и 2 мл анатоксина. Задача 8 Определите силу антитоксической сыворотки, если инициальнаяфлоккуляция произошла в 3-й пробирке, где прореагировало 0,2 мл антитоксической- сыворотки и 2 мл анатоксина. По условию 2 мл анатоксина составляет 60 Lf. Задача 9 В лабораторию поступил материал (кожа от полушубка) для 126 выявления сибиреязвенного антигена. Какую серологическую реакцию следует поставить для обнаружения антигена? Какие ингредиенты необходимы для этой реакции? Задача 10 В поликлинику обратился больной 35 лет с саркомой Капоши, которого врач направил для обследования на СПИД. Какие серологические методы применяются для диагностики синдрома приобретенного иммунодефицита? Вопросы к итоговому зачетному занятию по общей иммунологии для лечебного факультета 127 1. История развития иммунологии 2.Антиген, определение, свойства антигена 3.Антигены, классификация антигенов 4.Антигены микроорганизмов, их характеристика. 5.Виды иммунитета. 6.Антигены. Структура антигена. Гаптен. 7.Врожденный иммунитет, определение. Классификация факторов врожденного иммунитета. 8.Фагоцитоз, стадии фагоцитоза. Незаверщенный фагоцитоз. 9.Комплемент. Система комплемента: классический, лектиновый, альтернативный пути активации. 10.Лизоцим, роль в иммунитете. Механизм действия. 11.Клеточные факторы врожденного иммунитета. 12.Макрофаги, их функция в иммунитете. 13.ЕК, их роль в иммунитете. 14.Иммунная система: центральные и периферические органы. 15.Иммунокомпетентнные клетки, происхождение, созревание, функции. 16.Антигенпредставляющие клетки. 17.Главный комплекс гистосовместимости. 18.Особенности иммунитета при различных бактериальных инфекциях. 19.Клеточный, Th-1 опосредованный иммунитет. 20.Апоптоз. 21.Гуморальный, Th-2 опосредованный иммунитет. 22.Медиаторы иммунной системы. Цитокины. Классификация. 23.Т-лимфоциты, дифференцировка Т-лимфоцитов. 24.Антигены, химическая природа, свойства. Понятие о Т.зависимых и Т.независимых антигенах. Суперантигены. 25.Эндогенные иммунорегуляторы, гормоны тимуса и костного мозга их роль в иммунитете. 26.Механизмы презентации и распознавания антигенов. Понятие о поверхностных маркерах иммунных клеток. 27.В.лимфоциты, дифференцировка, роль в иммунитете. 28.Иммуноглобулины класса М, характеристика. 29.Иммуноглобулины класса А, сывороточные и секреторные. Роль в местном иммунитете. 30.Реакция антиген-антитело. Механизм, специфичность. Серологическая диагностика, инфекционных болезней. 31.РИМ, принцип диагностическое значение 32.ИФА, принцип применение для диагностики инфекционных болезней 33.Иммунофлюресценгтный метод, практическое применение. 128 34.РСК значение в диагностике. 35.Иммунологические реакции с участием комплемента. 36.Реакция нейтрализации, практическое применение. 37.Реакция преципитации, ее варианты. 38.Реакция радиальной преципитации по Манчини. Практическое применение. 39.Реакция бактериолиза in vitro, in vivo. 40.Реакция агглютинации и ее варианты. 41.Показатели фагоцитоза, их определение. 42.Интерфероны, типы природа. 43.РПГА, ингредиенты, практическое применение. 44.Аллергодиагностика ГЗТ 45.Живые ослабленные вакцины, принципы получения, примеры 46.Анатоксины, получение, практическое применение 47.Вакцинотерапия, как метод лечения, примеры. 48.Антитоксические сыворотки, практическое применение. 49.Заместительная иммунотерапия. 50.Иммуномодуляторы, практическое применение 51.Иммуностимуляторы, практическое применение. 52.Иммунодепрессанты, классификация, практическое применение. 53.Инактивированные вакцины, практическое применение. 54.Сыворотки, иммуноглобулины, практическое применение. 55.Принципы иммунотропной терапии. 56.Иммунограмма у ВИЧ инфицированных. 57.Иммуноблоттинг, практическое применение. 58.Реакция антиген-антитело. Механизм, специфичность. Серологическая диагностика, инфекционных болезней. 59. Иммунограмма при ВИЧ инфекции. 60.Иммуноглобулины класса М, характеристика. 61.Кожные тесты в диагностике аллергических заболеваний – prisk и patch – тесты. 62.Иммунограмма при болезни Брутона. 63.Иммунологическая память: природа, биологическое значение. Различия первичного и вторичного иммунного ответа. 64.Иммунологическая толерантность, определение, виды, биологисеское значение. 65.Трансплантационный иммунитет, механизмы. 66.Противоопухолевый иммунитет. Механизмы врожденного и приобретенного иммунитета. 129 67.Иммунодефициты, классификация. Методы диагностики. 68.Гиперчувствительность немедленного типа. Анафилактические реакции: механизмы, принципы диагностики и лечения. 69.Гиперчувствительность немедленного типа I, цитотоксические реакции. 70.Гиперчувствительность немедленного типа III – иммуно – комплексного. Механизмы, принципы диагностики и лечения. 71.Гиперчувствительность немедленного IV типа, механизмы. 72.Механизмы специфического и неспецифического противоопухолего иммунитета. 73.Реакция антиген – антитело, механизмы взаимодействия. 74.Иммунный статус, определение. Методы изучения иммунного статуса. 75.Вторичные иммунодефициты, диагностика, методы коррекции. 76.Антитела. Классы иммуноглобулинов. Структура иммуноглобулина. 77.Лекарственная аллергия, принципы диагностики, терапия. 78.Главный комплекс гистосовместимости. 79.Иммуноглобулины класса G. Их характеристика. 80.Макрофаги их роль в иммунитете. 81.Особенности иммунитета при вирусных инфекциях. 82.Особенности антигрипкового и антипротозойного иммунитета. 83.Аутоантиген, аутоантитела. Аутоиммунные заболевания. 84.Т-хелперы, Т-супрессоры их роль в иммунитете. Аутоиммунные заболевания. Механизмы запуска аутоиммунитета. 85.Антиинфекционный приобретенный иммунитет, искусственный, естественный, активный, пассивный, примеры. 86.Аутоиммунные реакции, аутоиммунные заболевания. 87.Сывороточная болезнь, принципы диагностики и лечения. 88.Анафилактический шок, этиология, клиника принципы диагностики и лечения. 89.Первичные иммунодефициты, принципы диагностики и лечения. 90.ВИЧ инфекция, принципы диагностики и лечения. 91.Аллергические болезни, принципы диагностики и терапии. 130 Список литературы Основная: 1.Хаитов Р. М. Иммунология: Учебник для вузов с компакт – диском. М.: ГЭОТАР - Медиа, 2011 - 320 с. 2.Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Под ред. проф. В.В.Зверева. Учебник в 2 частях. - М.: М.: ГЭОТАР Медиа, 2010 – 670 с. 3.Микробиология, вирусология и иммунология: учебн. для студентов мед. ВУЗов / Под ред. В.Н.Царева. – М.: Практическая медицина, 2013 г. – 581 с. Дополнительная: 1.Клиническая иммунология: Учеб. пособие. / Под ред. А. М. Земскова. – М.: ГЭОТАР - Медиа, 2008 – 320 с. Рек. УМО 2. Плейфэр Дж. Наглядная иммунология. Пер. с англ. - М. – ГЭОТАР Медицина, 2000. - 95 с. 3.Клиническая иммунология: Учеб. пособие / Под ред. А. М. Земскова. – М.: ГЭОТАР - Медиа, 2006 – 320 с. Рек. УМО 4.Иммунология и аллергология / Учебник для медицинских вузов // Под ред. А.А. Воробьёва, А.С. Быкова, А.В. Караулова.– М., Практическая медицина. – 2006. – 287с. 5.Воробьёв А.А., Быков А.С. Атласа по микробиоло гии, иммунологии и вирусологии. // Учебное пособие УМО – М., МИА. – 2005. – 450с. 6.Боровский Е.В., Леонтьев В.К. Биология полости рта. М., «Медкнига», 2001, 300 с. 131
