На правах рукописи УДК 618.146-006.6-074 Пономарева Юлия Николаевна

На правах рукописи
УДК 618.146-006.6-074
Пономарева Юлия Николаевна
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
В ПАТОГЕНЕЗЕ, ДИАГНОСТИКЕ И ПРОГНОЗИРОВАНИИ
ЦЕРВИКАЛЬНОЙ НЕОПЛАЗИИ
14.01.01 – «Акушерство и гинекология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва-2011
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медикостоматологический университет Росздрава», ФГУ «Российский научный центр
рентгенорадиологии Росмедтехнологий»
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор
Манухин ИгорьБорисович
доктор медицинских наук, профессор
Ашрафян Лев Андреевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Хашукоева Асият Зульчифовна
доктор медицинских наук, профессор
Дамиров Михаил Михайлович
доктор медицинских наук, доцент
Аполихина Инна Анатольевна
Ведущая
организация:
ГУ
«Московский
областной
научно-
исследовательский институт акушерства и гинекологии» Министерства Здравоохранения Московской области
Защита состоится «____» ___________ 2011 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.06 в ГОУ ВПО «Московский государственный
медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу: 127473, Москва,
ул. Делегатская д. 20/1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета (127206, г. Москва, ул. Вучетича д.10а).
Автореферат разослан « _____ » ________________ 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
Умаханова М.М.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Широкая распространенность, разнообразие патологических состояний и
потенциальный риск злокачественной трансформации эпителия шейки матки
определяют высокую значимость прогностических критериев развития цервикальной неоплазии (Кулаков В.И. и соавт., 2004). Мировые показатели заболеваемости предраковыми заболеваниями шейки матки составляют, по данным
различных авторов, от 1,5% до 20,0% и опухолями от 7‰ до 15‰ (GLOBOCAN
database, 2007; V. Kumar и соавт., 2007).
В Российской Федерации на протяжении двух последних десятилетий рак
шейки матки остается одной из часто встречающихся опухолей и составляет
5,2% в структуре злокачественных новообразований у женщин (Чиссов В.И. и
соавт., 2007). Негативной тенденцией является значительный рост заболеваемости среди молодых женщин, представляющих не только репродуктивно значимую часть населения, но и активную социальную группу. Важно отметить, что
в возрастной группе 20-40 лет рак шейки матки является основной причиной
смерти среди всех больных злокачественными новообразованиями женской половой сферы, достигая 60% (Аксель Е.М. и соавт., 2002).
Общепризнано, что проблема цервикальных опухолей связана не только с
устойчиво высокой заболеваемостью раком, но и с трудностями диагностики
цервикальной интраэпителиальной неоплазии, представляющую один из этапов
малигнизации цервикального эпителия. По мнению экспертов ВОЗ (Сидней,
1996), рак шейки матки – полностью предотвратимое заболевание, если оно выявлено на стадии предрака.
Как известно, развитие цервикальной интраэпителиальной неоплазии и
рака шейки матки связано с инфицированием онкогенными типами HPV. Длительная персистенция вирусов в цервикальном эпителии сопровождается их
интеграцией в клеточный геном и появлением мутаций, причем неопластическая трансформация возникает с большей вероятностью при взаимодействии
3
HPV с другими ИППП, достаточно распространенными в популяции (Киселев
В.И. и соавт., 2000-2003; zur Hausen H., 1991-2000).
По результатам многоцентровых эпидемиологических исследований, до
90% случаев инфицирования HPV заканчиваются спонтанным выздоровлением,
и только в 10% наблюдений развивается персистирующая инфекция, которая и
запускает механизм злокачественной трансформации эпителиальных клеток
(Herrington C.S., 1998; Schneider A. и соавт., 2002). Таким образом, инфицирование цервикального эпителия HPV представляет собой необходимое, но недостаточное условие для развития рака. Не исключено, что HPV является инициирующим фактором многостадийного процесса неопластической трансформации, однако, для финального превращения в рак важно его взаимодействие с
другими онкогенами.
Результаты исследований свидетельствуют, что усиленная транскрипция
вирусных онкогенов и функционирование вирусных онкобелков ассоциированы с нарушением экспрессии цитокинов, связанных не только противоинфекционным, но и противоопухолевым иммунитетом. Показано, что некоторые цитокины, в частности, TNFα, IL-1β, TGFβ, активно участвуют в регуляции факторов стабильности клеточного генома (Бережная М.Н., 2000; Hazelbag S., 2001;
Tjiong M.Y. и соавт., 2001). В свою очередь, изменения в генетическом аппарате клеток могут быть обусловлены нарушением программы клеточной гибели.
Одним из механизмов нарушения апоптоза являются мутации в генах, контролирующих гибель клеток. В ряду этих процессов находятся потеря функций
гена-супрессора опухолевого роста р53 в результате его превращения в мутантный тип и аберрантная экспрессия протоонкогена bcl-2. Генетические нарушения, изменяя темпы гибели клеток, влияют и на пролиферативную активность,
тем самым, способствуя нарушению процессов тканевого контроля (Лушников
Е.Ф., 2001; Hale A.J. и соавт., 1996; Sheets E.E., 1997; Thomas M. и соавт.,
1999).
4
Принято считать, что процесс неопластической трансформации связан с
изменением баланса апоптоза и пролиферации клеток (Новиков В.С., 1996;
Швемберг И.Н. соавт., 2002; Isacson C., 1996; Leung T.W. и соавт., 2004). Исследованию пролиферативной активности как показателю биологической
агрессивности опухолей в последнее время придается большое значение. Этому
способствовало появление иммуногистохимических методик, что позволило
определить маркеры, связанные с регуляцией митотического цикла,  c-erb-B2,
PCNA, Ki-67, а также рецепторы половых гормонов. Экспрессия последних в
эпителиальных клетках шейки матки определяет их гормоночувствительность,
и, как, следствие, пролиферативную активность цервикального эпителия. Тем
более что, по мнению ряда исследователей, для формирования необратимой
цервикальной неоплазии в качестве одного из факторов необходима конверсия
клеточного метаболизма эстрадиола (Киселев В.И., 2004; Auborn K.J. и соавт.,
1991; Woodworth C.D., 1998- 2002; Ramos J.G. и соавт., 2002; Remoue F. и соавт., 2003).
Изучение различных молекулярно-биологических факторов при цервикальной интраэпителиальной неоплазии во время ее перехода в рак и прогрессии начальных стадий рака представляет огромный клинический интерес. В
настоящее время активно исследуются количественные гистопатологические
параметры, пролиферативные, регуляторные маркеры, факторы стабильности
клеточного генома (Франк Г.А. и соавт., 1997; И.И. Фролова и соавт., 2002; Манухин И.Б. и соавт., 2001; Pillai M.R. и соавт., 1996; Waggoner S.E. и соавт.,
1998; Xue Y. и соавт., 1999; Sasagawa T. и соавт., 2003). Это обусловлено
стремлением к выявлению рака шейки матки на доклинической стадии развития, когда своевременное максимально щадящее лечение цервикальной интраэпителиальной неоплазии имеет оптимально-радикальный эффект, позволяющий добиться полного излечения (Ашрафян Л.А. и соавт., 2002). Важность подобного направления исследований понятна, так как эффективность существу-
5
ющих методов терапии предрака и рака шейки матки напрямую зависит от степени ее поражения.
В свою очередь, улучшение результатов лечения уже возникших опухолей достигается при индивидуальном прогнозировании клинического течения
рака шейки матки. Использование молекулярно-биологических критериев, характеризующих злокачественный потенциал опухоли, наряду с традиционными
факторами прогноза позволяет определить вероятность прогрессирования
начальных стадий рака шейки матки и повысить эффективность программы ведения пациенток высокого риска.
Цель исследования: улучшение результатов лечения и определение прогноза цервикальной неоплазии на основании комплексного анализа и систематизации молекулярно-биологических факторов, ассоциированных с неопластической трансформацией цервикального эпителия.
Задачи исследования:
1.
45
Определить инфицированность пациенток HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35,
типами,
CMV,
морфологическими
HSV
I-II
типа,
характеристиками
СТ
и
взаимосвязь
цервикальной
с
клинико-
интраэпителиальной
неоплазии и раком шейки матки (возраст, анамнез, степень тяжести поражения,
глубина инвазивного роста, степень дифференцировки, наличие метастазов).
2.
Изучить содержание цитокинов IL-1β, TNFα и TGFβ в цервикальной
слизи в зависимости от характера инфицирования, при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки и оценить их клиническое значение.
3.
Установить характер экспрессии белков-регуляторов апоптоза р53mut
и bcl-2, маркеров пролиферации c-erb-B2 и PCNA при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки для более точной оценки степени
тяжести цервикальной неоплазии.
4.
Выявить особенности экспрессии рецепторов половых гормонов при
цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки во взаимо-
6
связи с экспрессией маркеров апоптоза, пролиферации, метаболитов эстрогенов
(2-OH/16α-OH), индексом массы тела и определить их роль патогенезе цервикальной неоплазии.
5.
Определить характер корреляционных взаимоотношений между кли-
нико-морфологическими
параметрами
и
изученными
молекулярно-
биологическими факторами при цервикальной интраэпителиальной неоплазии
и раке шейки матки.
6.
Оценить
прогностическое
значение
изученных
молекулярно-
биологических факторов в развитии цервикальной неоплазии.
7.
Разработать оптимальную диагностическую и лечебную тактику и
постлечебный мониторинг у пациенток с цервикальной интраэпителиальной
неоплазией с использованием молекулярно-биологических факторов.
Научная новизна
1. Выявлено, что поражение цервикального эпителия канцерогеными типами вируса папилломы человека и хламидийно-папилломавирусное инфицирование при цервикальной интраэпителиальной неоплазии связано с увеличением локальной продукции противовоспалительного цитокина TGFβ.
2. Показано, что повышение содержания TGFβ в цервикальном секрете
пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией является диагностическим критерием тяжести поражения шейки матки, а увеличение концентрации IL-1β в цервикальной слизи больных инвазивным раком шейки матки
сопряжено с глубиной опухолевого роста более 3 мм и метастатическим поражением регионарных лимфатических узлов.
3. Установлено, что приоритетное значение в клиническом течении цервикальной интраэпителиальной неоплазии имеет сочетанное увеличение экспрессии p53mut, гиперэкспрессия bcl-2, выраженная экспрессия c-erb-B2, повышение уровня PCNA.
7
4. Обнаружено, что увеличение экспрессии bcl-2 и c-erb-B2 в эпителии
шейки матки характерно для пациенток репродуктивного возраста, а повышение экспрессии p53mut чаще встречается у больных в перименопаузе.
5. Установлено, что при определении степени тяжести и составлении прогноза заболевания необходимо учитывать сочетание экспрессии онкогенов
p53mut, bcl-2, c-erb-B2, рецепторов половых стероидов, в комплексе с продукцией метаболитов эстрогенов и индексом массы тела, что коррелирует с клиническим течением и является прогностическим фактором клинического течения
цервикальной неоплазии.
6. Определено, что формирование цервикальной неоплазии взаимосвязано с увеличением экспрессии p53mut и bcl-2, микстинфицированием CT и HPV
HR, высокой пролиферативной активностью, увеличением локальной продукции TGFβ, гиперэкспрессией онкогена c-erb-B2, снижением экспрессии рецепторов эстрогенов, повышением концентрации 16α-ОНЕ1 и локальным увеличением содержания IL-1β.
7. Выявлены молекулярно-биологические критерии оптимальной тактики
ведения пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией: определение концентрации TGFβ в цервикальном секрете, уровня экспрессии онкобелков p53mut, bcl-2, c-erb-B2, пролиферативной активности клеток, которые позволяют наряду со стандартными методами диагностики повысить эффективность курации цервикальной интраэпителиальной неоплазии и индивидуально
обосновать объем лечебно-диагностических мероприятий.
Практическая значимость
Установлены дифференциально-диагностические критерии клинически
значимых изменений на шейке матке при цервикальной интраэпителиальной
неоплазии и распространенности опухолевого процесса при раке шейки матки.
Определены и систематизированы наиболее значимые прогностические молекулярно-биологические факторы клинического течения цервикальной неоплазии. Определены группы риска по возникновению рака шейки матки. Предло-
8
жена тактика ведения пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией, которая обладает высокой эффективностью при использовании в лечебнопрофилактических учреждениях. Разработаны рациональные молекулярнобиологические критерии постлечебного мониторинга
Основные положения, выносимые на защиту
Вирусы папилломы человека высокого онкогенного риска 16, 18, 31, 33,
35, 45 типов выявляются более, чем у 50% пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией и 90% больных раком шейки матки. При этом частота
выявления 16 типа HPV у больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией возрастает по мере увеличения степени тяжести поражения шейки матки.
Цервикальная интраэпителиальная неоплазия ассоциирована с нарушением продукции цитокинов с преобладанием иммуносупрессивного влияния
TGFβ и нивелированием цитотоксического и антипролиферативного эффектов
TNFα и IL-1β.
Рецидивирование цервикальной интраэпителиальной неоплазии и прогрессия в рак взаимосвязаны с хламидийно-папилломавирусным инфицированием, увеличением экспрессии онкогенов p53mut, bcl-2, c-erb-B2, высоким
уровнем пролиферации.
Неблагоприятное течение цервикальной неоплазии связано двумя вариантами онкогенеза: промоторным – экспрессия рецепторов эстрогенов в сочетании с увеличением содержания16α-гидроксиэстрона у пациенток с ожирением
и отсутствием онкогенов p53mut, bcl-2, c-erb-B2; генотоксическим – гиперэкспрессия онкогенов bcl-2 и c-erb-B2 при отсутствии стероидных рецепторов на
фоне дефицита массы тела и критически низких значений соотношения
2ОН/16α-ОН.
Приоритетными факторами индивидуального прогнозирования клинического течения цервикальной неоплазии являются сочетание вариантов инфицирования шейки матки, продукции цитокинов, белков-регуляторов апоптоза,
9
пролиферации клеток, рецепторов стероидных гормонов, метаболитов эстрогенов.
Апробация диссертации
Основные результаты работы представлены и доложены на региональной
научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Рак репродуктивных органов: профилактика, диагностика, лечение» (Томск, 2002),
Международном Конгрессе «Профилактика, диагностика и лечение гинекологических заболеваний» (Москва, 2003), региональной научно-практической
конференции «Новые технологии акушерстве и гинекологии» (Хабаровск,
2004), V международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке»
(Томск, 2004), I Российском конгрессе «Генитальные инфекции и патология
шейки матки» (Москва, 2004), Российских Форумах «Мать и дитя» (Москва,
2003-2010), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), Международном Конгрессе
«Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии»
(Москва, 2006), Российской научно-практической конференции «Патология
шейки матки и генитальные инфекции – от теории к практике» (Москва, 2006),
1 Международном конгрессе «Менеджмент в индустрии здоровья и красоты»
(Москва, 2007), Всероссийском конгрессе «Амбулаторно-поликлиническая
практика – новые горизонты» (Москва, 2009-2010), ХХIII Международном конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2010).
Внедрение
Материалы исследования используются в лечебной работе отделения гинекологии ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии Федерального
агентства по высокотехнологичной медицинской помощи, гинекологических
отделений ГКБ № 36, Московской областной больницы №5.
Разработан «Способ диагностики тяжелой цервикальной дисплазии»,
подтвержденный патентом на изобретение (РФ № 2273855 от 10.04.06 г.).
10
Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре акушерства и гинекологии лечебного факультета МГМСУ.
Личное участие
Автором разрабатывалась методика исследования и лично проводился
подбор обследованных в группы изучения: 215 пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией I-III, 154 больных раком шейки матки Ia-III стадий, 50 здоровых женщин. Осуществлялся забор материала для ПЦР-детекции
генитальных инфекций, ИФА-анализа цитокинов цервикальной слизи, бактериоскопического и цитологического исследования, выполнялась расширенная
кольпоскопия и биопсия шейки матки, эндоцервикальный кюретаж с подбором
образцов для иммуногистохимического исследования. Выполнялось оперативное лечение (электрокоагуляция, электроэксцизия шейки матки, пангистерэктомия, расширенная экстирпация матки по Вертгейму), ведение и 5-летнее диспансерное наблюдение пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки. В ходе диссертационной работы соискателем освоены методы статистической обработки данных в медицинских исследованиях.
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 40 научных работ, из них 2
монографии, 20 статей, в том числе 14 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ,
17 тезисов и 1 патент на изобретение.
Объём и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 7 подглав результатов собственных исследований,
главы обсуждения результатов исследования, главы алгоритма ведения пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией, выводов, практических
рекомендаций и списка использованной литературы. Работа изложена на 280
страницах, иллюстрирована 24 таблицами и 70 рисунками. Список использованной литературы включает 221 отечественных и 278 зарубежных источников.
11
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
При выполнении исследования проведен анализ 3140 амбулаторных карт
и историй болезни пациенток с морфологически подтвержденным диагнозом
цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки. В процессе
проведения статистической выборки пациентки с тяжелой соматической патологией, имеющие опухоли других локализаций, с отсутствием возможности динамического 5-летнего наблюдения и выбывшие из наблюдения последовательно исключались методом компьютерного распределения. В результате проведено проспективное исследование 369 больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки, находившихся на обследовании, лечении и диспансерном наблюдении в областном онкологическом диспансере г.
Читы в 2001-2006 гг., отдельные положения прошли экспериментальную проверку в Российском научном центре рентгенорадиологии Росмедтехнологий.
Возраст обследованных варьировался от 16 до 60 лет, и составил, в среднем,
37,9±8,1 лет.
Все исследования выполнялись с информированного согласия пациентов
и соответствовали этическим принципам, предъявляемым Хельсинской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, 2000).
Диагностика цервикальной интраэпителиалиальной неоплазии и рака
шейки матки основывалась на комплексном клиническом обследовании, результатах расширенной кольпоскопии, цитологического и гистологического исследования (электроконизация шейки матки, аппарат «Фотек») в соответствии с
отраслевыми стандартами объемов обследования и лечения в гинекологии (Кулаков В.И. и соавт., 1999) и алгоритмами объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований в онкологии (Чиссов В.И. и соавт., 2002). Критерием отбора больных являлся морфологически подтвержденный диагноз цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) и рака шейки матки. Стадиро-
12
вание эпителиальных дисплазий проводилась в соответствии с МКБ-X (1995),
ГКО женского полового тракта ВОЗ (1995) и рака шейки матки в соответствии
с классификацией TNM и FIGO (1997). В зависимости от степени тяжести поражения шейки матки группы обследованных распределились следующим образом: у 62 женщин диагностировалась CIN I; 60 – CIN II; 93 –CIN III; 40 –
микроинвазивный рак (Ia стадия); 30 – Ib стадия; 30 – II стадия и у 54 – III стадия рака шейки матки.
Среди гистологических вариантов рака шейки матки у 125 (81,2%) пациенток обнаруживался плоскоклеточный рак (61 (39,6%) – без ороговения, 45
(29,2%) – крупноклеточный ороговевающий, 19 (12,3%) – мелкоклеточный низкодифференцированный), у 21 (13,6%) – аденокарцинома (12 (7,8%) – эндоцервикальная, 9 (5,8%) – мезонефроидная) и у 8 (5,2%) – железистоплоскоклеточный рак. Степень дифференцировки опухоли G1 выявлена у 27
(17,5%) больных, G2 – у 49 (31,8%) и G3 – у 78 (50,7%).
Лечение цервикальных интраэпителиальных неоплазий у 74 (34,4%)
больных выполнено в объеме электрокоагуляции шейки матки (CIN I-II), у 34
(15,8%) – криодеструкции (CIN I-II), у 81 (37,7%) – электроконизации (CIN III,
CIN I-II при сочетании с рубцовой деформацией шейки матки), у 18 (8,4%) –
ножевой ампутации шейки матки (CIN III на фоне рубцовой деформации, гипертрофии шейки матки), у 8 (3,7%) – гистерэктомии (CIN II-III в сочетании с
миомой матки, аденомиозом).
При лечении рака шейки матки в 15 (9,7%) случаев применялась электроконизация шейки матки (Ia стадия), в 16 (10,4%) – операция Вертгейма (Ib стадия), в 34 (21,4%) – пангистерэктомия (Ia-Ib стадии), в 16 (10,4%) – комбинированная терапия (Ib-II стадии), в 61 (39,6%) – сочетанная лучевая терапия (II-III
стадии) и в 12 (7,8%) – комплексное лечение.
После проведения лечения CIN рецидивы выявлены у 20 (9,3%) больных.
Только у 7 (35,0%) пациенток рецидив возник в течение 2 лет после терапии,
что свидетельствует о резидуальном поражении шейки матки. У 13 (75,0%)
13
больных рецидив обнаружен в сроки от 3 до 5 лет, что обусловлено возникновением нового заболевания. В большинстве наблюдений – 16 (80,0%), диагноз
при обнаружении рецидива оставался таким же, как и до лечения (CIN I-III), в 2
(0,5%) случаях после лечения CIN I-II возникла CIN III и у 2 (0,9%) больных
при первичном лечении CIN III впоследствии возник микроинвазивный рак.
Пациенткам с рецидивом заболевания CIN I-II была выполнена электроэксцизия шейки матки, при развитии рака – гистерэктомия. Все больные, наблюдавшиеся по поводу эпителиальных неоплазий живы и здоровы в течение 5 лет.
Показатель одногодичной летальности у больных раком шейки матки составил 11,7% (18). Прогрессирование рака шейки матки отмечено в 31,8% (49)
случаев: в 23,4% (36) проведена химиолучевая терапия, 8,4% (13) – симптоматическое лечение. Общая пятилетняя выживаемость составила 72,7% (112), летальность 27,3% (42).
Больные с рецидивом цервикальной неоплазии (n=20) и прогрессированием рака шейки матки (n=49) составили группы неблагоприятного прогноза
для CIN и рака шейки матки. Безрецидивное течение неоплазий (n=195) и рака
шейки матки (n=115) соответствовали группам с благоприятным прогнозом
CIN и рака шейки матки.
Цитологическое исследование цервикальных мазков и гистологическое
исследование биоптатов шейки матки и операционного материала (шейка матки, регионарные лиматические узлы) выполняли по стандартной методике цитологического (Меркулов Г. А., 1969; Лилли Р., 1969) и гистологического
(Хмельницкий О.К., 1994, 1999; Автандилов Г.Г., 2002; Семченко В.В., 2003)
методов исследования.
Детекцию HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45 типа, CMV, HSV I-II типа, СТ
проводили тест-системами «АмплиСенс-100-R» (Москва) методом
ПЦР-
анализа в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции» (ГК СЭН, 1995).
14
Определение концентрации цитокинов IL-1β, TNF-α, TGF-β в цервикальной слизи осуществляли при помощи стандартных коммерческих наборов для
ИФА компании «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург). Определение в моче 2-гидроксиэстрона и 16α-гидроксиэстрона основывалось на методе ИФА при
использовании набора «ESTRAMET 2/16 ELISA» и анализатора MULTISKAN
EX (Фримель Г., 1987; Ngo T.T. et al., 1988).
В качестве контрольной группы по изучению генитальных инфекций, цитокинов и метаболитов эстрогенов использовалась репрезентативная выборка
из 50 здоровых женщин, сформированная методом случайного выбора из общей популяции.
Иммуногистохимическое исследование онкомаркеров p53mut, bcl-2, cerb-B2, PCNA, рецепторов эстрогенов и прогестерона проводили с использованием
двухэтапного
с
демаскировкой
антигена
стрептавидин-биотин-
пероксидазного метода с использованием стандартных наборов антител
«Dako» (Дания) (Эллиниди В.Н. и соавт., 2002; Петров С.В. и соавт., 2004). При
проведении морфологических исследований для контроля использовали 10 образцов здоровых тканей шейки матки.
Индекс массы тела рассчитывался по G. Brey (1978).
Статистическая обработка данных проведена в соответствии с правилами
вариационной статистики (Гланц С., 1999). Данные представлены в виде M±m,
где M – среднее арифметическое, m – ошибка среднего, n  объем анализируемой подгруппы, р  достигнутый уровень значимости. В таблицах и рисунках
указаны только статистически значимые различия. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез оценивали с помощью t-test,
считая статистически достоверными значения р≤0,05.
При анализе качественных признаков учитывали оценку долей в совокупности с расчетом стандартной ошибки доли с применением формулы Бернулли. Вероятность развития рецидива эпителиальных дисплазий оценивали
при помощи модели пропорциональных рисков Кокса с применением критерия
15
Кокса. Анализ выживаемости и построение кривых выживаемости осуществляли по методу Каплана-Мейера, статистическую значимость различий между
кривыми оценивали при помощи критерия Гехана-Вилкоксона. Для изучения
силы и значимости взаимосвязей между различными иммунобиологическими
параметрами использовали многофакторный корреляционный анализ, при
оценке степени их влияния на развитие цервикальной неоплазии был использован метод множественной линейной регрессии (Юнкеров В.И. и соавт., 2002).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Клинико-эпидемиологические аспекты генитальных инфекций, ассоциированных с поражением цервикального эпителия. Слизистая оболочка
шейки матки как пограничный барьер между верхним отделом генитального
тракта и внешней средой постоянно подвергается воздействию повреждающих
факторов. Наиболее агрессивным антигенным воздействием на цервикальный
эпителий обладают сексуально-трансмиссивные инфекции. Именно на фоне генитальных инфекций развивается большинство поражений шейки матки с
нарушением процессов пролиферации, дифференцировки и гибели клеток, а
инфекции приобретают хроническое рецидивирующее течение. Среди инфекций, передаваемых половым путем, наибольшее модулирующее влияние на течение патологических процессов шейки матки оказывают вирусы и хламидии,
инфицирование которыми связывают с потенциальным риском малигнизации
цервикального эпителия.
Результаты проведенного исследования показали, что среди здоровых
женщин без патологических изменений цервикального эпителия у 12,0±4,6%
выявлялись HPV и у 4,0±2,8% – HSV и CMV, что свидетельствует о достаточно
высокой распространенности HPV у здоровых женщин.
При цервикальной интраэпителиальной неоплазии инфицированными
оказались 78,1±2,1% пациенток (p<0,001). Наиболее часто встречались HPV,
которые в 58,9±6,8% случаев сочетались с другими ИППП: в 18,8±4,0% – с СТ,
16
в 10,6±3,2% – CMV и в 5,3±2,3% – HSV. У больных раком шейки матки в
94,4±3,8% выявлялись HPV (p<0,001). В 52,7±5,4% случаев HPV имели смешанный характер: в 19,8±4,1% – с CMV (p=0,079), в 18,6±4,3% – с HSV
(p=0,004) и в 7,3±2,7% – с CТ (p=0,027).
При оценке частоты встречаемости ИППП среди различных возрастных
групп максимальная инфицированность была отмечена в возрасте от 20 до 29
лет и от 40 до 49 лет. HPV HR чаще выявлялись у женщин, игнорирующих контрацепцию – 53,1±6,2 (р=0,034), сочетание HPV и CT ассоциировалось с высокой частотой перенесенных доброкачественных заболеваний шейки матки –
62,5±9,9 (р=0,015), HPV и CMV – с отягощенным акушерско-гинекологическим
анамнезом – 60,0±8,9 (р=0,021). Большинство инфицированных женщин имели
хронические воспалительные заболевания гениталий – 33,3±9,6 (р=0,033) и
были курящими – 66,6±9,7 (р<0,001).
Распределение HPV по типам подтвердило общие тенденции преобладания HPV низкого онкогенного риска среди здоровых вирусоносителей (таб. 1).
При прогрессировании цервикальной интраэпителиальной неоплазии и
развитии рака шейки матки наиболее часто выявлялись канцерогенные типы
HPV. На долю 16 и 18 типов HPV приходилось 12,5-53,1% цервикальной интраэпителиальной неоплазии и 56,7-61,1% рака шейки матки.
При CIN чаще выявлялся 16 тип вируса. Отмечена прямая корреляционная зависимость между выявлением в цервикальном эпителии HPV 16 типа и
степенью тяжести цервикальной неоплазии: коэффициент корреляции при CIN
I составил r=0,762 (р=0,001), при CIN II – r=0,862 (р=0,047) и при CIN III –
r=0,835 (р=0,037). У больных раком шейки матки чаще встречались 16 и 18 типы HPV, при инвазивных опухолях превалировал 18 тип HPV, сочетавшийся в
22,2±6,9% случаев с HSV. Установлено, что HSV-инфицирование связано с
инициацией интеграции вирусного генома HPV в клеточную ДНК, что в большинстве случаев может рассматриваться как свидетельство процесса малигнизации инфицированных HPV клеток (J.S. Smith и соавт., 2002).
17
Таблица 1
Распределение типов HPV
Тип
HPV
Группы обследованных, число обследованных (n), % инфицированных
Здоро-
Цервикальная неоплазия
Рак шейки матки
вые
CIN I
CIN II
CIN III
Ia
Ib
II-III
n=50
n=62
n=60
n=93
n=40
n=30
n=84
6
6,0±3,4
9,4±5,2
6,7±4,6
–
–
–
–
11
4,0±2,8
6,3±4,3
3,3±3,3
3,1±3,1
–
–
–
16
2,0±2,0
9,4±5,2
16,7±6,8
37,5±8,6
30,0±8,4
27,7±8,1
38,9±8,1
р=0,014
p<0,001
p<0,001
р1=0,005
р1<0,001
р1=0,007
р1=0,039
15,6±6,4
20,0±7,3
30,0±8,4
22,6±4,6
р1=0,033
p<0,001
р=0,002
3,1±3,1
18
6,7±4,6
–
р2=0,030
р1=0,039
31
–
–
–
3,1±3,1
6,7±4,6
10,0±5,5
13,9±5,8
33
–
–
3,3±3,3
6,3±4,
3,3±3,3
10,0±5,5
8,3±4,6
35
–
–
–
6,3±4,3
6,7±4,6
3,3±3,3
8,3±4,6
45
–
–
6,7±4,0
–
3,3±3,3
–
–
HPV
–
–
10,0±5,5
6,3±4,3
6,7±4,6
10,0±5,5
2,8±2,7
Итого
12,0±4,6
28,1±7,9
53,3±9,1
78,1±7,3
77,7±7,7
90,0±5,5
94,4±3,8
р=0,050
p<0,001
p<0,001
Микст
р1=0,040
р2=0,037
Примечания: типы
HPV высокого онкогенного риска выделены жирным
шрифтом, типы низкого онкогенного риска – курсивом.
p – статистическая значимость различий с контролем;
р1 – статистическая значимость различий по сравнению с CIN I;
р2 – статистическая значимость различий по сравнению с CIN III.
18
Исследование показало, что HPV 16 типа превалировал при плоскоклеточном неороговевающем раке (p=0,012), а инфицирование HPV 18 типа и HSV
чаще встречалось при мелкоклеточном низкодифференцированном раке и
эндоцервикальных аденокарциномах (p=0,041 и p=0,037 соответственно).
Клиническое течение цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки не зависело от типа HPV. В 45,5% (9 случаев) рецидивирующего течения цервикальной интраэпителиальной неоплазии выявлялось с хламидийно-папилломавирусное инфицирование (p<0,001). Рак шейки матки, ассоциированный с HPV 18 типа и HSV, составлял 38,8% (19 наблюдений) в группе
неблагоприятного прогноза.
Длительная персистенция сексуально-трансмиссивных инфекций, сопровождающаяся существенными изменениями иммунологической реактивности
организма, создает условия для прогрессии цервикальной неоплазии и рака
шейки матки. Выявленные взаимосвязи между инфекционно обусловленными
изменениями шейки матки и особенностями клинического течения цервикальных неоплазий и рака шейки матки могут быть использованы в качестве факторов прогноза.
2. Локальная продукция цитокинов при поражениях шейки матки. В генезе неопластических изменений шейки матки определяющее значение имеют
локальные иммунные реакции, механизм регуляции которых связан с продукцией цитокинов. Система цитокинов обеспечивает развитие воспалительных
реакций, межклеточные взаимодействия, реализацию эндокринных эффектов и
во многом определяет клинические проявления и исход заболевания (Пальцев
М.А. и соавт., 1995; Зубова С.Г. и соавт., 2001; Кадагидзе З.Г., 2003).
Проведенная сравнительная оценка локальной продукции цитокинов
TNFα, IL-1β и TGFβ в зависимости от варианта инфицирования шейки матки,
позволила выявить следующие особенности (рис.1). При моноинфицировании
HPV HR и HPV LR отмечено увеличение продукции TGFβ на фоне стабильных
по отношению к контролю значений IL-1β и TNFα. Отсутствие адекватной ре-
19
Среднее; Среднее+ошибка среднего; Среднее+среднеквадратическое отклонение.
450
пк/мл
400
p<0,001
350
IL-1β
TNFα
300
TGFβ
p<0,001
250
p=0,010
200
p<0,001
p=0,012
p=0,030
p=0,038
150
100
50
0
Здоровые
HPV LR
HPV HR
CT
HSV
CMV
p - статистическая значимость различий по сравнению с контролем.
Рис. 1. Содержание IL-1β, TNFα, TGFβ в зависимости
от инфицирования шейки матки.
акции защитных систем при HPV связано с иммуносупрессивными свойствами
персистирующего вируса (F.L.Kisseljov, 2000; D. Gaiotti и соавт, 2000). Тем не
менее, длительное присутствие вируса приводит к изменению антигенной
структуры эпителиоцитов, инициируя активацию иммунокомпетентных клеток
и увеличение продукции TGFβ (S.L. Giannini и соавт., 1998; Slier A. и соавт.,
1998).
Высокие
уровни
TGFβ
при
ассоциированной
хламидийно-
папилломавирусной инфекции связаны с продукцией СТ белков теплового шока (Peeling R.W. и соавт., 1999; Zugel U. И соавт., 1999). Увеличение продукции
TGF-β, инактивирующего цитотоксическую активность макрофагов, сопровождается снижением экспрессии TNFα и IL-1β (Зубова С.Г. и соавт.,
2001).Известно, что TNFα и IL-1β, продукция которых увеличивалась при инфицировании шейки матки HPV HR в сочетании с HSV и CMV, связаны с ло20
кальными защитными реакциями против внутриклеточных вирусов. Несмотря
на активацию механизмов противоинфекционной защиты, элиминации вирусов
герпеса и цитомегалии не происходит, продолжается их персистенция с повреждением клеток эпителия шейки матки. Несостоятельность систем защиты при
инфицировании HPV в сочетании HSV и CMV связана с экспрессией вирусами
генов, гомологичных цитокинам и их рецепторам, что позволяет вирусам препятствовать их презентации иммунокомпетентным клеткам, влиять на вирусную репликацию и блокировать противовирусную активность IF и TNFα (Носик Н.Н., 2000; Ramshaw I.A. и соавт., 1998).
Биологические свойства провоспалительных цитокинов связаны не только с противовирусной, но и с противоопухолевой активностью. Нормальная
микрофлора слизистой оболочки шейки матки обеспечивает достаточно высокий уровень продукции цитокинов в цервикальном секрете здоровых женщин.
При снижении продукции провоспалительных цитокинов, что отмечалось в
группе вирусоносителей без патологических изменений шейки матки, вирусы
могут персистировать в эпителиальных клетках длительное время и при воздействии определенных факторов способны инициировать неопластическую
трансформацию клеток. Прогрессирование цервикальной неоплазии связано с
развитием локального иммунодефицита. Инфицированные эпителиоциты, макрофаги, клетки Лангерганса слизистой оболочки шейки матки не способны
продуцировать соответствующие уровни цитокинов(Connor J.P. и соавт., 1999;
Tay S.K. и соавт., 1997). Деактивирующее влияние на макрофаги со снижением
экспрессии провоспалительных цитокинов оказывает TGFβ. Обнаруженный в
нашем исследовании возрастающий уровень TGFβ соотносился со степенью
тяжести цервикальной неоплазии: повышение уровня TGFβ от 150 пкг/мл до
240 пкг/мл соответствовало CIN I-II, от 240 пкг/мл до 500 пкг/мл  CIN III. Повышение экспрессии TGFβ на этапах предракового поражения CIN I-II приводит к торможению роста и переводу пролиферации в дифференцировку клеток.
Дальнейшая прогрессия с развитием CIN III и рака, сопровождается снижением
21
восприимчивости трансформированных клеток к рост-ингибирующих эффекту
TGFβ с высоким его содержанием в цервикальной слизи и реализацией иммуносупрессивных и ангиогенных потенций этого цитокина. При этом постоянная
стимуляция клеток и нечувствительность к антипролиферативному действию
TGFβ, который является одновременно индуктором процессов клеточной дифференцировки, приводят к ингибированию или извращению этих процессов.
Способностью продуцировать некоторые цитокины обладают раковые
клетки, используя их для нейтрализации противоопухолевого иммунного ответа (Кадагидзе З.Г., 2003). При раке шейки матки значительно возрастало содержание провоспалительных цитокинов IL-1β и TNFα на фоне стабильно высоких значений TGFβ. Значительное увеличение концентрации IL-1β отмечено
в случае развития инвазивных опухолей. Изучение взаимосвязи IL-1β и клинико-морфологических особенностей опухолей установило, что высокие уровни
IL-1β (>350 пкг/мл) чаще встречались при раке шейки матки с поражением регионарных лимфоузлов по сравнению с карциномами без метастазов. Установлено, что IL-1β способен повышать синтез опухолевыми клетками протеаз, разрушающих базальную мембрану и внеклеточный матрикс, определяя метастатическую и инвазивную активность опухоли (Бережная М.Н. и соавт., 2000).
Показатели пятилетней выживаемости больных инвазивным раком шейки матки с высокими значениями IL-1β, превышавшим 300 пкг/мл, значительно хуже
по сравнению с пациентками, в цервикальной слизи которых уровни IL-1β соответствовали умеренным значениям.
Полученные данные убедительно свидетельствуют о выраженном дисбалансе цитокиновой регуляции механизмов иммунного контроля клеточного гомеостаза на фоне вирусного инфицирования, что предопределяет формирование и прогрессию неопластических поражений шейки матки.
3. Экспрессия белков-регуляторов апоптоза р53mut и bcl-2. Развитие неопластических состояний связано с неспособностью клеток подвергаться
апоптозу. Одним из механизмов нарушения гибели трансформированных кле-
22
ток являются мутация гена p53, что препятствует функционированию белкаиндуктора апоптоза p53, и нарушение экспрессии гена bcl-2, тормозящего
апоптоз. При дефектном функционировании этих онкобелков происходит
накопление клеток с множественными генетическими изменениями, что может
рассматриваться как фактор неблагоприятного прогноза (Лихтенштейн А.В.,
1997; Ярилин А.А., 1998; Лушников Е.Ф. и соавт., 2001; Швемберг И.Н. и соавт., 2002; Hale A.J. et al., 1996).
Обнаружено, что онкопротеин р53mut определялся в 21,3±4,2% случаев
цервикальной интраэпителиальной неоплазии и превышал 10,0% окрашенных
клеток, в контрольных образцах шейки матки р53mut не обнаружено. При раке
шейки матки частота определения р53mut составила 54,2±5,1% с уровнем его
экспрессии от 10 до 60% (таб. 2).
Таблица 2
Экспрессия р53mut
Группы обследован-
n
ных
Экспрессия р53mut, %
позитивные случаи
уровень экспрессии
CIN I
60
6,3±4,3
2,3±1,2
CIN II
62
16,7±6,8
4,8±1,2
CIN III
93
40,6±8,7
13,1±2,9
р=0,036
р=0,018
Рак шейки матки:
Ia
40
40,0±8,9
18,8±3,7
Ib
30
46,7±9,0
18,7±4,3
II-III
54
66,9±8,0
40,0±9,2
р1=0,050
р2=0,050
р2=0,049
р – статистическая значимость различий с CIN II;
р1 – статистическая значимость различий с Ia стадией рака;
р2 – статистическая значимость различий с Ib стадией рака.
23
Количество р53mut-позитивных случаев и средние значения экспрессии
р53mut при CIN I и CIN II не различались, в отличие от CIN III, при которой
экспрессия р53mut встречалась более чем в 40% наблюдений и превышала
10,0% окрашенных ядер. В исследованиях P.Beer-Romero и соавт. (1997) установлено, что протеин Е6 HPV HR способен активно инактивировать р53 и предупреждать апоптоз уже на ранних стадиях развития неоплазии.
Изучение возрастных особенностей экспрессии р53mut показало, что
наиболее часто р53mut определялся в возрасте от 40 до 59 с высокими значениями экспрессии у женщин 40-49 лет. Отмеченная динамика может быть связано с постепенным накоплением мутантных форм р53 и увеличением вероятности развития цервикального рака (Лукьянова Н.Ю. и соавт., 2000).
По мнению большинства исследователей, р53mut считается прогностическим маркером опухолевого роста и свидетельствует об усиленном инвазивномпотенциале и биологической агрессивности опухоли (Ровенский Ю.А.,
1998). Соотнесение р53mut с системой TNM (TNM Classification, 1997) выявило
высокую частоту встречаемости этого онкогена при всех стадиях инвазивного
поражения. Степень экспрессии р53mut значительно возрастала при опухолях
Т1b-Т2-Т3 по сравнению с микроинвазивным раком: 40,0±9,2% (р=0,003);
55,6±16,2% (р=0,025) и 44,7±12,7% (р=0,022) против 18,7±4,3%. При этом
р53mut-позитивные опухоли чаще были ассоциированы с местно-регионарным
метастазированием, а уровень экспрессии в метастазах рака превышал свои
значения по сравнению с первичными опухолями (40,0±9,2% против 66,9±8,6%
в метастазах; р=0,42). Считается, что изменения активности р53 приводят к
возникновению сразу нескольких компонентов метастатического фенотипа, генетической нестабильности, что облегчает появление дополнительных признаков, необходимых для метастазирования (Копнин Б.П., 2004).
Анализ клинического течения показал, что гиперэкспрессия р53mut ассоциировалась с неблагоприятным течением цервикальной интраэпителиальнойнеоплазии и рака шейки матки. Уровень экспрессии р53mut, превышающий
24
9,9% позитивных клеток при CIN и 30,6% – при раке шейки матки, превалировал в группе плохого прогноза (p<0,001 и p=0,034 соответственно).
Проявление проапоптозной активности продуктов гена р53 связано с экспрессией другого онкогена bcl-2, проявляющего выраженную антиапоптотическую направленность в случае действия ДНК-повреждающих факторов, именно
с этим свойством связывают способность этого гена стимулировать канцерогенез (Швемберг И.Н. и соавт., 2002; X.H. Liang, 1995; Waggoner S.E. и соавт,
1998).
Выявленная экспрессия bcl-2 в базальном слое неизмененного цервикального эпителия связана с протективными функциями bcl-2, который обеспечивает клеткам локальную резистентность к воздействию разнообразных факторов
альтерации (Hochebery D.M. и соавт., 1993). При CIN I-II частота и уровень
экспрессии bcl-2 не отличались по сравнению с показателями контроля. Отличительной чертой CIN III явилось уменьшение случаев определения bcl-2 и появление образцов с гиперэкспрессией этого онкогена, превышающей 10,0%
клеток. Этот уровень экспрессия bcl-2 сохранялся и при раке шейки матки на
фоне снижения частоты выявления bcl-2 (рис. 2).
Частота определения bcl-2 коррелировала с возрастом пациенток, снижаясь по мере их старения, что связано с участием гормональной составляющей в
регуляции экспрессии bcl-2 (Troche V. и соавт., 1991).
Распределение bcl-2-позитивных случаев и уровень экспрессии этого онкогена в зависимости от размеров первичного поражения таково, что наиболее
часто bcl-2 определялся при поражениях шейки матки, соответствующих TIa и
T2: 46,7±9,1% и 42,2±10,0% (р=0,014 и р=0,013). При этом опухоли Т2 характеризовались гиперэкспрессией bcl-2 по сравнению с карциномами TIa –
24,1±8,2% против 6,5±2,9% (р=0,048). Гиперэкспрессия bcl-2 была также выявлена и среди поражений T3, при которых доля bcl-2-положительных наблюдений снижалась по сравнению с другими группами (р=0,031).
25
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
2,1
4,5
6,3
8,7
90
87,5
6,5
80
56,3
К
CIN I
позитивные случаи
CIN II
CIN IIII
7,1
19,1
30
30,6
Ib ст.
II-III ст.
46,7
Ia ст.
позитивные клетки
негативные случаи
Рис. 2. Экспрессия bcl-2.
В превалирующем числе наблюдений не отмечено одновременной коэкспрессии bcl-2 и p53mut – bcl-2-негативные поражения в большинстве случаев
экспрессировали p53mut, и соответственно bcl-2 выявлялся при отсутствии экспрессии p53mut. Т.е. определенный уровень продукции bcl-2 способен нивелировать гипреэкспрессию р53mut, что объясняет благоприятное течение CIN и
рака шейки матки, которые ассоциировались с умеренным уровнем экспрессии
bcl-2. Выраженная экспрессия bcl-2 обнаруживалась в группе неблагоприятного
течения CIN и рака шейки матки – в данном случае антиапоптозная активность
bcl-2 инициировала прогрессию неоплазии.
Таким образом, совокупность указанных молекулярно-биологических
особенностей течения эпителиальных дисплазий и цервикальных опухолей,
обусловленных дисбалансом экспрессии bcl-2 и появлением р53mut, несомненно, имеет определяющее значение в формировании неопластических потенций
поражений шейки матки, и оказывает влияние на их клиническое течение.
4. Экспрессия маркеров пролиферации эпителия шейки матки. В основе
образования опухоли лежит избыточная пролиферация определенных клеток,
поэтому нарушения регуляции клеточного цикла являются одним из основных
26
механизмов возникновения и развития новообразований. (Шацева Т.А., 2004).
Одним из важнейших регуляторов клеточной пролиферации и злокачественной
трансформации является протоонкоген С-erb-B2 (Копнин Б.Н., 2000; Фрейдлин
И.С., 2001).
Выраженность патологических изменений шейки матки коррелировала с
уровнем экспрессии c-erb-B2 (рис. 3).
II-III ст.
p1=0,014
p1=0,045
Ib ст.
р=0,040
p1=0,003
Ia ст.
p1=0,002
CIN III
Уровень
экспрессии
с-erb-B:
(+++)
(++)
(+)
CIN II
CIN I
контроль
%
0
10
20
30
40
р - статистическая значимость различий по сравнению с контролем;
p 1 - статистическая значимость различий по сравнению со II-III ст.
50
Рис. 3. Экспрессия c-erb-B2.
В неизмененном цервикальном эпителии уровень с-erb-В2 соответствовал
низким значениям этого онкогена. Цервикальные неоплазии характеризовались
появлением случаев умеренной и выраженной экспрессии c-erb-B2. При раке
шейки матки снижалось количество случаев низкой экспрессии c-erb-B2, инва27
зивные опухоли экспрессировали c-erb-B2 только на умеренном и высоком
уровне.
Механизмы, регулирующие экспрессию c-erb-B2 при прогрессии пренеонеоплазии и развитии рака, связаны с изменениями, которые приводят к нарушению передачи рост-ингибирующих сигналов и обеспечивают клеткам самодостаточность в пролиферативных стимулах. C.D. Woodworth и соавт. (19952000) обнаружили, что инфицированные HPV HR кератиноциты способны продуцировать в высоких концентрациях IL-1 и TNFα, которые стимулируют пролиферацию посредством гиперэкспрессии c-erb-B2. Таким образом, выявленное
нами значительное увеличение концентраций IL-1β и TNFα при злокачественной трансформации клеток, является фактором, инициирующим высокие уровни экспрессии c-erb-B2, что является причиной повышенной пролиферативной
активности трансформированных клеток.
Показано, что в регуляции экспрессии c-erb-B2 участвуют стероидные
гормоны – Е2 увеличивает экспрессию c-erb-B2, реализуя свой пролиферативный эффект (Ignar-Trowbridge D.B. и соавт., 1992). Результаты проведенного
анализа подтвердили наличие обратной связи между частотой определения cerb-B2 и возрастом обследованных женщин.
Анализ клинического течения CIN и рака шейки матки, ассоциированных
с c-erb-B2, p53mut и bcl-2 выявил несколько иммунологических вариантов коэкспрессии этих онкопротеинов (рис. 4). Возможно, функциональная активность экспрессирующихся онкогенов может оказывать суммарное влияние на
биологическое поведение CIN и рака шейки матки.
Цервикальная интраэпителиальная неоплазия, в которой c-erb-B2- не обнаруживался или определялся на низком уровне c-erb-B2 в сочетании с умеренной экспрессией bcl-2, не превышающей 10,0% клеток, относилась к группе
благоприятного прогноза. Вероятно, что сохранение супрессорного влияния
bcl-2 по отношению к p53mut, оказалось стабильным и в сочетании с c-erb-B2.
28
1,10
Частота рецидива или прогрессирования, %
1,05
1,00
1
0,95
2
0,90
3
0,85
1: c-erb-B2(+)bcl-2 <10,0%
2: c-erb-B2(+++)p53mut >9,9%
3: c-erb-B2(+++)bcl-2 >10,0%
0,80
0,75
0,70
0,65
0,60
Критерий Кокса; p - статистическая
значимость различий:
p1-2<0,008;
p1-3<0,001;
p2-3=0,054
0,55
6,000
18,00
12,00
30,00
24,00
42,00
36,00
54,00
48,00
66,00
60,00
Время наблюдения, мес.
Рис. 4. Течение CIN при различных сочетаниях
c-erb-B2 с другими онкомаркерами.
Благоприятное течение предракf шейки матки было отмечено при c-erbB2-негативных поражениях или при сочетании низкой экспрессии c-erb-B2 и
умеренной экспрессии bcl-2. Сочетанная гиперэкспрессия c-erb-B2 с р53mut
или bcl-2 при CIN во всех случаях была связана с рецидивом заболевания или
прогрессированием в рак.
Сочетанная гиперэкспрессия c-erb-B2 и p53mut (более 30,6% клеток)
определялась в 40,0±11,0% плоскоклеточных карцином, склонных к инвазивному росту и развитию регионарных метастазов, отмеченных в 20,0±8,9% случаев в различные сроки наблюдения. В группу неблагоприятного прогноза относились и опухоли с гиперэкспрессией c-erb-B2 и bcl-2, сочетание которых,
вероятно, сопровождалось торможением программы клеточной гибели, и как
следствие, неконтролируемым ростом с приобретением клетками метастатических свойств. Опухоли с таким сочетанием онкобелков в 30,0±10,2% наблюде29
ний характеризовались выраженной метастатической активностью, с развитием
гематогенных метастазов, глубоким инвазивным ростом.
Одним из важных клинико-морфологических параметров неопластических изменений, определяющих развитие и прогноз заболевания, считается
пролиферативная активность клеток, специфичным маркером которой является
PCNA (Пожарисский К.М. и соавт., 2000; Петров С.В. и соавт., 2004).
Исследование экспрессии PCNA в образцах здоровых тканей шейки матки показало, что средний уровень определения этого антигена не превышал
5,0% клеток (таб. 3).
Таблица 3
Уровень экспрессии PCNA в группах обследованных
Группы обследо-
р
р1
15,5±3,1
0,040
0,898
60
16,1±3,5
0,048
93
27,4±4,4
0,005
Iа стадия
40
28,6±4,3
0,002
Ib стадия
30
48,1±8,7
0,006
II-III стадии
54
77,4±10,6
<0,001
n
PCNA, %
Контроль
10
3,5±1,5
CIN I
62
CIN II
CIN III
р2
р3
ванных
0,051
0,846
Рак шейки матки:
0,049
0,037
p – cтатистическая значимость различий с контролем;
p1 – cтатистическая значимость различий с CIN II;
p2 – cтатистическая значимость различий с микроивазивным раком;
p3 – cтатистическая значимость различий с Ib стадией рака.
При цервикальной интраэпитедиальной неоплазии отмечалась умеренная
или выраженная пролиферативная активность – в среднем от 10 до 30% клеток,
30
коррелирующая с нарастанием атипических изменений многослойного плоского эпителия. Систематизация полученных данных показала, что пролиферативная активность при цервикальных неоплазиях, не превышавшая 20,0% клеток,
соответствовала CIN I-II, экспрессия PCNA более 20,0% клеток характеризовала CIN III. Цервикальные неоплазии с уровнем пролиферирующих клеток более 29,6%, относились к группе неблагоприятного клинического течения. Таким образом, PCNA при цервикальной интраэпителиальной неоплазии может
рассматриваться прогностическим фактором, определяющим вероятную прогрессию CIN.
Определение PCNA в опухолях шейки матки выявило взаимосвязь с клинической характеристикой опухолевого роста – пролиферативная активность
раковых клеток в инвазивных опухолях превышала аналогичные параметры по
сравнению с микроинвазией. Исследование показало, что наиболее высокие показатели PCNA соответствовали I-III стадиям инвазивного роста, превышая
свои значения при внутриэпителиальном раке. Аналогичная направленность
отмечена и в отношении показателей пролиферативной активности в зависимости от размеров первичного поражения шейки матки – увеличение числа пролиферирующих клеток отмечалось при поражениях Тis и Т1а и при сравнении
последних с опухолями Т1b-T3. Максимально высокие значения PCNA определялись при вовлечении в злокачественный процесс регионарных лимфатических узлов, при этом пролиферирующие раковые клетки пораженных лимфоузлов превышали показатели экспрессии PCNA в первичных опухолях.
Клиническое течение рака шейки матки, связанного с темпами клеточного роста, превышающими 66,8% пролиферирующих клеток, характеризовалось
снижением показателей общей пятилетней выживаемости больных по сравнению пациентками, в опухолях которых PCNA не превышал 66,8% клеток:
77,5±6,4% против 94,3±4,1% (р=0,023).
31
Таким образом, формирование неоплазии и прогрессия рака шейки матки
связаны с избыточной пролиферацией клеток в результате нарушения баланса
анти- и проапоптозной регуляции поврежденных эпителиоцитов.
5. Экспрессия рецепторов половых гормонов в тканях шейки матки. Доказано, что в инициации цервикальной неоплазии наряду с инфицированием HPV
важную роль имеет стероидная регуляция (Auborn K.J. et al.;1991; Woodworth
C.D., 1998- 2002; Russo J., 2003).
Исследование обнаружило экспрессию рецепторов эстрогенов и прогестерона во всех образцах здоровых тканей шейки матки (таб. 4).
При цервикальной интраэпителиальной неоплазии отмечено появление
рецепторонегативных поражений. Рак шейки матки характеризовался уменьшением частоты сочетанной экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона.
Степень экспрессии PgR при раке шейки матки соответствовала отрицательным и низким значениям, не отличаясь от показателей контроля и при CIN.
Снижение уровня экспрессии ER до отрицательных значений выявлялось при
микроинвазивных карциномах. Инвазивные опухоли отличались увеличением
средних значений H-score ER до умеренных показателей, что определялось
присутствием среди инвазивных карцином умеренной и высокой экспрессии
ER. Снижение уровня стероидной рецепции при неопластических поражениях
шейки матки может свидетельствовать о возникновении автономного «самоподдерживающегося» роста за счет локально продуцирующихся ростовых факторов и цитокинов. Необходимо отметить, что HPV-индуцированные поражения шейки матки тесно взаимосвязаны с гиперэстрогенией, сопровождающейся
преимущественной конверсией E2 в агрессивный метаболит 16α-ОНE1, который
определяет пролонгированный эффект E2 и активирует экспрессию гена Е7
HPV, инициирующего механизмы патологической пролиферации клеток, блокирующего факторы иммунологической защиты и определяющего опухолевую
трансформацию клеток (Киселев В.И. и соавт., 2000-2003). При этом становится понятным доминирующее поражение эстроген-чувствительной зоны транс-
32
формации цервикального эпителия, где отмечается наиболее высокий уровень
экспрессии стероидных рецепторов.
Таблица 4
Экспрессия рецепторов стероидных гормонов
Группы,
число
Контр.,
Частота экспрессии, %
ER+PgR+
H-score
ER+PgR-
ER-PgR+ ER-PgR-
ER
PgR
60,0±15,5
30,0±14,5
10,0±9,5

76,9±10,1
55,6±7,9
53,1±8,8
34,4±8,4
9,4±5,2
3,1±3,1
78,0±16,7
55,5±6,6
n=10
CIN I,
р1=0,042
n=60
CIN II,
56,7±9,0
30,7±8,4
13,3±6,2
3,3±3,3
91,0±12,5
55,5±10,4
31,3±8,2
31,3±8,2
18,8±6,9
18,8±6,9
70,4±9,6
43,3±6,7
26,7±8,1
23,3±7,7
20,0±7,3
72,4±10,0
55,7±12,2
р3=0,034
р2=0,035
20,0±7,3
44,6±8,3
71,6±9,1
р3=0,034
р=0,046
р3=0,005
n=60
CIN III,
n=93
Рак шейки матки, стадия:
Ia,
30,0±8,4
n=40
Ib,
26,7±8,1
30,0±8,4
23,3±7,7
n=30
р3=0,002
II-III,
11,1±5,2
n=84
р<0,001
25,0±7,2
19,4±6,6
44,4±8,3
94,0±12,5
37,4±7,5
р – статистическая значимость различий по сравнению с контролем;
р1 – статистическая значимость различий с CIN III;
р2 – статистическая значимость различий с Ia стадией рака;
р3 – статистическая значимость различий с II-III стадией рака.
33
При оценке уровня метаболитов эстрогенов отмечено, что в группах
больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки
концентрации пролиферативно-нейтрального 2-ОНЕ1 снижались: соответственно 28,0±4,5 нг/мл и 14,5±2,1 нг/мл (p=0,016) против 30,3±2,8 нг/мл в контроле. Указанная динамика содержания 2-ОНЕ1 коррелировала с увеличением
уровня пролиферативно-активного 16α-ОНЕ1: 19,7±0,9 нг/мл при CIN и
19,9±1,1 нг/мл при раке шейки матки против 15,8±0,6 нг/мл в контроле (p=0,04
и p=0,025), что сопровождалось уменьшением соотношения 2-OHЕ1/16α-OHЕ1
метаболитов.
Проведенный анализ выявил наиболее часто встречающиеся варианты
коэкспрессии стероидных рецепторов, c-erb-B2, bcl-2, в сочетании с показателями индекса массы тела и метаболитами эстрогенов (таб.6). Учитывая возможность модуляции экспрессии стероидных рецепторов посредством продукции цитокинов и факторов роста, становится понятной частая встречаемость
изменений экспрессии стериодных гормонов, bcl-2, c-erb-B2 в самых разных
сочетаниях. В процессе неопластической трансформации координированное
действие этих регуляторов в большинстве случаев нарушается, что может быть
как следствием, так и одной из причин формирования неоплазии.
Взаимодействие ауто/паракринной регуляции при участии ростовых факторов, онкопротеинов и эндокринных механизмов при поражениях шейки матки преобладало в группе с благоприятным течением CIN – сочетание ER и PgR
с умеренной экспрессией bcl-2 при низкой экспрессии или отсутствии c-erb-B2
на фоне нормальных показателей индекса массы тела 26,6±1,0 и соотношения
2-ОНЕ1/16α -ОНЕ1, равного 1,66±0,12.
В 8,8±1,9% случаев поражений шейки матки, связанных с умеренной и
высокой степенью экспрессии ER, онкогены c-erb-B2, bcl-2, p53mut не выявлялись. В развитии этого варианта неоплазии, вероятно, превалировали эндокринные механизмы, на что указывают высокие средние значения индекса массы 34,4±1,5 тела и увеличение содержания 16α-OHЕ1 с уменьшением соотно-
34
шения 2-OHЕ1/16α-OHЕ1 метаболитов до 1,10±0,09. Рецидивирующее течение
CIN у пациенток этой группы отмечалось в 35,0±10,7% (7 наблюдений), что отличалось от группы благоприятного прогноза.
Таблица 6
Взаимосвязь экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона,
индекса массы тела и метаболитов эстрогенов
Сочетание RR,
Средние значения ИМТ, кг/м2, М±m
Соотношение
число обследо-
25,6±1,0
34,4±1,5
20,5±0,5
2OHЕ1/16OHЕ1
ER+PgR+, n=58
32,5±3,8
3,3±1,4
1,9±1,1
1,60±0,12
ER-PgR+, n=47
26,0±3,5
1,3±0,9
3,3±1,4
1,48±0,11
ER+PgR-, n=19
2,6±1,3
9,1±2,3
0,7±0,6
1,10±0,09
р,р1<0,001
р=0,040
р=0,024
р1,р2<0,001
р1=0,042
ванных
р2=0,010
ER-PgR-, n=30
4,5±1,7
р,р1<0,001
0,7±0,6
14,3±2,8
0,36±0,21
р,р1,р2<0,001
р,р1<0,001
Примечание: жирным шрифтом выделены значения, имеющие статистически
значимые различия.
р – достоверность значимых различий по сравнению с группой ER+PgR+;
р1 – достоверность значимых различий по сравнению с группой ER-PgR+;
р2 – достоверность значимых различий по сравнению с группой ER-PgR-.
Отсутствие экспрессии стероидных рецепторов в сочетании с гиперэкспрессией c-erb-B2 и bcl-2 у больных с дефицитом веса – индекс массы тела
20,5±0,5, и низкими показателями соотношения 2-ОНЕ1/16-ОНЕ1 – 0,36±0,21,
доминировало в большинстве случаев 65,0±10,7% (13) неблагоприятного кли-
35
нического прогноза и сочеталось с традиционно негативными характеристиками. Выявленные в этой группе тенденции связаны с доминирующим влиянием
автономной регуляции в биологически агрессивных поражениях шейки матки.
Экспрессия рецепторов половых гормонов при цервикальной неоплазии
взаимосвязана с экспрессией онкогенов, клинико-патологическими параметрами, особенностями клинического течения и может быть использована в прогнозе клинического течения заболевания.
6. Многофакторный корреляционный анализ иммунобиологических и
клинических параметров эпителиальных дисплазий и рака шейки матки.
Проведенный многофакторный корреляционный анализ подтвердил выявленные взаимосвязи между молекулярно-биологическими параметрами и традиционными клинико-морфологическими факторами прогноза, что свидетельствует
о наличии патогенетических механизмов формирования цервикальной неоплазии (рис. 5, 6).
IL-1β
r= 0.361
r= - 0.430
r= 0.701
TNFα
r= - 0.322
Отрицательная связь
TGFβ
r= 0.661
Положительная связь
r= 0.571
bcl-2
HPV LR
r= 0.524
r= - 0.356
HPV HR
HPV HR+CT
r= 0.614
Тяжесть
поражения
r= 0.350
p53 mut
r= 0.703
r= - 0.771
ER
Возраст
r= - 0.309
r= - 0.347
r= - 0.279
r= - 0.301
Аборты
ИМТ
r= - 0.649
r= 0.557
r= - 0.557
c-erb-B2
r= 0.729
r= 0.428
r= 0.707
r= 0.707
PCNА
Рис. 5. Корреляционные взаимосвязи при CIN.
36
HPV+HSV
TNF
r= 0.543
r= 0.688
Глубина
инвазивного
роста
r= 0.723
Mts
IL-1
r= 0.377
c-erb-B2
r= 0.400
r= 0.370
r= -0.468
ER
r= 0.686
r= -0.550
r= 0.444
PCNА
r= 0.762
bcl-2
r= 0.664
HPV HR
r= 0.857
p53 mut
r= 0.762
r= 0.321
Положительная связь
Отрицательная связь
r= 0.699
Возраст
Т0-3
N1-2
Рис. 6. Корреляционные взаимосвязи при раке шейки матки.
7. Многофакторный регрессионный анализ в прогнозе развития цервикальной неоплазии. Для оценки степени влияния изученных молекулярнобиологических параметров на формирование цервикальной неоплазии нами
был проведен многофакторный регрессионный анализ. Высокой прогностической значимостью неопластического поражения шейки матки обладали инфицирование HPV HR (29,5%; p<0,001 ), экспрессия онкогена p53mut (27,1%;
p<0,001 ), гиперэкспрессия bcl-2 (26,6%; p<0,001), микстинфицирование HPV
HR и CT (22,2%; p=0,002), увеличение содержания TGFβ (20,9%; p=0,001), высокая пролиферативная активность (20,9%; p=0,001), гипреэкспрессия онкогена
c-erb-B2 (16,4%; p=0,008), снижение экспрессии рецепторов половых гормонов
(16,0%; 0,011), увеличение уровня IL-1β (14,6%; p=0,030) и уменьшение соотношения 2ОНЕ1/16α-ОНЕ1 (11,09; p=0,041).
8. Гипотетическая схема формирования цервикальной неоплазии, разработанная на основании результатов собственных исследований и данных литературы (рис. 7).
37
* Инфицирование и
другие факторы риска
Альтерация эпителия
шейки матки
Нарушение функций
HLA-системы
Нарушение регуляции
клеточного цикла
Ослабление индукции
апоптоза
* Мутация
p53
*Изменение
экспрессии
bcI-2
* Нерегулируемая
пролиферация
* Гиперэкспрессия
с-erb-B2
* Нарушение клеточной
дифференцировки
Е6/Е7 HPV
Активация
теломеразы
Конверсия
Е2→16α-OH
Дефицит и
функциональная
неполноценность
АРС
* Дисбаланс цитокинов IL-1β, TNFα и
TGFβ
Генетическая
нестабильность
* Изменение
экспрессии
стероидных
RR
Локальная
иммуносупрессия
Нечувствительность к
рост-супрессирующим
факторам
Угнетение цитотоксического и антипролиферативного действия IF, TNFα, IL-2
* Продукция трансформированными
клетками цитокинов
Самодостаточность в
пролиферативных
сигналах
Иммортализация
*- собственные исследования
Малигнизация
Стимуляция
неоангиогенеза
Изменения морфологии /
локомоции / инвазия /
метастазирование
Рис. 7. Гипотетическая схема формирования цервикальной неоплазии.
9. Алгоритм обследования женщин с цервикальной интраэпителиальной
неоплазией.
Комплексный
анализ
и
систематизация
молекулярно-
38
биологических факторов, ассоциированных с неопластической трансформацией
эпителия шейки матки, позволили разработать алгоритм ведения больных CIN,
позволяющий индивидуализировать объем лечебно-диагностических мероприятий и повысить эффективность тактики ведения этой категории пациенток
(рис. 8).
ПЦР-HPV HR + Цитология
ПЦР (+)
Цитология -N
ПЦР (+)
Цитология - атипия
ПЦР (-)
Цитология - атипия
ПЦР (-)
Цитология - N
Кольпоскопия +Биопсия
TGF-β
цервикальной
слизи
Гистология + Иммуногистохимия
<150
кг/мл
ERPgR(+), p53mut(-), bcl-2<10%,
c-erb-B2(-), PCNA<29,9%
>150
пкг/м
л
ERPgR(-), p53mut>10%, bcl-2(-),
C-erb-B2(+++), PCNA >29,9%
CIN I – терапия
CIN I – деструкция
CIN II – деструкция
CIN II-III – хирургия
CIN III – хирургия
Ведение по
результатам
гистологии
Цитология 6 мес.
Атипия
Цитология
4 р через 3 мес.,
2 р через 6 мес.
N
Цитология 6 мес.
Атипия
N
Цитология
2 р через 6 мес.
Ежегодный скрининг
Рис. 8. Алгоритм ведения пациенток с CIN.
39
ВЫВОДЫ
1. При цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки с
различной частотой обнаруживаются 16, 18, 31, 33, 35, 45 типы HPV. Наиболее
распространенными при цервикальной интраэпителиальной неоплазии является
16 тип HPV, при раке шейки матки – 16 и 18 типы HPV.
2. Развитие цервикальной интраэпителиальной неоплазии не имеет прямой
связи с идентификацией типа вируса папилломы человека. Сочетание 16 типа
HPV с хламидийным инфицированием при цервикальной интраэпителиальной
неоплазии и 18 типа HPV с вирусом герпеса при раке шейки матки имеет прогностическое значение и, как правило, ассоциировано с неблагоприятным вариантом клинического течения.
3. Латентная папилломавирусная инфекция шейки матки характеризуется
снижением в цервикальной слизи концентрации провоспалительных цитокинов
IL-1β и TNF, предопределяя возникновение локальной иммуносупрессии и возможность перехода в клиническую стадию, что требует коррекции иммунных
нарушений и биоценоза.
4. Аналитическим критерием тяжести поражения при цервикальной интраэпителиальной неоплазии является увеличение локальной продукции TGFβ:
концентрация TGFβ в цервикальной слизи 150-240 пкг/мл соответствует CIN III, TGFβ 240-500 пкг/мл  CIN III.
5. Благоприятными факторами прогноза при цервикальной интраэпителиальной неоплазии являются отсутствие p53mut, умеренный уровень bcl-2, менее
10,0% клеток, низкая экспрессия c-erb-B2 (+), низкий уровень PCNA, не превышающий 29,6% клеток, экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона.
6. Неблагоприятными факторами клинического течения цервикальной
неоплазии являются следующие:
– сочетание умеренной экспрессии рецепторов эстрогенов (++), отсутствие
онкобелков p53mut, bcl-2, c-erb-B2, ИМТ, превышающим 34,4 и соотношение
2ОНЕ1/16α-ОНЕ1 от 1,48 до 1,1;
40
– отсутствие экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона, коэкспрессия c-erb-B2(+++) и bcl-2, более 10,0% клеток, ИМТ менее 20,5 и соотношение
2ОНЕ1/16α-ОНЕ1 менее 1,0.
7. Клинико-морфологические факторы прогноза цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки имеют прямую корреляционную зависимость с инфицированием шейки матки, продукцией цитокинов, регуляцией
апоптоза, пролиферации клеток, рецепторами стероидных гормонов и метаболизмом эстрогенов на основании чего предложена гипотетическая схема формирования цервикальной неоплазии.
8. Высокой прогностической значимостью в клиническом течении цервикальной неоплазии обладают инфицирование HPV HR, увеличение экспрессии
p53mut и bcl-2, микстинфицирование CT и HPV HR, высокая пролиферативная
активность, увеличение локальной продукции TGFβ, гиперэкспрессия онкогена
c-erb-B2, снижение экспрессии рецепторов эстрогенов, повышение концентрации 16α-ОНЕ1 и локальное увеличение содержания IL-1β.
9. Дифференцированный алгоритм ведения цервикальной интраэпителиальной неоплазии внедрен в клиническую практику: при CIN I – коррекция биоценоза и устранение местной иммуносупрессии; при CIN II-III – петлевая эксцизия шейки матки с проведением пред- и послеоперационной терапии. Определены рациональные критерии постлечебного мониторинга (HPV-тестирование,
цитологическое исследование, определение молекулярно-биологических факторов).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. При проведении HPV-тестирования у больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки рекомендуется использование
мультипраймерных тест-систем для одномоментной детекции нескольких онкогенных типов при одной постановочной реакции, при этом генотипирование
отдельных типов HPV нецелесообразно.
41
2. Пациенток с латентной папилломавирусной инфекцией следует относить к группе высокого риска по возникновению предрака и рака шейки матки,
что требует обязательного диагностического мониторинга.
3. Дифференциально-диагностическим критерием степени тяжести поражения шейки матки при цервикальной интраэпителиальной неоплазии может
быть определение содержания TGFβ в цервикальном секрете – концентрация
менее 150 пкг/мл свидетельствует об отсутствии клинически значимых изменений, 150-240 пкг/мл – соответствует CIN I-II, более 240 пкг/мл – CIN III.
4. При составлении прогноза клинического течения цервикальной
неоплазии необходимо учитывать следующие факторы. Благоприятные – отсутствие экспрессии онкопротеинов p53mut, c-erb-B2, экспрессия bcl-2, умеренная пролиферативная активность клеток, наличие рецепторов эстрогенов и
прогестерона, низкий уровень 16α-ОНЕ1. Неблагоприятные – микстинфицирование шейки матки HPV с хламидийной или герпетической инфекцией, гиперэкспрессия p53mut, c-erb-B2, отсутствие bcl-2, высокая пролиферативная активность клеток, отсутствие рецепторов половых гормонов, высокий уровень 16αОНЕ1.
5. При планировании тактики ведения пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией рекомендуется использовать такие иммуногистохимические показатели как: сочетание экспрессии онкопротеинов 53mut, bcl-2, cerb-B2, значения PCNA, наличие рецепторов эстрогенов и прогестерона, уровень 16α-ОНЕ1. При неблагоприятном прогнозе заболевания следует предпочесть деструктивное и хирургическое лечение; при благоприятном – возможно
консервативное ведение пациенток с CIN I, деструктивное и хирургическое лечение при CIN II-III.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
42
1. Пономарева Ю.Н. Сравнительная оценка продукции провоспалительных цитокинов при различных заболеваниях шейки матки // Сборник научных
работ «Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике». – Чита, 2002. – С. 104-105.
2. Витковский Ю.А., Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н. Дифференциально-диагностические критерии дисплазии и рака шейки матки // Сибирский онкологический журнал. – 2002. – №3. – С. 33-35.
3. Пономарева Ю.Н., Широков В.А. Эпидемиологические аспекты рака
шейки матки // Материалы региональной научно-практической конференции
НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Рак репродуктивных органов: профилактика,
диагностика, лечение». – Томск, 2002. – С. 105.
4. Белокриницкая Т.Е., Витковский Ю.А., Пономарева Ю.Н. Роль цитокинов в патогенезе нарушений иммунитета и гемостаза у больных тяжелыми
дисплазиями и раком шейки матки // Вопросы онкологии.  2003.  Т. 49, № 1.
 С. 51-54.
5. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е. Эффективность цитологической диагностики предраковых и злокачественных заболеваний шейки матки //
Материалы V Российского форума «Мать и дитя». – М., 2003. – Ч. II. – С. 421.
6. Белокриницкая Т.Е., Витковский Ю.А., Пономарева Ю.Н., Мочалова
М.Н. Трансформирующий фактор роста бета при эпителиальной дисплазии и
преинвазивном раке шейки матки // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2004. – Т. 1., № 1. – С. 174-177.
7. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е., Маккавеев Е.П. Маркеры
апоптоза и пролиферации клеток при дисплазии и раке шейки матки // Материалы V Международного Конгресса молодых ученых «Науки о человеке». –
Томск, 2004. – С. 70-71.
8. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е. Апоптоз при диспластических
поражениях шейки матки // Материалы VI Российского форума «Мать и дитя».
– М., 2004. – С. 447.
43
9. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е. Экспрессия трансформирующего фактора роста бета при дисплазии и раке шейки матки // Материалы VI
Российского форума «Мать и дитя». – М., 2004. – С. 448.
10. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е., Вологдин Е.В. Прогностическое значение параметров апоптоза и пролиферации в диагностике эпителиальных дисплазий и преинвазивного рака шейки матки // Материалы I Российского
конгресса «Генитальные инфекции и патология шейки матки».  М., 2004.  С.
107.
11. Витковский Ю.А., Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н. Содержание
цитокинов в цервикальной слизи у больных дисплазией шейки матки в сочетании с хламидийной инфекцией // Научные труды I Съезда физиологов СНГ. –
Сочи, 2005. – С. 144.
12. Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н., Ломнева Г.М., Маккавеев Е.П.,
Вологдин Е.В., Вершинин О.В. Экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона в нормальных и опухолевых тканях шейки матки // Бюллетень ВосточноСибирского научного центра СО РАМН. – 2005.  № 1 (39). – С. 7-12.
13. Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н., Витковский Ю.А., Мочалова
М.Н., Ладыгина Н.М., Бунина Е.Н., Ломнева Г.М. Цитокин-опосредованная
роль папилломавирусной инфекции в развитии цервикальной дисплазии //
Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2005. – № 2
. – С. 162-166.
14. Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н., Ломнева Г.М., Добросовестнова С.В. Исследование параметров апоптоза при цервикальной дисплазии и раке
шейки матки // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО
РАМН. – 2005. – № 2 . – С. 166-169.
15. Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н., Бунина Е.Н., Ладыгина Н.М.
Генитальные инфекции и локальная продукция цитокинов при диспластических
процессах шейки матки // Сибирский медицинский журнал. – Иркутск, 2005. –
Приложение к №7 (ноябрь). – С. 29-31.
44
16. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е., Ладыгина Н.М., Бунина Е.Н.
Исследование цитокинов цервикального секрета при поражениях шейки матки,
ассоциированных с генитальными инфекциями // Материалы VII Российского
форума «Мать и дитя». – М., 2005. – С. 485.
17. Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н., Бунина Е.Н. Клиникоэпидемиологические аспекты заболеваний шейки матки, ассоциированных с
вирусом папиллом // Дальневосточный медицинский журнал.  2005.  № 1.
 С. 40-43.
18. Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н., Ломнева Г.М., Маккавеев Е.П.
Пролиферативная активность клеток при предраковых и злокачественных поражениях шейки матки // Дальневосточный медицинский журнал.  2005. –
№ 2. – С. 58-61.
19. Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н., Ломнева Г.М., Маккавеев Е.П.
Прогностическое значение исследования пролиферативной активности опухолевых клеток при раке шейки матки // Бюллетень Восточно-Сибирского
научного центра СО РАМН. – 2006. – № 1. – С. 53-55.
20. Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н., Бунина Е.Н.Исследование папилломавирусной инфекции при заболеваниях шейки матки у подростков //
Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. – 2006. – №
1. – С. 55-58.
21. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е., Ломнева Г.М., Вершинин О.В.
Диагностическое значение определения пролиферации клеток при предраковых
поражениях шейки матки // Материалы VIII Российского форума «Мать и дитя». – М., 2006. – С. 487.
22. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е., Ломнева Г.М., Вологдин Е.В.
Иммуногистохимическое изучение экспрессии онкогена С-erb-В2 при дисплазии и раке шейки матки // Материалы Международного Конгресса «Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии». – М., 2006. – С.
147-148.
45
23. Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н., Ладыгина Н.М., Бунина Е.Н.
Содержание цитокинов в цервикальном секрете при дисплазии шейки матки на
фоне генитальных инфекций // Журнал акушерства и женских болезней. –
2006. – Т. LV, Вып. 2. – С.64-67.
24. Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н., Бунина Е.Н., Ломнева Г.М.
Некоторые клинико-морфологические особенности цервикальных эпителиальных дисплазий // Журнал акушерства и женских болезней. – 2006. – Т. LV,
Вып. 2. – С. 71-75.
25. Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н., Мочалова М.Н. Способ диагностики тяжелой цервикальной дисплазии // Пат. № 2273855, Российская Федерация, МПК G 01 N 33/577. – № 2004118205; заявл. 15.06.04; опубл.
10.04.06., Бюл. № 10. – С. 1-6.
26. Белокриницкая Т.Е., Витковский Ю.А., Пономарева Ю.Н., Мочалова
М.Н., Ломнева Г.М. Фактор некроза опухолей альфа и трансформирующий
фактор роста бета в регуляции апоптоза и пролиферации клеток при дисплазии
и раке шейки матки // Цитокины и воспаление. – 2006. – Т. 5, № 1. – С. 31-33.
27. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е., Бунина Е.Н., Вологдин Е.В.
Клинико-анамнестические факторы риска развития генитальных инфекций, ассоциированных с эпителиальными дисплазиями и раком шейки матки // Материалы Российской научно-практической конференции «Патология шейки матки
и генитальные инфекции – от теории к практике». – М., 2007. – С. 64.
28. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е., Добросовестнова С.В., Бунина
Е.Н., Ломнева Г.М. Прогностические критерии формирования цервикальной
неоплазии // Материалы 9-го Всероссийского научного форума «Мать и дитя».
– М., 2007. – С. 492-493.
29. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е. Роль папилломавирусной инфекции в регуляции клеточного роста при цервикальных дисплазиях // Материалы
межрегиональной
научно-практической
конференции,
посвященной
60летию онкологической службы Забайкалья. – Чита, 2007. – С. 141-145.
46
30. Пономарева Ю.Н., Белокриницкая Т.Е., Вологдин Е.В. Иммунологические предикторы цервикального рака // Материалы Всероссийской научнопрактической конференции, посвященной 60-летию онкологической службы
Тамбовской области. – Тамбов, 2007. – С. 118-123.
31. Пономарева Ю.Н. Медико-социальные аспекты развития заболеваний
шейки матки // Материалы I Международного конгресса «Менеджмент индустрии здоровья и красоты». – М., 2008. – С.8-11.
32. Левин И.А., Манухин И.Б., Пономарева Ю.Н., Шуметов В.Г. Методология и практика анализа данных в медицине: монография. Том I. Введение в
анализ данных. – Москва-Тель-Авив: АПЛИТ, 2010. – 168 с.
33. Левин И.А., Манухин И.Б., Пономарева Ю.Н., Шуметов В.Г. Методология и практика анализа данных в медицине: монография. Том II. Одномерные
методы анализа данных. – Москва-Тель-Авив: АПЛИТ, 2011. – 201 с.
34. Манухин И.Б., Пономарева Ю.Н. Исследование пролиферативной активности клеток в диагностике цервикальных интраэпителиальных неоплазий //
Материалы Всероссийского конгресса «Амбулаторно-поликлиническая практика – новые горизонты». – М., 2010. – С. 206.
35. Манухин И.Б., Пономарева Ю.Н. Прогностическая значимость молекулярно-биологических факторов развития цервикальной неоплазии // Материалы Всероссийского конгресса «Амбулаторно-поликлиническая практика – новые горизонты». – М., 2010. – С. 207.
36. Манухин И.Б., Пономарева Ю.Н., Ашрафян Л.А. Нарушения метаболизма эстрогенов при цервикальной интраэпителиальной неоплазии // Материалы Всероссийского конгресса «Амбулаторно-поликлиническая практика – новые горизонты». – М., 2010. – С. 204-205.
37. Манухин И.Б., Ашрафян Л.А, Пономарева Ю.Н. Исследование мутированного гена-супрессора р53, антигена ядер пролиферирующих клеток и рецепторов половых стероидов в прогнозировании цервикальных интраэпителиальных неоплазий // Материалы ХХIII Международного конгресса с курсом эн-
47
доскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний». – М., 2010. – С. 212.
38. Манухин И.Б., Пономарева Ю.Н. Исследование маркеров апоптоза при
цервикальных интраэпителиальных неоплазиях // Материалы ХI Всероссийского научного форума «Мать и дитя». – М., 2010. – С. 442-443.
39. Тимошенко М.В., Гараз Т.В., Пономарева Ю.Н. Числовые характеристики распределения при обработке результатов эксперимента // Информационные комплексы и системы. – 2010. – Т.6, №2. – С. 42-46.
40. Пономарева Ю.Н., Манухин И.Б., Ашрафян Л.А. Молекулярнобиологические факторы в диагностике цервикальной интраэпителиальной
неоплазии // Опухоли женской репродуктивной системы. – 2010. – №1. – С.
72-76.
48