3. БАКТЕРИИ Бактерии – это мельчайшие одноклеточные
реклама
3. БАКТЕРИИ Бактерии – это мельчайшие одноклеточные организмы. Диаметр бактериальной клетки в среднем составляет 1 мкм. Размеры клеток варьируют в пределах от 0,1 до 10 мкм. Бактерии освоили самые разнообразные среды обитания: они живут в почве, пыли, воде, воздухе, на внешних покровах животных и растений и внутри организма. Их можно обнаружить даже в горячих источниках, где они живут при температуре около 60 °С или выше. Численность бактерий трудно оценить: в 1 г плодородной почвы может находиться до 100 млн., а в 1 см3 парного молока – свыше 3000 млн. бактерий. Жизнедеятельность микроорганизмов имеет важное значение для всех остальных живых существ, так как бактерии и грибы разрушают органическое вещество и участвуют в круговороте веществ в природе. К тому же бактерии приобретают все большее значение в жизни людей, и не потому, что они вызывают различные заболевания, а потому, что их можно использовать для получения многих необходимых продуктов. При неблагоприятных условиях бактерии способны образовывать споры. Некоторые бактерии (в основном принадлежащие к роду Clostridium или Bacillus) образуют эндоспоры, т. е. споры, находящиеся внутри клетки. Эндоспоры - толстостенные долгоживущие образования, крайне устойчивые к нагреванию и коротковолновому излучению. Они по-разному располагаются внутри клетки, что служит очень важным признаком для идентификации и систематики таких бактерий. Если покоящаяся, устойчивая структура образуется из целой клетки, то она называется цистой. Цисты образуют некоторые виды Azotobacter. Одним из важнейших систематических признаков является форма бактериальной клетки. Kокки (сферические): стафилококки (напоминают виноградную гроздь). Пример – Staphylococcus aureus, живущий в носоглотке; разные штаммы стафилококков вызывают фурункулез, воспаление легких, пищевые отравления и другие заболевания; стрептококки (образуют цепочки клеток). Пример – многие виды Streptococcus; некоторые вызывают инфекционные заболевания верхних дыхательных путей; например, S. Pyogenes – вызывает ангину и скарлатину; S. thermophilus придает йогурту его пикантный вкус; диплококки (две клетки в одной капсуле) – к этому роду относится единственный вид Diplococcus pneumoniae (пневмококк), возбудитель пневмонии, который многочисленные вызывает тяжелые острые крупозное воспаление пиогенные инфекции: легких и менингит, септицемию, эмфизему и перитонит. Спириллы (спиралевидные): Спиральная палочка с одним жгутиком Пример – Spirillum. Сюда же относятся спирохеты. Форма клеток у спирохет очень схожа, но есть различия по способу передвижения, например Treponema pallidum – возбудитель сифилиса. Бациллы (палочковидные): одиночные палочки, например, Escherichia coli (обычный кишечный симбионт), Lactobacillus, Salmonella typhi – возбудитель брюшного тифа; палочки, образующие цепочки клеток, например Azotobacter – азотфиксирующая бактерия; Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы. Некоторые бациллы образуют эндоспоры, которые находятся в разном положении, имеют разные размеры и форму: овальная спора находится в центре и не вызывает набухания клетки, например у Bacillus anthracis; сферическая спора находится на конце материнской клетки, придает ей характерную форму барабанной палочки, например, Clostridium tetani- возбудитель столбняка; спора находится в субтерминальном положении, вызывая набухание клетки, например у Clostridium botulinum (споры могут занимать и центральное положение) – возбудитель смертельного пищевого отравления – ботулизма. Вибрионы – короткие палочки, всегда изогнутые в виде запятой, например, Vibrio cholerae - возбудитель холеры, имеет один жгутик. Бактерии способны образовывать капсулы и слизистые слои. Капсулы и слизистые слои – это слизистые или клейкие выделения некоторых бактерий, такие выделения хорошо видны после негативного контрастирования (когда окрашивают не препарат, а фон). Капсула представляет собой относительно толстое и компактное образование, а слизистый слой намного рыхлее. В некоторых случаях слизь служит для формирования колоний из отдельных клеток. И капсула, и слизистые слои служат дополнительной защитой для клеток. Так, например, инкапсулированные штаммы пневмококков свободно размножаются в организме человека и вызывают воспаление легких, а некапсулированные штаммы легко атакуются и уничтожаются фагоцитами и поэтому совершенно безвредны. Бактериальная клетка устроена достаточно просто, особенно если сравнить ее с клетками эукариот. Клеточная стенка придает бактериальной клетке определенную форму и жесткость и препятствует осмотическому набуханию и разрыву клеток, когда они, как это часто случается, попадают в гипотоническую среду. Вода, другие малые молекулы и разные ионы легко проникают через крошечные поры в клеточной стенке, но через них не проходят крупные молекулы белков и нуклеиновых кислот. Кроме того, клеточная стенка обладает антигенными свойствами, которые ей придают содержащиеся в ней белки и полисахариды. По строению клеточной стенки бактерий можно разделить на две группы. Одни окрашиваются по Граму, поэтому их называют грамположительными, а другие обесцвечиваются при отмывке красителя, и поэтому их называют грамотрицательными. В клеточной стенке и тех и других есть особая жесткая решетка, состоящая из муреина. Молекула муреина представляет собой правильную сеть из параллельно расположенных полисахаридных цепей, сшитых друг с другом короткими цепями пептидов. Таким образом, каждая клетка окружена сетевидным мешком, составленным всего из одной молекулы. У грамположительных бактерий, например у Lactobacillus, в муреиновую сетку встроены другие вещества, главным образом полисахариды и белки. Так вокруг клетки создается сравнительно толстая и жесткая упаковка. У грамотрицательных бактерий, например, у Escherichia coli или у Azotobacter, клеточная стенка гораздо тоньше, но устроена она сложнее. Муреиновый слой у этих бактерий снаружи покрыт мягким и гладким слоем липидов. Это защищает их от лизоцима содержащегося в биологических жидкостях. Он катализирует гидролиз определенных связей между остатками углеводов и таким образом расщепляет полисахаридную основу муреина. Клеточная стенка разрывается, и, если клетка находится в гипотоническом растворе, происходит ее лизис (клетка осмотически набухает и лопается). Липидный слой придает клетке устойчивость и к пенициллину. Этот антибиотик препятствует образованию сшивок в клеточной стенке грамположительных бактерий, что делает растущие клетки более чувствительными к осмотическому шоку. Многие бактерии подвижны, и эта подвижность обусловлена наличием у них одного или нескольких жгутиков. Жгутики у бактерий устроены гораздо проще, чем у эукариот, и по своей структуре напоминают одну из микротрубочек эукариотического жгутика. Жгутики состоят из одинаковых сферических субъединиц белка флагеллина (похожего на мышечный актин), которые расположены по спирали и образуют полый цилиндр диаметром около 10-20 нм. Несмотря на волнистую форму жгутиков, они довольно жестки. Жгутики приводятся в движение посредством уникального механизма. Основание жгутика вращается так, что жгутик как бы ввинчивается в среду, не совершая беспорядочных биений, и таким образом продвигает клетку вперед. Это, очевидно, единственная известная в природе структура, где используется принцип колеса. Другая интересная особенность жгутиков – это способность отдельных субъединиц флагеллина спонтанно собираться в растворе в спиральные нити. Спонтанная самосборка – очень важное свойство многих сложных биологических структур. В данном случае самосборка целиком обусловлена аминокислотной последовательностью (первичной структурой) флагеллина. Подвижные бактерии могут передвигаться в ответ на определенные раздражители, т. е. они способны к таксису. Так, аэробные бактерии обладают положительным аэротаксисом (движутся туда, где среда богаче кислородом), а подвижные фотосинтезирующие бактерии – положительным фототаксисом (движутся к свету). На клеточной стенке некоторых грамотрицательных бактерий видны тонкие выросты (палочковидные белковые выступы), которые называются пили или фимбрии. Они короче и тоньше жгутиков и служат для прикрепления клеток друг к другу или к какой-нибудь поверхности, придавая специфическую «липкость» тем штаммам, которые ими обладают. Пили бывают разного типа. Наиболее интересны так называемые F-пили, которые кодируются специальной плазмидой и связаны с размножением бактерий. Плазмиды придают своим клеткам-хозяевам целый ряд особых свойств. Некоторые плазмиды являются «факторами резистентности» (R-плазмиды, или R-факторы), т. е. факторами, придающими устойчивость к антибиотикам. Примером может служить пенициллиназная плазмида стафилококков, которая трансдуцируется различными бактериофагами. В этой плазмиде содержится ген, кодирующий фермент пенициллиназу, которая разрушает пенициллин и, таким образом, придает устойчивость к пенициллину. Другие плазмидные гены определяют устойчивость к дезинфицирующим средствам; способствуют таким заболеваниям, как стафилококковая импетиго; помогают молочнокислым бактериям превращать молоко в сыр, придают способность усваивать такие сложные вещества, как углеводороды, что можно использовать для борьбы с загрязнениями океана или для получения кормового белка из нефти. Как у всех клеток, протоплазма бактерий окружена полупроницаемой мембраной. По структуре и функциям плазматические мембраны бактерий не отличаются от мембран эукариотических клеток. У некоторых бактерий плазматическая мембрана впячивается внутрь клетки и образует мезосомы и (или) фотосинтетические мембраны. Мезосомы – складчатые мембранные структуры, на поверхности которых находятся ферменты, участвующие в процессе дыхания. Следовательно, мезосомы можно назвать примитивными органеллами. Во время клеточного деления мезосомы связываются с ДНК, что, по-видимому, облегчает разделение двух дочерних молекул ДНК после репликации и способствует образованию перегородки между дочерними клетками. У фотосинтезирующих бактерий в мешковидных, трубчатых или пластинчатых впячиваниях плазматической мембраны находятся фотосинтетические пигменты (в том числе бактериохлорофилл). Сходные мембранные образования участвуют и в фиксации азота. ДНК бактерий представлена одиночными кольцевыми молекулами длиной около 1 мм. Каждая такая молекула состоит примерно из 5х106 пар нуклеотидов. Суммарное содержание ДНК (геном) в бактериальной клетке намного меньше, чем в эукариотической, а, следовательно, меньше и объем закодированной в ней информации. В среднем такая ДНК содержит несколько тысяч генов, что примерно в 500 раз меньше, чем в клетке человека. Индивидуальный рост и бесполое размножение бактерий. Отношение поверхность/объем у бактериальных клеток очень велико. Это способствует быстрому поглощению питательных веществ из окружающей среды за счет диффузии и активного транспорта. В благоприятных условиях бактерии растут очень быстро. Рост, прежде всего, зависит от температуры и рН среды, доступности питательных веществ и концентрации ионов. Облигатным аэробам обязательно нужен еще и кислород, а облигатным анаэробам, наоборот, нужно, чтобы его совсем не было. Достигнув определенных размеров, бактерии переходят к бесполому размножению (бинарному делению), т. е. начинают делиться с образованием двух дочерних клеток. Переход к делению диктуется отношением объема ядра к объему цитоплазмы. Перед клеточным делением происходит репликация ДНК, во время которой мезосомы удерживают геном в определенном положении. Мезосомы могут прикрепляться и к новым перегородкам между дочерними клетками и каким-то образом участвовать в синтезе веществ клеточной стенки. У самых быстрорастущих бактерий деление происходит через каждые 20 мин; интервал между делениями называется временем генерации. Половое размножение, или генетическая рекомбинация. У бактерий наблюдается и половое размножение, но в самой примитивной форме. Половое размножение бактерий отличается от полового размножения эукариот тем, что у бактерий не образуются гаметы и не происходит слияния клеток. Однако главнейшее событие полового размножения, а именно обмен генетическим материалом, происходит и в этом случае. Этот процесс называется генетической комбинацией. Часть ДНК (очень редко вся ДНК) клетки-донора переносится в клетку-реципиент, ДНК которой генетически отличается от ДНК донора. При этом перенесенная ДНК замещает часть ДНК реципиента. В процессе замещения ДНК участвуют ферменты, расщепляющие и вновь соединяющие цепи ДНК. При этом образуется ДНК, которая содержит гены обеих родительских клеток. Такую ДНК называют рекомбинантной. У потомства, или рекомбинантов, наблюдается заметное разнообразие признаков, вызванное смешением генов. Такое разнообразие признаков очень важно для эволюции и является главным преимуществом полового размножения. Известны три способа получения рекомбинантов. Это трансформация, конъюгация и трансдукция. При трансформации клетки донора и реципиента не контактируют друг с другом. Этот процесс открыл Гриффит в 1928 г, работая с пневмококками. У пневмококков имеются колонии двух типов, которые различаются по внешнему виду. Одни колонии – шероховатые – R-штаммы (R – от англ. rough - шероховатый), другие – гладкие – S-штаммы (S – от англ. Smooth – гладкий, ровный). R-штаммы не патогенны и не образуют капсулы; S-штаммы патогенны, и у них имеются толстые капсулы. Гриффит обнаружил, что если мышам ввести живые R-клетки и мертвые (убитые нагреванием) S-клетки, то мыши погибают через несколько дней, а в крови у них можно обнаружить живые S-клетки. На этом основании Гриффит сделал вывод, что из мертвых S-клеток высвобождается какой-то фактор, который придает R-клеткам способность образовывать капсулу и предохраняет их от разрушения в организме животного-хозяина. Оказалось, что такая «трансформация» наследуется. В настоящее время известно, что при трансформации из клетки-донора выходит небольшой фрагмент ДНК, который активно поглощается клеткой-реципиентом и включается в состав ее ДНК, замещая в ней похожий, хотя и не обязательно идентичный фрагмент. Трансформация наблюдается лишь у немногих бактерий, в том числе и у некоторых так называемых «компетентных» штаммов пневмококков, у которых ДНК может проникать в клетку-реципиента. При трансдукции небольшой двухцепочечный фрагмент ДНК попадает из клетки-донора в клетку-реципиент вместе с бактериофагом. Некоторые вирусы способны встраивать свою ДНК в ДНК бактерий; такая встроенная ДНК реплицируется одновременно с ДНК хозяина и передается от одного поколения бактерий к другому. Время от времени такая ДНК активируется и начинает кодировать образование новых вирусов. ДНК хозяина (бактерии) разрывается, а высвобожденные фрагменты иногда захватываются внутрь новых вирусных частиц, порой даже вытесняя ДНК самого вируса. Такие новые «вирусы», или трансдуцирующие частицы, затем переносят ДНК в клетки других бактерий. Питание бактерий. В соответствии с типом питания самой важной является группа хемогетеротрофных бактерий. По способу добывания пищи эти бактерии можно разделить на три группы: сапрофиты, симбионты и паразиты. Сапрофиты - это организмы, которые извлекают питательные вещества из мертвого и разлагающегося органического материала. Сапрофиты секретируют ферменты в органическое вещество, так что переваривание происходит вне организма. Образующиеся при этом растворимые продукты всасываются и усваиваются (ассимилируются) уже внутри тела сапрофита. Сапрофитные бактерии составляют группу редуцентов. Они необходимы для разложения веществ и круговорота элементов в природе. Редуценты образуют гумус из останков животных и растений, но они могут разрушать и другие вещества, в том числе нужные человеку, например портить пищевые продукты. Примерами симбионтов могут служить Rhizobium - бактериясимбионт, способная фиксировать азот и живущая в корневых клубеньках бобовых растений, или Escherichia coli, обитающая в кишечнике и участвующая в образовании витаминов группы В и К. Бактерии-паразиты, вызывающие различные заболевания, называют патогенами. Паразит-это организм, живущий внутри другого организма (хозяина) или на нем. Организм-хозяин обеспечивает паразита пищей и убежищем. Хозяином может быть любой организм, причем паразит, как правило, наносит вред своему хозяину. Одни паразиты могут жить и расти только в живых клетках и поэтому называются облигатными паразитами. Другие заражают хозяина, вызывают его гибель и затем питаются сапрофитно его остатками; такие паразиты называются факультативными. Один из признаков паразита - чрезвычайная взыскательность к составу пищи. Все паразиты нуждаются в «дополнительных ростовых веществах», которые они не могут сами синтезировать и находят их только в других живых клетках. Значение бактерий. Микроорганизмы имеют большое значение они играют важную роль в биосфере, их преднамеренно можно использовать в нужных целях для человека и при этом самыми разными способами. Бактерии играют важную роль в плодородии почвы, в частности сапрофитные бактерии участвуют в образовании гумуса из лесной подстилки и лежащих на ней гниющих растительных и животных. При разложении органических остатков образуются двуокись углерода, аммиак, минеральные соли (например, фосфаты и сульфаты) и вода, которые снова вступают в круговорот веществ. Азотфиксирующие бактерии, такие, как свободно живущие сапрофиты, например Azotobacter, или симбионты, например Rhizobium участвуют в кругообороте азота, серы и фосфора; нитрифицирующие бактерии, например Nitrosomonas и Nitrobacter, превращают азот, связанный в органических соединениях (например, в белках), в нитраты; денитрифицирующие бактерии, например Thiobacillus, превращают нитрат в свободный азот. Кроме того, в очистных сооружениях бактерии играют почти такую же роль, как в почве. И в том и в другом случае они расщепляют органические вещества, превращая их в безвредные растворимые неорганические соединения. Бытовые сточные воды предварительно разделяют в специальных отстойниках на жидкую часть и илистый осадок, которые затем перерабатывают в несколько этапов, используя аэробные и анаэробные бактерии. Метан, образуемый анаэробными бактериями, иногда используют как топливо для рабочих механизмов очистных сооружений. После очистки получают очищенную жидкость, которую обычно спускают в реки, и ил, состоящий из безвредных органических и неорганических веществ и микроорганизмов (в основном бактерий и простейших), который можно затем высушить и, если он не загрязнен тяжелыми металлами, использовать вместо удобрения. Важную роль играют бактерии и в организме животных. Так, млекопитающие и другие животные не могут переваривать целлюлозу, так как у них нет фермента целлюлазы. Основную же массу пищи, поедаемой травоядными животными, составляет клетчатка. Однако у них в кишечнике живут симбиотические бактерии и простейшие, переваривающие клетчатку. У кроликов такие бактерии живут в слепой кишке и червеобразном отростке, а у коров и овец – в рубце. Косвенным образом эти бактерии служат и человеку, поскольку он использует мясо домашних животных в пищу. Более непосредственное отношение к человеку имеет «микрофлора» его собственного кишечника. В кишечнике живут многие бактерии, при этом некоторые из них, например Escherichia coli, синтезируют витамины группы В и витамин К. Некоторые бактерии, живущие на коже человека, предохраняют его от заражения патогенными организмами. Следует отметить важную роль бактерий в промышленных процессах брожения. Многие полезные органические продукты получаются в результате брожения, и человек использует их уже несколько тысяч лет. Продукты брожения становятся все более важными как новый источник пищи и топлива. Этими вопросами занимаются многие ученые и технологи. При производстве сыра молочный сахар лактоза сбраживается до молочной кислоты, а кислота заставляет свертываться белок молока казеин. Твердые сгустки, состоящие из белка и жиров, отделяют от жидкой сыворотки и затем инокулируют бактерии. Для получения разных сортов сыра используют разные микроорганизмы, так, например, чеддер получают с помощью различных видов Lactobacillus. Молочнокислые стрептококки сквашивают сливки и придают сливочному маслу характерный вкус и аромат. Молочнокислые бактерии из рода Lactobacillus применяют также для квашения капусты, приготовления различных солений и маринадов, для получения силоса. С 30-х годов прошлого столетия многие исследователи начали заниматься выделением из бактерий и грибов природных веществ, обладающих антибиотическими свойствами, т. е. способных либо подавлять рост, либо совсем убивать других микробов. Эти исследования продолжаются по сей день. Антибиотики находят применение в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, промышленности и чисто научных исследованиях. Самый богатый источник антибиотиков – организмы, живущие в почве. В почвенных микроэкосистемах чрезвычайно развита конкуренция между отдельными обитателями, а антибиотики входят в тот природный «арсенал», который нужен для захвата экологической ниши. Образцы почв из всех районов мира постоянно анализируют в поисках новых сильнодействующих источников антибиотиков. антибиотиков служит Одним род из самых Streptomyces. продуктивных К этому роду принадлежат многие виды актиномицетов, у которых обнаружено и идентифицировано свыше 500 антибиотиков. Свыше 50 таких антибиотиков широко применяется в практике; к их числу относятся стрептомицин, хлорамфеникол и различные антибиотики тетрациклинового ряда. 4. СТРУКТУРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ Эукариотическая клетка в сравнении с прокариотической представляет собой более сложное образование. Важнейшим отличием эукариот является организация внутреннего объема клетки, уже не представляющего собой единое пространство, но разделенного внутренними мембранами на множество различных отсеков – компартментов (органелл). Добавить из Дерябина – отсканировать с 155 -162 4.1. Цитоплазматическая мембрана Мембраны играют ключевую роль как в структурной организации, так и в функционировании всех клеток – прокариотических и эукариотических, растительных и животных. Мембраны формируют внутриклеточные компартменты (отсеки), с их помощью происходит разделение содержимого компартментов и окружающей их среды. Мембраны не только разделяют клетку на отдельные компартменты, но и участвуют в регуляции всех связей и взаимодействий, которые осуществляются между наружной и внутренней сторонами этих компартментов. Это может проявляться в виде физического переноса ионов или молекул через мембрану (внутрь компартмента или из него) или в форме передачи информации при помощи конформационных изменений, индуцируемых в мембранных компонентах. Кроме того, с мембранами связаны многие клеточные ферменты. Некоторые из них катализируют трансмембранные реакции, когда реагенты находятся по разные стороны мембраны или когда каталитический акт сопровождается транспортом молекул. Другие ферменты образуют своеобразные комплексы, которые осуществляют цепь последовательных превращений, причем благодаря тому, что эти ферменты располагаются в плоскости мембраны, повышается эффективность всего процесса. Имеются ферменты, которые, действуя на мембраносвязанные субстраты, участвуют тем самым в биосинтезе мембран. С участием мембран в той или иной степени осуществляется большинство жизненно важных клеточных функций, например, протекают такие разные процессы, как репликация прокариотической ДНК, биосинтез белков и их секреция, биоэнергетические процессы и функционирование систем гормонального ответа. Данные, полученные при изучении клеток млекопитающих методом электронной микроскопии, свидетельствуют о наличии широко развитой сети внутриклеточных мембранных образований, которая занимает значительную часть внутреннего объема клетки. Сейчас уже не вызывает сомнений, что основные принципы структурной организации всех этих мембран по сути одинаковы. Более того, эти принципы соблюдаются также и в случае мембран растительных и бактериальных клеток. Основные закономерности, установленные Робертсоном в конце 1950-х гг, позволяют нам переносить результаты, полученные при исследовании одной мембранной системы (например, мембраны эритроцитов), на другие системы (конечно, со всеми необходимыми предосторожностями). Естественно, учет специфики здесь необходим, поскольку, как это ни парадоксально звучит, одной из самых характерных особенностей мембран является их чрезвычайное разнообразие. Такое разнообразие обусловлено, прежде всего, разнообразием белков, присутствующих в каждой мембране, и способов их взаимодействия друг с другом и с компонентами цитоплазмы. Эти взаимодействия, в конечном счете, проявляются в специфической морфологии мембранных образований (таких, как микроворсинки кишечного эпителия или тубулярный эндоплазматический ретикулум) и могут быть связаны с латеральной гетерогенностью той или иной мембраны. Плазматическая мембрана образует границу, на которой осуществляется контакт клетки с ее окружением. Она содержит специализированные компоненты, участвующие в межклеточных контактах и взаимодействиях, в системах гормонального ответа и транспорта как малых, так и больших молекул из клетки и внутрь ее. Однако и сама плазматическая мембрана состоит из специализированных участков, которые имеют различное окружение – это апикальный и базолатеральный участки. Апикальная мембрана контактирует с какой-либо внутриклеточной средой. Так, у гепатоцитов она обращена в просвет желчных канальцев, а у эпителиальных клеток кишечника – в просвет желудочно-кишечного тракта. Она может иметь специализированные структуры, например микроворсинки. Последние в некоторых всасывающих клетках образуют щеточную каемку. Микроворсинки значительно увеличивают площадь поверхности мембраны, в результате чего повышается эффективность мембранного транспорта. Базолатеральная мембрана находится в контакте с другими клетками (в этом случае она называется латеральной или контактной) или обращена в просвет кровеносных сосудов (и называется синусоидной мембраной). Латеральная и синусоидная мембраны гепатоцитов различаются как по своей морфологии, так и биохимически. Базолатеральная мембрана, например, гепатоцитов, имеет также специализированные структуры, ответственные за межклеточную адгезию и транспорт. Тот факт, что плазматическая мембрана, окружающая клетки, представляет собой вполне определенную структуру, был осознан в середине XIX столетия. На исходе этого столетия Овертон обратил внимание на корреляцию между скоростью, с которой небольшие молекулы проникают в растительные клетки, и их коэффициентом распределения между маслом и водой. Это привело его к мысли о липидной природе мембран. В 1925 г. Гортер и Грендел предположили, что липиды в мембране эритроцитов образуют биомолекулярный слой (липидный бислой). Эта идея возникла на основе результатов элегантного и простого эксперимента. Липиды эритроцитов экстрагировали ацетоном и затем в кювете Лэнгмюра получали из них тонкую пленку на поверхности воды. С помощью поплавка сжимали слой липидных молекул на границе раздела вода-воздух до тех пор, пока этот слой не начинал оказывать сопротивление дальнейшему сжатию. Это явление было объяснено образованием плотноупакованной мономолекулярной липидной пленки. Измерение площади, занимаемой липидами, и сравнение ее с площадью поверхности эритроцитов, из которых эти липиды были экстрагированы, дали соотношение 2:1. Отсюда был сделан вывод, что мембрана эритроцитов состоит из липидных молекул, расположенных в два слоя. По-видимому, этот вывод Гортера и Грендела оказался правильным только благодаря взаимной компенсации ошибок, однако в историческом плане эта работа имела большое значение, поскольку с тех пор концепция липидного бислоя как структурной основы биологических мембран стала доминирующей и на самом деле оказалась верной. Концепция бимолекулярной липидной мембраны получила дальнейшее развитие в предложенной в 1935 г. модели Дэвсона-Даниелли, или модели «сэндвича», в которой предполагалось, что белки покрывают поверхность липидного бислоя. Это была необыкновенно удачная модель, и в течение последующих 30 лет многочисленные экспериментальные данные, особенно полученные с помощью дифракции рентгеновских лучей и электронной микроскопии, полностью подтвердили ее адекватность. Однако тогда же обнаружилось, что мембраны выполняют огромное множество функций, и чтобы объяснить этот феномен, исходная модель Дэвсона-Даниелли неоднократно подвергалась модификациям. Быстрый прогресс в мембранологии, в результате которого сформировались современные представления, был достигнут в значительной мере благодаря успехам в изучении свойств мембранных белков. Электронно-микроскопические исследования с применением метода замораживания-скалывания показали, что в мембраны встроены глобулярные частицы. В этих случаях препараты быстро замораживают, не подвергая их при этом каким-либо повреждающим воздействиям, как при получении тонких срезов. Процесс подготовки препарата включает следующие операции: 1. После замораживания образец, представляющий собой суспензию клеток или мембран, скалывают с помощью ножа при низкой температуре (– 100 °С) в глубоком вакууме. Возникающие при скалывании усилия приводят к образованию среза, проходящего через образец. Оказалось, что, когда плоскость среза проходит через мембрану, последняя раскалывается преимущественно по своей срединной области и расщепляется на две половинки. В результате на образовавшихся плоскостях скола обнажается внутренняя область мембраны. 2. При необходимости образец подвергают травлению – проводят обычную возгонку льда в вакууме. Это позволяет лучше визуализировать поверхностные структуры клеточных мембран. 3. После этого получают так называемую реплику с обнаженной поверхности. Именно эту реплику и изучают под электронным микроскопом. Для получения реплики сначала напыляют на образец платину под углом около 45°, чтобы выявить топологические характеристики препарата. Затем платиновой реплике придают механическую прочность, нанеся на нее слой углерода. После этого препарат оттаивают, реплика всплывает, и ее вылавливают с помощью специальной сеточки. Наиболее характерные структуры, наблюдаемые при изучении мембран методом замораживания-скалывания – это многочисленные внутримембранные частицы диаметром от 80 до 100 А, лежащие в плоскости мембранных сколов. Обычно они расположены хаотично, но иногда образуют группы. Многочисленные исследования показали, что эти частицы, возможно, являются мембранными белками. Любопытно, что при электронной микроскопии тонких срезов подобные структуры не обнаруживаются. Реплики, полученные от двух половинок расщепленной мембраны, не всегда бывают топологически комплементарными. Это означает, что некоторые частицы связаны только с одной из половин мембраны. Данные, полученные методом замораживания-скалывания, широко использовались Сингером и Николсоном при создании жидкостномозаичной модели мембран, поскольку они убедительно показывали, что глобулярные белки находятся не только на поверхности мембраны, но и внутри бислоя. Тем временем биохимикам удалось диссоциировать мембраны до состояния функционально активных «частиц». Данные спектральных исследований указывали, что для мембранных белков характерно высокое содержание α-спиралей и что они, вероятно, образуют глобулы, а не распределены в виде монослоя на поверхности липидного бислоя. Неполярные свойства мембранных белков наводили на мысль о наличии гидрофобных контактов между белками и внутренней неполярной областью липидного бислоя. Тогда же были разработаны методы, позволившие выявить текучесть липидного бислоя. Сингер и Николсон свели воедино все эти идеи, создав жидкостно-мозаичную модель. В рамках этой модели мембрана представляется как текучий фосфолипидный бислой, в который погружены свободно диффундирующие белки. Прежняя модель ДэвсонаДаниелли была статичной и успешно объясняла имевшиеся в то время стркутурные данные, полученные с довольно низким разрешением. В то же время, начиная с 1970 г. большое внимание стало уделяться изучению динамических свойств и их взаимосвязи с мембранными функциями. В последние годы жидкостно-мозаичная модель тоже подверглась модификации, и этот процесс будет продолжаться. В частности, теперь стало ясно, что не все мембранные белки свободно диффундируют в жидком липидном бислое. Имеются данные о существовании латеральных доменов в самой мембране. 4.2. Состав мембран Основными компонентами мембран являются белки и липиды. На долю углеводов может приходиться около 10% массы мембран, при этом они всегда входят в состав гликолипидов или гликопротеинов. Соотношение между белками и липидами в мембранах значительно варьирует – от 20% (по массе сухого вещества) белка в миелине до 80% в митохондриях. Плотность мембран прямо пропорциональна содержанию в них белка. Судя по данным изопикнического центрифугирования, чем выше содержание белка в мембране, тем больше ее плотность. Белковый состав мембраны зависит в какой-то степени от метода ее выделения. Некоторые белки непрочно связаны с мембраной и легко удаляются при промывании ее растворами с высокой или, напротив, с низкой ионной силой, щелочными растворами или растворами, содержащими хелатирующие агенты типа ЭДТА. При этом трудно сказать, является ли белок мембранным или цитоплазматическим, случайно связавшимся с мембраной в ходе ее выделения. 4.2.1. Мембранные липиды Следует отметить в мембранных липидах их огромное разнообразие. Причины этого пока не ясны, хотя становится все более очевидно, что, повидимому, связано это с тем разнообразием функций, которые липиды выполняют в мембранах. Но, конечно, главная функция мембранных липидов состоит в том, что они формируют бислойный матрикс, с которым взаимодействуют белки. Различают следующие основные классы липидов. Глицерофосфолипиды – это наиболее распространенные липиды. Одна из гидроксильных групп глицерола связана с полярной группировкой, содержащей фосфат, а две другие – с гидрофобными остатками. Среди глицерофосфолипидов выделяют: 1. 1,2-диацилфосфоглицериды или фосфолипиды. Эти липиды, являющиеся сложными эфирами жирных кислот и глицерола, широко представлены во многих мембранах эукариотических и прокариотических клеток, за исключением архебактерий. В частности, фосфатидилхолин является основным компонентом мембран животных клеток, а фосфатидилэтаноламин – это нередко основной липид бактериальных мембран. 2. Кардиолипины или дифосфатидилглицеролы – это димерные формы фосфолипидов. Они содержатся в большом количестве во внутренней мембране митохондрий, в мембране хлоропластов и в некоторых бактериальных мембранах, но редко встречаются в других мембранах. 4. Плазмалогены – это фосфоглицеролипиды, у которых одна из углеводородных цепей представляет собой простой виниловый эфир Этаноламиновые плазмалогены широко представлены в миелине и в саркоплазматическом ретикулуме сердца. Фосфосфинголипиды – эти липиды имеют такие же полярные головки (например, фосфорилхолин), как и глицерофосфолипиды, но их гидрофобная часть представлена церамидом. В плазматических мембранах животных клеток широко распространен сфингомиелин (церамид-1-фосфорил-холин). В мембранах растительных и бактериальных клеток фосфосфинголипиды встречаются редко. Кроме сфингомиелина известны и другие фосфосфинголипиды, например церамид-1-фосфорилэтаноламин, церамид-1фосфорилинози-тол и церамид-1-фосфорилглицерол. Гликоглицеролипиды – это полярные липиды, у которых в 3положении глицерола находится углевод, присоединенный с помощью гликозидной связи, например галактоза. Гликоглицеролипиды широко представлены в мембранах хлоропластов, они обнаружены также в заметных количествах в сине-зеленых водорослях и бактериях. Моногалактозилдиацилглицерол был назван «наиболее распространенным в природе полярным липидом», поскольку на его долю приходится половина всех липидов тилакоидной мембраны хлоропластов. Для мембран грамположительных бактерий характерны гликоглицеролипиды с большим разнообразием сахаров. Архебактерии также содержат такие липиды, но, как и в случае глицерофосфолипидов, их стереохимическая конфигурация является обращенной. В мембранах животных клеток гликоглицеролипиды встречаются редко. Гликосфинголипиды – эти липиды содержат углеводы, присоединенные с помощью гликозидной связи к концевой гидроксильной группе церамида. Их классифицируют в соответствии с размером углеводной части, которая может быть представлена всего лишь одним моносахаридным остатком, с одной стороны, и очень сложным углеводным полимером – с другой. Моногликозилцерамиды обычно называют цереброзидами. Ганглиозиды представляют собой класс анионных гликосфинголипидов, которые содержат один или несколько остатков сиаловой кислоты (Nацетилнейраминовой кислоты, NeuNAc), связанных с сахарными остатками церамидолигосахарида. Глобозидами называют нейтральные гликосфинголипиды, которые не содержат остатков отрицательно заряженной сиаловой кислоты. Гликосфинголипиды находятся на наружной поверхности плазматических мембран животных клеток; обычно они являются минорными компонентами, но иногда содержатся в значительных количествах (например, в плазматических мембранах эпителиальных клеток). Одним из основных компонентов миелиновой оболочки нервного волокна является моногалактозилцерамид. В некоторых случаях гликосфинголипиды локализуются не в плазматической мембране, а во внутриклеточных мембранах. Следует отметить, что гликосфинголипиды мембран эритроцитов несут антигены группы крови. В клетках аденокарциномы человека накапливаются необычные фукозилированные гликосфинголипиды, которые можно использовать для обнаружения этих клеток и контроля за развитием опухоли. Стеролы – эти липиды присутствуют во многих мембранах растений, животных и микробов. По-видимому, самым распространенным из стеролов является холестерол. Его молекула состоит из компактного, жесткого гидрофобного ядра, а полярной головкой является гидроксильная группа. Холестерол содержится в плазматических мембранах животных клеток, в лизосомах, эндосомах и в мембранах аппарата Гольджи. Он составляет около 30% всей массы мембранных липидов во многих плазматических мембранах животных клеток. В высших растениях обнаружены другие стеролы, чаще всего ситостерол и стигмастерол. Растительные стеролы (фитостеролы) часто имеют еще одну боковую цепь в положении С-24 и/или двойную связь в положении С-22. В мембранах дрожжей и других эукариотических микроорганизмов часто содержится эргостерол. К классу стеролоподобных липидов относят также гопаноиды, которые найдены в бактериях и некоторых растениях. Минорные компоненты. В мембранах присутствуют также и другие липиды, которые можно отнести к разряду минорных компонентов вследствие их малого содержания в мембранах. Так, в мембранах обычно обнаруживаются, хотя и в очень малых количествах, свободные жирные кислоты и лизофосфолипиды. Пожалуй, исключением из этого правила являются мембраны хромаффинных гранул, которые, как известно, содержат необычно много свободных жирных кислот. Минорными компонентами мембран являются также моноацил- и диацилглицеролы. Диацилглицеролы выполняют важную функцию вторых посредников в передаче сигнала при активации клеток рядом биологически активных веществ. В мембранах обычно присутствуют и полиизопреноидные липиды. К ним относятся убихиноны и менахиноны – компоненты цепи электронного транспорта в мембранах. Можно отметить также ундекапренол и долихол, которые являются липидными переносчиками промежуточных продуктов соответственно при биосинтезе клеточной стенки у прокариот и при биосинтезе гликопротеинов в аппарате Гольджи эукариот. Длина молекул этих липидов в вытянутом состоянии значительно превышает толщину бислоя, поэтому неизвестно, как эти молекулы в нем расположены. Неясно также, почему липидными переносчиками служат именно полиизопреноидные структуры. Таким образом, совершенно очевидно, что липидный состав различных мембран не является случайным, однако удовлетворительного объяснения этому феномену не найдено. Любая конкретная мембрана может содержать более ста разных типов липидных молекул. Почему их так много и почему каждая мембрана имеет уникальный липидный состав? Становится все более очевидным, что липиды активно участвуют в процессах, протекающих в мембранах, однако причины их разнообразия неясны. Вместе с тем выделяют некоторые факторы, возможно, определяющие липидный состав мембраны. 1. Смесь липидов обязательно должна быть способна образовать стабильный бислой, в котором могли бы функционировать белки. Некоторые липиды способствуют стабилизации сильно искривленных участков мембраны, образованию контакта между мембранами или связыванию определенных белков, поскольку форма этих молекул благоприятствует нужной упаковке бислоя на соответствующих участках мембраны. 3. Некоторые липиды являются важными биорегуляторами. Наиболее изучена в этом отношении регуляторная роль производных фосфатидилинозитола в плазматических мембранах клеток эукариот. 4. Некоторые липиды участвуют в реакциях биосинтеза. Например, в клетках Е. coli фосфатидилглицерол поставляет глицерофосфатный фрагмент при биосинтезе периплазматических олигосахаридов. 5. Отдельные липиды необходимы для поддержания оптимальной активности ряда ферментов. 6. Ганглиозиды, как полагают, играют важную роль в регуляции роста клеток, являются специфическими рецепторами в плазматической мембране и ответственны за клеточную адгезию. 7. Специфические функции могут выполнять и другие липиды. К ним относятся полиизопреноиды (например, долихол, убихиноны, менахиноны и каротиноиды), а также фактор активации тромбоцитов. 4.2.2. Мембранные белки Мембранные белки – обязательные компоненты биологических мембран. Мембраны содержат от 20 до 80% (по весу) белка. Как правило, именно белки ответственны за функциональную активность мембран. В среднем в липопротеидных мембранах белки по массе составляют 50%. Но количество белков в разных мембранах может быть различным. Так, в мембранах митохондрий на долю белков приходится около 75%, а в плазматической мембране клеток миелиновой оболочки – около 25%. Но так как липидные молекулы имеют небольшой размер (около 0,5 нм) и невысокую молекулярную массу, их число в 50 раз выше числа белковых молекул. Поэтому белковые молекулы как бы вкраплены в билипидный слой мембраны. Часть из них связана с липидными головками с помощью ионных (солевых) связей и поэтому легко экстрагируется из мембран растворами солей. Другие образуют солевые связи с полярными участками липидов через взаимодействие с ионами Mg2+ или Са2+. Данные белки экстрагируются с помощью хелатных соединений, таких как версен (ЭДТА). Эти легко экстрагируемые белки большей частью расположены на мембранах со стороны цитоплазмы и в цитоплазматической мембране тесно связаны с белковыми структурами цитоскелета. Большая часть белков взаимодействует с липидами в составе мембран. Оказалось, что многие мембранные белки состоят как бы из двух частей: из участков, богатых полярными (несущими заряд) аминокислотами, и участков, обогащенных неполярными аминокислотами (глицином, аланином, валином, лейцином). Эти белки в липидных слоях мембран располагаются так, что их неполярные участки как бы погружены в «жирную» часть мембраны, где находятся гидрофобные участки липидов. Полярная (гидрофильная) часть таких белков взаимодействует с головками липидов и обращена в сторону водной фазы, поэтому эти белки, связанные с липидами путем гидрофобных взаимодействий, практически не экстрагируются в водных фазах. Их можно выделить, лишь разрушая мембрану, экстрагируя из нее липиды или органическими растворителями, или детергентами. Поэтому эти белки мембран и называют интегральными. Выделяют следующие основные виды мембранных белков, исходя из их функции. 1. Структурные белки. Белки этой группы а) придают клетке и органеллам определенную форму; б) придают мембране (например, плазмолемме) те или иные механические свойства (эластичность и т. п.); в) обеспечивают связь мембраны с цитоскелетом или (в случае ядерной мембраны) с хромосомами. 2. Транспортные белки. Проницаемость мембран определяется их липидным бислоем. Последний же проницаем лишь для ограниченного круга веществ – не очень больших гидрофобных молекул (например, жирных кислот) и совсем мелких молекул (газов, воды и т. д.). Все прочие вещества могут перемещаться через мембрану только при наличии в ней соответствующих белковых транспортных систем. Причем одни из этих систем обеспечивают двусторонний перенос своих лигандов, а другие – только односторонний. В итоге деятельность этих систем дает два основных результата: а) создаются устойчивые транспортные потоки определенных веществ через мембраны (например, в проксимальных канальцах почек – поток глюкозы из первичной мочи в кровь через последовательно расположенную серию мембран); б) кроме того, транспорт ионов приводит к возникновению трансмембранного потенциала во всех клетках, а также к его изменениям в нервных и мышечных клетках и волокнах. Последнее же лежит в основе таких важнейших явлений, как возбудимость и проводимость. 3. Белки, обеспечивающие непосредственное межклеточное взаимодействие. Многочисленные белки этой группы можно поделить, прежде всего, на две совокупности: а) так называемые адгезивные белки необходимы для связывания клеток друг с другом или неклеточными структурами (базальной мембраной, волокнами); б) другие белки участвуют в образовании специализированных межклеточных контактов (десмосом и др.). В свою очередь, в каждой из этих совокупностей можно произвести дальнейшее деление белков, о чем будет речь позднее. 4. Последняя большая группа мембранных белков – белки, участвующие в передаче сигналов от одних клеток к другим. Такая передача осуществляется в очень многих случаях и самыми разными способами. Например, в нервных и нервно-мышечных синапсах с так называемыми ионотропными рецепторами сигнальной молекулой (внеклеточным медиатором) является определенное низкомолекулярное вещество, а плазмолемма воспринимающей клетки содержит: а) рецепторные белки; б) белки эффекторного устройства – ионные каналы, изменяющие свою функцию при связывании лиганда с рецепторами; в) фермент инактивации медиатора. Как видно, участвующие в этом ионные каналы попадают сразу в две функциональные группы: кроме данной, еще и в группу транспортных белков. Помимо того, обычно эти ионные каналы сами же осуществляют и рецепторную функцию (за счет дополнительных субъединиц). Так обстоит, например, дело в случае холинорецепторов – они одновременно являются ионными каналами для катионов. Все это иллюстрирует сложность классификации мембранных белков. Итак, мы перечислили четыре основные функциональные группы мембранных белков, каждая из которых обычно подразделяется далее и объединяет большое количество конкретных белков. Наличие углеводного компонента характерно практически для всех мембран клетки, но особенно для мембран вакуолярной системы и плазматической мембраны. Углеводный компонент мембран представлен главным образом гликопротеинами – молекулами белков, ковалентно (в отличие от нуклеопротеидов) связанных с цепочками углеводов – гликокаликс. Как правило, цепочки углеводов расположены в наружных слоях мембран (для цитоплазматических вакуолей наружными считают слои, обращенные не к матриксу цитоплазмы, а в полость везикул или вакуолей). Они имеют ковалентные связи с интегральными белками, образуя гликопротеиды, или с липидами (гликолипиды). Углеводы мембран представляют собой короткие линейные или разветвленные цепочки, в состав которых входят галактоза, манноза, фруктоза, сахароза, N- ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, пентозы (арабиноза и ксилоза), а также нейраминовая (сиаловая) кислота. Значение этого компонента очень велико для функционирования плазматической мембраны и обеспечения ее механической устойчивости. Как показали электронно-микроскопические исследования, особенно контрастирования с применением полисахаридов, гликокаликс специальных имеет вид методов рыхлого волокнистого слоя толщиной 3–4 нм, покрывающего всю поверхность клетки. Особенно хорошо гликокаликс выражен в щеточной каемке клеток всасывающего эпителия кишечника (энтероциты), однако он обнаружен практически у всех животных клеток, но степень его выраженности различна. Механическая устойчивость плазматической мембраны, кроме того, обеспечивается структурой примыкающего к ней со стороны цитоплазмы кортикального слоя и внутриклеточных фибриллярных структур. Кортикальный (от слова cortex – кора, кожица) слой цитоплазмы, тесно контактирующий с липопротеидной наружной мембраной, имеет ряд особенностей. Здесь в толщине 0,1–0,5 мкм отсутствуют рибосомы и мембранные пузырьки, но в большом количестве встречаются фибриллярные элементы цитоплазмы – микрофиламенты и часто микротрубочки. Основным фибриллярным компонентом кортикального слоя является сеть актиновых микрофибрилл. Здесь же располагается ряд вспомогательных белков, необходимых для движения участков цитоплазмы. Роль этих связанных с актином белков очень важна, так как она объясняет их участие в связи, в «заякоривании» интегральных белков плазматической мембраны. Так, для того чтобы проколоть ее с помощью микроигл или микропипеток, требуется довольно большое усилие. При давлении на нее микроиглы она сначала сильно прогибается, а лишь затем прорываемся. Искусственные липидные мембраны менее устойчивы. Эта механическая устойчивость плазматической мембраны может определяться дополнительными компонентами, такими как гликокаликс и кортикальный слой цитоплазмы. Т.о., плазматическая мембрана, или плазмалемма, среди различных клеточных мембран периферическая занимает структура, особое место. ограничивающая Это клетку поверхностная снаружи, что обусловливает ее непосредственную связь с внеклеточной средой, а следовательно, со всеми веществами и стимулами, воздействующими на клетку. Поэтому плазматическая мембрана играет роль барьера, преграды между сложно организованным внутриклеточным содержимым и внешней средой. В этом случае плазмалемма выполняет не только роль механического барьера, но, главное, ограничивает свободный поток низко- и высокомолекулярных веществ в обе стороны через мембрану. Более того, плазмалемма выступает как структура, «узнающая», рецептирующая, различные химические вещества и регулирующая избирательно транспорт этих веществ в клетку и из нее. Другими словами, плазматическая мембрана осуществляет функции, связанные с регулируемым избирательным трансмембранным транспортом веществ, и исполняет роль первичного клеточного анализатора.
