Document 4117733

РАЗРАБОТКА НАУЧНЫХ ОСНОВ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ
ТРИПСИНА И ХИМОТРИПСИНА ИЗ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА ИЗОЛЯТА БЕЛКА СОИ
Хабибулина Н.В., ernestine2007@ya.ru
Красноштанова А.А., aak28@ya.ru
РХТУ имени Д.И.Менделеева, г. Москва
Основным направлением переработки сои является производство различных белковых
продуктов, в частности, изолята белка сои (ИБС). Однако, помимо высокого содержания белка, соя
характеризуется наличием ингибиторов протеаз (трипсина и химотрипсина), обладающих
иммуностимулирующим, радиопротекторным и антиканцерогенным действием. В ходе производства
ИБС эти ценные вещества не выделяются, а попадают в отходы. В связи с вышесказанным, целью
данной работы явилось получение соевых ингибиторов трипсина и химотрипсина из отходов
производства ИБС.
Типовая технологическая схема получения ИБС предполагает проведение кислотной экстракции
белковых веществ белого лепестка с последующим концентрированием экстракта методом
ультрафильтрации. Далее из концентрата получают изолят, а пермеат является отходом. Именно он в
разрабатываемой технологии явился исходным сырьем для получения ингибиторов трипсина и
химотрипсина.
Ингибиторы сои относятся к двум семействам – это ингибиторы Кунитца и ингибиторы БауманаБирка. Основываясь на свойствах ингибиторов, нами были предложены такие технологические подходы
к их выделению, как разделение ингибиторов методом ультрафильтрации, с последующим осаждением
разными органическими соединениями.
Первым этапом исследований стало определение возможности выделения ингибиторов с
использованием мембранного разделения, при этом в качестве модельных мембран изучались мембраны
с отсекаемой молекулярной массой 100 и 20 кДа. Согласно проведенным исследованиям, после
концентрирования на УПМ-100 основная масса ингибиторов накапливается в пермеате. При
концентрировании на УПМ-20 в концентрате должен оставаться ингибитора Кунитца, а в пермеат
должен переходить ингибитор Баумана-Бирка. Однако, концентрат после ультрафильтрации на УПМ-20
содержит значительное остаточное количество ингибитора Баумана-Бирка. Для очистки концентрата от
указанного ингибитора нами был применен метод диафильтрации, при этом оптимальная кратность
процесса равнялась двум.
Следующим этапом исследований стало выделение ингибиторов из белковых растворов
осаждением органическими растворителями с определением оптимальных гидромодулей органических
растворителей. Было установлено, что оптимальным гидромодулем для осаждения ингибитора Кунитца
является гидромодуль спирта 1:2, а для осаждения ингибитора Баумана-Бирка – гидромодуль ацетона
1:1.
Проверка полученных нами препаратов ингибиторов на гомогенность (с помощью электрофореза
в полиакриламидном геле) показала, что они соответствуют контрольным препаратам ингибиторов, а
результаты теста на острую токсичность с использованием тест-культуры инфузорий Tetrachimena
pyriformis свидетельствуют об отсутствии таковой у полученных препаратов ингибиторов трипсина и
химотрипсина.
Соевые ингибиторы в последнее время привлекают внимание исследователей в связи с их
радиопротекторными свойствами. Мы исследовали влияние полученных нами ингибиторов трипсина и
химотрипсина на выживаемость клеток дрожжей при воздействии агентов окислительного стресса. При
этом на биомассу дрожжей Saccharomyces cerevisiae оказывалось воздействие жестким УФ-облучением в
течение различных промежутков времени либо пероксидом водорода различной концентрации, после
чего осуществляли подсчет живых и мертвых клеток. Такой эксперимент проводился как с исходной
культурой дрожжей, так и с культурой, предобработанной препаратами ингибиторов в концентрациях от
0,01 до 1г/л. Было установлено, что полученные препараты ингибиторов Кунитца и Баумана-Бирка
обладают заметным защитным действием при добавлении их к культуре клеток дрожжей во всем
исследованном диапазоне концентраций ингибиторов.
Таким образом, в результате проведенных исследований нами была разработана принципиальная
схема получения соевых ингибиторов совместно с производством соевого изолята. Схема включает в
себя две стадии ультраконцентрирования с использованием мембран с отсекаемой молекулярной массой
100 и 20 кДа, причем концентрат после первого концентрирования служит для получения изолята белка
сои, а пермеат – сырьем для выделения ингибиторов. В ходе второго ультраконцентрирования и
проведения двух стадий диафильтрации происходит разделение ингибиторов Кунитца и Баумана-Бирка.
Затем следует стадия осаждения ингибиторов, причем ингибитор Кунитца осаждается из диаконцентрата
спиртом с гидромодулем 1:2, а ингибитор Баумана-Бирка – из пермеата ацетоном с гидромодулем 1:1.
1
Также в ходе исследований была изучена принципиальная возможность использования
образующихся сточных вод (диафильтрат и кубовые остатки после регенерации органических
растворителей со стадии осаждения) в качестве питательных сред для культивирования
микроорганизмов на примере Candida tropicalis и Endomycopsis fibuligera. Было показано, данные
микроорганизмы способны усваивать питательные компоненты данных стоков.
2