На правах рукописи Абаимов Андрей Владимирович ВЛИЯНИЕ МЕТААРСЕНИТА НАТРИЯ

На правах рукописи
Абаимов Андрей Владимирович
ВЛИЯНИЕ МЕТААРСЕНИТА НАТРИЯ
НА МЕХАНИЗМЫ ИММУНОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА
ЖИВОТНЫХ
03.00.16 – экология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов – 2008
Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Саратовский военный институт
биологической и химической безопасности» МО РФ
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор,
Заслуженный деятель науки РФ
Шляхтин Геннадий Викторович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Тихомирова Елена Ивановна
доктор биологических наук
Цимбал Федор Анатольевич
Ведущая организация:
ФГУП «33 Центральный научно-исследовательский
испытательный институт МО РФ»
Защита состоится «19» декабря 2008 г. в 12 часов на заседании
диссертационного совета Д 212.243.13 при Государственном образовательном
учреждении высшего профессионального образования «Саратовский
государственный университет им. Н. Г. Чернышевского» по адресу: 410012,
г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83. E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке
ГОУ ВПО «Саратовский ГУ».
Автореферат разослан «17» ноября 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
С.А. Невский
Общая характеристика работы
Актуальность исследования. Изучение действия ксенобиотиков на
механизмы иммунорезистентности (неспецифическую резистентность и
адаптивный иммунитет) организма человека и животных является одной из
актуальных проблем современной экологии, поскольку иммунная система
наиболее чувствительна к экотоксикантам (Забродский и др., 1998, 2005,
2007; Vos et al., 1983; Hermann, Kim, 2005 и др.).
В настоящее время при уничтожении мышьяксодержащих боевых
отравляющих веществ первостепенную важность приобретает вопрос об
иммунотоксичности метаарсенита натрия (МАН) – продукта детоксикации
люизита, который при аварийных ситуациях может приводить к загрязнению
почвы и воды (Алимов и др., 2000; Калинина, 2000; Щербаков и др., 2002).
В связи с широким использованием МАН в химической промышленности
возрастает возможность заражения окружающей среды при авариях на
промышленных объектах. Хроническое отравление соединениями мышьяка
признают важной проблемой международного здравоохранения, так как
длительное
воздействие
неорганического
мышьяка
снижает
иммунорезистентность организма, в частности, стимулирует канцерогенез
(Yu et al., 2006). Недостаточность изученности особенностей действия МАН
на иммунный статус человека и животных определяет актуальность
изучения механизмов нарушения иммунорезистентности в теоретическом и
практическом отношениях.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование
влияния МАН на механизмы иммунорезистентности организма животных.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
- изучить влияние МАН на показатели интегральной неспецифической
резистентности
организма,
комплексной
неспецифической
и
иммунологической резистентности организма и доиммунные факторы
защиты от инфекций;
- исследовать воздействие токсиканта на содержание лимфоцитов в
органах системы иммунитета и миграцию Т-клеток из тимуса и Влимфоцитов из костного мозга в селезенку;
- оценить изменения гуморальных иммунных реакций после острого,
подострого и хронического действия МАН, а также изучить влияние
токсиканта на кооперацию Т- и В-лимфоцитов и способность макрофагов к
индукции гуморального и клеточного иммунных ответов;
- изучить изменения функции коры надпочечников, перекисного
окисления липидов, активности эстераз Т-клеток, моноцитов и макрофагов,
3
относительной роли Th1- и Th2-лимфоцитов в нарушении иммунного
статуса при острой, подострой и хронической интоксикации МАН.
Научная новизна. Впервые дана оценка действия МАН на механизмы
неспецифической и специфической иммунорезистентности в организме
экспериментальных животных. Показано, что после острой, подострой и
хронической интоксикации происходит дозозависимое увеличение
летальности животных от экспериментального перитонита, вызванного
E. сoli, что свидетельствует о снижении неспецифической резистентности
организма под влиянием токсиканта. Острое отравление МАН вызывает
дозозависимое увеличение летальности животных от экспериментальной
пневмонии, уменьшение LD50 Р. vulgaris и среднеэффективного времени
жизни животных, обусловливает снижение бактерицидной активности
сыворотки крови, лизоцима и фагоцитарно-метаболической активности
нейтрофилов. Установлено, что при интоксикации МАН происходит
дозозависимое уменьшение миграции Т-клеток из тимуса и В-лимфоцитов из
костного мозга, снижение синтеза IgG В-клетками и функции Th2лимфоцитов, активности естественных клеток-киллеров. Выявлено, что
действие МАН сопровождается утратой способности макрофагов
индуцировать гуморальный иммунный ответ, снижением функции Т- клеток
и дозозависимом уменьшении активности Th1- лимфоцитов.
Впервые показано, что острая интоксикация МАН повышает
концентрацию кортикостерона в плазме крови, который играет весьма
существенную роль в супрессии гуморального и клеточного иммунных
ответов при действии токсичных химических веществ. Экспериментально
установлено, что интоксикация МАН активирует перекисное окисление
липидов, что проявляется снижением активности антиоксидантной системы,
увеличением содержания малонового диальдегида и суммарной продукции
радикалов в плазме крови; выявлена обратная корреляции интенсивности
инициации перекисного окисления липидов с формированием иммунных
реакций. Впервые также установлено, что подострое действие МАН
вызывает снижение функции Th1- и Th2-лимфоцитов в равной степени,
уменьшении концентраций в крови экспериментальных животных ИФН-γ,
синтезируемого Th1-клетками, и ИЛ-4, продуцируемого Th2-лимфоцитами.
Научно-практическая значимость. В результате проведенных
исследований доказано, что при интоксикации МАН развивается
постинтоксикационное иммунодефицитное состояние, проявляющееся в
дозозависимом (при остром действии) снижении интегральных показателей
неспецифической
резистентности
организма,
неспецифической
и
иммунологической резистентности организма и нарушении механизмов
4
формирования адаптивного иммунитета к инфекциям у экспериментальных
животных. Возникающее под влиянием МАН вторичное иммунодефицитное
состояние может вызывать инфекционные заболевания, требующие
применения средств их профилактики.
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедр охраны
окружающей среды и экологической безопасности процессов хранения и
уничтожения химического оружия и токсичных веществ и технологий
уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского
военного института биологической и химической безопасности, кафедры
токсикологии, радиологии и медицинской защиты Саратовского военномедицинского института, кафедры морфологии и экологии животных
Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.
Полученные результаты работы использованы в плановых НИР
Саратовского военного института биологической и химической
безопасности. Материалы работы опубликованы в монографии
«Иммунотоксичность ксенобиотиков», (Саратов, 2007 г.).
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на:
заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и
уничтожения химического оружия Поволжского отделения АВН (2002, 2004,
2006, 2007, 2008 гг.), XIII Международном конгрессе по реабилитации в
медицине и иммунореабилитации и Всемирном форуме по астме (Дубай,
2008 г.), Российской научной конференции «Медико-биологические
проблемы токсикологии и радиологии» (СПб, 2008 г.), ХХХVIII научной
конференции 33 ЦНИИИ МО РФ «Актуальные вопросы теории и практики
радиационной, химической и биологической защиты» (Вольск, 2008 г.), IV
научно-практической
конференции
«Научно-технические
аспекты
обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке
химического оружия» (Москва, 2008 г.), научно-практических конференциях
Саратовского военного института биологической и химической
безопасности (2003 – 2008 гг.), совместном заседании кафедр технологии
уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского
военного института биологической и химической безопасности и кафедры
токсикологии, радиологии и медицинской защиты Саратовского военномедицинского института (2008 г.), кафедре морфологии и экологии
животных ГОУ ВПО “Саратовский государственный университет им.
Н.Г. Чернышевского” (2007, 2008 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, три из
которых в изданиях перечня ВАК РФ.
Декларация личного участия автора. Автор лично участвовал в
5
проведении лабораторных экспериментов. Обработка полученных данных, их
интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В
совместных публикациях вклад автора составил 60-80 %.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на
129 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 7 глав,
заключения, выводов и списка использованных источников. Работа
иллюстрирована 36 таблицей и 12 рисунками. Библиографический указатель
включает 181 источник, 80 – на иностранном языке.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Загрязнение окружающей среды МАН может вызывать снижение
неспецифической иммунологической резистентности организма и
активности адаптивного иммунитета к инфекциям у животных.
2. Интоксикация МАН приводит к уменьшению числа лимфоцитов в
лимфоидных органах, снижению миграции Т-клеток из тимуса и В-клеток из
костного
мозга
и
уменьшения
их
кооперации,
супрессии
антителообразования вследствие нарушения способности макрофагов
индуцировать гуморальный иммунный ответ.
3. Под влиянием МАН поражаются функции преимущественно Тклеток: снижается активность Th1- и Th2-лимфоцитов (в равной степени),
уменьшается продукция ими соответственно ИФН-γ и ИЛ-4, снижается
антителозависимая клеточная цитотоксичность и активность естественных
клеток-киллеров.
4. При воздействии МАН происходит повышение концентрации
кортикостерона в плазме крови, ингибирование эстераз Т-клеток, инициация
перекисного окисления липидов.
Содержание работы
Во введении обосновывается актуальность исследования, его
теоретическая и практическая значимость; сформулированы основная цель и
задачи.
Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ДЕЙСТВИИ
МЫШЬЯКСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ НА НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ
ФАКТОРЫ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА И ИММУННЫЙ СТАТУС
(обзор литературы)
На основании анализа отечественной и зарубежной литературы в
данной главе дается общая характеристика соединений трехвалентного
мышьяка,
токсикологическая
характеристика
МАН.
Приводятся
токсикометрические параметры этого токсиканта, особенности его
воздействия на органы, системы, ткани и клетки живых организмов.
6
Анализируются известные данные о нарушениях доиммунных механизмов
защиты и иммунного статуса под влиянием этого токсиканта и других
мышьяксодержащих соединений.
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Перечень условных сокращений: МАН– метаарсенит натрия; НРО–
неспецифическая резистентность организма; НИРО– неспецифическая и
иммунологическая резистентность организма; ПОЛ– перекисное окисление
липидов; ЭБ– эритроциты барана; АЗКЦ– антителозависимая клеточная
цитотоксичность; АОК– антителообразующие клетки; БАСК– бактерицидная
активность сыворотки крови; ГЗТ– гиперчувствительность замедленного
типа; ЕКК – естественные клетки-киллеры; КС– кортикостерон; ОДЛТА–
отрицательный двоичный логарифм титра антител; ФМАН– фагоцитарнометаболическая активность нейтрофилов; Et50– среднеэффективное время
жизни животных.
Исследования проводили в 2002-2008 гг. на 745 лабораторных крыс и
75 лабораторных мышей обоего пола. Эксперименты на животных
осуществляли в соответствии с требованиями Женевской конвенции
«International Guiding Principles for Biomedical Research Inroling Animals»
(Geneva, 1990).
МАН вводили подкожно в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50. При
моделировании острого действия использовали дозу 0.75 LD50, которая
составляла для мышей и крыс соответственно 40.2+2.0 и 47.1+2.2 мг/кг.
Подострое действие моделировали введением МАН в течение 6 сут в дозе
1/7 LD50, а хроническое – 0.01 LD50 в течение 30 сут. Эти дозы обоснованы
расчетными данными при аварийных ситуациях на химических объектах
общепринятыми методами (Заугольников, 1978).
Интегральную НРО и комплексную НИРО определяли по показателям
течения экспериментальной инфекции, вызванной внутрибрюшинным
введением лабораторным животных взвеси суточной культуры Е. cоli в дозах
1.5, 2.0 и 2.5 млрд. микробных тел без предварительной иммунизации. Для
оценки НИРО моделировали экспериментальную пневмонию путем
введения крысам взвеси суточной культуры Р. vulgaris в дозах 4.0, 6.0, 9.0
млрд. микробных тел в ткань легкого c предварительной иммунизацией
7
данной культурой в дозе 106 микробных тел за 4 сут до моделирования
инфекционного процесса (Забродский, 1987).
Для изучения активности факторов естественной резистентности к
инфекции определяли БАСК, сывороточную активность лизоцима, ФМАН.
Содержание лимфоцитов в органах иммунной системы крыс выявляли
общепринятыми методами (Хаитов и др., 1995; Ройт и др., 2000; Кудаева и
др., 2007). Клеточный иммунный ответ исследовали по функции Тлимфоцитов в тесте оценки секреции ими фактора, ингибирующего
миграцию лейкоцитов (Гембицкий и др., 1987), а также по активности Th1лимфоцитов в реакции ГЗТ, показателю АЗКЦ (Зимин, Ляхов, 1985) и
активности ЕКК (Гордиенко, 1984).
Оценку параметров Т-зависимого и Т-независимого гуморального
иммунного ответа проводили через 5, 8, 14 и 20 сут после острой
интоксикации МАН при иммунизации крыс ЭБ и брюшнотифозным Viантигеном (Vi-Ag) по ОДЛТА к ЭБ и Vi-Ag соответственно, а также по
числу АОК в селезенке (Белокрылов и др., 1980; Jerne, Nordin, 1963). При
подострой интоксикации МАН иммунизацию антигенами осуществляли
через 2 сут после первого введения токсиканта (исследование проводили на
7 сут). При хроническом действии МАН животных иммунизировали на 26
сут хронической интоксикации, исследование проводили на 31 сут.
Миграцию полипотентных стволовых кроветворных клеток (ПСКК) из
костного мозга и Т-клеток из тимуса оценивали общепринятыми методами
(Петров и др., 1981) в организме мышей линии СВА/J. Кооперацию Т- и Вклеток мышей изучали в модели in vitro (Thomas, Imamura, 1986).
Способность макрофагов к индукции гуморального иммунного ответа
оценивали через 5 сут по числу АОК к ЭБ у крыс-реципиентов линии Август
после введения токсиканта сингенным крысам-донорам (Argyris, 1967).
Активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в Т-лимфоцитах крыс определяли
методом (Szelenyi et al., 1982). Содержание α-нафтил-АS-ацетатэстеразо- и
α-нафтилбутиратэстеразопозитивных спленоцитов мышей (Т-лимфоцитов,
моноцитов и макрофагов) изучали гистохимическим методом (Хейхоу,
Кваглино, 1983). Для определения концентрации КС в плазме крови крыс
использовали флюорометрический метод (Moor et al., 1976). ПОЛ оценивали
по активности каталазы и пероксидазы, суммарной продукции радикалов,
содержанию малонового диальдегида в крови (Коробейникова, 1989;
Валеева и др., 2002).
Полученные данные обрабатывались с использованием общепринятых
статистических методов. Расчеты проводились на персональном компьютере
с использованием пакета программ Statgraphics.
8
ГЛАВА 3. ДЕЙСТВИЕ МЕТААРСЕНИТА НАТРИЯ
НА ПОКАЗАТЕЛИ АНТИИНФЕКЦИОННОЙ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ И
ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА
Состояние антиинфекционной НРО исследовали на беспородных
мышах через 24 ч после введения МАН в дозе 0.1, 0.2, 0.5, 0.8 LD50, т.к. по
литературным данным, выживаемость в течение первых сут определяется
преимущественно факторами естественной резистентности организма, а все
специфические иммунные реакции (за исключением функции ЕКК)
реализуются не ранее 2-3 сут после введения инфицирования (Ройт и др.,
2000). При остром отравлении МАН летальность мышей от
экспериментальной инфекции увеличивалась соответственно на 2.2 (р>0.05),
18.0, 30.9 и 25.6% (р<0.05) по сравнению с контролем (55.7+5.9%). При этом
LD50 E. сoli уменьшалась в 1.35 (р > 0.05), 1.58, 1.63 и 1.69 раза (р < 0.05), а
Еt50 – соответственно в 1.46, 1.61, 1.92 и 2.11 раза (р<0.05).
Подострое (1/7 LD50 в течение 6 сут) и хроническое действие МАН
увеличивало летальность крыс по сравнению с контролем соответственно на
24.9 и 49.9% (р<0.05). При данных воздействиях токсиканта снижались LD50
E. сoli и Еt50 (р<0.05).
При оценке комплексной НИРО было установлено, что интоксикация
МАН (0.1, 0.2, 0.5, 0.8 LD50) повышала летальность крыс от
экспериментальной пневмонии соответственно на 8.9, 14.4, 28.4 и 51.2%
(р<0.05) по сравнению с контролем (28.9+5.6%). Одновременно уменьшалась
LD50 Р. vulgaris в 1.23, 1.60, 1.80 и 1.90 раза (р<0.05), а Еt50 – в 1.21, 1.31, 1.40
и 1.74 раза (р<0.05) соответственно указанным дозам МАН.
При подостром и хроническом действии МАН летальность крыс
увеличивалась по сравнению с контролем на 37.4 и 41.1% (р<0.05), а LD50
Р. vulgaris уменьшалась в 1.49 и 1.66 раза (р<0.05), а Еt50 - в 1.73 и 1.62 раза
(р<0.05) соответственно. При действии токсиканта в дозах 0.25, 0.50 и 0.75
LD50 БАСК через 1 сут снижалась в 1.18, 1.31 и 1.58 раза (p<0.05), через 6
сут – в 1.15, 1.22 и 1.30 раза (p<0.05), а через 9 сут – в 1.08, 1.18 и 1.26 раза
(p<0.05) соответственно. БАСК при подостром и хроническом отравлении
МАН при экспозиции 30 сут уменьшалась соответственно в 1.39 и 1.50 раза
(р<0.05).
Острая интоксикация МАН в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 дозозависимо
снижала активность лизоцима и ФМАН у крыс через 1-9 сут: сывороточная
активность лизоцима через 1 сут снижалась в 1.69, 2.38 и 2.84 раза (p<0.05),
через 6 сут – в 1.47 (р>0.05), 2.05 и 2.20 раза (p<0.05), а через 9 сут – в 1.26
(р>0.05), 1.38 и 1.69 раза (p<0.05) соответственно; ФМАН через 1 сут
9
уменьшалась в 1.39, 1.70 и 2.16 раза (p<0.05), а через 6 сут – в 1.30, 1.50 и
1.86 раза (p<0.05) соответственно. После подострого и хронического
действия МАН в дозе 0.01 LD50 показатели ФМАН существенно снижались
по сравнению с контролем в среднем в 1.88 раза (р<0.05).
Таким образом, после острого, подострого и хронического действия
МАН происходит снижение НРО и НИРО (увеличивается летальность
животных от экспериментальной инфекции, уменьшается LD50 E. сoli,
Р. vulgaris и Еt50), наблюдается супрессия факторов естественной
резистентности к инфекциям (снижается активность БАСК, лизоцима,
ФМАН).
Глава 4. ДЕЙСТВИЕ МЕТААРСЕНИТА НАТРИЯ НА СОДЕРЖАНИЕ
ЛИМФОЦИТОВ В ОРГАНАХ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА
После острого действия МАН происходит дозозависимое уменьшение
содержания лимфоцитов в тимусе через 1 сут после интоксикации в 1.45,
1.82 и 2.06 раза соответственно. Эти сдвиги были статистически значимы
при дозах 0.5 и 0.75 LD50 (р<0.05). Содержание лимфоцитов в селезенке,
костном мозге и лимфатических узлах изменялось аналогично. После
действия МАН в дозе 0.75 LD50 были выявлены изменения числа
лимфоцитов в органах системы иммунитета через 1-6 сут. В лимфоидных
органах происходило снижение содержания лейкоцитов: статистически
значимое (р<0.05) в тимусе (через 1-6 сут), селезенке (через 1-6 сут), костном
мозге (через 1 сут) и лимфоузлах (через 1-6 сут). Через 9 сут отмечалось
восстановление этих параметров до контрольных значений. В крови под
влиянием острой интоксикации МАН число лимфоцитов статистически
значимо снижалось через 1-4 сут. При подостром и хроническом действии
МАН отмечено приблизительно такое же изменение показателей, как и при
его действии в дозе 0.75 LD50.
Проведенные нами исследования показали, что острая интоксикация
МАН в дозах 0.25, 0.50, 0.75 LD50 вызывает дозозависимое снижение
миграции Т-клеток из тимуса через 8 сут соответственно в 1.24 (р>0.05), 1.66
и 2.11 (р 0.05) раза. МАН в этих дозах вызывал угнетение миграции ПСКК
из костного мозга и В-клеток (по числу АОК в селезенке) в 1.23 (р>0.05),
1.54 и 1.89 раза (р 0.05) соответственно. При подостром и хроническом
отравлении миграция Т- клеток из тимуса уменьшалась в 1.87 и 1.91 (р<0.05)
раза, а В-клеток – в 1.40 и 1.34 (р<0.05) раза соответственно.
Таким образом, острая, подострая и хроническая интоксикация МАН
уменьшает число лимфоцитов в лимфоидных органах. При остром
10
отравлении токсикантом данное снижение носит дозозависимый характер.
Под влиянием его острой интоксикации в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 через 8
сут происходит дозозависимое угнетение миграции ПСКК из костного мозга,
Т-клеток и В-клеток из органов иммунной системы. При подостром и
хроническом отравлении МАН миграция Т-лимфоцитов из тимуса и Вклеток также существенно уменьшается.
Глава 5. ВЛИЯНИЕ МЕТААРСЕНИТА НАТРИЯ
НА ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ
Острая интоксикация МАН приводила к редукции ОДЛТА через 5 сут в
1.27, 1.42 и 1.57 раза (p<0.05), а через 20 сут – в 1.13 (p>0.05), 1.19 и 1.24 раза
(p<0.05) по сравнению с контрольными показателями соответственно.
Подострое и хроническое действие МАН снижало ОДЛТА соответственно в
1.59 и 1.77 раза (p<0.05).
При дозах МАН, составляющих 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, число АОК в
селезенке белых крыс к ЭБ (характеризующих синтез IgM и функцию Th1лимфоцитов) через 5 сут после острой интоксикации в индуктивной фазе
антителогенеза снижалось в 1.78, 2.39 и 3.34 раза (р<0.05) соответственно
(рис.1).
×103
60
50
40
30
*
20
*
*
10
0
1
Контроль
2
3
0,25
0,50
4
0,75
LD50
Рис. 1. Влияние острого действия МАН на число АОК к ЭБ (×103) в селезенке крыс
через 5 сут после иммунизации в продуктивной фазе иммуногенеза
По оси абсцисс - доза; по оси ординат – число АОК к ЭБ (×103 ). В каждой серии
использовалось от 6 до 8 крыс; * - различие с контролем достоверно - р0.05.
В продуктивной фазе иммуногенеза число АОК в селезенке при этих
же дозах МАН снижалось в 2.50, 3.23 и 4.92 раза (р< 0.05) в зависимости от
использованных доз. При подостром и хроническом действии МАН
отмечалось приблизительно такое же изменение показателей, как и при
остром в дозе 0.75 LD50 через 5 сут (снижение параметра в 3.16 и 2.75 раза,
р<0.05).
11
Действие МАН в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, вызывало дозозависимое
снижение синтеза IgG, оцениваемого по числу АОК, через 8 сут в 1.46, 1.74 и
2.15 раза (р<0.05), через 14 сут - в 1.51, 1.88 и 2.87 раза (р<0.05), а через 20
сут - в 1.14 (р>0.05), 1.41 и 1.97 раза (р<0.05) соответственно. При подостром
и хроническом действии МАН отмечалось приблизительно такое же
снижение продукции IgG, как и при его остром действии в дозах 0.50 и 0.75
LD50.
В индуктивном периоде гуморальной иммунной реакции острое
отравление токсикантом в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 приводило к
уменьшению содержания АОК в селезенке к Vi-Ag у крыс через 5 сут
соответственно в 1.53, 1.93 и 2.33 (р<0.05) раза (табл. 1). В продуктивной
фазе антителопродукции острое отравление МАН вызывало снижение числа
АОК в селезенке к Vi-Ag соответственно в 1.95, 2.58 и 3.20 раза (р<0.05).
Таблица 1
Влияние острого отравления МАН на число АОК к Vi-Ag (10 ), синтезирующих
IgM, в селезенке крыс через 5 сут после иммунизации ЭБ (M+m, n=5-7)
Токсикант
Доза,
Время интоксикации после иммунизации, сут
LD50
индуктивная фаза
продуктивная фаза
3
МАН
контроль
0,25
25.1±2.5*
19,7+2,1*
0,50
19.9±2.2*
14,9+2,3*
38.4±2.9
0,75
16.5±1.5*
Примечание: * - p<0.05 по сравнению с контролем
12,0+1,8*
При подостром и хроническом действии МАН через 30 сут в дозе 0.01
LD50 отмечалось уменьшение числа АОК к Vi-Ag соответственно в 2.06, 1.99
и 1.70 раза (p<0.05). При этом данные воздействия МАН, оцениваемые по
редукции иммунного ответа, статистически значимо не отличались и
приблизительно соответствовали его действию в дозах 0.50-0.75 LD50.
В опытах in vitro на cпленоцитах мышей установлено (табл. 2), что
МАН в концентрациях 10ˉ5, 10ˉ4 и 10ˉ3 М уменьшает функцию В-клеток в
кооперации с Т-лимфоцитами в 1.33, 1.68 и 2.75 раза (р<0.05), а функцию
Т-клеток - в 2.06, 2.40 и 4.52 раза (р<0.05) соответственно. Исследуемый
токсикант при этих концентрациях в большей степени снижает функцию Тлимфоцитов (р<0.05).
При исследовании действия МАН на способность макрофагов
индуцировать гуморальный иммунный ответ было установлено, что в дозе
0.75 LD50 токсикант в организме крыс через 1 сут снижает способность
макрофагов к индукции антителообразования, оцениваемой по числу АОК к
ЭБ в селезенке, в 2.43 раз (p<0.05) по сравнению с контролем. При
12
подостром и хроническом действии МАН в дозе 0.01 LD50 отмечено
снижение этого показателя соответственно в 2.10 и 1.81 (р0.05) раза.
Таблица 2
Нарушение кооперации Т- и В-лимфоцитов под влиянием МАН in vitro (по
формированию АОК иммуноцитами мышей на 106 В-клеток) (M+m, n=6-7)
Клетки
Концентрация МАН, М
10ˉ5
10ˉ4
10ˉ3
В0+Т
267+29
213+18 a
130+13 a
0
b
a b
В+Т
173+18
149+16
79+9 a b
Примечание: К – В+Т – контроль - 357+32; В0, Т0 - в течение 1 ч до добавления
ЭБ клетки инкубировали с МАН, a - p<0.05 по сравнению с контролем (В+Т); b - p<0,05 по
сравнению с В0+Т
Таким образом, под влиянием острой, подострой и хронической
интоксикации МАН происходит угнетение способности макрофагов
индуцировать гуморальный иммунный ответ, преимущественное снижение
Т-зависимой антителопродукции (синтеза IgM и IgG) плазмоцитами,
связанной с функцией Th1- и Th2-лимфоцитов, более выраженное в
продуктивной фазе антителогенеза по сравнению с индуктивным периодом.
При действии in vitro МАН в прямой зависимости от концентрации снижает
кооперацию Т- и В-лимфоцитов, поражая преимущественно Т-клетки.
Глава 6. ДЕЙСТВИЕ МЕТААРСЕНИТА НАТРИЯ
НА КЛЕТОЧНЫЕ ИММУННЫЕ РЕАКЦИИ
Острое отравление МАН в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 уменьшало
функцию Т-клеток через 1 сут соответственно на 19.5 (р>0.05), 21.8 (р0.05)
и 37.2% (р0.05). Снижение показателя сохранялось до 12 сут, причем оно
было статистически значимым (р0.05) при дозах МАН 0.5 и 0.75 LD50. При
подостром и хроническом его действии отмечено снижение функции Тклеток соответственно на 33.3 и 34.0% (р0.05).
Дозы МАН, составляющие 0.25, 0.50 и 0.75 LD50, вызывали супрессию
формирования ГЗТ соответственно в 1.73, 2.05 и 2.70 раза (р0.05). При
подостром и хроническом действии токсиканта в дозе 0.01 LD50 отмечалось
снижение функции Тh1-клеток в первичном клеточном иммунном ответе
соответственно в 2.34 и 2.76 раза (р0.05). При острой интоксикации МАН
установлено дозозависимое уменьшение АЗКЦ под влиянием токсиканта
(рис.2). Так, МАН в дозах 0.25, 0.50 и 0.75 LD50 вызывал снижение АЗКЦ
13
спленоцитов у крыс через 5 сут соответственно в 1.55, 1.85 и 3.20 (р<0.05)
раза.
%
18
16
14
12
*
*
10
8
*
6
4
2
0
Контроль
1
0,25
0,50
2
3
4
0,75
LD50
Рис. 2. Влияние острого отравления МАН на АЗКЦ спленоцитов у белых крыс
через 5 сут.
По оси абсцисс - доза; по оси ординат – АЗКЦ, %. В каждой серии использовалось 7
- 8 животных; * - различие с контролем достоверно - р0.05
При подостром и хроническом действии МАН в дозе 0.01 LD50
отмечено уменьшение АЗКЦ спленоцитов в 1.80 и 1.76 раза (р0.05), а
тимоцитов – в 2.10 и 1.96 раза (р0.05) соответственно. При исследовании
влияния МАН (0.25, 0.50 и 0.75 LD50) на ЕКК крыс установлено
дозозависимое снижение их активности через 1–6 сут. Острое отравление
МАН приводило к снижению активности ЕКК у крыс через 1 сут в 1.35, 1.89
и 2.77 раза (р<0.05), через 3 сут в 1.51, 2.02 и 2.89 раза (р<0.05), через 6 сут
в 1.48, 1.68 и 2.30 раза (р<0.05) соответственно. Следует отметить, что и к 9
сут данный показатель оставался сниженным. При подостром и хроническом
действии МАН в дозе 0.01 LD50 наблюдалось угнетение ЕКК соответственно
в 2.42 и 2.04 раза (р0.05).
При оценке влияния МАН in vitro на активность ЕКК селезенки белых
крыс (табл. 3) было установлено, что при концентрациях 10ˉ6, 10ˉ5 и 10ˉ4 М,
Таблица 3
Влияние МАН in vitro на активность ЕКК (%) у крыс (M+m, n=6-7)
Токсикант
Концентрация, М
10ˉ6
10ˉ5
10ˉ4
Контроль
31.0 + 2.8
МАН
20.1 + 2.0*
14.5 + 2.1*
9.1+ 1.4*
Примечание: спленоциты в течение 1 ч инкубировали с МАН, * - p<0.05 по
сравнению с контролем
14
происходило дозозависимое уменьшение активности ЕКК в 1.54, 2.14 и 3.41
раза (р0.05) соответственно.
Таким образом, острое, подострое и хроническое воздействие МАН in
vivo вызывает снижение функции Т-клеток, в частности функции Th1лимфоцитов, угнетение АЗКЦ, активности ЕКК; МАН in vitro в прямой
зависимости от концентрации снижает активность ЕКК.
Глава 7. РОЛЬ КОРТИКОСТЕРОНА, ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ
ЛИПИДОВ, ИНГИБИРОВАНИЯ ЭСТЕРАЗ И ОТНОСИТЕЛЬНОЙ
ФУНКЦИИ Th1- и Th2-ЛИМФОЦИТОВ В НАРУШЕНИИ ИММУННОГО
СТАТУСА ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ МЕТААРСЕНИТА НАТРИЯ
Содержание КС в плазме крови крыс после интоксикации МАН, как
показали наши исследования, увеличивается через 1 ч и в дальнейшем к 12 ч
снижается до контрольного уровня. Так, под влиянием острой интоксикации
через 1 и 3 ч концентрация КС увеличивалась соответственно в 6.23 и 3.60
раза. Выявлена отрицательная корреляция между концентрацией КС и
показателями гуморального и клеточного иммунных ответов при
интоксикации МАН (r = -0.715 и -0.709, p<0.05).
Нами показано, что под влиянием МАН при остром, подостром и
хроническом действии инициируется ПОЛ: при острой интоксикации (0.75
LD50) активность каталазы и пероксидазы, характеризующей АОС,
уменьшалась соответственно в 1.65 и 1.70 раза (p<0.05). Основной продукт
ПОЛ малоновый диальдегид при остром отравлении МАН повышался в 1.24
раза (p<0.05), а суммарная продукция радикалов – в 1.74 раза (p<0.05). При
подостром и хроническом действии МАН в дозе 0.01 LD50 отмечалось
снижение каталазы в 1.51 и 1.57 раза (p<0.05), а активность пероксидазы - в
2.04 и 1.52 раза (p<0.05) соответственно. Суммарная продукция радикалов и
содержание малонового диальдегида изменялись приблизительно так же, как
и при остром отравлении.
Выявлена положительная корреляция между параметрами системы
иммунитета и содержанием каталазы и пероксидазы в крови крыс (от 0.672
до 0.790) и отрицательная корреляция между показателями гуморального и
клеточного иммунных ответов и содержанием малонового диальдегида в
крови (от -0.670 до -0.779).
Установлено, что МАН в дозе 0.75 LD50 через 3 сут снижает активность
ацетилхолинэстеразы Т-клеток тимоцитов и спленоцитов соответственно в
1.37 и 1.38 раза (р<0.05). При подостром и хроническом действии МАН в
дозе 0.01 LD50 выявлено приблизительно такое же снижение параметра, как
15
и при остром через 3 сут. При остром действии МАН только при дозе 0.75
LD50 число клеток (Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов), содержащих αнафтил-АS-ацетатэстеразу в спленоцитах крыс, статистически значимо
снижалось в 1.28 раза (p<0.05).
Показано, что параметры, характеризующие различные иммунные
реакции и связанную с ними функцию Th1- и Th2-лимфоцитов, при действии
МАН снижались в 2.32 и 2.26 раза соответственно. Это свидетельствует о
нарушении в равной степени функций Th1- и Th2-лимфоцитов под влиянием
токсиканта.
Установленные особенности поражения МАН функции Th1- и Th2лимфоцитов подтверждается исследованием концентрации цитокинов в
крови крыс (табл. 4). На фоне действия токсиканта выявлено уменьшение
концентрации ИФН-γ на 5 сут и ИЛ-4 на 14 сут соответственно в 2.35 и 2.39
раза (p<0.05).
Таблица 4
Действие подострой интоксикации МАН на содержание цитокинов в крови крыс,
пг/мл, (М+m, n=6)
Токсикант
ИФН-γ
ИЛ-4
ИФН-γ /ИЛ-4
Контроль
835±78
134±15
6.2
МАН
355±41*
56±11*
6.3
Примечание: * -p<0.05 по сравнению с контролем
Таким образом, снижение показателей гуморального и клеточного
иммунных ответов при интоксикации МАН связана с повышением
концентрации КС в плазме крови, инициацией перекисного окисления
липидов, снижением активности эстераз Т-лимфоцитов, моноцитов и
макрофагов. Подострое действие МАН в суммарной дозе 1.0 LD50 вызывает
угнетение функции Th1- и Th2-лимфоцитов в равной степени.
ВЫВОДЫ
1. Воздействие метаарсенита натрия вызывает снижение интегральной
неспецифической резистентности организма (подострое и хроническое
действие токсиканта увеличивает летальность крыс по сравнению с
контролем соответственно на 24.9 и 49.9%) и комплексной неспецифической
и иммунологической резистентности (хроническое действие увеличивает
летальность крыс на 37.4 и 41.1%). Хроническая интоксикация
метаарсенитом натрия снижает показатели бактерицидной активности
сыворотки крови, активности лизоцима и фагоцитарно-метаболической
активности нейтрофилов в 1.5, 2.5 и 1.9 раза соответственно.
16
2. Хроническая интоксикация организма метаарсенитом натрия
приводит к снижению числа лимфоцитов в тимусе, селезенке и костном
мозге в 2.1, 1.7 и 1.6 раза соответственно, уменьшает миграцию Т-клеток из
тимуса в 1.9 раз и В-клеток из костного мозга в 1.3 раза по сравнению с
контролем.
3.
Хроническое
действие
метаарсенита
натрия
вызывает
дозозависимое снижение антителообразования преимущественно в
продуктивный период иммуногенеза по сравнению с индуктивным, что
свидетельствует о снижении функции Th1-лимфоцитов и В-клеток. Уровень
Т-зависимого и Т-независимого гуморального иммунного ответа
уменьшается в 2.8 и 2.0 раза соответственно. Показано снижение
способности макрофагов индуцировать гуморальный иммунный ответ при
подостром (в 2.1 раза) и хроническом (в 1.8 раза) действии метаарсенита
натрия.
4. При хроническом действии токсиканта in vitro поражаются
преимущественно Т-клетки, существенно нарушается кооперация Т- и Влимфоцитов; снижается активность Th1-лимфоцитов и антителозависимая
клеточная цитотоксичность соответственно в 2.8 и 1.8 раза. Метаарсенит
натрия уменьшает активность естественных клеток-киллеров в прямой
зависимости от концентрации (10ˉ6, 10ˉ5 и 10ˉ4 М) соответственно на 35.2, 53.2
и 70.6%.
5. Воздействие метаарсенита натрия стимулирует повышение функции
коры надпочечников: концентрации кортикостерона в плазме крови через 1 и
3 ч увеличивались в 6.2 и 3.6 раза. Метаарсенит натрия при дозе 0,75 LD50
ингибирует эстеразы Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов (активность
ацетилхолинэстеразы снижалась в 1.4 раза), пероксидацию липидов
(содержание малонового диальдегида в крови при хроническом действии
повышалось в 1.3 раза), вызывает супрессию продукции Th1- и Th2лимфоцитами ИФН-γ и ИЛ-4 соответственно в 2.5 и 2.4 раза.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
* - публикации в печатных изданиях перечня ВАК РФ
1. Германчук В.Г., Василенко О.А., Абаимов А.В. Связь иммунотоксичных свойств соединений мышьяка с перекисным окислением липидов
// Сборник научных статей. Вып.3, Ч. 1. Биология, экология, медицина.
Саратов, Саратовский военный институт РХБЗ, 2003. С. 48-53.
17
2. Германчук В.Г., Василенко О.А., Абаимов А.В. Механизмы
иммунотоксичности химических соединений // Сборник научных статей.
Саратов, Саратовский военный институт РХБЗ, 2004. С. 55–57.
3. Абаимов А.В., Забродский П.Ф. Снижение функции Th1- и Th2лимфоцитов при остром отравлении диметилдихлорвинилфосфатом
// Сборник научных статей. Саратов, Саратовский военный институт РХБЗ,
2007. С. 112–114.
4. Абаимов А.В., Забродский П.Ф. Активация симпатико-адреналовой
системы и ее влияние на иммунные реакции при острой интоксикации
фосфорорганическими соединениями // Сборник научных статей. Саратов,
Саратовский военный институт РХБЗ, 2007. С. 118–121.
5. Абаимов А.В., Забродский П.Ф. Влияние полиоксидония на
показатели системы иммунитета и перекисного окисления липидов после
отравления токсичными химическими веществами // Сборник научных
статей. Саратов, Саратовский военный институт РХБЗ 2007. С. 125–127.
6. Абаимов А.В., Забродский П.Ф., Германчук В.Г. Связь инактивации
эстераз Т-клеток и естественных киллеров с иммунотоксичностью
фосфорорганических соединений // Сборник научных статей. Саратов,
Саратовский военный институт РХБЗ, 2007. С. 128–130.
7. *Забродский П.Ф., Абаимов А.В., Мандыч В.Г. Редукция активности
Th1- и Th2-лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов при подостром
отравлении метаарсенитом натрия // Вестник новых медицинских
технологий. Тула, 2008. - Т. XV, № 1. С. 102.
8. *Абаимов А.В., Шляхтин Г.В., Забродский П.Ф. Редукция
иммунных реакций и активности лимфоцитов Th1- и Th2- типа при
отравлении метаарсенитом натрия // Аллергология и иммунология. 2008.
Том 9, № 1. С. 173.
9. *Абаимов А.В., Шляхтин Г.В. Забродский П.Ф. Супрессия
активности субпопуляций лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов при
подостром отравлении метаарсенитом натрия // Вестник Российской военномедицинской академии. 2008. Приложение 1, 3(23). С. 94.
10. Шляхтин Г.В., Абаимов А.В., Забродский П.Ф. Снижение функции
Th1- и Th2-лимфоцитов при интоксикации метаарсенитом натрия
// Реферативный сборник. Актуальные вопросы теории и практики
радиационной, химической и биологической защиты. ХХХVIII научная
конференция. 33 ЦНИИИ МО РФ, Вольск-18, 2008. С. 54–55.
11. Забродский П.Ф., Абаимов А.В., Германчук В.Г., Ковалев А.Ю.
Особенности редукции синтеза цитокинов Th1- и Th2-лимфоцитами и их
функции токсичными химикатами // Тезисы докладов IV научно18
практической конференции «Научно-технические аспекты обеспечения
безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического
оружия». Москва, 2008. С.146-148.
12. Забродский П.Ф., Абаимов А.В., Шляхтин Г.В., Василенко О.А.
Редукция функции лимфоцитов и синтеза цитокинов метаарсенитом натрия
// Тезисы докладов IV научно-практической конференции «Научнотехнические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении
и транспортировке химического оружия». Москва, 2008. С.148-149.
13. Абаимов А.В., Забродский П.Ф., Шляхтин Г.В. Снижение
функции субпопуляций лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов при
действии метаарсенитом натрия // Доклады Академии военных наук,
Поволжское отделение. 2008, №3(32). С.89-91.
14. Абаимов А.В., Забродский П.Ф., Шляхтин Г.В., Германчук В.Г.,
Меркина С.М. Снижение продукции лимфоцитами цитокинов при
отравлении различными токсикантами // Доклады Академии военных наук,
Поволжское отделение. 2008, №4(33). С.181-183.
Подписано в печать 04.04.2007. Формат 60 × 84 1/16.
Бумага офсетная № 1. Гарнитура Таймс. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 89
Отпечатано в типографии ООО «Тироль».
410005, Саратов, ул. Чернышевского, 203.
19