КОЖЕМЯКИНА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА 03.02.03 – микробиология

На правах рукописи
КОЖЕМЯКИНА
НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА
СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ УГЛЕВОДНЫХ
КОМПОНЕНТОВ МИЦЕЛИЯ НЕКОТОРЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ
03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург
2010
2
Работа выполнена на кафедре микробиологии Государственного образовательного
учреждения
высшего
государственной
профессионального
химико-фармацевтической
образования
академии
Санкт-Петербургской
Федерального
агентства
по
здравоохранению и социальному развитию РФ
Научный руководитель:
Доктор технических наук,
профессор
Галынкин Валерий Абрамович
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук,
профессор, з.д.н. РФ
Елинов Николай Петрович
Кандидат биологических наук
Няникова Галина Геннадьевна
Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук
Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина РАМН (директор,
академик РАН и РАМН М.И. Давыдов)
Защита состоится «
15
»
ноября
2010 года в
13
часов на
заседании диссертационного совета ДМ 001.022.01 при Учреждении Российской академии
медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины
Северо-Западного
отделения
РАМН
по
адресу:
197376,
Санкт-Петербург,
Каменноостровский проспект, д. 69/71, конференц-зал НИИЭМ СЗО РАМН.
С
диссертацией
можно
ознакомиться
в
научной
библиотеке
Научно-
исследовательского института экспериментальной медицины Северо-Западного отделения
РАМН, по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. академика Павлова, д. 12.
Автореферат разослан « 14»
октября
2010 года
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук
А.Н. Суворов
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Базидиомицеты являются перспективными микробиологическими
объектами,
которые
привлекают
внимание
исследователей
как
источники
профилактических и лечебных средств, оказывающих общеукрепляющее, тонизирующее
и иммуностимулирующее действие на организм человека. Биологическая активность
базидиомицетов определяется наличием в них ряда компонентов, важнейшими из которых
являются гликаны (полисахариды) (Bao X.F., 2002; Wasser S.P., 2005). Одно из главных
достоинств грибных гликанов заключается в отсутствии токсичности, при этом они
способны оказывать стимулирующее действие на различные звенья иммунитета и
корректировать патологические состояния, связанные с нарушением функций иммунной
системы, приводя их к норме. (Akramiene D., 2007; Israilides C., 2008; Goodridge H., 2009).
Помимо этого, гликаны некоторых базидиомицетов обладают противоопухолевой
активностью (Lin Z., 2004; Chen J., 2007; Shimizu K., 2009). В настоящее время препараты
на их основе не используют в онкологической практике в качестве единственных средств
для лечения раковых заболеваний из-за недостаточной эффективности, но активно ведутся
исследования по их применению в комплексной терапии раковых больных и в качестве
средства
поддерживающей
терапии
(Wasser
S.P.,
1999;
Горовой
Л.Ф.,
2006).
Существенным достоинством грибных гликанов, помимо действия на опухоли, является
способность значительно снижать побочные эффекты химио- и радиотерапии (Gao Y. et
al., 2002; Wang D.H., Weng X.C., 2006). Ранее, объектом исследования служили в
основном плодовые тела грибов, часто дикорастущие, хотя, очевидно, что более
перспективным является получение мицелия при глубинном культивировании грибов,
когда удается осуществлять направленный синтез целевого продукта, стандартизовать
условия его получения и показатели качества, сократить длительность процесса. В
глубинной культуре грибы на протяжении всего жизненного цикла образуют
микроскопические структуры, то есть являются микромицетами. Состав глубинного
мицелия по всем важнейшим показателям, в том числе и по содержанию структурнофункциональных полисахаридов, качественно превосходит состав плодовых тел грибов
(Бабицкая В.Г., 2005). В связи с возросшим интересом к базидиомицетам перспективно
всестороннее исследование новых представителей данного класса, особенно в условиях
погруженного
культивирования,
с
целью
получения
на
основе
их
мицелия
профилактических и лечебных средств для поддержания иммунной системы в норме и
при патологических состояниях.
4
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении
особенностей роста базидиомицетов Ganoderma applanatum, Fomes fomentarius и
Flammulina
velutipes
в
условиях
глубинного
культивирования;
исследовании
полисахаридных компонентов мицелия и экзополисахаридов, оценке их биологической
активности.
В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие
конкретные задачи:
1) изучить особенности роста базидиальных грибов в глубинных условиях и
подобрать условия культивирования для накопления максимального количества биомассы
мицелия грибов;
2) выделить полисахаридные компоненты мицелия и экзогликаны, исследовать их
состав и физико-химические свойства;
3)
оценить
экзополисахаридов
иммунобиологические
по
их
влиянию
на
свойства
показатели
мицелия
грибов,
функциональной
эндо-
и
активности
перитонеальных макрофагов мышей, отражающие стадии фагоцитоза;
4) исследовать в системе in vivo (на экспериментальных моделях опухолевого
роста) противоопухолевую активность углеводных компонентов мицелия.
Научная новизна исследования. В работе впервые изучены особенности роста
базидиальных грибов Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. штамм 9, Flammulina velutipes
(Curtis: Fr.) P. Karst. штамм 20 и Fomes fomentarius (L.:Fr.) Fr. штамм 6 в условиях
погруженного (глубинного) культивирования. Путем водной экстракции из мицелия
выделены растворимые и нерастворимые полисахаридные фракции. Установлено, что
нерастворимые
фракции
представляют
собой
хитин-глюкановые
комплексы,
а
водорастворимые – смесь гетерополисахаридов, состоящих из глюкозных, маннозных и
галактозных остатков. G. applanatum в глубинных условиях синтезирует внеклеточный
гетерогликан, сходный по составу и физико-химическим характеристикам с растворимой
полисахаридной фракцией мицелия.
Показано, что полисахаридные компоненты мицелия исследуемых грибов
оказывают активирующее действие на клетки системы мононуклеарных фагоцитов, в
частности перитонеальные макрофаги мышей, что проявляется в усилении хемотаксиса,
адгезии, увеличении поглотительной способности и микробоцидности макрофагов.
Растворимые фракции более активны по сравнению с нерастворимыми. Мицелий грибов
при пероральном введении проявляет менее выраженное действие на функциональную
активность макрофагов, чем углеводные фракции. Установлено, что растворимая
углеводная фракция мицелия G. applanatum, наряду с высоким стимулирующим
5
действием
на
макрофаги,
обладает
значительным
и
продолжительным
противоопухолевым эффектом в отношении асцитной опухоли Эрлиха.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований
выбрана культура G. applanatum штамм 9 для использования в качестве продуцента
биологически активных углеводных полимеров, так как она обеспечивала достаточно
высокий прирост биомассы, и компоненты мицелия обладали выраженной биологической
активностью. Экспериментально подобраны состав питательной среды и условия
культивирования для наибольшего накопления биомассы (выход вырос на 30% по
сравнению с исходными условиями), при этом сроки ферментации сократили с 14 до 8
суток. Установлено, что растворимая полисахаридная фракция мицелия G. applanatum
обладает выраженной противоопухолевой активностью, что, в сочетании с безвредностью,
служит основанием для разработки на её основе средств, перспективных в комплексной
терапии онкологических заболеваний. Разработан лабораторный регламент на получение
биологически активной субстанции «Ганодермин».
Результаты работы внедрены в курсы лекций и лабораторные занятия по
дисциплинам «Основы конструирования новых штаммов микроорганизмов» для
студентов 3 курса и «Микробиология продуцентов БАВ» для студентов 4 курса
факультета промышленной технологии лекарств СПХФА. Рабочие программы курсов
утверждены 16.06.2009 г методической комиссией факультета промышленной технологии
лекарств СПХФА.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.
Подбор условий культивирования базидиальных грибов G. applanatum,
F. fomentarius и F. velutipes и изучение особенностей их роста в глубинных условиях
привели к повышению выхода биомассы мицелия и сокращению сроков культивирования.
2.
Растворимые углеводные фракции мицелия грибов, представляют собой
смесь гетерополисахаридов, состоящих преимущественно из глюкозных, маннозных и
галактозных остатков, нерастворимые – хитин-глюкановые комплексы. Основным
углеводным компонентом фракций является глюкоза.
3.
G. applanatum
в
условиях
глубинного
культивирования
синтезирует
экзогетерогликан, сходный по составу и физико-химическим характеристикам с
растворимой полисахаридной фракцией мицелия.
4.
Полисахаридные компоненты мицелия грибов G. applanatum, F. fomentarius,
F. velutipes и экзополисахарид G. applanatum оказывают стимулирующее действие на
клетки системы мононуклеарных фагоцитов, в частности на перитонеальные макрофаги
мышей, что проявляется в увеличении показателей их функциональной активности,
6
отражающих стадии фагоцитоза. Наиболее активны растворимые углеводные фракции
мицелия.
5.
Растворимый
эндополисахарид
G. applanatum
обладает
выраженной
длительной противоопухолевой активностью в отношении асцитной опухоли Эрлиха;
нерастворимые
фракции
G. applanatum
и
F. fomentarius
обладают
умеренной
противоопухолевой активностью.
Личное
участие
автора
заключалось
в
проведении
всех
лабораторных
исследований, обобщении и анализе полученных результатов.
Апробация работы. Результаты исследований обсуждены на заседаниях кафедры
микробиологии ГОУ ВПО СПХФА, доложены на VI и VII международных форумах
«Биотехнология и современность» (Санкт-Петербург, 2005 г, 2006 г), научной
конференции СПХФА «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности»
(Санкт-Петербург, 2006 г), региональной научной конференции СПХФА «Молодые
ученые практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007 г). Работа выполнена в
соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры микробиологии ГОУ
ВПО СПХФА.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 3 в
журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования результатов диссертационной работы.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на 148 страницах
машинописного текста (150 стр. вместе с приложениями) и состоит из введения, обзора
литературы, результатов, обсуждения, выводов, указателя литературы, включающего 100
отечественных и 115 иностранных источников. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 18
рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Представлен обзор научных публикаций по теме диссертации. Рассмотрены
сведения о различных способах культивирования базидиомицетов. Проанализированы
данные, касающиеся условий культивирования, в том числе источников углеродного и
азотного питания, входящих в состав питательных сред; температуры и аэрации.
Показано, что биологическая активность базидиальных грибов определяется наличием в
их мицелии, культуральной жидкости и плодовых телах веществ полисахаридной
природы. Рассмотрены особенности строения грибных гликанов, связь между структурой
и биологической активностью, а также основные механизмы их противоопухолевого и
7
иммуностимулирующего действия. На основании обзора литературы сформулированы
цель и задачи исследования.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе исследовали мицелиальные культуры Ganoderma applanatum (Pers.) Pat.
штамм 9, Flammulina velutipes (Curtis: Fr.) P. Karst. штамм 20 и Fomes fomentarius (L.:Fr.)
Fr. штамм 6, полученные из коллекции Санкт-Петербургского государственного
технологического института (технического университета). Объекты исследования:
мицелий грибов; выделенные из него растворимые (РФр) и нерастворимые углеводные
фракции (НФр); экзополисахарид G. applanatum (ЭПС).
Поверхностное культивирование грибов проводили в термостатируемых условиях
на агаризованных средах: сусло-агаре (7Б), агаре Сабуро, среде Чапека-Докса, глюкозопептонной среде и фармакопейной среде №2 (ГФ РФ XII, ч.1, 2008) при 24  1С в
течение 14 суток. Глубинное культивирование проводили в жидком сусле (ЖС, 7Б) и
глюкозо-пептонной среде (ГПС) (Koroleva-Skorobogatko О. et al., 1998) в динамических
(120 об/мин) и статических условиях при температуре 241С в течение 14 суток.
Концентрацию
биомассы
определяли
весовым
способом.
Питательные
среды
инокулировали агаровыми блоками диаметром 10 мм (1 блок на чашку Петри, 10 блоков
на колбу), или четырехсуточной глубинной культурой, выращенной на ГПС в количестве
10% от объёма среды.
Экзополисахарид G. applanatum выделяли из сконцентрированного нативного
раствора 96% этиловым спиртом в соотношении 1:2. Для выделения углеводных фракций
сухой измельченный мицелий заливали очищенной водой в соотношении 1:10,
выдерживали на кипящей водяной бане в течение 8 ч. Полученную суспензию
центрифугировали (15 мин, 5000 g), осадок (нерастворимую фракцию НФр) промывали
этанолом (1:1) на центрифуге, обрабатывали ацетоном, высушивали до получения
постоянного веса. Из упаренного в 2 раза супернатанта осаждали полисахарид 96%
этиловым спиртом в соотношении 1:2, образовавшийся осадок (растворимую фракцию
РФр) отделяли центрифугированием (15 мин, 5000 g), обрабатывали ацетоном и сушили
до постоянного веса.
Содержание редуцирующих веществ, белка, минеральных примесей в мицелии
грибов, эндо- и экзополисахаридах; -аминного азота и редуцирующих сахаров в
культуральной жидкости определяли с использованием стандартных методик (ГФ РФ XII,
ч.1, 2008; Захарова И.Л., Косенко Л.В., 1982; Ленинджер А., 1985).
8
Качественный моносахаридный состав в гидролизатах определяли с помощью
тонкослойной хроматографии на пластинках«Silufol» в системе н-бутанол–вода–этанол–
аммиак (40:49:10:1). Количественный моносахаридный состав определяли методом ГЖХ в
виде триметилсилильных (ТМС) производных сахаров на колонке НР-5 (SE-54)
30 м×0.25 мм×0.25 мкм на приборе «Кристалл» («Хромотек», Россия). ИК-спектры
поглощения фракций снимали на инфракрасном Фурье-спектрометре ФСМ 1201 (АО
«СПб Инструментс», Россия). Соотношение гликозидных связей во фракциях определяли
методом перйодатного окисления (Захарова И.Л., Косенко Л.В., 1982). Удельное вращение
растворимых фракций и экзогликана определяли на автоматическом поляриметре PerkinElmer-241 (PerkinElmer, США), молекулярно-массовое распределение – методом гельхроматографии на колонке, заполненной сефарозой-4В.
Иммунобиологическое действие мицелия грибов и полученных из него фракций
оценивали по их влиянию на показатели функциональной активности перитонеальных
макрофагов мышей, отражающие стадии фагоцитоза: хемотаксис, распластывание
фагоцитов на стекле, их микробоцидность по отношению к клеткам Staphylococcus aureus
(штамм 209) и поглотительную способность в отношении клеток Candida albicans (штамм
АТСС 855-263) (Фримель Г., 1987).
Определение острой токсичности проводили по экспресс-методу Прозоровского и
унифицированному методу Миллера–Тейтнера (Прозоровский В.Б. и соавт., 1978;
Руководство
по
экспериментальному
(доклиническому)
изучению
новых
фармакологических веществ, 2005).
Противоопухолевую активность фракций определяли на мышах-самцах с перевитой
асцитной опухолью Эрлиха (Стуков А.Н., 2001).
Статистическую обработку результатов производили по методу СтьюдентаФишера и с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни (Uтест). Достоверными считались различия между группами при p<0,05. Повторность всех
экспериментов составляла не менее 5-ти раз (Руководство по экспериментальному
(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Культивирование базидиомицетов
При культивировании на плотных питательных средах наиболее интенсивный рост
мицелия грибов наблюдали на сусло-агаре. Скорость роста мицелия при температуре 24°С
составила в среднем для G. applanatum – 2,0 мм/сут, F. fomentarius – 1,5 мм/сут и
9
F. velutipes – 1,2 мм/сут. На указанной среде рост культур был типичным для
соответствующих видов. F. fomentarius образовывал плоские ватно-войлочные колонии
белого цвета, в центре пигментированные в желто-бежевый цвет, со слаборазвитым
воздушным мицелием; F. velutipes – колонии белого цвета, выпуклые, округлые, с ровным
краем, с сильно развитым воздушным ватообразным мицелием ярко-белого цвета; у
G. applanatum воздушный мицелий был слаборазвит, белого цвета, субстратный – не
пигментирован, при старении культуры мицелий приобретал окраску от желто-золотистой
до светло-коричневой. При длительном культивировании G. applanatum (больше 2-х
недель) на поверхности мицелия появлялись структуры в виде «губок». Остальные
плотные питательные среды осваивались мицелием грибов менее интенсивно. Общим
микроморфологическим
признаком
для
всех
изученных
грибов
было
наличие
регулярносептированного мицелия с одиночными пряжками, часто без просвета,
характерными для базидиомицетов.
Глубинное культивирование мицелия проводили в жидких питательных средах:
ГПС и ЖС. Интенсивное накопление биомассы мицелия наблюдали на ЖС (10–14 г/л),
однако, использование этой среды создавало трудности при выделении и очистке
углеводных фракций; поэтому для дальнейших исследований была выбрана ГПС. Для
повышения выхода биомассы мицелия варьировали источники углеродного (рис. 1) и
азотного питания (рис. 2), входящие в состав ГПС.
7
Б
6
5
Ganoderma applanatum
4
Fomes fomentarius
3
Flammulina velutipes
2
1
0
1
2
3
4
5
6
Рис. 1. Влияние источников углерода в питательной среде на выход биомассы мицелия
грибов (p<0,05)
По оси абсцисс:
1, 2, 3 – варианты среды с глюкозой в концентрации 10; 7 и 5 г/л соответственно;
4 – среда с растворимым крахмалом; 5 – среда с нерастворимым крахмалом;
6 – среда с сахарозой.
По оси ординат: Б – выход биомассы мицелия, г/л.
Для исследуемых культур оптимальным источником углерода была глюкоза в
концентрации 10 г/л. Замена глюкозы на другие источники углерода (сахарозу, крахмал)
или снижение её концентрации в среде приводили к значительному снижению выхода
10
мицелия (на 17–94%). Повышение концентрации глюкозы в среде (выше 10 г/л) было
нецелесообразным, так как не приводило к существенному увеличению выхода биомассы.
7
Б
6
5
Ganoderma applanatum
4
Fomes fomentarius
3
Flammulina velutipes
2
1
0
1
2
3
Рис. 2. Влияние источников азота в питательной среде на выход биомассы мицелия грибов
(p<0,05)
По оси абсцисс: 1 – среда с пептоном;
2 – среда с пептоном и дрожжевым экстрактом;
3 – среда с пептоном и дрожжевым автолизатом.
По оси ординат: Б – выход биомассы мицелия, г/л.
В ходе экспериментов установили, что при внесении в ГПС дополнительно к
пептону (основному источнику азота в ГПС) дрожжевого автолизата в концентрации
20 мл/л выход мицелия увеличился на 40–70%. Было показано, что исследуемые грибы
хорошо усваивали органические формы азота и практически не усваивали источники
неорганического азота (натрия нитрат и аммония сульфат). Соотношение С:N в
подобранной глюкозо-пептонной среде, содержащей 10 г/л глюкозы, 20 мл/л дрожжевого
автолизата и 2,5 г/л пептона, составило 35:1.
Установили, что культуры на ГПС росли в широком диапазоне начальных
значений рН среды (от 3,0 до 7,5) (рис. 3).
Б
7
6
5
G.applanatum
4
F.fomentarius
3
F.velutipes
2
1
0
3
4
5
6
6,5
7
7,5
Рис. 3. Влияние исходного рН среды на выход биомассы мицелия (p<0,05)
По оси абсцисс: исходные значения рН среды (ГПС).
По оси ординат: Б – выход биомассы мицелия, г/л.
11
Оптимальное значение рН среды для роста G. applanatum составило 5,0,
F. velutipes, F. fomentarius – 6,0. Для дальнейших исследований было принято исходное
значение рН среды – 6,0.
Динамические условия культивирования были более благоприятны для накопления
биомассы, чем статические: выход биомассы G. applanatum и F. fomentarius в
динамических условиях был в 2 раза выше, а у F. velutipes – в 7 раз выше, чем в
статических условиях (p<0,05). На жидких средах в статических условиях культуры
образовывали войлочные пленки различной толщины, при выращивании в динамических
условиях – пеллеты (крупные шарообразные скопления биомассы, состоящие из клеток
мицелия) диаметром 0,2–1,0 см. В крупных глобулах наблюдали зональность, полости.
При микроскопии глубинного мицелия обнаружили активно ветвящиеся гифы, с
одиночными крупными пряжками. Использование вегетативного посевного материала в
форме пеллет вместо агаровых блоков способствовало повышению выхода биомассы
мицелия в 1,5–2,0 раза, сроки культивирования при этом сократились на 4–5 суток. В
результате подбора условий культивирования выход биомассы мицелия G. applanatum
увеличился на 30%, F. fomentarius – на 23%, F. velutipes – на 39% по сравнению с выходом
в исходных условиях (p<0,05), и составил 6,0; 4,8 и 5,5 г/л соответственно.
Была изучена динамика развития грибов на подобранной среде в глубинных
условиях (рис. 4). В течение первых 4-х суток культивирования происходило
незначительное потребление грибами источников углерода и азота. Резкое уменьшение
содержания глюкозы в среде наблюдали на 5-е, аминного азота – на 7-е сутки (при
культивировании F. fomentarius на 4-е сутки). К 10-м суткам происходила почти полная
утилизация культурами питательных веществ, при этом значительное накопление
биомассы наблюдали со 2-х по 8-е сутки ферментации. Максимальная продуктивность
мицелия G. applanatum, F. velutipes и F. fomentarius составила 1,2 г/лсут, 1,3 г/лсут и
1,0 г/лсут соответственно. Значение рН среды к 5–6-м суткам снижалось с исходного 6,0
до 3,5–3,8; с 8-х суток наблюдали повышение значения рН до 4,8–7,5. Возможно, рост
культур после исчерпания источников питания в среде происходил за счет потребления
продуктов ЦТК в качестве субстрата, что могло являться причиной подъёма рН.
Таким образом, были изучены морфолого-культуральные и микроморфологические
характеристики культур при росте на плотных и жидких питательных средах, подобраны
состав среды и условия для накопления биомассы мицелия. На основании полученных
результатов было предложено сокращение сроков культивирования исследуемых
базидиомицетов с 14 до 8 суток.
12
12
С
а
10
8
1
2
6
3
4
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
сутки
0,35
N
б
0,3
0,25
1
0,2
2
0,15
3
0,1
0,05
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14
сутки
8
в
рН
7
6
5
1
4
2
3
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
сутки
10
11
12
13
14
г
7 Б
6
5
1
4
2
3
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
сутки
Рис. 4. Динамика утилизации источников углерода (а) и азота (б),
изменения рН (в) и накопления биомассы (г) в процессе глубинного
культивирования
По оси абсцисс: время культивирования.
По оси ординат: а) N – концентрация α-аминного азота, мг/мл;
б) С – концентрация сахаров, мг/мл;
в) рН – значения рН среды в процессе культивирования;
г) Б – выход биомассы мицелия, г/л.
1 – F. fomentarius; 2 – G. applanatum; 3 – F. velutipes.
13
Изучение состава и физико-химических свойств мицелия, экзо- и
эндополисахаридов грибов
Мицелий грибов G. applanatum, F. velutipes и F. fomentarius, выделенные из него
растворимые (РФр) и нерастворимые фракции (НФр), а также экзополисахарид (ЭПС),
синтезируемый G. applanatum состояли преимущественно из углеводов (табл. 1 и 2).
Таблица 1. Характеристика химического состава мицелия базидиомицетов
Образец
n=6
F. fomentarius
Редуцирующие
вещества*, %
66,2±2,1
Белок*, %
Зольность*, %
13,0±1,5
1,8±0,1
F. velutipes
56,0±3,1
17,5±1,9
1,4±0,1
G. applanatum
67,0±2,0
22,5±1,9
1,4±0,04
* – % от высушенной массы образца.
Наибольшее количество редуцирующих веществ содержали растворимые фракции
мицелия грибов и экзополисахарид (82,5–89,0% и 85,0% соответственно). Количество
белка в выделенных из мицелия фракциях и экзогликане составляло от 1,0 до 10,0% от
сухого веса образца. В мицелии отмечали более высокое содержание белка (13,0–22,5%),
количество редуцирующих веществ не превышало 67,0%. Содержание минеральных
примесей во фракциях, мицелии и ЭПС было незначительным.
Установили, что соотношение растворимой и нерастворимой фракции в мицелии и
их состав не зависели от условий культивирования. Хроматографическим анализом
гидролизатов фракций было показано, что основным углеводным компонентом являлась
глюкоза, причем её содержание в нерастворимых фракциях было на 20% выше, чем в
растворимых (исключение – фракции G. applanatum, которые практически не различались
по составу). В РФр F. velutipes и F. fomentarius помимо глюкозы отмечали высокое
содержание маннозы и галактозы. Экзогликан и растворимый клеточный полисахарид
G. applanatum состояли из одних и тех же моносахаридов, содержание глюкозы в ЭПС
было на 15% ниже, а маннозы на 17% выше, чем в РФр (табл. 2). Растворимые фракции
мицелия исследуемых грибов содержали различные типы гликозидных связей, с
преобладанием 1→4, 1→2-, а в случае F. fomentarius – 1→3-гликозидных связей.
Содержание 1→3-гликозидных связей в нерастворимых фракциях было почти на 20%
выше, чем в растворимых, что коррелировало с высоким содержанием глюкозы в
нерастворимых полимерах. Достаточно высокое содержание 1→4-гликозидных связей в
нерастворимых фракциях мицелия, возможно, было связано с наличием в них хитина.
14
Таблица 2. Характеристика химического состава углеводных компонентов мицелия
Образец
Ред.
Белок*,
Золь-
n=6
в-ва*,
%
ность*,
Моносахаридный состав**, %
F. fomentarius
РФр
82,5±
3,6
1,0±
0,1
0,3±
0,07
44,7
3,3
29,5
20,2
Фукоза и
арабиноза
2,3
F. fomentarius
НФр
74,0±
2,1
10,0±
1,2
0,6±
0,05
65,7
1,7
18,6
13,2
0,8
F. velutipes
РФр
F. velutipes
НФр
G. applanatum
РФр
84,0±
2,8
7,5±
1,4
0,2±
0,01
53,6
3,2
23,6
18,0
1,6
65,3±
3,5
88,9±
3,9
10,0±
1,8
7,5±
1,1
0,8±
0,03
0,2±
0,08
78,8
1,4
9,8
9,4
0,6
75,3
1,1
9,0
13,8
0,8
G. applanatum
НФр
84,0±
4,1
5,0±
0,9
0,8±
0,1
71,1
2,1
11,9
14,0
0,9
%
%
Глюкоза
Ксилоза
Манноза
Галактоза
G. applanatum
85,0±
2,2±
0,2±
59,8
2,8
26,5
9,6
1,3
ЭПС
4,0
0,3
0,02
* – % от высушенной массы образца, ** – % от общего содержания углеводов в образце.
Показатели удельного вращения 0,1% водных растворов растворимых фракций
исследуемых грибов и ЭПС варьировали в пределах +8,0–+31°, что позволило сделать
предположение о наличии в изучаемых гликанах α- и β-гликозидных связей. Наличие
данных связей также подтвердили результаты проведенной ИК-спектроскопии. На ИКспектрах НФр отмечали характеристические полосы хитина, что подтверждало его
присутствие во фракциях, поэтому предположили, что НФр представляли собой хитинглюкановые
комплексы.
При
изучении
молекулярно-массового
распределения
полисахаридных компонентов в растворимых фракциях установили, что РФр состояли из
нескольких компонентов, различающихся по молекулярной массе, то есть представляли
собой гетерогенные системы. На гельхроматограммах фракций наблюдали 2 основных
углеводных пика. Вероятно, РФр являлись смесью гетерополисахаридов, состоящих из
глюкозных, маннозных и галактозных остатков с α- и β-гликозидными связями. Был
проведен сравнительный гельхроматографический анализ ЭПС и РФр мицелия
G. applanatum.
При
исследовании
ЭПС
G. applanatum
обнаружили
3
пика,
соответствующие различным фракциям, причем основной пик совпадал по времени
выхода с максимальным пиком растворимого клеточного полисахарида. Вероятно,
внеклеточный
полисахарид,
в
основном,
является
растворимых полисахаридов клеточных стенок гриба.
результатом
гиперпродукции
15
Изучение иммунобиологической активности мицелия грибов и фракций
Оптимальная стимулирующая доза гликанов при однократном внутрибрюшинном
введении фракций была экспериментально выбрана 50 мг/кг. При введении гликанов в
более высоких концентрациях показатели функциональной активности макрофагов
практически не изменялись.
Полисахаридные фракции достоверно стимулировали функциональную активность
макрофагов в течение всего срока наблюдения (10 дней), что свидетельствовало об их
стойком и долговременном действии (рис. 5).
8
а
Х
7
6
1
5
2
3
4
4
3
5
2
6
1
0
1
5
10
сутки
80
б
Р
70
60
1
50
2
3
40
4
30
5
20
6
10
0
1
5
10
сутки
70
в
ПС
в
60
1
50
40
2
3
*
4
30
5
20
6
10
0
1
5
10
сутки
Рис. 5. Динамика изменений показателей функциональной активности макрофагов под
действием гликанов (р<0,01, кроме *)
По оси абсцисс: время опыта.
По оси ординат: а) Х (хемотаксис) – количество клеток в 1 мл ППС,×106,
б) Р (распластывание) – количество распластанных макрофагов, %,
в) ПС – количество макрофагов, поглотивших клетки C. аlbicans, %.
1–НФр G. applanatum; 2–РФр G. applanatum; 3–НФр F. fomentarius;
4–РФр F. fomentarius; 5–НФр F. velutipes;
6–РФр F. velutipes.
контроль –
16
Наиболее эффективны были растворимые фракции мицелия, при их введении
показатели хемотаксиса и активации цитоплазматической мембраны макрофагов
(распластывания) достигали максимальных значений на 5-е сутки эксперимента:
количество перитонеальных клеток в брюшной полости увеличивалось в 2,9–3,4 раза
(p<0,01), количество распластанных макрофагов – на 41–58% по сравнению с
контрольным уровнем (p<0,01). К 10-м суткам показатели несколько снижались,
сохраняясь достоверно выше контроля (p<0,01). Нерастворимые фракции оказывали менее
выраженное стимулирующее действие на макрофаги, чем растворимые, но обладали
пролонгированным эффектом, который сохранялся вплоть до 10-х суток эксперимента,
что, вероятно, связано с медленным выведением фракций из организма. Максимальное
увеличение активности макрофагов под действием ЭПС G. applanatum наблюдали на 1-е
сутки после введения препарата, активность ЭПС была ниже по сравнению с активностью
углеводных фракций (рис. 6).
ИА
3,5
хемотаксис
3
*
активация
цитоплазматической
мембраны
2,5
2
*
1,5
‫٭‬
*
*
* *
микробоцидность
1
0,5
0
1
2
поглотительная
способность по
отношению к
C.albicans
3
Рис. 6. Влияние углеводных фракций G. applanatum на показатели активации макрофагов
По оси абсцисс: 1 – РФр G. applanatum; 2 – НФр G. applanatum;
3 – ЭПС G. applanatum.
По оси ординат: ИА (Xo/Xk) – индекс активации.
*р<0,05 достоверность различий показателей по сравнению с контролем;
‫٭‬р<0,01 достоверность различий показателей по сравнению с контролем;
В остальных случая р<0,001 достоверность различий показателей по сравнению с
контролем.
Поглощение макрофагами убитых нагреванием клеток C. albicans (штамм АТСС
855-263) на ранние сроки действия гликанов было на уровне контроля, что, вероятно,
связано с временным экранированием лектиноподобных рецепторов на поверхности
макрофагов и их недоступностью для маннозосодержащих полисахаридных компонентов
клеточных
стенок
дрожжей.
На
5-е
сутки
эксперимента
наблюдали
усиление
фагоцитарной активности макрофагов под действием гликанов, особенно растворимых
17
фракций (значение показателя увеличилось в 1,4–2,5 раза по сравнению с контролем
(p<0,01)), к 10-м суткам показатели фагоцитоза оставались на том же уровне (рис.5в).
Фракции
G. applanatum,
F. fomentarius,
F. velutipes
и
ЭПС
G. applanatum
стимулировали способность фагоцитов к киллингу тест-культуры S. aureus (штамм 209),
наиболее сильным микробоцидным действием обладала РФр G. applanatum.
Таким образом, полисахаридные фракции мицелия грибов оказывали выраженное
стимулирующее действие на клетки системы мононуклеарных фагоцитов, в частности
перитонеальные макрофаги мышей (рис. 7).
ИА
3,5
*
‫٭‬
3
*
хемотаксис
‫٭‬
*
*
2,5
2
*
1,5
*
‫٭‬
активация
цитоплазматической
мембраны
*
‫٭‬
*
*
***
микробоцидность
1
поглотительная
способность по
отношению к Candida
albicans
0,5
0
1
2
3
4
5
6
Рис. 7. Сравнительная характеристика показателей активации макрофагов под влиянием
углеводных фракций мицелия
По оси абсцисс:
1 – РФр G. applanatum; 2 – НФр G. applanatum;3 – РФр F. fomentarius;
4 – НФр F. fomentarius; 5 – РФр F. velutipes; 6 – НФр F. velutipes.
По оси ординат: ИА (Xo/Xk) – индекс активации.
*р<0,05 достоверность различий показателей по сравнению с контролем;
‫٭‬р<0,01 достоверность различий показателей по сравнению с контролем;
В остальных случая р<0,001 достоверность различий показателей по сравнению с
контролем.
Мицелий грибов при пероральном введении в дозе 70 мг/кг в течение 5 дней
оказывал
стимулирующее
действие
на
показатели
функциональной
активности
макрофагов, но в меньшей степени, чем фракции (рис. 8).
Таким образом, показано, что мицелий исследуемых грибов, выделенные из него
углеводные
фракции,
а
также
экзогликан
G. applanatum
являются
активными
стимуляторами основных функций клеток системы мононуклеарных фагоцитов, в
частности
перитонеальных
макрофагов
мышей,
что
проявлялось
в
увеличении
показателей, отражающих стадии фагоцитоза. Наиболее активными были растворимые
углеводные фракции мицелия. Вероятно, биологическая активность мицелия грибов во
многом определяется содержанием в его составе веществ полисахаридной природы.
18
ИА
1,8
‫٭‬
‫٭‬
*
‫٭‬
1,6
‫٭‬
*
хемотаксис
1,4
1,2
активация
цитоплазматической
мембраны
1
0,8
поглотительная
способность по
отношению
C.albicans
0,6
0,4
0,2
0
1
2
3
Рис. 8. Изменение показателей активации макрофагов при пероральном введении мицелия
грибов
По оси абсцисс: 1 – G. applanatum; 2 – F. fomentarius; 3 – F. velutipes.
По оси ординат: ИА (Xo/Xk) – индекс активации.
*р<0,05 достоверность различий показателей по сравнению с контролем;
‫٭‬р<0,01 достоверность различий показателей по сравнению с контролем;
В остальных случая р<0,001 достоверность различий показателей по сравнению с
контролем.
Изучение противоопухолевой активности гликанов
Для изучения противоопухолевого действия гликанов были выбраны фракции,
отличающиеся по моносахаридному составу и растворимости – НФр мицелия
F. fomentarius, РФр и НФр мицелия G. applanatum.
Многократные введения гликанов (ежедневно в течение 5 дней) в дозе 50 мг/кг не
отразились на общем состоянии мышей, их поведении, потреблении корма и воды, что
свидетельствовало об их хорошей переносимости. По результатам измерения объема
опухоли в динамике (наблюдение в течение 21 дня) было установлено, что наиболее
значительным противоопухолевым эффектом обладала РФр G. applanatum. Объемы
опухоли у мышей, которым вводили этот гликан, были на 55-58% меньше, чем у мышей
контрольной группы. Нерастворимые фракции G. applanatum и F. fomentarius в меньшей
степени ингибировали рост опухоли, что позволяет судить об их
умеренной
противоопухолевой активности. Противоопухолевую активность гликанов оценивали по
проценту торможения роста опухоли (Т%) (рис. 9), индексу эффективности препарата
(ИЭ) (рис. 10) и индексу роста опухоли (ИРО).
РФр G. applanatum вызывала статистически достоверное торможение роста
опухоли на все сроки наблюдения, причем процент торможения роста опухоли (Т%)
достигал высоких значений (58%) уже на 10-е сутки после перевивки. НФр G. applanatum
и F. fomentarius оказывали менее выраженный ингибирующий эффект (Т% – 31–39%),
статистически достоверное торможение роста наблюдали на более поздние сроки
19
эксперимента (17–19 сутки). При оценке показателя индекса эффективности гликанов
(ИЭ) наблюдали ту же тенденцию, что и при измерении Т% (рис. 10).
60
Т%
*
*
*
‫٭‬
‫٭‬
‫٭‬
50
‫٭‬
‫٭‬
40
*
30
*
1
2
20
3
10
0
7
10
12
14
17
19
21
сутки
Рис. 9. Динамика торможения роста опухоли
По оси абсцисс: время опыта.
По оси ординат: Т% – процент торможения роста опухоли.
1 – НФр F. fomentarius; 2 – РФр G. applanatum; 3 – РФр G. applanatum.
*р<0,05 достоверность различий показателей по сравнению с контролем;
‫٭‬р<0,01 достоверность различий показателей по сравнению с контролем.
ИЭ
2,5
*
*
*
‫٭‬
‫٭‬
‫٭‬
2
*
1,5
*
‫٭‬
‫٭‬
1
1
2
3
0,5
0
7
10
12
14
17
19
21
сутки
Рис. 10. Динамика изменения индекса эффективности гликанов
По оси абсцисс: время опыта.
По оси ординат: ИЭ – индекс эффективности.
1 – НФр F. fomentarius; 2 – РФр G. applanatum; 3 – РФр G. applanatum.
*р<0,05 достоверность различий показателей по сравнению с контролем;
‫٭‬р<0,01 достоверность различий показателей по сравнению с контролем.
Для оценки динамики изменения объемов опухолей в опытной и контрольной
группах использовали кинетические кривые роста опухолей (рис. 11) и индекс роста
опухоли (ИРО), выражающий отношение площадей под кинетическими кривыми роста в
опытной и контрольной группах.
ИРО – интегральный критерий, учитывающий выраженность и продолжительность
противоопухолевого действия препарата. Чем меньше индекс роста опухоли, тем
продолжительнее и сильнее терапевтический эффект.
20
8000
V
7000
6000
контроль
5000
1
4000
2
3000
3
2000
1000
0
7
10
12
14
17
19
21
сутки
Рис. 11. Кинетические кривые роста опухолей
По оси абсцисс: время опыта.
По оси ординат: V – объём опухолей, мм3.
1 – НФр F. fomentarius; 2 – РФр G. applanatum; 3 – РФр G. applanatum.
При введении нерастворимых фракций F. fomentarius и G. applanatum ИРО
составлял 0,79 и 0,68, соответственно, разница между опытом и контролем не являлась
статистически достоверной. При применении РФр G. applanatum ИРО с высокой степенью
достоверности (р<0,01) отличался от контрольных значений и составлял 0,46 (46% по
отношению к контролю). Таким образом, наиболее устойчивым и выраженным
противоопухолевым действием обладала РФр G. applanatum, нерастворимые фракции
обладали более кратковременным эффектом.
Таким образом, показано, что углеводные компоненты мицелия грибов оказывают
стимулирующее действие на макрофаги и обладают противоопухолевой активностью в
отношении асцитной опухоли Эрлиха. Возможно, ингибирование роста опухолей под
действием гликанов осуществляется за счет стимулирования иммунной системы. На
примере растворимой полисахаридной фракции мицелия G. applanatum, было показано,
что грибные полисахариды не обладают токсичностью. Максимально переносимая доза
данного гликана при оценке острой токсичности составила 5000 мг/кг, на основании чего,
он был отнесен к веществам 4 класса токсичности (Globally Harmonized System of
Classification and Labeling of Chemicals, 2006), то есть нетоксичным соединениям. Таким
образом,
полисахариды
базидиомицетов
перспективно
использовать
в
качестве
вспомогательных средств в комплексной терапии, в частности онкологических больных.
21
ВЫВОДЫ
1. Подобраны условия культивирования и состав питательной среды для накопления
биомассы мицелия грибов G. applanatum, F. velutipes и F. fomentarius; выход
биомассы вырос на 23–40%, сроки ферментации сокращены с 14 до 8 суток.
2. Изучена динамика роста исследуемых базидиомицетов в условиях глубинного
культивирования. Активное накопление биомассы наблюдали в течение первых 5-ти
суток, что сопровождалось почти полной утилизацией источников углерода и
сокращением содержания азота в среде в 2 раза.
3. Установлено, что мицелий грибов содержит водорастворимые и нерастворимые
полисахаридные фракции. Растворимые фракции представляли собой смесь
гетерополисахаридов, состоящих преимущественно из глюкозных, маннозных и
галактозных остатков, нерастворимые - хитин-глюкановые комплексы. Основным
углеводным компонентом фракций являлась глюкоза (45–79%).
4. G. applanatum в условиях глубинного культивирования синтезирует внеклеточный
гетерогликан, сходный по составу и физико-химическим характеристикам с
растворимой полисахаридной фракцией гриба.
5. Установлено, что полисахаридные фракции мицелия обладают выраженным
стимулирующим действием на клетки системы мононуклеарных фагоцитов, в
частности перитонеальные макофаги мышей, что проявляется в увеличении
показателей их функциональной активности, отражающих стадии фагоцитоза.
Растворимые полисахаридные фракции оказывали более активное действие на
макрофаги по сравнению с нерастворимыми.
6. Показано, что активирующий эффект полисахаридных фракций на макрофаги
сохраняется в течение 10-ти суток после их однократного введения. Растворимая
фракция проявляла максимальную активность в течение первых 5-ти суток,
нерастворимая оказывала более длительное стимулирующее действие (до 10-х
суток).
7. Растворимая полисахаридная фракция
G. applanatum не токсична, обладает
выраженным пролонгированным противоопухолевым действием в отношении
асцитной опухоли Эрлиха. Нерастворимые фракции G. applanatum и F. fomentarius
обладают умеренной противоопухолевой активностью.
22
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Кожемякина Н.В., Гурина С.В., Ананьева Е.П., Стуков А.Н. Характеристика
компонентов мицелия Ganoderma applanatum; изучение их иммунобиологической и
противоопухолевой активности // Проблемы медицинской микологии. – 2008. – Т. 10, № 1.
– С. 40–43.
2. Кожемякина Н.В., Гурина С.В., Ананьева Е.П. Иммунобиологическая активность
мицелия Fomes fomentarius и выделенных из него углеводных фракций // Проблемы
медицинской микологии. – 2010. – Т 1. – С. 27–30.
3. Кожемякина Н.В., Гурина С.В., Ананьева Е.П. Условия культивирования, состав
и биологическая активность мицелия Flammulina velutipes (Fr.). P. Karst // Прикладная
биохимия и микробиология. – 2010. – Т 46, № 5. – С. 583–586.
4. Кожемякина Н.В., Галынкин В.А. Влияние условий культивирования на характер
роста
представителей
высших
базидиомицетов
//
Тез. докл. VI межд. форума
«Биотехнология и современность». – СПб, 2005. – С. 42–43.
5. Кожемякина Н.В., Гурина С.В., Ананьева Е.П., Стуков А.Н. Получение
углеводных фракций из базидиомицетов и изучение их биологической активности //
Тез. докл. VII межд. форума «Биотехнология и современность». – СПб, 2006. – С. 20–21.
6. Кожемякина Н.В. Влияние некоторых условий культивирования на характер
роста представителей высших базидиомицетов // Сб. научн. тр. конф., посвященной 60летию ФПТЛ СПХФА. – СПб: СПХФА, 2006. – С. 102–103.
7. Кожемякина Н.В., Гурина С.В., Ананьева Е.П. Гликаны грибов как
иммуностимуляторы // Научн. труды V Всеросс. конгресса по мед. микологии «Успехи
медицинской микологии». – М., 2007. – Т. IX. – С. 154.
8. Кожемякина Н.В. Противоопухолевая активность гликанов базидиальных грибов
//
Тез.
докладов
регион.
научн.
конф.
«Молодые
ученые
практическому
здравоохранению». – СПб: СПХФА, 2007. – С. 117–118.
9. Кожемякина Н.В., Гурина С.В., Ананьева Е.П. Состав и биологическая
активность фракций, выделенных из некоторых базидиомицетов // Труды научн-практ.
конф. «Фармация из века в век», ч. IV. – СПб, 2008. – С. 53–56.
10. Кожемякина Н.В., Гурина С.В., Ананьева Е.П. Глубинное культивирование
некоторых базидиомицетов // Тез. докл. II съезда микологов России «Современная
микология в России». – М., 2008. – Т. 2. – С. 330.
11. Кожемякина Н.В., Гурина С.В., Ананьева Е.П. Иммуномодулирующая
активность
мицелия
некоторых
базидиомицетов
//
Иммунология,
аллергология,
инфектология. Сб. тр. междисц. микологического форума. – М., 2010. – №1. – С. 253–254.