СОСНИНА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА СРАВНИТЕЛЬНОЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ, СТАНДАРТИЗАЦИЯ СЫРЬЯ И ФИТОПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи
СОСНИНА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ,
СТАНДАРТИЗАЦИЯ СЫРЬЯ И ФИТОПРЕПАРАТОВ
ВИДОВ РОДА PLANTAGO L.
Специальность 15.00.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата фармацевтических наук
ПЕРМЬ – 2009
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего
профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая
академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель:
кандидат фармацевтических наук, профессор Олешко Григорий Иванович
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук, профессор Фурса Николай Сергеевич,
ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Федерального
агентства по здравоохранению и социальному развитию»
кандидат фармацевтических наук, доцент Калина Милитина Александровна,
ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального
агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Ведущая организация:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального
агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится 15 декабря 2009 года в 13 часов на заседании диссертационного
совета Д 208.068.01 при ГОУ ВПО ПГФА Росздрава по адресу 614990, г. Пермь,
ул. Ленина, 48. Тел. (3422) 129-006, 123-445; Факс (3422) 129-476.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ПГФА
Росздрава по адресу: 614070 г. Пермь, ул. Крупской, 46.
Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте ПГФА
http://www. pfa.ru 12 ноября 2009 г.
Автореферат разослан 12 ноября 2009 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета Д 208.68.01,
кандидат фармацевтических наук, доцент
И.А. Липатникова
3
Общая характеристика работы
Актуальность темы. В научной медицине России применяются подорожник большой – Plantago major L. и подорожник блошный – Plantago psyllium L.
Фармакопейным видом является подорожник большой. Листья и препараты из
него - настой, сборы, «Плантаглюцид», настойка обладают противовоспалительной, антимикробной, антиоксидантной и гиполипидемической активностью. Это обусловлено комплексом биологически активных веществ (полисахариды, флавоноиды, оксикоричные кислоты, иридоиды).
Систематически близкие виды подорожник средний – Plantago media L. и
подорожник ланцетный – Plantago lanceolata L. произрастают в более экологически чистых луговых сообществах.
Выявление близости химического состава и высокого содержания биологически активных веществ дает возможность предложить дополнительные источники лекарственного растительного сырья. При обнаружении хемотаксономических различий создаются предпосылки для разработки оптимальных методик
качественного и количественного анализа лекарственного растительного сырья.
Сравнительное исследование лекарственных растений и близких к ним в систематическом отношении видов, а также стандартизация сырья и фитопрепаратов имеют актуальное значение.
Цель исследования – сравнительное фармакогностическое изучение видов
подорожника – большого, среднего и ланцетного; разработка и совершенствование методик оценки качества листьев и настойки подорожника большого.
Задачи исследования:
1. Провести сравнительный анализ качественного состава и количественного
содержания основных групп биологически активных веществ (БАВ) в листьях
подорожника большого, п. среднего и п. ланцетного.
2. Разработать методики количественного анализа ведущих групп БАВ листьев
подорожника большого, п. среднего, п. ланцетного.
3. Определить товароведческие показатели листьев подорожника большого, п.
среднего и п. ланцетного.
4
4. Установить показатели оценки качества по содержанию БАВ для листьев подорожника большого.
5. Составить проект ФС на листья подорожника большого для ГФ ХII издания.
6. Разработать методику оценки качества настойки подорожника по содержанию суммы флавоноидов.
7. Изучить возможность использования листьев подорожника среднего и п.
ланцетного для получения настойки и препарата «Плантаглюцид». Определить
токсичность субстанции для получения препарата «Плантаглюцид».
Научная новизна. Проведено комплексное сравнительное фармакогностическое изучение листьев подорожника большого, п. среднего и п. ланцетного.
Проведен качественный и количественный анализ фракций полисахаридного
комплекса подорожников большого, п. среднего и п. ланцетного. Модифицирована методика количественного определения суммы полисахаридов в листьях
подорожника большого. Из листьев подорожника среднего и п. ланцетного получены субстанции для производства препарата «Плантаглюцид», определена
их токсичность.
Изучена динамика накопления флавоноидов и полисахаридов в листьях подорожника большого.
Определено содержание экстрактивных веществ в листьях подорожника
большого, п. среднего и п. ланцетного, извлекаемых различными растворителями.
Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в
пересчете на цинарозид для сырья и настойки подорожника большого.
Проведен сравнительный анализ сырья и настоек из листьев подорожника
большого, п. среднего и п. ланцетного по содержанию суммы флавоноидов в
пересчете на цинарозид.
Практическая значимость. Разработан проект ФС на листья подорожника
большого для ГФ ХII издания, включены в статью микрофотографии и характеристика УФ – спектра, необходимые для достоверной идентификации сырья.
5
Разработана и валидирована методика спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид для листьев подорожника большого. Методика адаптирована для стандартизации
настойки подорожника.
Предложены показатели оценки качества сырья с учетом путей использования: по содержанию суммы флавоноидов и содержанию экстрактивных веществ.
Установлено, что листья подорожника среднего и п. ланцетного перспективны для получения настойки и препарата «Плантаглюцид».
Результаты проведенных исследований используются в учебном процессе на
кафедре фармакогнозии ГОУ ВПО ПГФА при изучении теоретического и практического материала на третьем курсе очного факультета, на занятиях интернов, слушателей элективных курсов, факультета дополнительного профессионального образования провизоров и центра повышения квалификации работников здравоохранения.
Публикация материалов исследования и апробация работы. По теме
диссертации опубликовано 6 работ, в том числе статья в журнале, рекомендованном ВАК. Материалы диссертационной работы представлены на научно –
практических конференциях профессорско-преподавательского состава Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь, 2006, 2007 гг.), на
международной Российско-Китайской научной конференции (Пермь, 2006 г.);
на международном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008 г.).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических
наук. Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО ПГФА Росздрава в соответствии с планом научно-исследовательских работ по теме «Изучение лекарственной флоры РФ». Номер Государственной регистрации 01.9.10.018875. Тема утверждена на заседании Учёного совета Пермской государственной фармацевтической академии (протокол № 4 от 28.12.2006 г.)
6
На защиту выносятся результаты:
 сравнительного фитохимического анализа листьев подорожника большого,
п. среднего и п. ланцетного;
 разработки и валидации методики количественного определения суммы
флавоноидов в пересчете на цинарозид;
 фракционного анализа и количественного определения полисахаридов в листьях подорожника большого, п. среднего и п. ланцетного;
 товароведческого анализа листьев подорожника большого, п. среднего и п.
ланцетного;
 исследований динамики накопления флавоноидов и полисахаридов листьев
подорожника большого, п. среднего и п. ланцетного;
 исследований экстракционных лекарственных форм из листьев подорожника
среднего и п. ланцетного.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (4 глав), общих выводов, списка литературы и приложения;
иллюстрирована 20 рисунками и 61 таблицами. Список литературы включает
166 источников, в том числе 17 – на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и
задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы, основные положения, выносимые на защиту.
В обзоре литературы (глава 1) дана морфологическая характеристика и
обобщены данные о современном состоянии исследований по химическому составу, фармакологической активности, указано применение в научной и народной медицине листьев подорожника большого, п. среднего и п. ланцетного. В
главе 2 дана характеристика объектов и методов исследования. В главе 3 приведены результаты по исследованию фенольных соединений, полисахаридов,
иридоидов, дубильных веществ и элементного состава листьев подорожника
большого, п. среднего, и п. ланцетного. В главе 4 изложены материалы по разработке проекта Фармакопейной статьи для ГФ ХII издания «Plantaginis majoris
7
folia – Подорожника большого листья». В главе 5 приведены результаты исследования экстракционных лекарственных форм, полученных из листьев подорожника большого, п. среднего и п. ланцетного.
Содержание работы
Объекты исследований:
 70 образцов листьев подорожника большого, п. среднего, п. ланцетного, собранные в 2005 - 2008 гг. на территории Пермского края, Кировской, Свердловской, Челябинской областей;
 12 промышленных серий сырья подорожника большого различных производителей (ОАО «Красногорсклексредства», ООО «Апекс», ООО «Лекс +»,
ООО «Фито-ЭМ», ООО «Фито-старт», ЗАО «Иван-чай»);
 5 образцов промышленных серий настойки подорожника Тверской фарм.
фабрики (сер.10205, 30505, 20707,30408, 20308);
 2 серии препарата «Плантаглюцид» (сер.081106 производства ЗАО «ВИФИТЕХ», Московская обл. и сер.81006 производства ООО «Здоровье», г. Харьков);
 настойки и субстанции препарата «Плантаглюцид», полученные в лабораторных условиях из листьев исследуемых видов подорожника.
Для проведения качественного фитохимического анализа использовали общепринятые химические реакции, методы восходящей хроматографии на бумаге (ВХБ) в системах БУВ (бутанол : уксусная кислота : вода) 4:1:2; 3:1:1 и уксусная кислота : вода 15:85; 2:98; тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системах этилацетат : пиридин : вода : спирт-н-бутиловый : кислота уксусная
5:4:4:10:2; этиловый спирт : хлороформ 1:1, этиловый спирт : ацетон 3:7 и УФспектрофотометрии с использованием приборов СФ-46; СФ-2000.
Количественный анализ полисахаридов и экстрактивных веществ проводили
гравиметрическим методом; суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид методом дифференциальной спектрофотометрии по разработанной нами методике; иридоидов в пересчете на аукубин - методом фотоэлектроколориметрии;
8
суммы дубильных (окисляемых) веществ - титриметрическим методом по ГФ
ХI, вып.1.
Изучение элементного состава листьев подорожника большого, п. среднего
и п. ланцетного проводили на дифракционном спектрографе ДФС-13-1 методом
атомно-абсорбционной пламенной спектрометрии в аккредитованном аналитическом испытательном центре ОАО «Уральская центральная лаборатория», г.
Екатеринбург.
Определение товароведческих показателей проводили в соответствии с требованиями ГФ ХI и ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных
средств».
Субстанцию для препарата «Плантаглюцид» получали под руководством
проф., д.ф.н. Молоховой Е.И. на кафедре промышленной технологии лекарств
ГОУ ВПО ПГФА Росздрава.
Изучение острой токсичности проводили под руководством проф., д.м.н.
Сыропятова Б.Я. на кафедре физиологии и патологии ГОУ ВПО ПГФА Росздрава.
Сравнительный фитохимический анализ листьев подорожника
большого, п. среднего и п. ланцетного
Качественный анализ исследуемых видов подорожника подтвердил наличие в них полисахаридов, иридоидов и фенольных соединений, в том числе
флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ.
Полисахариды листьев подорожника большого, п. среднего и п. ланцетного
представлены 4 фракциями: водорастворимый полисахаридный комплекс
(ВРПК), протопектины (ПП), гемицеллюлоза А (ГЦ-А), гемицеллюлоза Б (ГЦБ). Среди фракций полисахаридов у всех видов подорожника преобладают: водорастворимый комплекс – от 31 до 36% и протопектины - около 40% (табл. 1).
На хроматограммах гидролизатов ВРПК и ПП подорожника большого, п.
среднего, п. ланцетного идентифицированы D(+)-глюкоза, L(+)арабиноза, Lрамноза и галактуроновая кислота (рис. 1). Моносахара ГЦ А и Б подорожника
большого представлены галактозой и арабинозой; подорожника среднего –
9
только арабинозой; подорожника ланцетного – галактозой и фруктозой
(табл. 1,2).
Таблица 1
Результаты фракционного анализа полисахаридов
Содержание полисахаридных фракций в листьях подорожника, %
большого
среднего
ланцетного
25,74
26,82
21,26
ВРПК
31,61
36,19
29,63
33,10
30,37
29,17
ПП
40,66
40,70
40,66
14,76
11,28
11,80
ГЦ А
18,13
15,12
16,45
7,81
6,14
9,51
ГЦ Б
9,59
8,23
13,26
Примечание: в числителе – содержание фракции от общей массы сырья;
в знаменателе – содержание фракции от общей массы полисахаридов.
Название
фракции
Рис.1. Схема хроматограммы гидролизатов фракций полисахаридов подорожников
большого, п. среднего и п. ланцетного в системе растворителей БУВ (3:1:1) с достоверными образцами моносахаров: ГЛЮК – D-глюкоза, ГАЛ – D(+)галактоза, АРАБ
– L(+)арабиноза, РАМН – L рамноза, ФРУК – D(-)-фруктоза, гал. к-та –
галактуроновая кислота.
Полученные результаты свидетельствуют о близком составе полисахаридного комплекса исследуемых видов подорожника.
Качественный состав фенольных соединений подорожника большого, п.
среднего и п. ланцетного на хроматограммах представлен 8 веществами, из них
5 – флавоноиды, 2 – фенолкарбоновые кислоты.
С помощью аутентичных образцов на одномерных хроматограммах идентифицировали цинарозид, хлорогеновую и феруловую кислоты в образцах всех
10
видов подорожников. Кофейная кислота обнаружена в листьях подорожника
большого и п. среднего.
Таблица 2
Состав полисахаридных фракций видов рода Plantago L.
Вид подорожника
П. большой
П. средний
П. ланцетный
ВРПК
L(+)арабиноза
L-рамноза
D(+)-глюкоза
галактуроновая
кислота
D-глюкоза
L(+)-арабиноза,
L-рамноза
галактуроновая
кислота
Фракции полисахаридов
ПП
ГЕМ.Ц-А
L(+)арабиноза
L-рамноза
D(+)-галактоза
D(+)-галактоза
D(-)-фруктоза
галактуроновая
кислота
D-глюкоза,
L(+)-арабиноза
L-рамноза
L(+)-арабиноза
галактуроновая
кислота
D-глюкоза
L(+)-арабиноза
L-рамноза
галактуроновая
кислота
D-глюкоза
L(+)-арабиноза
L-рамноза
галактуроновая
кислота
D(+)-галактоза
D(-)-фруктоза
ГЕМ.Ц-Б
D(+)-галактоза
D(-)-фруктоза
L(+)-арабиноза
D(+)-галактоза
D(-)-фруктоза
На двумерных хроматограммах подорожника большого, п. среднего и п.
ланцетного обнаружено 8 пятен фенольной природы, 6 из которых отнесены
нами к флавоноидам и 2 - к фенолкарбоновым кислотам.
УФ - спектры спиртовых извлечений из сырья всех исследуемых видов подорожника имеют максимум при длинах волн 288±3 нм и 333±2 нм, что подтверждает наличие флавонов, фенолкарбоновых и гидроксикоричных кислот
(рис. 2).
0,8
Оптическая плотность
0,7
0,6
2
0,5
0,4
1
3
0,3
0,2
0,1
0
240
260
280
300
1- П. большой
320
340
360
2- П. средний
380
400
420
440
Длина волны, нм
3- П. ланцетный
Рис. 2. Спектральные характеристики собственного светопоглощения
извлечений из листьев видов подорожника
11
Качественный состав иридоидов всех исследуемых видов подорожников
представлен каталполом, аукубином, каталпозидом.
Количественный анализ. Содержание полисахаридов (табл. 3) в листьях
подорожника большого - 14,80 - 20,55%, подорожника среднего - 12,28 20,90%, ланцетного - 11,33 – 18,18%. Статистическая обработка показала, что
фактор видовой принадлежности не оказывает существенного влияния на содержание полисахаридов в листьях исследуемых видов подорожника.
Таблица 3
Содержание полисахаридов в листьях видов подорожника
Содержание полисахаридов в листьях видов подорожника, %
№
П. большой
№
П. средний
№
П. ланцетный
образца
(1)
образца
(2)
образца
(3)
1
18,34 ± 0,55
5
12,28 ± 0,63
1
15,78 ± 1,50
4
17,63 ± 0,27
6
15,61 ± 0,53
3
12,10 ± 0,24
13
15,06 ± 0,27
8
15,99 ± 0,25
5
11,33 ± 0,43
16
14,80 ± 0,20
10
16,31 ± 0,47
8
12,44 ± 1,27
17
19,57 ± 1,93
11
16,45 ± 0,48
9
13,76 ± 0,79
19
16,68 ± 3,15
12
13,60 ± 0,90
10
12,52 ± 0,32
24
17,06 ± 2,37
14
16,76 ± 0,37
12
13,83 ± 0,93
25
20,55 ± 1,21
15
20,90 ± 0,22
13
18,18 ± 0,99
26
16,21 ± 0,98
17
19,06 ± 0,51
14
12,52 ± 0,23
27
19,75 ± 0,27
18
17,90 ± 0,69
15
17,36 ± 0,18
17,57 ± 0,47
16,49 ± 0,17
13,98 ± 0,26
Х
сравнение пар
1–2
2–3
1–3
tэ
1,0769
2,3203
3,6940
1,5739
1,1146
1,4120
Fэ
Примечания: в таблице приведены средние значения трех определений; табличные
значения коэффициентов Стьюдента tк =2,1007 и Фишера Fк =3,1827 при Р=0,05.
Содержание суммы флавоноидов определяли по разработанной нами методике спектрофотометрического определения для листьев подорожника большого, обладающей хорошей воспроизводимостью. Методика пригодна для определения суммы флавоноидов в других видах подорожника (табл. 4, рис. 9).
Таблица 4
Метрологические характеристики спектрофотометрического метода
количественного определения суммы флавоноидов
в листьях видов подорожника
Вид
подорожника
П. большой
П. средний
П. ланцетный
n
f
x
S2
10
10
10
9
9
9
0,978
1,116
0,817
0,00013
0,00015
0,00191
S
0,0067
0,0125
0,04373
Р,%
t(P, f)
х
 ,%
95
95
95
2,20
2,20
2,20
0,0296
0,0375
0,0304
2,91
3,36
3,73
12
Содержание флавоноидов в листьях подорожника большого составило 0,821,28%, п. среднего – 0,92-1,67%, п. ланцетного – 0,63-0,96%. Влияние фактора
видовой принадлежности на содержание флавоноидов несущественно (табл. 5).
Таблица 5
Содержание флавоноидов в листьях видов подорожника
Содержание флавоноидов в листьях видов подорожника, %
№
П. большой
№
П. средний
№
П. ланцетный
образца
(1)
образца
(2)
образца
(3)
3
1,28 ± 0,04
2
1,57 ± 0,06
4
0,77 ± 0,02
14
0,96 ± 0,02
3
1,45 ± 0,05
5
0,81 ± 0,02
15
0,90 ± 0,04
4
1,36 ± 0,04
6
0,83 ± 0,02
21
0,85 ± 0,02
5
1,42 ± 0,03
7
0,63 ± 0,03
22
1,11 ± 0,02
6
1,16 ± 0,03
8
0,92 ± 0,04
23
0,82 ± 0,01
7
1,29 ± 0,03
9
0,84 ± 0,03
26
1,00 ± 0,04
11
1,35 ± 0,02
10
0,79 ± 0,02
28
0,79 ± 0,03
12
0,92 ± 0,04
11
0,87 ± 0,01
29
1,05 ± 0,03
13
1,09 ± 0,03
12
0,93 ± 0,03
30
0,94 ± 0,01
14
1,43 ± 0,02
13
0,75 ± 0,04
31
0,99 ± 0,02
15
1,67 ± 0,03
14
0,96 ± 0,02
32
1,24 ± 0,03
16
1,34 ± 0,02
15
0,73 ± 0,04
0,99 ± 0,02
1,34 ± 0,03
0,82 ± 0,02
Х
сравнение пар
1–2
2–3
1–3
tэ
4,6259
7,9586
3,3427
1,7491
2,0737
2,7185
Fэ
Примечания: в таблице приведены средние значения трех определений; табличные
значения коэффициентов Стьюдента tк =2,0737 и Фишера Fк =2,8209 при Р=0,05.
Сумма иридоидов (табл.6, 7) в листьях подорожника большого составила –
0,23 - 0,40%; подорожника среднего – 0,27 - 0,53 %, подорожника ланцетного –
0,78 - 1,02 %.
Таблица 6
Метрологическая характеристика фотоколориметрического метода
количественного определения иридоидов в листьях видов подорожника
Вид
подорожника
П. большой
П .средний
П. ланцетный
n
f
x
S2
7
7
7
6
6
6
0,29
0,40
0,96
0,00025
0,00033
0,00197
S
0,01574
0,01826
0,04435
Р,%
t(P, f)
х
 ,%
95
95
95
2,47
2,47
2,47
0,015
0,017
0,041
4,29
4,25
4,27
Фактор видовой принадлежности оказывает существенное влияние на количественное содержание иридоидов в листьях видов подорожника. Наибольшее
количество иридоидов - в листьях подорожника ланцетного (табл.7).
13
Таблица 7
Содержание иридоидов в листьях видов подорожника
Содержание иридоидов в листьях видов подорожника, %
П. большой
№
П. средний
№
П. ланцетный
(1)
образца
(2)
образца
(3)
0,23 ± 0,010
8
0,37 ± 0,001
6
0,94 ± 0,013
0,24 ± 0,003
19
0,45 ± 0,001
7
0,96 ± 0,010
0,27 ± 0,010
20
0,53 ± 0,002
8
0,95 ± 0,003
0,33 ± 0,001
4
0,43 ± 0,001
9
0,87 ± 0,001
0,31 ± 0,002
13
0,44 ± 0,012
10
0,99 ± 0,011
0,34 ± 0,001
14
0,39 ± 0,001
11
0,78 ± 0,005
0,27 ± 0,011
15
0,39 ± 0,002
12
0,97 ± 0,002
0,32 ± 0,002
17
0,40 ± 0,003
13
0,98 ± 0,012
0,40 ± 0,003
18
0,32 ± 0,001
14
1,02 ± 0,003
0,36 ± 0,001
3
0,27 ± 0,010
15
0,89 ± 0,015
0,31 ± 0,002
0,40 ± 0,001
0,94 ± 0,003
сравнение пар
1–2
1–3
2–3
tэ
3,2370
22,3495
16,8620
1,7527
3,6906
3,0367
Fэ
Примечание: в таблице приведены средние значения трех определений, табличное
значение коэффициента Стьюдента tэкс 2,1007, и Фишера Fэкс 3,1827 при Р=0,05.
№
образца
5
7
10
12
16
28
29
34
35
36
Х
Таблица 8
Содержание окисляемых веществ в листьях видов подорожников
Содержание окисляемых веществ в листьях видов подорожника, %
№
П. большой
№
П. средний
№
П. ланцетный
образца
(1)
образца
(2)
образца
(3)
26
4,89±0,06
11
8,26±0,07
6
9,03±0,04
27
4,75±0,03
12
7,11±0,05
7
8,19±0,05
28
3,06±0,01
13
6,36±0,05
8
8,36±0,02
29
5,56±0,08
14
6,52±0,03
9
10,18±0,02
30
4,23±0,05
15
9,56±0,08
10
9,44±0,01
31
5,27±0,05
16
8,60±0,02
11
10,30±0,05
32
4,90±0,04
17
6,15±0,04
12
9,18±0,05
33
5,24±0,06
18
7,36±0,02
13
7,25±0,03
34
4,15±0,01
19
9,52±0,06
14
8,57±0,02
35
4,42±0,02
20
6,90±0,04
15
9,67±0,03
4,65±0,03
7,63±0,03
9,02±0,02
Х
сравнение пар
1–2
2–3
1–3
tэ
6,4596
2,7590
11,6029
3,0963
11,8029
1,7174
Fэ
Примечания: в таблице приведены средние значения трех определений; табличные
значения коэффициентов Стьюдента tк =2,1007 и Фишера Fк =3,1827 при Р=0,05.
Содержание суммы окисляемых веществ в образцах исследуемых видов подорожников достоверно отличалось и составило в листьях подорожника боль-
14
шого – 3,06 - 5,56 %, подорожника среднего – 6,36 - 9,52 %; подорожника ланцетного – 8,19 - 10,30% (табл. 8), но фактор видовой принадлежности не имел
существенного влияния.
Элементный состав листьев исследуемых видов по качественным характеристикам существенно не различается и представлен 19 микроэлементами, в
том числе эссенциальными – Mn, Cu, Zn, V, Cr, Ni, Co, Mo (рис. 3 А, Б, В). Серебро накапливают только листья подорожника большого. Во всех видах подорожника наибольшими концентрациями отличались элементы Ti, Ba, Sr, Mn, Zr
и Cu (рис. 3 А), наименьшими - Co, Sc, Ga, Mo, Yb, Ag (рис. 3 В), что объясняется физиологической особенностью растений рода Plantago L. к их накоплению.
На диапазон концентраций микроэлементов в листьях подорожников оказывают влияние геохимические особенности мест произрастания.
Экологическую безопасность образцов сырья подорожников подтверждает
содержание свинца в концентрациях, не превышающих ПДК, и отсутствие таких элементов, как ртуть, мышьяк и кадмий.
Разработка Фармакопейной статьи «Подорожника большого листья»
При составлении ФС для ГФ ХII издания на листья подорожника большого
учитывали современные требования к стандартизации лекарственного растительного сырья.
Сроки сбора сырья подтверждены нами результатами исследования морфометрических показателей и динамики накопления доминирующих групп БАВ полисахаридов и флавоноидов.
Изучена динамика накопления БАВ на образцах сырья, заготовленного согласно «Инструкции по заготовке листьев подорожника большого», в течение
всего периода вегетации растения с июня по август 2006 года с интервалом между датами сбора 10 дней.
15
мг/ кг
400
350
300
3
250
200
150
2
1
100
50
0
Ti
Ba
1-п. большой
А
Sr
Mn
Zr
2-п.средний
Cu
3-п.ланцетный
мг/ кг
14
12
1
10
2
8
6
3
4
2
0
Zn
V
Pb
1-п. большой
Б
Cr
Y
2-п.средний
Ni
Nb
Co
3-п.ланцетный
мг/ кг
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
2
3
Co
В
Sc
1-п. большой
1
Ga
Mo
2-п.средний
Yb
Ag
3-п.ланцетный
Рис 3. А, Б, В. – Содержание микроэлементов в видах подорожника.
16
Содержание полисахаридов колебалось от 14,48 до 20,24% (рис. 4), все об-
Содержание полисахаридов, %
разцы соответствовали требованиям ст. 20 ГФ ХI изд., вып. 1 (не менее 12%).
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
01.06.
10.06.
20.06.
01.07.
10.07.
20.07.
01.08.
10.08. 20.08. 30.08.
Даты заготов ки, 2006 г.
Рис. 4. Динамика накопления полисахаридов в листьях подорожника большого.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид было в пределах
Содердание флавоноидов, %
от 0,68 до 1,22% (рис. 5).
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
01.06.
10.06.
20.06.
01.07.
10.07.
20.07.
01.08.
10.08.
20.08.
30.08.
Даты заготов ки, 2006 г.
Рис. 5. Динамика накопления флавоноидов в листьях подорожника большого.
Статистический анализ не выявил достоверных различий в содержании БАВ
в листьях подорожника большого образцов разных периодов заготовки. Это говорит о том, что фазы развития растения в течение вегетационного периода не
оказывают существенного влияния на накопление флавоноидов и полисахаридов, что благоприятно для заготовки сырья в любую декаду.
17
В статью «Подорожника большого листья» для ГФ ХII издания, по сравнению со ст.20 ГФ ХI внесены следующие изменения и дополнения.
Раздел «Внешние признаки» дополнен описанием отличительных морфологических признаков примесей - листьев подорожника среднего и п. ланцетного.
В раздел «Микроскопия» внесены размеры основных элементов и микрофотографии с главными отличительными признаками – строением трихом
(рис. 6, 7).
А
Б
В
Рис. 6. Простые волоски: А- подорожника большого, Б- п. среднего, В- п.ланцетного
А
Б
В
А
Рис. 7. Головчатые волоски: А- подорожника большого, Б- п. среднего, В- п.ланцетного
В раздел «Качественные реакции» включен спектр поглощения спиртового
извлечения из листьев подорожника большого, имеющий характерные для данного вида сырья экстремумы: максимумы при длинах волн 288 ± 3 нм и 333 ± 2
нм; минимум при длине волны 303 ± 2 нм (рис. 8).
18
Оптическая плотность
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
Длина волны, нм
Рис. 8. Спектр поглощения извлечения из листьев подорожника большого
В раздел «Числовые показатели» для оценки качества листьев подорожника
большого, используемого как лекарственное средство и для получения препарата «Плантаглюцид», к показателю содержания полисахаридов (не менее
12%), дополнительно включен показатель «Содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой, не менее 35%»; для сырья, предназначенного для
получения настойки - «Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид не менее 0,6%» и «Экстрактивных веществ, извлекаемых 70% этиловым
спиртом, не менее 20%».
В раздел «Количественное определение» включена модифицированная нами
методика количественного определения полисахаридов, в которой исключены
стадии центрифугирования и вакуум-фильтрации. Методика обладает большей
точностью (относительная ошибка методики – 3,12% при Р = 0,05) и воспроизводимостью (Fэксп.=11,12 > Fкрит.=6,39) по сравнению с методикой ст. 20 ГФ ХI
изд. (табл. 9). Сохраняя основную концепцию гравиметрического определения,
модифицированная методика позволяет значительно сократить время определения и потери при определении содержания полисахаридов.
При разработке методики спектрофотометрического определения флавоноидов определены оптимальные условия экстракции флавоноидов (экстрагент,
измельченность сырья, время экстракции), условия проведения реакции комплексообразования с алюминия хлоридом и её стабильность, аналитическая
19
длина волны на дифференциальной кривой светопоглощения извлечения из листьев подорожника большого (рис. 9).
Таблица 9
Содержание полисахаридов в листьях подорожника большого,
метрологические характеристики методик
1
2
3
4
5
Х
S2
S
Sx
P,%
t(Р,f)
∆x
ε,%
tэксп.
Fэксп.
Fкрит.
Содержание полисахаридов, %
Исключены стадии:
ГФ XI,
центрифугировакуум–
центрифугировып.2, ст.20
вание после
фильтрация
вание перед
настаивания
вакуум–
фильтрацией
9,75
11,48
12,13
12,04
12,05
12,61
13,58
11,49
11,84
13,02
12,47
11,86
12,58
12,05
12,37
12,36
12,27
11,97
12,45
13,18
Метрологическая характеристика
11,70
12,22
12,60
12,18
1,27
0,37
0,32
0,41
1,13
0,61
0,56
0,64
0,5
0,27
0,25
0,29
95
2,31
1,40
11,98
Оптическая плотность
№ определения
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1280
-0,2
-0,3
-0,4
1-п.большой
95
2,31
0,76
6,22
0,92
3,52
6,39
95
2,31
0,70
5,55
1,60
3,96
6,39
центрифугирование и
вакуум–
фильтрация
12,16
12,83
12,02
12,36
12,02
95
2,31
0,80
6,56
0,84
3,09
6,39
12,27
0,10
0,31
0,14
95
2,31
0,38
3,12
1,11
11,12
6,39
4
2
3
310
340
370
430
Длина в олны, нм
1
2-п.средний
400
3-п.ланцетный
4-ГСО цинарозида
Рис. 9. Дифференциальные спектры комплексов флавоноидов
видов подорожника с алюминия хлоридом.
20
Валидация методики проведена по характеристикам: специфичность, линейность, правильность, прецизионность, воспроизводимость.
Линейность методики. Коэффициент корреляции линейного графика
(7 уровней концентрации) составил r = 0,99. Соблюдается линейная зависимость между величинами оптической плотности и содержанием флавоноидов в
извлечениях из листьев подорожника большого в интервале от 25 до 175% от
номинального значения определяемой величины.
Правильность методики. Отсутствие систематической ошибки подтверждено методом добавок различных концентраций раствора ГСО цинарозида непосредственно в извлечение из листьев подорожника большого. Ошибка анализа
находится в пределах ошибки единичного определения (2,91%), что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики.
Прецизионность. Проверка повторяемости (сходимости) результатов показала, что степень согласованности результатов измерений не превышает допустимые пределы. Относительная ошибка определения составила 2,91% (табл.4).
Внутрилабораторную прецизионность методики определяли на 3 образцах
сырья в 3х кратной повторности на спектрофотометрах СФ–2000 и СФ–46. Рассчитанная величина относительного стандартного отклонения исследованных
образцов ниже 10%, что говорит о незначительной изменчивости показателей.
Результаты определения подтверждают прецизионность методики в условиях
внутрилабораторной воспроизводимости.
Межлабораторную воспроизводимость методики оценивали по результатам
испытаний, проведённых в лабораториях кафедры фармакогнозии и РИЦ
«Фарматест». Величина относительного стандартного отклонения не превышает допустимые пределы и указывает на прецизионность разработанной методики в условиях межлабораторной воспроизводимости результатов.
Методика обладает точностью и прецизионностью, позволяет объективно
оценивать качество листьев подорожника большого. При апробации методики
сумма флавоноидов в исследованных образцах листьев подорожника большого
21
находилась в пределах от 0,63 до 1,3%, это позволило нормировать содержание
данной группы веществ - не менее 0,6%.
Определение срока годности листьев подорожника проводили по всем показателям качества в течение срока хранения. Образцы листьев подорожника по
показателям подлинности и доброкачественности соответствовали требованиям
проекта фармакопейной статьи «Подорожника большого листья», что даёт основание рекомендовать оставить без изменения срок годности сырья подорожника большого – 3 года.
Фитохимический анализ экстракционных лекарственных форм
из листьев подорожника большого, п. среднего, п. ланцетного
Качественные характеристики настоек из листьев подорожника среднего и
подорожника ланцетного, полученных в лабораторных условиях, соответствовали требованиям нормативных документов для настойки подорожника большого. Концентрация этилового спирта, содержание сухого остатка и суммы
окисляемых веществ в настойках подорожника среднего и п. ланцетного сопоставимо с аналогичными показателями настойки подорожника большого, полученной в лабораторных условиях и настоек промышленных серий.
Для проведения количественного анализа нами разработана методика оценки качества настойки подорожника большого по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид. Методика хорошо воспроизводима, применима и
для анализа настойки подорожника среднего и п. ланцетного (табл. 10).
Содержание суммы флавоноидов в настойках, полученных из листьев подорожника большого в лабораторных условиях (0,050 - 0,062%), сопоставимо с
промышленными образцами (0,043 - 0,065%).
Таблица 10
Метрологическая характеристика методики количественного
определения суммы флавоноидов в настойках видов подорожника
Настойка
подорожника
П. большого
П. среднего
П.ланцетного
n
f
x
S2
10
10
10
9
9
9
0,053
0,057
0,054
0,00001
0,00001
0,00001
S
0,00201
0,00222
0,00246
Р,%
t(P, f)
х
 ,%
95
95
95
2,26
2,26
2,26
0,00155
0,00159
0,00176
2,94
2,78
3,26
22
В настойках из листьев подорожника среднего, в сравнении с настойками из
листьев подорожника большого, содержание флавоноидов более высокое (0,06 0,084%), а в настойках из листьев подорожника ланцетного – несколько меньше
(0,040 - 0,053%).
Из сырья каждого вида подорожника в одинаковых условиях получили по
пять серий субстанции для препарата «Плантаглюцид».
Качественный анализ сахаров в полисахаридном комплексе полученной
субстанции и препарате промышленного производства проводили после кислотного гидролиза методом ТСХ.
В гидролизатах субстанций на хроматограмме видны полосы от розоватобурого до коричневого цвета, что соответствует окраске моносахаров - «свидетелей». В составе полисахаридного комплекса субстанции «Плантаглюцид»,
полученной в лабораторных условиях и промышленных образцов гранул, присутствуют галактуроновая кислота, глюкоза, арабиноза, рамноза. Наличие вышеперечисленных сахаров характерно и для субстанций из подорожника среднего и п. ланцетного.
Полученные нами результаты свидетельствуют об идентичности полисахаридного состава промышленного образца и полученных субстанций для производства препарата «Плантаглюцид» из листьев подорожника большого, п.
среднего, п. ланцетного.
Количественный анализ полисахаридного комплекса субстанции «Плантаглюцида» проводили спектрофотометрическим методом, по содержанию восстанавливающих сахаров в пересчете на глюкозу согласно ФСП 42-8128-97.
Все образцы субстанций для получения препарата «Плантаглюцид» соответствовали требованиям нормативной документации. Содержание сахаров в субстанции для препарата «Плантаглюцид» из листьев подорожника большого несколько выше (6 - 11%), чем в субстанциях из листьев подорожника среднего
(6 - 10%) и п. ланцетного (6 - 7%).
Полученная в лабораторных условиях субстанция препарата «Плантаглюцид» из листьев подорожника среднего и п. ланцетного по качественному со-
23
ставу и количественному содержанию полисахаридов сопоставима с препаратом «Плантаглюцид» промышленного производства.
Субстанция препарата «Плантаглюцид» из листьев подорожника среднего и
п. ланцетного относится к практически нетоксичным лекарственным средствам.
Сырье и экстракционные препараты из листьев подорожника среднего и
ланцетного представляют интерес для дальнейшего фармакогностического и
фармакологического исследования.
ВЫВОДЫ
1. Листья подорожника большого, п. среднего и п. ланцетного имеют близкий
химический состав и содержат полисахариды, флавоноиды, фенолкарбоновые
кислоты, иридоиды, дубильные вещества, микроэлементы.
2. Фракционный состав полисахаридов листьев подорожника большого представлен водорастворимым полисахаридным комплексом (до 25,74%), протопектинами (до 33,10%), гемицеллюлозой А (до 14,76%) и гемицеллюлозой Б (до
7,81%); подорожника среднего - 26,82; 30,37; 11,28; и 6,14% и подорожника
ланцетного - 26,26; 29,17; 11,80 и 9,51% соответственно.
3. Модифицирована методика гравиметрического определения полисахаридов
для листьев подорожника большого. Содержание полисахаридов в листьях подорожника большого - от 14 до 21%, п. среднего- от 13 до 20%, ланцетного – от
11 до 18%. Статистическая обработка полученных результатов не выявила видовых различий.
4. Разработана методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в листьях подорожника большого и проведена
ее валидация. Содержание флавоноидов в пересчете на цинарозид в листьях
подорожника большого – от 0,82 до 1,28%, п. среднего – от 0,92 до 1,67%,
п. ланцетного – от 0,63 до 0,96%.
5. Во всех исследуемых видах присутствуют иридоидные гликозиды –каталпол,
аукубин и каталпозид. Содержание иридоидов в пересчете на аукубин в листьях
подорожника большого - от 0,23 до 0,40%, п. среднего - от 0,27 до 0,53%, п.
ланцетного - от 0,78 до 1,02%.
24
6. Разработан проект ФС для ГФ ХII издания «Plantaginis majoris folia - Подорожника большого листья». Определены товароведческие показатели, на основании исследований по динамике накопления БАВ подтверждены сроки сбора
листьев подорожника большого, выполнены микрофотографии анатомических
признаков листьев подорожников.
В раздел «Качественные реакции» включен УФ-спектр, характеризующий
наличие фенольных соединений (флавонов и фенолкарбоновых кислот).
В раздел «Числовые показатели» для оценки качества листьев подорожника
большого, используемого как лекарственное средство и для получения препарата «Плантаглюцид» к показателю «Содержание полисахаридов не менее
12%», дополнительно введен показатель «Содержание экстрактивных веществ,
извлекаемых водой, не менее 35%». Для сырья, предназначенного для получения настойки, - «Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид не
менее 0,6%» и «Экстрактивных веществ, извлекаемых 70% этиловым спиртом,
не менее 20%».
Изучена стабильность содержания полисахаридов и флавоноидов при хранении сырья. Подтвержден срок годности – три года.
7. Разработана методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в настойке подорожника большого, установлен показатель оценки качества – «Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид не менее
0,04%».
8. Полученные в лабораторных условиях субстанции препарата «Плантаглюцид» из листьев подорожника среднего и п. ланцетного по качественному составу и количественному содержанию полисахаридов сопоставимы с препаратом «Плантаглюцид» промышленного производства из листьев подорожника
большого и относятся к практически нетоксичным лекарственным средствам.
9. Листья подорожника среднего и п. ланцетного являются потенциальными
сырьевыми источниками для получения препарата «Плантаглюцид» и настойки, представляют интерес для дальнейшего фармакогностического и фармакологического исследования.
25
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Печерская, Л.Г. Разработка методики количественного определения суммы
флавоноидов в листьях подорожника большого / Л.Г. Печерская, С.А. Соснина, А.И. Возжаева // Фармация и здоровье : материалы межвуз. науч.практ. конф. (9 - 12 ноября 2005 г.) / под ред. В.В.Юшкова, Г.И. Олешко,
М.Д. Решетниковой – Пермь, -2005. – С.144 - 145.
2. Количественное определение полисахаридов в листьях подорожника большого, подорожника среднего и подорожника ланцетного / С.А Соснина [и
др.] // Вест. Перм. гос. фармац. акад. – Пермь. 2007. – № 2. – С. 285 – 288.
3. Полисахариды листьев подорожника большого, подорожника среднего и подорожника ланцетного / С.А. Соснина [и др.] // Достижения и перспективы в
области создания новых лекарственных средств : материалы Рос. науч.практ. конф., посвящ. 70-летию ПГФА (27 – 28 нояб. 2007 г.). – Пермь, 2007.
– № 2 – С.460 – 465.
4. Виды подорожника: содержание действующих веществ / С.А. Соснина [и
др.] – Фармация. – 2008. – № 8. – С. 21 – 24.
5. Обнаружение примесей в лекарственном растительном сырье / Л.Г. Печерская [и др.] // Человек и лекарство : тез. докл. XV Рос. нац. Конгресс – М.,
2008 – С. 145.
6. Sosnina, S.A. Perspectives of usage of views of a kind Plantago L. in medical
practice / S.A. Sosnina, G.I. Oleshko, L.G. Pecherskay //. Fundamental pharmacology and pharmacy – clinical practice : materials of the 2-nd Russian-Chinese
international scientific conferences on pharmacology. – Perm, 2006. – Р. 150.