На правах рукописи Дугарова Ирина Далаевна ДИАГНОСТ

На правах рукописи
Дугарова Ирина Далаевна
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ КОНДЕНСАТА ВЫДЫХАЕМОГО
ВОЗДУХА У ПАЦИЕНТОВ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ
14.01.25 – пульмонология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2010
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научноисследовательский институт пульмонологии» Федерального медикобиологического агентства России
Научный руководитель:
доктор медицинских наук Анаев Эльдар Хусеевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Осипова Галина Леонидовна
ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России
доктор медицинских наук, профессор Ненашева Наталия Михайловна
Российская медицинская академия последипломного образования
Ведущая организация:
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России
Защита состоится «……..» ……………………… 2010 г. в .……. часов
на заседании диссертационного совета Д 208.053.01 при ФГУ «НИИ
пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ
пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32)
Автореферат разослан «……..» ……………………… 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук
Анаев Э.Х.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Бронхиальная астма (БА) является глобальной проблемой мирового
здравоохранения. Люди всех возрастов во всем мире страдают этим
хроническим заболеванием, и в случае тяжелого неконтролируемого течения
эта болезнь ограничивает и значительно ухудшает качество жизни человека и
подчас заканчивается летальным исходом. Эта болезнь приводит к потере
трудоспособности и снижает участие пациента в жизни семьи [GINA, 2006].
Несмотря
на
большое
число
исследований,
начиная
от
эпидемиологических и заканчивая изучением тонких механизмов реализации
болезни на молекулярном уровне, в понимании БА, её течении, механизмах
развития и подходах к лечению, существует много неясностей и
противоречий, что заставляет продолжать исследования в данной области
[Чучалин А.Г., 2007].
В настоящее время наибольшее значение для диагностики БА имеют
клинические и функциональные тесты. Однако симптомы болезни не всегда
отражают
природу
свидетельствуют
и
степень
выраженности
слабовыраженные
взаимосвязи
воспаления,
между
о
чем
значениями
функциональных тестов и маркеров воспаления [Robroeks C.M. et al., 2007].
БА является комплексным хроническим воспалительным заболеванием
с вовлечением многих структурных клеток и клеток воспаления, с
высвобождением
медиаторов
воспаления,
которые
приводят
к
формированию основных патофизиологических механизмов заболевания
[Barnes P.J., 1996]. На данный момент известно около 50 цитокинов и
хемокинов, играющих важную роль в патогенезе БА [Barnes P.J., 2007],
однако их роль в управлении патофизиологическими процессами до конца не
изучена.
Исследование маркеров воспаления в легких обычно осуществляется
при использовании метода индуцированной мокроты [Berlyne G.S. et al.,
2000;
Hargreave
F.E.,
2007],
бронхоальвеолярного
3
лаважа
(БАЛ),
бронхобиопсий [Adelroth E., 1998], а также сыворотки крови и мочи для
оценки системных эффектов. Однако получение БАЛ и бронхобиоптатов
являются
инвазивными,
травматичными
методами,
вызывающими
множественные побочные эффекты, вследствие чего не могут проводиться
через короткий промежуток времени, а также у тяжелых больных, детей и в
амбулаторной практике [Анаев Э.Х., Чучалин А.Г., 2002].
В последние годы в клиническую практику широко внедряются
неинвазивные методы диагностики и контроля лечения БА, в частности
исследование биомаркеров в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ)
[Horvath I. et al., 2005]. Анализ КВВ позволяет оценить активность
воспаления в легких и уточнить состояние местного воспаления в
дыхательных путях, а также оценить роль цитокинов в нем. Однако работы,
посвященные изучению концентраций цитокинов, как ключевого звена
воспаления
при
БА,
носят
единичный,
разрозненный,
не
систематизированный и дискуссионный характер.
Цель исследования:
Изучить
значение
цитокинов
атопии
(ИЛ-4,
ИЛ-13),
провоспалительных (ИЛ-6, ФНО-α), противовоспалительного (интерферон-)
и хемокина (ИЛ-8) в КВВ и сыворотке крови, установить взаимосвязь между
концентрацией цитокинов и клинико-функциональными показателями у
больных БА среднетяжелого течения в разные фазы течения заболевания.
Задачи исследования:
1. Определить содержание различных цитокинов в КВВ и сыворотке
крови у здоровых субъектов и больных БА в период обострения и
ремиссии.
2. Установить диагностическую значимость концентрации цитокинов в
КВВ для оценки активности воспалительного процесса в дыхательных
путях при БА.
4
3. Провести сравнительную оценку концентраций цитокинов в КВВ и
сыворотке крови у больных БА в разные периоды заболевания.
4. Изучить взаимосвязь уровня цитокинов с клинико-функциональными
показателями БА в разные периоды течения заболевания.
Научная новизна
В представленной работе впервые:
 проведено определение цитокинового профиля КВВ у пациентов со
среднетяжелым течением БА в разные фазы течения заболевания;
 показано, что частота определения различных интерлейкинов, ИФН-γ и
ФНО-α в КВВ выше, чем в сыворотке крови;
 полученные значения неинвазивных маркеров определяют степень
активности местного воспаления в дыхательных путях при БА;
 показано, что высокая концентрация
ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ
свидетельствует о степени тяжести обострения заболевания;
 установлено, что обострение при БА проявляется воспалительным
отеком в слизистой оболочке стенки бронхов и гиперсекрецией слизи,
о чем свидетельствует достоверное увеличение объема КВВ и
снижение его рН;
 выявленная высокая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ у пациентов с
атопической БА указывает на наличие фенотипа заболевания с
преобладанием Th2-типа иммунного ответа;
 обнаружена обратная корреляционная взаимосвязь между уровнем ИЛ4 в КВВ со степенью бронхиальной обструкции в фазе обострения БА;
 выявлена прямая взаимосвязь между содержанием ИЛ-13 в КВВ с
показателями функции внешнего дыхания (ФВД) у пациентов с БА в
период ремиссии, что свидетельствует о персистирующем характере
воспаления в дыхательных путях;
 обнаружена прямая корреляционная зависимость между эозинофилией
крови и коэффициентом соотношения ИЛ-4/ИФН-γ в КВВ, что
5
отражает взаимосвязь системной реакции организма с активностью
местного воспаления.
Практическая значимость
1. Анализ
цитокинов
в
КВВ
следует
использовать
в
качестве
неинвазивного метода оценки активности воспалительного процесса в
дыхательных путях при БА.
2. Определение концентрации различных интерлейкинов, ИФН-γ и ФНОα в КВВ позволяет оценить эффективность проводимого лечения.
3. Исследование цитокинов в КВВ, отражающих природу и особенности
местного воспаления, позволяет корректировать дальнейшую тактику
ведения пациентов с БА.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Анализ цитокинового профиля (различных интерлейкинов, ИФН-γ и
ФНО-α)
КВВ
воспалительного
более
четко
ответа
в
отражает
дыхательных
активность
путях
при
местного
БА,
чем
исследование сыворотки крови.
2. Высокая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-13 в КВВ у пациентов с
обострением БА, а также их взаимосвязь с легочной функцией
указывает
на
преобладание
Th2-типа
иммунного
ответа
и
персистирующий воспалительный процесс в дыхательных путях при
ремиссии заболевания.
3. Выявленная прямая зависимость между эозинофилией крови и
коэффициентом соотношения ИЛ-4/ИФН-γ в КВВ указывает на
взаимосвязь системной реакции организма с местным воспалением.
Внедрение в практику здравоохранения
Исследование цитокинов в КВВ внедрено в качестве дополнительного
метода диагностики у больных БА в аллергологическом отделении ГКБ №57
6
г.Москвы. Материалы исследования включены в лекционный курс на
кафедре пульмонологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
- 17-м, 19-м Национальных конгрессах по болезням органов дыхания
(Казань, 2007; Москва, 2009);
- Научной сессии НИИ пульмонологии Росздрава (Рязань, 2007);
- 3-ей международной научной конференции (Улан-Удэ, 2008);
- Ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества
(Берлин, 2008);
-
Ежегодном
конгрессе
Германского
общества
пульмонологов
(Маннхайм, 2009);
- Совместном заседании Ученого совета ФГУ «НИИ пульмонологии»
ФМБА России и кафедры госпитальной терапии педиатрического факультета
ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (Москва, 23.06.2010.).
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2
статьи в журнале, входящем в перечень ведущих рецензируемых научных
журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста.
Состоит из введения, глав обзор литературы, материалы и методы
исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение,
выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Иллюстрирована
15 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель включает 21
отечественных и 143 зарубежных источников. Диссертация изложена на
русском языке.
7
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Общее
количество
пациентов,
участвовавших
в
исследовании,
составило 28 больных БА и 14 здоровых добровольцев.
Критерии включения:
Обязательными
клиническими
и
функциональными
критериями
для
включения в исследование были: больные обоего пола в возрасте от 18 до 60
лет; пациенты с подтвержденным диагнозом БА среднетяжелого течения [в
соответствии с критериями GINA, 2006]; наличие атопии в анамнезе,
подтвержденной кожными пробами (prick-test) и повышением уровня общего
иммуноглобулина Е (IgЕ) сыворотки крови; длительность заболевания более
2-х лет; базисная терапия ингаляционными глюкокортикоидами (ГК) в дозе
≤1000
мкг
(в
пересчете
на
беклометазон);
обратимая
обструкция
дыхательных путей (КБДОФВ112% от должного и 200 мл); наличие
подписанного информированного согласия на участие в исследовании.
Критерии исключения:
наличие ХОБЛ, туберкулеза и других заболеваний легких, в т.ч. пневмония в
течение последних 6 месяцев; тяжелые сопутствующие заболевания
сердечно-сосудистой системы, органов пищеварения, мочеполовой и
нервной системы; прием системных ГК; курение (ИКЧ  10 пачка/лет);
злоупотребление алкоголем и наркотиками в анамнезе; хронические
инфекционные заболевания верхних дыхательных путей (гаймориты и
другие); беременность и кормление грудью.
В исследование было включено 28 больных БА средней степени
тяжести заболевания (диагноз подтвержден данными анамнеза, клинической
картиной, рентгенологическими, функциональными методами диагностики),
из них 14 пациентов в стадии обострения средней тяжести и 14 - в стадии
стабильного течения заболевания. Контрольную группу составили 14 человек
–
здоровые
добровольцы

(ИКЧ
5
пачка/лет),
не
страдающие
аллергическими и хроническими, в т.ч. бронхолегочными заболеваниями.
8
Пациенты в стадии обострения находились на стационарном лечении в
аллергологическом отделении ГКБ №57 с 2006 по 2009 год, остальные
пациенты наблюдались амбулаторно в ФГУ НИИ пульмонологии.
Характеристика больных БА и здоровых добровольцев, включенных в
исследование, представлена в табл. 1.
Таблица 1.
Характеристика больных БА, включенных в исследование.
Признаки
Mean±SD
БА, стадия
БА, стадия
Здоровые
обострения
ремиссии
добровольцы
(n=14)
(n=14)
(n=14)
2/12
4/10
2/12
47,412,7
36,913,7
25,95,3
2
2
2
Длительность заболевания, лет
6,42,5
6,83,1
-
Кашель, баллы
3,50,7
0,90,5
-
Приступы удушья,
5,41,0
0,90,4
-
6,81,5
1,40,6
-
Лейкоциты крови, 109/л
10,32,63*
8,862,30
6,180,91
Эозинофилы крови, %
3,571,83*
2,640,93
2,241,29
287118
16659
11265
ОФВ1, %должн.
66,721,3*
78,114,7*
102,79,8
ФЖЕЛ, %должн.
85,633,1*
93,314,7
114,19,4
ОФВ1/ФЖЕЛ, %должн.
71,519,6
78,47,7
84,52,1
КБДОФВ1, %
29,510,1*
14,74,2*
3,82,0
Пол, муж/жен (n)
Возраст, лет
Курящие, n
в сутки
Потребность в 2-агонистах,
в сутки
Эозинофилы крови, клеток/мкл
Примечание: * - р<0,05 по сравнению со здоровыми добровольцами.
9
Методы исследования.
Во всех группах проводилась оценка клинико-функциональных
показателей,
маркеров
системного
воспаления,
оценка
взаимосвязи
иммунологических маркеров воспаления с клинико-функциональными
показателями.
У всех больных оценивались приведенные ниже клинические и
функциональные показатели:
Клинико-физикальное обследование включало сбор анамнеза и жалоб
пациента, оценку объективных данных. Клиническая оценка симптомов БА
(кашель, мокрота, одышка) проводилась однократно по 4-х балльной шкале
(0 – отсутствие симптома, 3 – максимальное проявление симптома). Также
оценивали число приступов удушья и потребность в симпатомиметиках
короткого действия.
Лабораторно-инструментальные исследования включали: общий и
биохимический анализ крови, анализ мокроты, ЭКГ, рентгенографию
органов грудной клетки.
Аллергологическое обследование включало: сбор аллергологического
анамнеза, методы, подтверждающие наличие атопии у пациентов (уровень
общего IgE, кожные аллергопробы – Prick-test с бытовыми, эпидермальными,
пыльцевыми аллергенами) вне обострения БА.
Уровень общего IgE измеряли с использованием реагентов для
количественного иммуноферментного анализа определения общего IgE в
сыворотке крови в соответствии с инструкцией по применению. За
нормальный уровень общего IgЕ принимали значения ниже 130 МЕ/мл.
Исследование ФВД проводили с помощью прибора MasterScreen Spiro
фирмы "Erich JAEGER" (Германия) в соответствии с рекомендациями ERS
(Европейского респираторного общества). Оценивали объем форсированного
выдоха за первую секунду (ОФВ1), форсированную жизненную емкость
легких (ФЖЕЛ), ОФВ1/ФЖЕЛ. Оценку полученных результатов проводили
при сопоставлении данных с должными величинами, вычисленными по
10
формулам, предложенным консенсусом ERS и ATS (Американского
торакального общества) [Miller M.R. et al., 2005], а их интерпретацию
осуществляли с использованием методических рекомендаций [Чучалин А.Г.,
2009].
Сбор КВВ.
Сбор
КВВ
проводили
в
утренние
часы,
после
двукратного
ополаскивания ротовой полости водой. Для сбора КВВ использовался
аппарат ECoScreen (Erich JAEGER GmbH, Германия), снабженный клапанной
системой, которая позволяет осуществлять вдох из окружающей среды, а
выдох – в устройство с конденсацией паров, то есть клапан не позволяет
смешиваться вдыхаемому и выдыхаемому воздуху. Двухсторонний клапан
используется также как уловитель слюны. Метод основывается на так
называемом принципе противотока. Вещества охлаждаются приблизительно
до -10 С.
Сбор проводили в течение 10 мин в сидячем положении и спокойном
дыхании обследуемого со средней частотой 15 в мин. Для исключения
носового дыхания использовали специальные зажимы для носа. Измеряли
объем собранного КВВ и немедленно помещали его в герметичные сухие
термоустойчивые ДНК- и РНК- очищенные стерильные полипропиленовые
пробирки типа Эппендорф (компания GREINER BIO-ONE, Австрия)
объемом 1,5 мл. Пробирки с материалом немедленно замораживались в
морозильнике при температуре -70 C. Собранные образцы хранились при
данной температуре до проведения анализов сроком не более 1 месяца. Сбор
КВВ и сыворотки крови здоровым добровольцам и больным с ремиссией БА
проводили однократно. Пациентам с обострением заболевания сбор КВВ и
сыворотки проводился однократно в первый-второй день поступления в
стационар. Сразу после сбора проводилось измерение объема и уровня рН
полученного КВВ.
Измерение pH КВВ проводили немедленно после получения образца с
помощью ф32 рН-метра (Beckman, США) со стеклянным микроэлектродом.
11
Калибровку рН-метра проводили стандартными растворами с рН 4,00; 7,00 и
10,00. Измерения рН в образцах КВВ проводили четырехкратно, и
полученные значения обрабатывали статистически для получения средней
величины. Для анализа требовалось 0,3 мл КВВ.
Определение цитокинов в КВВ.
Количественные уровни цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-13, ФНО-,
ИФН-) в КВВ и параллельно в сыворотке крови определяли методом ИФА с
помощью
тест-систем
«BioSource»
(Бельгия)
согласно
приложенным
инструкциям на базе лаборатории индукторов интерферона ГУ НИИ
эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН. Работа
выполнена совместно с к.м.н. Оспельниковой Т.П.
Данный тест основан на методе твердофазного иммуноферментного
анализа (ELISA). Микропланшет покрывается моноклональными антителами
к исследуемому цитокину (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13). В
ходе реакции в лунки планшеты добавляются стандарты, контроли и
исследуемые образцы.
Во время первой инкубации антиген цитокина (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8,
ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13) связывается с иммобилизованными в лунках
антителами одним сайтом связывания. После промывки добавляются вторые
биотилированные моноклональные антитела против антигена (ФНО-, ИЛ-6,
ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13). Во время второй инкубации эти антитела
связываются с иммобилизованным антигеном (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-,
ИЛ-4, ИЛ-13), захваченным во время первой инкубации. После удаления
избытка вторых антител добавляется стрептавидин-пероксидаза, которая
связывается с биотилированными антителами с формированием сэндвичкомплекса из 4-х реагентов. После третьей инкубации и промывки удаляется
несвязавшийся фермент, после чего добавляется субстратный раствор,
который взаимодействует с ферментом с образованием цветного комплекса.
Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации
12
цитокина (ФНО-, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-, ИЛ-4, ИЛ-13), присутствующего в
образце.
Оптическая
плотность
содержимого
ячеек
определялась
с
использованием автоматического фотометра для микропланшетов при длине
волны 450 нм. Концентрация цитокинов определялась по калибровочной
кривой
«оптическая
плотность/концентрация»,
используя
данные
по
проводилась
с
концентрациям стандартов.
Статистическая
обработка
результатов
использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 for Windows.
Все численные данные представлены как meanSD. Достоверность различий
одноименных показателей внутри одной группы определяли при помощи
парного t-критерия. Различия считались статистически достоверными при
p<0,05. Для выявления зависимости между показателями использовали
линейный регрессионный анализ и метод Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Уровень рН и объем КВВ.
Объем собранных образцов КВВ в группах с обострением и ремиссией
БА, и в группе здорового контроля достоверно не различался (1,64±0,51
мл/10 мин; 1,48±0,22 мл/10 мин и 1,61±0,25 мл/10 мин, соответственно;
р>0,05).
Уровень рН КВВ у больных с обострением и ремиссией БА был
достоверно ниже, чем у здоровых добровольцев (6,12±0,47 и 6,41±0,49
напротив 6,99±0,36; p<0,05) (Рис. 1). В группе с обострением БА средние
значения рН были достоверно ниже по сравнению с группой ремиссии, что
указывает на высокую степень активности воспалительного процесса в
дыхательных путях при БА и разнородность исследуемых групп.
Концентрация цитокинов в КВВ и сыворотке крови.
Все цитокины, за исключением ИЛ-8, удалось обнаружить во всех
образцах КВВ у здоровых добровольцев, тогда как в сыворотке крови
удалось определить их содержание менее чем в половине образцов (рис. 2).
13
*- p<0,05 по сравнению со здоровыми людьми;
**- p<0,05 по сравнению с обострением БА.
7,5
7
*,**
6,5
*
6
5,5
5
Здоровые
БА,обостр.
БА,ремис.
Рис. 1. Уровень рН КВВ у здоровых людей и больных БА.
%
100
80 %
60
сыворотка
КВВ
40
20
0
ИЛ-4
ИЛ-6
ИЛ-8
ИЛ-13 ФНО-а ИФН-г
Рис. 2. Частота обнаружения цитокинов в КВВ
и сыворотке крови у здоровых добровольцев.
Аналогичная ситуация была у больных БА (рис. 3), то есть все
цитокины, за исключением ИЛ-8, в КВВ определялись намного чаще, чем в
образцах сыворотки крови.
14
%
100
%
80
60
сыворотка
КВВ
40
20
0
ИЛ-4
ИЛ-6
ИЛ-8 ИЛ-13 ФНО-а ИФН-г
Рис. 3. Частота обнаружения цитокинов в КВВ
и сыворотке крови при БА.
Частота определения цитокинов в сыворотке крови распределилась
следующим образом. В группе с обострением ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-13, ИЛ-8,
ФНО-α и ИФН-γ удалось определить в 21,4%, 28,6%, 21,4%, 28,6%, 100% и
64,3% случаев, соответственно. У пациентов с ремиссией заболевания ИЛ-4,
ИЛ-6, ИЛ-13, ИЛ-8, ФНО-α и ИФН-γ удалось определить в 28,6%, 28,6%,
21,4%, 28,6%, 100% и 64,3% случаев, соответственно. В группе здорового
контроля ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-13, ИЛ-8, ФНО-α и ИФН-γ удалось определить в
21,4%, 14,3%, 14,3%, 21,4%, 100% и 85,7% случаев, соответственно.
Средние значения ИЛ-4 в КВВ у пациентов с БА в фазе обострения и
ремиссии болезни были достоверно выше по сравнению со здоровыми
добровольцами (1,49±0,53 и 1,44±0,50 напротив 0,81±0,36 пг/мл; p<0,05)
(Рис. 4). Содержание ИЛ-4 в сыворотке крови удалось определить у 3
человек в фазе обострения и у 4 пациентов в фазе ремиссии, и у 3 человек в
группе здорового контроля.
Повышение уровня ИЛ-4 в КВВ у пациентов с БА можно объяснить
основными свойствами ИЛ-4. Этот цитокин относят к основным пусковым
медиаторам воспаления Th2-типа. ИЛ-4 выполняет ключевую роль в
15
продукции IgЕ и экспрессии молекулы адгезии сосудистого эндотелия 1 типа
(VCAM-1) на эндотелиальных клетках, который тем самым вызывает
миграцию эозинофилов из крови [Moser R. et al., 1992]. Многие авторы
отмечают более высокие концентрации ИЛ-4 в КВВ у больных БА
[Суровенко Т.Н. и др., 2002; Shahid S.K. et al., 2002; Matsunaga K et al., 2006;
Brunetti L. et al., 2008]. В работе Robroeks и соавт. (2007) методом
мультивариантной статистической регрессии показана диагностическая
значимость ИЛ-4 в КВВ при постановке диагноза БА.
*- p<0,05 по сравнению
со здоровыми людьми
Концентрация, пг/мл
2
*
1,5
*
1
0,5
0
Здоровые
БА,обостр.
БА,ремис.
Рис. 4. Концентрация ИЛ-4 в КВВ у больных БА.
У больных с обострением БА концентрация ИЛ-13 в КВВ была
достоверно выше на 43% по сравнению со здоровыми добровольцами, а
именно в фазе обострения его значения составили 21,05±10,04 пг/мл, в фазе
ремиссии - 15,06±9,42 пг/мл, в группе здоровых добровольцев - 11,97±6,29
пг/мл (Рис. 5). Однако уровень ИЛ-13 в КВВ был значимо повышен в группе
с обострением БА (p<0,05). В сыворотке крови ИЛ-13 удалось определить у
небольшой части больных: в группе обострения БА – у 3 больных, в группе
ремиссии - у 3 пациентов, в группе контроля - у 2 человек.
16
*- p<0,05 по сравнению
со здоровыми людьми
25
Концентрация, пг/мл
*
20
15
10
5
0
Здоровые
БА,обостр.
БА,ремис.
Рис. 5. Концентрация ИЛ-13 в КВВ у здоровых людей
и больных БА.
Повышение ИЛ-13 можно объяснить рядом его свойств, а именно, он
имеет схожую биологическую активность c ИЛ-4. ИЛ-13 также повышает
синтез ИЛ-4, увеличивая количество В-лимфоцитов, усиливая синтез IgE,
увеличивает экспрессию CD23 на В-лимфоцитах. ИЛ-13 отвечает за развитие
и поддержание воспалительного процесса при БА. Одним из его общих
свойств с ИЛ-4 является подавление Th1-клеток путем подавления
продукции ИЛ-12 моноцитами, тем самым, активируя развитие Th2-типа
воспалительной реакции [Le Gros G. et al., 1990; Swain S.L. et al., 1990].
Повышение экспрессии мРНК ИЛ-13 в гладкомышечном слое бронха
было обнаружено у пациентов с атопической и неатопической БА [Humbert
M. et al., 1997; Naseer T. et al., 1997]. Также отмечалось увеличение
концентрации ИЛ-13 в БАЛ у больных БА после введения аллергена в
дыхательные пути [Kroegel С. et al., 1996]. Лишь в одной работе данный
биомаркер был определен в КВВ у пациентов с БА при использовании
белкового чипа [Matsunaga K. et al., 2007].
17
Уровень ИЛ-6 у пациентов в стадии обострения БА составил 2,13±1,84
пг/мл, в фазе ремиссии - 1,37±0,25 пг/мл, и в группе контроля - 1,29±0,34
пг/мл. Имелась тенденция к повышению концентрации ИЛ-6 в КВВ в группе
с обострением БА, однако разница была недостоверной (p>0,05).
Повышение провоспалительной группы цитокинов при БА описано и в
других работах. Так, при измерении цитокинов в сыворотке крови у
пациентов с БА обнаружены более высокие значения, в частности ИЛ-6, у
пациентов с тяжелым течением БА по сравнению со среднетяжелым
течением заболевания [Дюсембаева Н.К. и др., 2006]. Это объясняется
провоспалительными свойствами цитокинов, в частности, они способны
активировать
воспалительный
процесс
путем
воздействия
на
провоспалительные факторы транскрипции, которые отвечают за запуск
воспалительного процесса.
Взаимосвязь ИЛ-6 с воспалительным процессом описывается и в ряде
других работ. Повышенный уровень ИЛ-6 в назальных смывах был
обнаружен у детей, перенесших риновирусную инфекцию (Zhou Y. et al.,
2001).
Другими
исследователями
продемонстрировано
повышение
концентрации ИЛ-6 в КВВ у женщин с гормональным вариантом БА
[Carpagnano G.E. et al., 2009].
ИЛ-8 не удалось определить ни в одном образце КВВ. В сыворотке
крови ИЛ-8 определили в стадии обострения у 4 больных, в стадии ремиссии
- у 4 пациентов, в группе контроля - у 3 человек. По своим свойствам ИЛ-8
относится к группе хемокинов. Было показано, что ИЛ-8 вызывает
активацию и хемотаксис лейкоцитов [Teran L.M. et al., 1996]. Также было
обнаружено, что ИЛ-8 в индуцированной мокроте удается определить лишь у
больных с тяжелым течением БА. Этот факт объясняет, почему мы не смогли
определить ИЛ-8 в КВВ у больных атопической формой БА среднетяжелого
течения. Связь повышенного уровня ИЛ-8 и содержания нейтрофилов в
индуцированной мокроте у пациентов с тяжелым течением БА описывает ряд
18
исследователей,
объясняя
это
наличием
персистирующей
вирусной
инфекции у данной категории больных [Shannon J. et al., 2008].
Концентрация ФНО-α в КВВ у больных БА в стадии обострения
составила 4,35±2,14 пг/мл, в фазе ремиссии - 4,06±1,18 пг/мл, а в группе
здорового контроля - 3,80±1,45 пг/мл (p>0,05). Уровень ФНО-α в сыворотке
крови в группе обострения составил 3,19±2,94 пг/мл, в группе ремиссии 2,61±2,13 пг/мл и 3,09±2,01 пг/мл - в группе здоровых добровольцев. Однако
различия были незначимыми.
ФНО-α, как и ИЛ-6, относится к провоспалительной группе цитокинов.
Согласно
имеющимся
данным,
ФНО-α
повышает
гиперреактивность
дыхательных путей и число нейтрофилов в индуцированной мокроте [Yates
D.H. et al., 1993]. Также были получены сильные корреляционные
взаимосвязи между содержанием ФНО-α и трансформирующего фактора
роста-β (TGF-β) в КВВ с концентрацией метахолина при проведении
провокационного теста и недельным разбросом значений пиковой скорости
выдоха (ПСВ) [Matsunaga K. et al., 2007]. Роль ФНО-α в развитии
бронхообструктивных нарушений была подтверждена в исследовании с
использованием антител к рецептору ФНО-α у больных с тяжелой БА. На
фоне лечения этим препаратом отмечалась положительная динамика, в т.ч.
снижение гиперреактивности бронхов [Hanania N., 2010].
Концентрация ИФН-γ в КВВ была ниже у пациентов с обострением БА,
но разница была недостоверной. Данный маркер относится к группе Th1цитокинов. Исследования показали, что он способен снижать аллергический
тип воспаления, уменьшая эозинофилию и явления гиперреактивности
дыхательных путей. При анализе цитокинового профиля у детей с БА
установлено достоверное снижение содержания ИФН-γ в КВВ [Shahid S.K. et
al., 2002]. Также снижение уровня ИФН-γ в сыворотке крови обнаружено у
пациентов с тяжелым течением БА [Hamzaoui A. et al., 2009]. Это
подтверждает
подавление
Th1-иммунного
аллергического механизма воспаления при БА.
19
ответа
и
преобладание
С целью оценки баланса Th1- к Th2-типу воспалительной реакции в
патогенезе БА проводили определение соотношения ИЛ-4 к ИФН-γ в КВВ. У
пациентов с БА этот коэффициент был выше, чем у здоровых, однако
разница была незначимой.
В работе Shahid et al. (2002) показан дисбаланс между Th2- и Th1ответом при БА, о чем свидетельствовало достоверное повышение уровня
ИЛ-4 и коэффициента соотношения ИЛ-4/ИФН-γ, а также снижение
концентрации ИФН-γ в КВВ у детей с БА по сравнению с группой здорового
контроля. Другие исследователи продемонстрировали, что коэффициент ИЛ4/ИФН-γ был повышен в группе больных БА по сравнению с больными
атопическим дерматитом, и его уровень снижался на фоне терапии ГК
[Brunetti L. et al., 2008]. Таким образом, с помощью данного коэффициента
можно оценивать эффективность проводимого лечения.
Корреляционный анализ.
Проведенный линейный корреляционный анализ выявил обратную
связь между концентрацией ИЛ-4 в КВВ и показателем ОФВ1 (r=-0,56;
р<0,05) в группе с обострением БА (Рис. 6). Это связано с основными
патологическими
свойствами
ИЛ-4,
прежде
всего
он
запускает
аллергический тип воспалительной реакции, вследствие чего развивается
бронхиальная обструкция.
Также при обострении БА была обнаружена корреляционная связь
между
коэффициентом
соотношения
ИЛ-4/ИФН-γ
и
абсолютным
количеством эозинофилов крови (r=0,65; р<0,05). Данную взаимосвязь
можно
объяснить
основными
свойствами
ИЛ-4,
который
способен
индуцировать Th2 тип воспаления и параллельно вызывать хемотаксис
эозинофилов (Рис. 7).
В фазе ремиссии БА была выявлена прямая корреляционная
взаимосвязь между уровнем ИЛ-13 и значением ОФВ1 (r=0,73; р<0,05). Это
20
свидетельствует о том, что, несмотря на купирование бронхообструктивных
нарушений сохраняются явления воспаления в дыхательных путях (Рис. 8).
r = - 0,56
85
80
ОФВ1,%должн.
75
70
65
60
55
50
45
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
ИЛ-4 в КВВ, пг/мл
Рис. 6. Корреляция между концентрацией ИЛ-4 в КВВ
и лёгочной функцией при обострении БА.
r = 0,65
900
800
Эозинофилы, клеток/мкл
700
600
500
400
300
200
100
0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
ИЛ-4 / ИФН-гамма в КВВ
Рис. 7. Корреляция между коэффициентом ИЛ-4/ИФН-γ
в КВВ и эозинофилией крови при обострении БА.
21
При помощи непараметрического корреляционного анализа Спирмена
у больных с обострением БА была обнаружена обратная взаимосвязь между
объемом КВВ и значением ОФВ1 (r=-0,53; р=0,049).
r = 0,73
30
25
ИЛ-13 в КВВ, пг/мл
20
15
10
5
0
-5
50
60
90
80
70
110
100
ОФВ1, %должн.
Рис. 8. Корреляция между концентрацией ИЛ-13 в КВВ
и лёгочной функцией при ремиссии БА.
Это свидетельствует о том, что обструктивные нарушения связаны с
развитием
отека
слизистой
стенки
бронхов
и
непосредственно
гиперсекрецией слизи, которые являются проявлением воспалительного
процесса при БА.
Также корреляционный анализ (метод Спирмена) в группе с
обострением БА выявил корреляционную связь между уровнем ИЛ-4
(цитокина атопии) в КВВ и концентрацией ФНО-α (провоспалительного
цитокина) в сыворотке крови (r=0,73; р=0,003). Это указывает на синергизм
ФНО-α с ИЛ-4 [Thornhill M.H. et al., 1991] и взаимосвязь местного
воспаления с проявлениями провоспалительной активности.
Помимо
этого,
с
использованием
метода
непараметрической
корреляции Спирмена в группе больных с ремиссией БА была обнаружена
корреляционная связь между концентрацией ИФН-γ в КВВ и ФНО-α в
22
сыворотке крови (r=-0,61; р=0,021). Это указывает на то, что наряду с
продукцией ФНО-α (провоспалительного фактора), происходит последующая
активация Th2-типа воспаления, и параллельное подавление Th1-иммунного
ответа на местном уровне.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о доминирующей
роли атопии в патогенезе БА, о наличии сохраняющейся воспалительной
активности даже в фазе ремиссии заболевания. Следовательно, определение
цитокинов в КВВ расширяет возможности изучения патогенеза БА, поможет
определить основные биомаркеры в диагностике этого заболевания.
В данной работе нами проведено одномоментное исследование
цитокинового паттерна КВВ и сыворотки крови, и полученные данные
указывают на перспективу данной методики. Для более глубокого понимания
роли цитокинов при БА следует оценить содержание цитокинов в КВВ у
больных с разным течением и фенотипами БА, измерить их концентрацию на
фоне проводимого противовоспалительного лечения. Однако в настоящее
время сохраняется ряд вопросов по методике определения различных
цитокинов в КВВ. До сих пор не определен, какой из методов является
наиболее оптимальным, учитывая низкие их концентрации в этой
биологической
жидкости.
Необходимо
проведение
дальнейших
исследований с целью разработки методологических стандартов и внедрения
этого метода в повседневную клиническую практику.
ВЫВОДЫ
1.
В КВВ больных БА удалось определить как провоспалительные, так и
противовоспалительные цитокины, за исключением ИЛ-8.
2.
Анализ цитокинов в КВВ позволил всесторонне оценить активность
местного воспаления в дыхательных путях у пациентов с БА, в то время
как их уровень в сыворотке крови отражает системный характер
воспаления в период обострения и ремиссии.
23
3.
Увеличение концентрации ИЛ-4, 6 и 13 в КВВ у больных БА указывает
на степень выраженности воспалительного процесса в дыхательных
путях и позволяет оценить эффективность проводимого лечения.
4.
Наличие взаимосвязи между содержанием ИЛ-4 в КВВ и показателем
ОФВ1, а также коэффициента ИЛ-4/ИФН-γ в КВВ и эозинофилии крови
у больных с обострением БА свидетельствует о доминирующей роли
атопического компонента в воспалительной реакции дыхательных путей.
5.
Выявленная корреляционная взаимосвязь между содержанием ИЛ-13 в
КВВ и значением ОФВ1 в период ремиссии свидетельствует о
персистирующем характере воспаления дыхательных путей у больных
БА.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Анализ
цитокинов
в
КВВ
следует
использовать
в
качестве
неинвазивного метода оценки активности местного воспалительного
процесса в дыхательных путях при БА.
2. Определение концентрации различных интерлейкинов, ИФН-γ и ФНОα
в
КВВ
является
важным
способом оценки
эффективности
проводимого лечения.
3. Исследование цитокинов в КВВ следует использовать для оценки
степени выраженности и природы обострения для определения
фенотипа заболевания, что позволяет уточнить дальнейшую тактику
ведения пациентов с БА.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Оспельникова Т.П., Анохина Т.Н.,
Чучалин А.Г. Цитокиновый статус конденсата выдыхаемого воздуха
при
бронхиальной
астме.
Пульмонология.
17-й
Национальный
конгресс по болезням органов дыхания: Сборник трудов конгресса.
Казань, 2007; А255, с.105.
2. Анохина Т.Н., Анаев Э.Х., Дугарова И.Д., Чучалин А.Г. Оценка
24
функции легких при сборе конденсата выдыхаемого воздуха.
Пульмонология. 17-й Национальный конгресс по болезням органов
дыхания: Сборник трудов конгресса. Казань, 2007; А254, с.105.
3. Dugarova I., Anaev E., Ospel`nikova T., Anokhina T., Chuchalin A.
Inflammatory markers in exhaled breath condensate in patients with
asthma. Materials of the III international scientific conference “Traditional
medicine: a current situation and perspectives of development”. August 1822, 2008; Ulan-Ude, Russia. - P.145.
4. Dugarova I., Anaev E., Ospelnikova T., Anokhina T., Chuchalin A.
Cytokines in exhaled breath condensate of patients with asthma. Eur Respir
J. 2008; Vol.32, (Suppl.52). - P.187s-188s.
5. Anaev E., Chuchalin A., Dugarova I., Ospelnikova T. Inflammatorische
Zytokine im Atemkondensat und Serum bei Asthma bronchiale.
Pneumologie. 2009; Vol.63, Suppl. - S.32.
6. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Хаптхаева Г.Э., Чучалин А.Г. Экспрессия
цитокинов в конденсате выдыхаемого воздуха и ее взаимосвязь с
клинико-функциональными
показателями
бронхиальной
астмы.
Тезисы докладов научно-практической конференции «Актуальные
вопросы респираторной медицины», Москва, 4-5 марта 2009 г., с.50.
7. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Чучалин А.Г. О роли цитокинов при
бронхиальной астме. Пульмонология. 2009; №4, с.96-102.
8. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Оспельникова Т.П., Чучалин А.Г.
Цитокины в конденсате выдыхаемого воздуха и их взаимосвязь с
клинико-функциональными показателями бронхиальной астмы. 19-й
Национальный конгресс по болезням органов дыхания: Сборник
трудов конгресса. Москва, 2009; А175, с.156.
9. Дугарова И.Д., Анаев Э.Х., Оспельникова Т.П., Чучалин А.Г.
Экспрессия цитокинов в конденсате выдыхаемого воздуха и её
взаимосвязь
с
клинико-функциональными
бронхиальной астмы. Пульмонология. 2010; №3, с.57-61.
25
показателями
Список сокращений
БА – бронхиальная астма
БАЛ – бронхоальвеолярный лаваж
ГК – глюкокортикоиды
ИКЧ – индекс курящего человека
ИЛ-4 – интерлейкин-4
ИЛ-6 – интерлейкин-6
ИЛ-8 – интерлейкин-8
ИЛ-13 – интерлейкин-13
ИФН-γ – интерферон-гамма
КБД – коэффициент бронходилатации
КВВ – конденсат выдыхаемого воздуха
ОФВ1 – объем форсированного выдоха за первую секунду
ПСВ – пиковая скорость выдоха
ФВД – функция внешнего дыхания
ФЖЕЛ – форсированная жизненная ёмкость легких
ФНО-α – фактор некроза опухолей-α
ХОБЛ – хроническая обструктивная болезнь лёгких
ATS – Американское торакальное общество
ERS – Европейское респираторное общество
GINA – Глобальная стратегия по бронхиальной астме
IgE – иммуноглобулин класса Е
TGF-β – трансформирующий фактор роста-β
VCAM-1 – молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа
26