НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
реклама
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ Российского федерального агентства здравоохранения и социального развития Фармацевтический факультет __________________________ Кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии Электронная спектроскопия в фармацевтическом анализе Учебно - методическое пособие для студентов 4 - 5 курсов фармацевтического факультета. Нижний Новгород 2006 УДК 615.1 Электронная спектроскопия в фармацевтическом анализе. Учебнометодическое пособие для студентов 4-5 курсов фармацевтического факультета. – Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2006. Учебно–методическое пособие составлено для студентов 4-5 курсов фармацевтического факультета в соответствии с программой по фармацевтической химии (Москва, 2002 г.). В пособии рассмотрены общие теоретические положения электронной спектроскопии и методы установления подлинности, доброкачественности и количественного определения лекарственных средств. Рекомендовано к изданию Центральным методическим советом Нижегородской государственной медицинской академии. Протокол № 3 от 28 ноября 2005 года. Составители: Н.Б. Мельникова, О.Е. Зимнякова, В.М. Пожидаев, Т.В. Саликова, И.А. Пегова, М.С. Гусихина. Рецензент: профессор кафедры «Биотехнологии, физической и аналитической химии» Нижегородского государственного технического университета, д.х.н. Арбатский А.П. © Н.Б. Мельникова, О.Е. Зимнякова, В.М. Пожидаев, Т.В. Саликова, И.А. Пегова, М.С. Гусихина, 2006. 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Общие теоретические положения. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 Электронная спектроскопия: УФ-видимая область. . . . . . . . . 6 Фотометрия в видимой области спектра. . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Лабораторно–практическая работа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Перечень приобретаемых навыков и умений . . . . . . . . . . . . . 27 Ситуационные задачи . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 Контрольные задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Литература . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3 ОБЩИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Электронная спектроскопия широко используется как при установлении структуры новых биологически активных веществ (БАВ), так и при контроле качества лекарственных веществ. Методы основаны на поглощении исследуемым веществом монохроматического излучения областей электромагнитного спектра. Электромагнитное излучение имеет двойственную природу: волновую и корпускулярную. Характеристикой, отражающей волновую природу является: λ - длина волны излучения, выражаемая обычно в нм, ν - волновое число (см-1) – число волн, приходящееся на 1 см длины светового луча. Оно пропорционально частоте, а, значит, и энергии квантов. 1 (1) Испускание и поглощение электромагнитного излучения происходит квантами, энергия которых описывается уравнением: Е h h c (2), где h = 6.5·10-27 эрг/сек (постоянная Планка); с – скорость распространения электромагнитных волн. Энергия кванта обратно пропорциональна длине волны. С уменьшением λ увеличивается энергия электромагнитного излучения, что определяет характер взаимодействия электромагнитных волн с исследуемым веществом. Использование в аналитических целях определенного интервала длин волн обусловлено тем, что излучение в данной области обладает энергией, соизмеримой с энергией связей 4 химических соединений: более коротковолновое излучение в данной области спектра может приводить к разрушению связей в молекулах, а более длинноволновое слабо воздействует на химические связи и поэтому не дает информации о строении. Области электромагнитного спектра Длина волны, λ Излучение Причина Наблюдаемый поглощения спектр излучения поглощения Энергия, эВ Переходы 1·10-3-10 мягкое внутренних нм рентгеновское электронов в Рентгеновский 105 Электронный 10 ИК 1 – 10-3, ЯМР, ЭПР 10-6 атомах 10-400 нм 400-800 нм УФ Переходы в видимой валентных области электронов Колебательные 8-300 мкм и вращательные ИК переходы молекул 300 мм - короткие 200 м радиоволны Спиновые переходы ядер и электронов 5 ЭЛЕКТРОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ УФ-ВИДИМАЯ ОБЛАСТЬ Спектры λ = f(J0) получают, измеряя интенсивность поглощенного монохроматического излучения, прошедшего через кювету с образцом, и сканируя определенную область длин волн (Г.Стокс и У.Миллер, 1852 г.). Метод стал фармакопейным с 1968 года. Блок - схема для получения УФ – спектра может быть представлена следующим образом: И М О Д РУ И - источник излучения; М – монохроматор; О – исследуемый образец; Д – детектор (фотоэлемент); РУ – регистрирующее устройство. Спектр представляет собой зависимость Т= f (λ). Область интенсивного поглощения принято называть полосой поглощения. После прохождения светового луча через кювету его интенсивность уменьшается за счет отражения от стенок кюветы, поглощения образцом и, наконец, за счет рассеяния на взвешенных частицах. При этом только потери на поглощение вызваны собственно растворенным исследуемым веществом. Для учета отражения и рассеяния опыт повторяют с аналогичной кюветой, содержащей только растворитель (рис 1). 6 образец рассеяние отражение от источника к детектору поглощение Рис 1. Прохождение светового луча через кювету. При солнечном свете, который служит источником излучения, человеческому глазу, представляющему собой качественный детектор образец бензола кажется бесцветным, поскольку он не обладает поглощением в диапазоне длин волн > 400 нм. Увеличение системы сопряженных колец сдвигает полосу поглощения образца в синюю область, и образец видится нам красным или желтым. Точно таким же образом синие вещества обладают сильным поглощением в красной области видимого диапазона спектра. Так качественно можно объяснить окраску веществ и материалов. Пропускание (пропускаемость) Т рассчитывают по формуле: Т J раствор J J 0 J растворитель (3) Интенсивность полосы поглощения, т.е. А или D – оптическая плотность, пропорциональна числу поглощающих частиц в облучаемой зоне кюветы. D A lg T lg 7 J0 J (4) Эта величина пропорциональна толщине кюветы d (см), и концентрации компонента С (моль/л). D A d C (5), ε – коэффициент пропорциональности. Он зависит от природы вещества и называется молярным коэффициентом поглощения (л/моль·см). В ГФ используется термин поглощаемость. Поглощаемость (а) определяется как: а А d C [C] – г/л (6) , По ГФ используется удельный показатель экстинкции Е1см , при этом 1% концентрация (C) выражается в г/100мл. (%) Расчетные формулы: % Е11см 10 а a Мr % Е11см Мr 10 (7) (8) (9) где Мr молекулярная масса вещества. Взаимодействие вещества с УФ-излучением Электроны в молекулах органических соединений располагаются на связывающих, несвязывающих и разрыхляющих орбиталях. На связывающих орбиталях располагаются электроны, участвующие в образовании валентных связей: σ, π - электроны. σ - электроны участвуют в образовании простых (одинарных связей), π - кратных (двойных и тройных). На несвязывающих орбиталях располагаются электроны, не участвующие в образовании химических связей – это n-электроны (ими являются свободные электронные пары гетероатомов – O, S, N, Hal). Расположение электронов на связывающих и несвязывающих орбиталях 8 соответствует основному состоянию молекулы. Нахождение электронов на разрыхляющих – возбужденному, которое возникает при поглощении молекулой определенного количества энергии. При возбуждении возможен переход электронов с одних орбиталей на другие по схеме: Наибольшей энергии требует σ – σ* переход, связанный с возбуждением электронов σ связи, соответствующий поглощению в определенной УФ-области. Такие переходы наблюдаются в насыщенных соединениях – алканах. Переход π – σ* связан с меньшими затратами энергии, полосы поглощения располагаются в области 200-300 нм. Еще меньшая энергия требуется для перехода на разрыхляющую π* орбиталь; переходы π – σ* и π – π* встречаются в молекулах соединений с сопряженными связями, в том числе в молекулах ароматических соединений. Следовательно, существенными элементами, обуславливающими наличие электронных спектров органических молекул, является кратная связь и неподеленная электронная пара. Их наличие, многочисленные сочетания в молекулах с разнообразными заместителями объясняет совокупность электронных спектров органических соединений. Группировки, содержащие в своем составе сопряженные двойные связи и неподеленные пары электронов, называются хромофорами. 9 Схема электронных переходов Хромофор Переход λmax, нм -С-С- σ – σ* 135-150 -О- n – σ* 180-185 -N< n – σ* 190-200 -S- n – σ* 210-215 π – π* 190-200 n – π* 290-300 π – π* 175-190 >C=O >C=C< Электронные переходы, вызванные поглощением определенных квантов световой энергии, характеризуются наличием полос поглощения в характерной области электронных спектров атомов или молекул. Природа полос поглощения в УФ и видимых областях спектра одинакова и связана главным образом с числом и расположением электронов в поглощающих молекулах и ионах. Путем изучения модельных соединений были определены длины волн УФ - света, поглощаемые теми или иными хромофорами, например: Карбоксил -COOH Карбонил >C=O Тиокарбонил >C=S Азогруппа -N=NАроматическая нитрогруппа Ar-NO2 Диен 195-210 нм -С=С - С=С 210-250 нм Полиены 290-300 нм (ретинолы) 310-360 нм [-С=С - С=С-]n 330 нм Бензил 350-370 нм Нафтил 200-210, 270-280 нм 10 210 или 270 нм 310 нм Определенные полосы поглощения в спектре могут указывать на наличие в структуре этого соединения тех или иных функциональных групп (хромофоров). Этим объясняется сходство спектров веществ, содержащих, например, фенильный радикал: эфедрин, димедрол, атропин, бензилпенициллин. Они имеют три максимума поглощения 251, 257, 263 нм. Лекарственные вещества, содержащие замещенный ароматический радикал (адреналин, морфин, эстрадиол, левомицетин и др.) имеют в спектре один максимум около 280 нм, сопряженную еноновую систему в лекарственных веществах из группы кортикостероидов – около 238 нм. Однако однозначный вывод о структуре химического соединения сделать сложно, т.к. интерпретация спектра затруднена: 1. Присутствием в молекуле более чем одного хромофора; 2. Наличием в молекуле исследуемого вещества тех или иных заместителей; 3. Влиянием растворителя; 4. Поведением вещества в растворе (способностью образовывать внутри - и межмолекулярные водородные связи, наличием или отсутствием динамической изомерии и т.д.). 5. Наличие геометрической изомерии. Все эти факторы могут вызывать эффекты изменения интенсивности и положения максимума поглощения. Если полоса поглощения смещается в сторону более длинных волн, говорят о батохромном смещении, в сторону более коротких волн – о гипохромном смещении. Для применяют характеристики такие интенсивности), понятия изменения как гипсохромный интенсивности гиперхромный эффект (рис. 2). 11 эффект (ослабление поглощения (усиление интенсивности) гиперхромный эффект D гипсохромный гипохромное батохромное смещение смещение λ Рис. 2. Применение электронной спектроскопии Электронная спектроскопия применяется для: 1. установления подлинности и доброкачественности; 2. количественного определения как индивидуальных веществ, так и компонентов сложных смесей, 3. испытания по тестам «Растворение» и «Однородность дозирования» таблеток и капсул; 4. изучения фармакокинетики, биодоступности лекарственных веществ, их стабильности и установления сроков годности. Операции в УФ-спектроскопии 1. Подготовка образца. 1% 2. Снятие спектра, определение λmax, λmin, вычисление Е1см или ε. 3. Анализ и сравнение с данными НД. 4. Подготовка раствора стандартного образца (РСО). 5. Измерение А (D) РСО и испытуемого раствора. 6. Проверка расчетов. Удобным приемом при испытании на подлинность является определение отношения величин поглощения двух максимумов. Это 12 уменьшает влияние переменных характеристик прибора на испытание и исключает необходимость использования стандартного образца. Такой способ используют в случае анализа пара-аминосалицилата, дексаметазона, рибоксина, феноксиметилпенициллина, кислоты фолиевой. 1% При испытании на подлинность часто рекомендуют рассчитать Е1см в максимуме поглощения (например, для левомицетина, адреналина, прогестерона). Количественное определение Количественное определение лекарственных веществ осуществляется несколькими способами: 1. С помощью калибровочного графика. 2. Определением концентрации на основе сравнения поглощения раствора испытуемого вещества с поглощением раствора стандартного образца. Астанд. А х С станд. С х Сх Сстанд. Ах Астанд. (10) (11) Расчет количественного содержания индивидуального вещества в %: Х (%) Ах Сстанд. в 100 , Астанд. а (12) где в - разведение, а – навеска вещества. Расчет количественного содержания индивидуального вещества в таблетках производится по формуле: Г Ах Сстанд. в Р Астанд. а , где Р - средняя масса таблетки. 13 (13) 3. Определение концентрации (содержания) с использованием удельного или молярного коэффициентов поглощения. % А Е11см сd А сd С (%) при d=1 см (14) (15) А % Е11см d (16) С (%) А % Е11см (17) Концентрация (%) индивидуального вещества находится по формуле: Х (%) А в Е11см% а (18) в таблетках: Г А в Р % Е11см а 100 С при d=1 см А d C Е11см% (19) Мr 10 А (20) Лекарственные вещества: Рутин, феноксиметилпенициллин, ретинола ацетат, рибофлавин, таблетки преднизолона, кортизона ацетата. Анализ смесей Анализ смесей без разделения на компоненты возможен в том случае, если компоненты смеси имеют максимум поглощения при разных длинах волн. 14 Например, в таблетках состава: Никотиновая кислота – 22 мг Дротаверина гидрохлорид – 78 мг Используют раствор навески препарата в 0.1M HCl. Измеряют оптическую плотность раствора при λmax=353 нм и 260 нм. Содержание дротаверина гидрохлорида определяют по оптической плотности при 353 нм, а никотиновой кислоты по разности оптических плотностей при 360 и 353 нм. Расчет содержания компонентов по 1% Е1см Спектр дротаверина гидрохлорида: определяют оптическую плотность А(D) при λmax =240 нм, 302 нм, 353 нм, λmin =261 нм, 322 нм. (предварительно необходимо сделать испытание на однородность дозирования, т.е. содержание вещества в каждой отдельной дозе.) УФ-спектроскопия используется в тесте «Растворение» (ГФ XI, т.2, стр. 154). 15 ФОТОМЕТРИЯ В ВИДИМОЙ ОБЛАСТИ СПЕКТРА В видимой области (400—800 нм) электромагнитное излучение поглощают окрашенные вещества: либо за счет собственной окраски (КМnO4, рибофлавин), либо за счет образования окрашенных продуктов испытуемых веществ после реакции с цветореагентами. В основе фотометрического метода в видимой области лежит объединенный закон светопоглощения Бугера–Ламберта–Бера А( D ) d C , (21) где А (D) – оптическая плотность исследуемого раствора; С – концентрация вещества в моль/л (г/100 мл); d – толщина слоя (кюветы); ε – молярный коэффициент поглощения (оптическая плотность одномолярного раствора при толщине слоя 1 см); 1% E1см - удельный показатель экстинкции (оптическая плотность раствора, содержащего 1,0 г вещества в 100 мл раствора при толщине 1 см) % Е11см Мr 10 (22) Типы реакций, применяемых в фотометрии 1. Получение ацисолей с NаОН фурацилин, фуразолидон, левомицитин, нитроксолин. O NaOH O 2N O N N H N N H2 CH NaO OH O O Nitrofural (Фурацилин, 5 - нитрофурфурола семикарбазон) желтая - желто-зеленая окраска 16 N H2 N O 2. Диазотирование с последующим азосочетанием для препаратов, содержащих первичную ароматическую группу (анестезин, новокаин, сульфамиламид) NaO NH2 N N N -NaCl -2H2O COOC2H5 OH Cl NaNO2 +2HCl N +NaOH -NaCl -2H2O COOC2H5 COOC2H5 Benzocaine, Этиловый эфир п-аминобензойной кислоты 3. Получение гидроксаматов меди и железа для препаратов, содержащих сложноэфирную (новокаин), лактонную (пилокарпин), лактамную (бензилпенициллина К - и Nа - соли) группы. NH 2 NH2 + HOC2H4(C2H5)2 + HCl * HCl + N H 2 OH C ONHOH COOC2H4N(C2H5)2 +Fe Cl 3 -HCl NH2 * Fe3+ C O NHO 3 Procaine Hydrochloride Новокаин β-диэтиламиноэтилового эфира гидрохлорид 17 n-аминобензойной кислоты Pilocarpine Hydrochloride C2 H5 CH2 N CH3 NaOH HCl+NH2OH -H2O -NaCl O O N C2H5 CH2 C HO N FeCl3 -3HCl CH2OH HN N O C2H5 CH2 C - NH O CH3 N CH3 Fe3+ CH2OH N O 3 4. Окисление калия перманганатом и определение продуктов реакции после реакции диазотирования с последующим азосочетанием с N-1нафтилэтилендиамином дихлоридом. OH N CH2 N C NH NH O H2 N N CH2 CH 2 COOH O COOH N R OH N COOH N H2N C R + H2 N N H2 N O N C R HCl N + NaNO2 N C O NH CH2 CH2 NH2 O NH CH2 CH2 NH2 2HCl +3NaOH -NaCl N N C O 18 R R Cl 5. Комплексообразование с FeCl3, (кислота салициловая) или с Cu 2+ (CuSO4) (производные барбитуровой кислоты, глицерин). COOH COO +FeCl3 FeCl -2HCl OH O CH2 CH2OH CH2 Cu 2 NaOH 2 CHOH +CuSO4 O O CHO CH2OH CH2OH +Na2SO4 + 2 H2O OHC CH2OH 6. Конденсация с n-диметиламинобензальдегидом (новокаин), 2,4 – динитрофенилгидразином (цитраль): NH CH3 H3 C C CH NO2 H + C CH CH2 CH2 C NH2 H3 C O CH3 NH N CH CH C NO2 CH2 CH2 CH NO2 CH3 C CH3 +NaOH -H2O CH3 NO2 NH N CH CH C CH3 CH2 CH2 CH NO2 O N C CH3 ONa Если полученное окрашенное соединение нерастворимо в воде, его извлекают органическим растворителем, несмешивающимся с водой (хлороформ, эфир и др.) и определяют оптическую плотность извлечения. Это вариант экстракционной фотометрии. Требования, предъявляемые к реакциям: продукт реакции образует устойчивую окраску и имеет постоянный состав; 19 реакция должна быть стехиометричной; реакция протекает быстро; высокая избирательность и чувствительность реакции; реагенты должны быть доступны, безвредны и экономичны. Экстракционная фотометрия. Методом экстракционной фотометрии проводится определение следующих веществ: - производных барбитуровой кислоты - эфедрина - солей органических азотсодержащих оснований - алкалоидов по реакции с кислотными индикаторами (бромтимоловый синий, пикриновая кислота, тропеолин 00 и др.) с образованием ионных ассоциатов: CH3 H CH3 C C NH CH 3 H O Cu O N NaOH CH CH NH CH3 + CuSO4 OH Ephedrine Hydrochloride 1-эритро-2-метиламино-1-фенилпропанола-1 гидрохлорид. Эфир – краснофиолетовый цвет, H2O – синий. В дифференциальном светопоглощения проводится варианте фотометрии относительно раствора измерение сравнения, содержащего определенное количество анализируемого вещества. В связи с этим дифференциальная фотометрия позволяет повысить точность фотометрических измерений при определении высоких концентраций (10 100%) и уменьшить относительную ошибку анализа до 0,5 — 1,0%. 20 Фармакопейный анализ Испытание на подлинность. 1. Aλ( Dотн.) (0,01% тетрациклина в 0,01М HCl), А380нм=0,36-0,38 1% 2. Е1см при λ – (цианокобаламин при 550 нм Е1см =61,5-66,5) 1% 3. D1 k a D 2 D361 3.0 3.4 D548 0,002% раствор цианокоболамина. Количественное определение. Количественное определение в фармакопейном анализе использованием фотометрии проводится несколькими способами: 1. По калибровочному графику: у = ax + b Концентрация вещества в лекарственной форме X C X 100 PилиV , a (23) где СX – масса вещества по калибровочному графику (г); Р – средняя масса лекарственной формы (г); V – объем раствора лекарственной формы (мл); a – навеска лекарственной формы, взятая для анализа (г). 2. Расчет по стандарту (ГСО, РСО, СОВС): а) концентрация в индивидуальном веществе Cстанд. АХ Vколбы 100 С% Астанд. Vпипетки а (24) б) в лекарственной форме Г Сстанд AX Vкол бы Р(илиV ) Астанд Vпипетки a 21 (25) с где Р – средняя масса лекарственной формы (г); V - объем лекарственной формы (мл). 1% 3. Расчет по молярному коэффициенту поглощения – ε или E1см С С D % Е11см d (26) D d (27) а) концентрация в индивидуальном веществе: C% С% АХ Vколбы % Е11см Vпипетки d a АХ Vкол бы М .м. 100 Vпипетки d a 1000 (28) (29) б) в лекарственной форме: Г Г АХ Vкол бы Р(илиV ) % Е11см Vпипетки d a 100 АХ Vкол бы М . м. Р (илиV ) Vпипетки d a 1000 22 (30) (31) ЛАБОРАТОРНО–ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА Определение основных характеристик электронных спектров поглощения лекарственных веществ и препаратов Цель: фармацевтический анализ на подлинность, доброкачественность и количественное содержание лекарственных веществ и лекарственных препаратов. Этапы работы: 1) Получить задание у преподавателя. 2) Подготовить анализируемый образец (взятие навески, растворение, разведение до оптимальной концентрации порядка 10-410-5 моль/л). Запись спектра поглощения исследуемого раствора на спектрофотометре относительно раствора сравнения. 3) 1% Найти λmax и λmin, вычислить Е1см или ε выбранной полосы поглощения в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера. 4) Подготовить серию растворов стандартного образца для построения калибровочной прямой. Измерить оптическую плотность стандартных растворов и анализируемого образца при определенной длине волны. 5) Проанализировать соответствующие расчеты полученные и дать данные, заключение сделать о качестве анализируемого образца в соответствии с НД. 6) Составить отчет и сдать его преподавателю. Использование полученных результатов. Полученные результаты могут использоваться для: Испытания на подлинность Нахождение в спектре λmax и λmin и сравнение с аналогичными характеристиками, приведенными в НД. Если значения совпадают то делают заключение о идентичности веществ. 23 Вычисление соотношений Dmax1/Dmax2 и Dmax/Dmin (Dmin определяют при длине волны λmin, предшествующей λmax). Характеристика спектра поглощения по величине 1% Е 1см или ε в максимуме поглощения. Сравнение общего вида спектра раствора анализируемого вещества со спектром раствора стандартного образца или спектром приведенным в НД. Испытания на доброкачественность (чистоту) Используются те же характеристики, что и при испытании на подлинность. При наличии примесей может изменяться λmax, λmin, Dmax, Dmin, появляются дополнительные максимумы. Количественного определения По калибровочному графику. Приготовить серию растворов стандартного образца исследуемого вещества с постепенно возрастающей концентрацией. Измерить оптическую плотность каждого раствора при заданной длине волны. Построить график зависимости оптической плотности от концентрации. Измерить оптическую плотность исследуемого раствора и по калибровочному графику (графически или алгебраически) найти искомую концентрацию. По светопоглощению стандартного раствора. Приготовить раствор стандартного образца известной концентрации. Определить оптическую плотность анализируемого и стандартного раствора. Провести расчет как показано на стр. 20-21 . 1% 1% По известному значению Е1см или ε. Значения Е1см или ε могут быть взяты из литературных источников или определены экспериментально. Произвести расчет как показано на стр. 20-21. 24 Лекарственное вещество Концентрация и растворитель Показатель, используемый для идентификации λmax=278 нм; Адреналин 0,005% в 0,01М HCl Аминазин 0,0005% в 0,01М HCl λmax=254 нм;307 нм 0,005% в 0,01М λmax=281 нм, NaOH λmin=238 нм Анестезин Аскорбиновая кислота 0.001% в буферном растворе с рН 7,0 Викасол 0,0005% в Н2О Дексаметазон 0,001% в 95% спирте Дибазол 0,002% в 95% спирте Димедрол 0,05% в 95% спирте Изониазид 0,002% в 0,01М HCl Кофеин 0,001% в 0,01М HCl 1% Е 1см =78-72 λmax=265 нм λmax=230нм, 265нм; λmin=248нм λmax=240нм D240/D263=1.9-2.1 λmax=244, 275, 281 нм λmin=230, 259, 263 нм λmax=253, 258, 264 нм λmin=244, 255, 263 нм λmax=266 нм, λmin=234 нм λmax=273 нм λmax=278 нм; Левомицетин 0,002% в H2O 1% Е 1см =290-305 λmin=237 нм Натрия бензоат 0,001% в H2O 25 λmax=226 нм Натрия 0,001% в H2O D265/D299=1,50-1,56 Папаверина гидрохлорид 0,0025% в 0,01М HCl λmax=285, 309 нм Парацетамол 0,0005% в метаноле λmax=249 нм Прогестерон 0,001% в 95% спирте Рибоксин 0,001% в H2O парааминосалицилат λmax=241 нм; 1% Е 1см =518-545 λmax=249 нм λmax=251 нм Стрептоцид 0,0008% в 0,01М λmax=264 нм, 271 нм, NaOH λmin=241 нм, 268 нм, 0,015% в 1М HCl плечо в области от 257-261 нм. Сульфацилнатрий 0,001% в H2O Тетрациклин 0,001% в 0,2М NaOH λmax=256 нм, λmin=227 нм λmax=380 нм λmax=285 нм; Токоферол 0,01% в спиртеректификате 1% Е 1см =42-47 λmin=227 нм, 1% Е 1см =7-12 Феноксиметил 0,02% в 0,04% пенициллин растворе NaHCO3 D268/D274=1,21-1,24 λmax=256, 283, 365 нм Фолиевая кислота 0,001% в 0,1М NaOH λmin=235, 265, 332 нм D256/D365=2,8-3,0 Фуразолидон 0,001% в ДМФА Фурацилин 0,0006% в ДМФА Цианокоболамин 0,002% в H2O 26 λmax=260 нм, 237 нм λmin=302 нм λmax=260 нм, 375 нм λmin=306 нм λmax=278, 361, 550 нм ПЕРЕЧЕНЬ ПРИОБРЕТАЕМЫХ НАВЫКОВ И УМЕНИЙ 1. Практические навыки проведения фармакопейного анализа субстратов и готовых лекарственных средств методами электронной спектроскопии. 2. Умение проводить анализ спектров и составлять заключение о качестве образца. 3. Умение работать с нормативной документацией (ГФ XI, фармакопейные статьи) 27 СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ. Задача №1. Дайте заключение о качестве лекарственной формы состава: Раствора рибофлавина 0,02%—10 мл Кислоты аскорбиновой 0,02 Тиамина бромида 0,02 Калия йодида 0,3 По количественному содержанию рибофлавина, если оптическая плотность раствора, полученного разведением 0,5 мл лекарственной формы до 10 мл водой, измеренная при λ = 445 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм, равна 0,340. Удельный показатель рибофлавина при 445 нм равен 328. Задача №2. Рассчитайте содержание левомицетина в лекарственной форме состава: Раствора левомицетина 0,015% 10 мл Натрия хлорида 0,09 если оптическая плотность 10 мл раствора, полученного из 1,5 мл разведения лекарственной формы 1:5, измеренная при длине волны 364 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм равна 0,430. Оптическая плотность 10 мл стандартного раствора левомицетина, полученного из 1,5 мл 0,02% раствора левомицетина, измеренного в тех же условиях, равна 0,285. Задача №3. При количественном определении рутина в таблетках «Аскорутин» (состав: кислоты аскорбиновой 0,05, рутина 0,05) оптическая плотность раствора, полученного из 0,0305 г порошка растертых таблеток, разведенных в 250 раз, при длине волны 420 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм равна 0,380. Оптическая плотность 0,02% раствора РСО рутина, измеренная в тех же 28 условиях равна 0,395. Средняя масса одной таблетки 0,327 г. Сделайте заключение о качестве препарата по содержанию рутина, которого в одной таблетке должно быть 0,04625-0,05375 г. Задача №4. При определении примеси свободной салициловой кислоты в таблетках кислоты ацетилсалициловой по 0,5 г навеску порошка растертых таблеток равную 0,5015 г поместили в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавили 2 мл 0,2% раствора железо-аммонийных квасцов, довели спиртом до метки, профильтровали. Оптическая плотность фильтрата, измеренная при 540 нм в кювете с толщиной слоя 50 мм, равна 0,105. Оптическая плотность раствора РСО кислоты салициловой, полученного из 2 мл 0,01% раствора в тех же условиях равна 0,262. Средняя масса таблетки 0,605 г. Сделайте заключение о качестве препарата по содержанию свободной салициловой кислоты, которой должно быть не более 0,000125 г, считая на среднюю массу одной таблетки. Задача №5. Рассчитайте удельный показатель поглощения рибофлавина в максимуме при длине волны 444 нм, если оптическая плотность, раствора, содержащего 10-5 г препарата в 1 мл равна 0,328 при толщине поглощающего слоя 10 мм. Задача №6. Рассчитайте содержание фурацилина в г в 200 мл раствора, если оптическая плотность стандартного раствора 0,356, оптическая плотность испытуемого раствора 0,368, концентрация стандартного раствора 0,02%. Для анализа взято по 1 мл исследуемого и стандартного растворов. Задача №7. Рассчитайте содержание левомицетина в водном растворе, если при 1% измерении на спектрофотометре (кювета 10 мм) D=0,59 и Е1см =295. 29 Задача №8. При количественном определении фуразолидона оптическая плотность раствора, полученного путем растворения навески массой 0,1092 в 50 мл растворителя с последующим разведением 1:200 оказалась равна 0,465 1% ( Е1см =750). Соответствует ли содержание фуразолидона (%) требованиям ФС? Задача №9. Рассчитайте удельный показатель поглощения витамина В12 при 278 нм, если массу 0,0500 г растворили в 100 мл воды очищенной. 4 мл этого раствора поместили в мерную колбу вместимостью 100 мл, довели до метки тем же растворителем. Оптическая плотность оказалась равной 0,31. Задача №10. Рассчитайте содержание цианокобаламина (%) в растворе по следующим данным: Dx=0,460, Dст=0,462, Сст =0,00002 г/мл, l=1 см. Задача №11. Рассчитайте содержание бутадиона в одной таблетке, если оптическая плотность испытуемого раствора равна 0,321, а стандартного раствора 0,338, масса препарата 0,0802 г, масса РСО бутадиона 0,0506 г, средняя масса таблетки равна 0,2521. Для анализа массу препарата растворяли в 200 мл 0,1М раствора гидроксида натрия и далее использовали разведение 1:50. Задача №12. Рассчитайте молярный показатель поглощения вещества, если оптическая плотность раствора составляет 0.424, концентрация раствора 0,002%, толщина кюветы 0,5 см, молекулярная масса вещества 200,00. 30 КОНТРОЛЬНЫЕ ЗАДАНИЯ. 1. Назвать (обозначить) хромофорные группы в молекуле вещества А. 2. Обосновать значение(я) λmax для вещества А. Указать связь спектральных характеристик и электронного строения. 3. Сравнить УФ – видимые спектральные свойства вещества А со спектральными свойствами других веществ того же класса. Обосновать связь спектральных свойств и строения веществ этого класса. 4. Дать обоснование фармакопейной методике, основанной на УФ – видимом анализе вещества А. Вариант Вещество А Вариант № 1 1. Дайте заключение о качестве лекарственной формы состава: Раствора рибофлавина 0,02% — 10мл Кислоты аскорбиновой 0,02 г Тиамина бромида Калия йодида по 0,02 г 0,3 г количественному содержанию рибофлавина, если оптическая плотность раствора, полученного разведением 0,5 мл лекарственной формы до 10 мл водой, измеренная при длине волны 445нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм, равна 0,340. Удельный показатель рибофлавина в максимуме при 445 им равен 328. 2. Объясните наблюдаемые цвета веществ, основываясь на их спектрах. Назовите хромофорные группы в молекуле рибофлавина. Какую информацию можно получить, изучая оптические свойства веществ в УФвидимом диапазоне. 31 3. Какая примесь в рибофлавине мешает определению и как ее устанавливают, используя видимую область спектра? 4. Рибофлавин имеет 4 максимума поглощения 223, 267, 370 и 445 нм. Объясните значение λmax, исходя из квантово-химических представлений. 5. Сравните УФ - видимые спектральные свойства рибофлавина и рибофлавина мононуклеотида. Дайте мотивированное заключение о различии самих спектров. 6. Дайте подробную методику по ФС УФ-идентификации дисульфирама (Disulfiram). Вариант № 2 1. Рассчитайте содержание левомицетина в лекарственной форме состава: Раствора левомицетина 0,015 % 10мл Натрия хлорида 0,09 г, если оптическая плотность 10 мл раствора, полученного из 1,5 мл разведения лекарственной формы 1:5, измеренная при длине волны около 364 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм равна 0,430. Оптическая плотность 10 мл стандартного раствора левомицетина, полученного из 1,5 мл 0,02% раствора левомицетина, измеренного в тех же условиях, равна 0,285. 2. Какой метод фотометрии, или какая цветная реакция рекомендуется ГФ для анализа левомицетина. Напишите уравнение реакции и объясните окраску продукта реакции с точки зрения квантовой химии. Назовите хромофорные группы в молекуле левомицетина. 3. Как влияет изменение молекулы левомицетина Л — Л. стеарат. — Л. сукцинат на поведение УФ-спектров. Какие методики используются при анализе левомицетина и его производных. Дайте характеристику УФ- спектрального количественного определения левомицетина. 32 4. Дать подробное описание фармакопейной методики, основанной на УФ - видимом анализе фитоменадиона (витамин К2) и менадиона натрия бисульфита Menadione Sodium Bisulfite (викасола). Вариант № 3 1. При количественном определении рутина в таблетках "Аскорутин" (состав: кислоты аскорбиновой спектрофотометрическим 0,05 методом г, оптическая рутина плотность 0,05 г) раствора, полученного из 0,0305 г порошка растертых таблеток разведенных в 250 раз, при длине волны 420 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм равна 0,380. Оптическая плотность 0,02 % раствора РСО рутина измеренная в тех же условиях равна 0,395. Средняя масса одной таблетки 0,327. Сделайте заключение о качестве препарата по содержанию рутина, которого в 1 таблетке должно быть 0,04625 - 0,05375 г. 2. Назовите хромофорные группы кислоты аскорбиновой и рутина. Какую информацию можно получить, изучая оптические свойства в УФ – видимом диапазоне? 3. Дайте характеристику спектральных свойств флавоноидов (рутин, кверцетин, дигидрокверцетин). Объясните существующие различия в характере спектров на основе их структуры. 4. Напишите цветную реакцию цианидин-хлоридной пробы (цианиновой реакции). Предположите область определения пириллиевых солей флавоноидов видимой спектроскопией. 5. Приведите статью ГФ по УФ - видимому анализу апрофена (Aprofene). Опишите особенности установления количественного определения. 33 подлинности препарата и Вариант № 4 1. При определении примеси свободной салициловой кислоты в таблетках кислоты ацетилсалициловой 0,5 г, навеску порошка растертых таблеток, равную 0,5015 г поместили в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавили 2 мл 0,2 % раствора железо-аммониевых квасцов, довели спиртом до метки, профильтровали. Оптическая плотность фильтрата, измеренная при 540 нм в кювете с толщиной слоя 50 мм, равна 0,105. Оптическая плотность раствора стандартного образца кислоты салициловой, полученного из 2 мл 0,01 % раствора в тех же условиях равна 0,262, Средняя масса таблетки 0,605 г. Сделайте заключение о качестве препарата по содержанию свободной салициловой кислоты, которой должно быть не более 0,000125, считая на среднюю массу одной таблетки, 2. Дайте характеристику УФ-спектров барбитуратов. Обоснуйте связь спектральных свойств и строения барбитуратов: барбитала, фенобарбитала, бензобарбитала, гексенала, тиопенталнатрия. 3. Напишите цветные реакции барбитуратов и обоснуйте фотометрическое определение препаратов. 4. Дать подробное описание фармакопейной методики установления подлинности и количественного анализа неостигмина метилсульфата. Вариант № 5 1. Рассчитайте удельный показатель поглощения рибофлавина в максимуме при длине волны 444 нм, если оптическая плотность раствора содержащего 1·10-5 г препарата в 1 мл, равна 0,328 при толщине поглощающего слоя 10 мм. 2. Дайте заключение о качестве лекарственной формы состава: Раствора рибофлавина 0,02 % 10 мл Кислоты аскорбиновой 0,02 г Тиамина бромида Калия йодида 0,02 г 0,3 г 34 по количественному содержанию рибофлавина, если оптическая плотность раствора, полученного разведением 0,5 мл лекарственной формы до 10 мл водой, измеренная при длине волны 445 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм, равна 0,340. Удельный показатель рибофлавина в максимуме 445 нм равен 328. 3. Дайте УФ-спектральную характеристику производных урацила (фторурацила, метилурацила, тегафура, азидотимидина). Какую информацию дают электронные спектры поглощения? Укажите связь спектральных характеристик и электронного строения. 4. Напишите цветные реакции производных урацила. Обоснуйте фотометрические методы анализа препаратов на их основе. 5. Дать характеристику фармакопейного анализа (УФ - видимая) прокаинамида гидрохлорида, метоклопрамида гидрохлорида (церукал). Вариант № 6 1. Рассчитайте содержание фурацилина в г в 200 мл раствора, если оптическая плотность стандартного раствора 0,356, оптическая плотность испытуемого раствора 0,368, концентрация стандартного раствора 0,02%. Для анализа взято по 1 мл исследуемого и стандартного растворов. 2. Какой метод фотометрии или какие цветные реакции рекомендуются для анализа цефалоспоринов? Напишите возможные схемы реакций. Обоснуйте наблюдаемые цвета веществ, основываясь на их спектрах. Какую информацию можно получить, изучая оптические свойства веществ в УФ - видимом диапазоне. 3. Укажите хромофорные группы цефалоспоринов. Объясните значение λmax в спектре цефалотина натриевой соли на основе квантово-химических представлений. 4. Дать характеристику фармакопейного анализа бензокаина, прокаина гидрохлорида, тетракаина гидрохлорида. 35 ЛИТЕРАТУРА. 1. Свердлова О.В. « Электронные спектры в органической химии. 2-е изд., перераб. – Л.: Химия, 1985 – 248 с. 2. Чекрышкина Л.А., Эвич Н.И. « Методы УФ- и ИК – спектрофотометрии в фармацевтическом анализе» Учебное пособие. Пермская фармацевтическая академия. кафедра фармацевтической химии ФДПО и заочного факультета. Пермь., 2000 – 49 с. 3. Сайдов Г.В., Свердлова О.В. « Практическое руководство по молекулярной спектроскопии»: Учебное пособие / Под ред. Бахишева Н.Г. – Л.: Издательство Ленинградского университета. 1980-136 с. 4. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР – 11-е изд., доп.- М.: Медицина, с. 32-39. 5. Международная фармакопея. – 3-е изд. – Т.1 Общие методы анализа. – Женева: ВОЗ, 1981.- с. 37-49. 36 ЭЛЕКТРОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ Учебно-методическое пособие для студентов 4 – 5 курсов фармацевтического факультета Печатается в авторской редакции Компьютерная верстка – авторская Подписано к печати ___________ Формат 60×841/16. Бумага писчая. Гарнитура «Таймс». Печать офсетная. Усл. печ. л. _____. Уч.-изд. л. ____. Тираж 300 экз. Заказ _____ Издательство Нижегородской государственной медицинской академии 603005, Н.Новгород, пл. Минина 10/1 Полиграфический участок НижГМА 603005, Н.Новгород, ул. Алексеевская, 1. 37
