УДК 636: 611-013.7: 57.086.13 ТОЙШИБЕКОВ Е.М. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДА НА МОРФОЛОГИЮ И ПРИЖИВЛЯЕМОСТЬ ЗАМОРОЖЕННО-ОТТАЯННЫХ ЭМБРИОНОВ ОВЕЦ (ЗАО Институт экспериментальной биологии им. Ф.Мухамедгалиева) Применялась методика криоконсервации эмбрионов овец с применением в качестве криопротектора диметилсульфоксида. Изучено влияние ДМСО на морфологию и приживляемость заморожено-оттаянных эмбрионов овец. Полученные данные помогут расширить научные знания о влиянии ДМСО на морфо-функциональное состояние и жизнеспособность заморожено-оттаянных эмбрионов овец. Эти исследования помогут в дальнейшем решить проблему сохранения ценных и исчезающих пород овец Казахстана. Криоконсервация эмбрионов является одним из методов сохранения биоразнообразия животных, так как влияние различных факторов привело к исчезновению как диких видов, так сельскохозяйственных пород животных [1]. Данная проблема является актуальной не только на территории Казахстана, но и во всем мире [2]. Для успешной криоконсервации необходимо изучить влияние пенетрирующих криопроекторов на морфологию и приживляемость эмбрионов. Изучение морфологии замороженно-оттаянных эмбрионов необходимо, так как замороженно-оттаянные эмбрионы, имеющие различные повреждения не способны к дальнейшему развитию и имплантации. Таким образом, морфология эмбрионов имеет прямое влияние на приживляемость эмбрионов. Научной основой применения пенетрирующих криопротекторов является их способность проникать внутрь эмбриона и защищать их от повреждающих факторов криоконсервации. К пенетрирующим криопротекторам относятся диметил-сульфоксид (ДМСО), глицерин, этиленгликоль и др. Целью настоящей работы было изучить влияние ДМСО на морфологию и приживляемость эмбрионов овец. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА Индукция суперовуляции и извлечение эмбрионов овец. В исследованиях использовали 2,5 годовалых маток казахской полутонкорунной породы овец с кроссбредной шерстью в количестве 7 голов. Суперовуляцию индуцировали инъекциями гонадотропного гормона Folligon (Intervet International, Netherland) в на 12 день эстрального цикла в дозе 1200 ИЕ. Затем вводили через 48 часов 125 мг эстрофана (Чехия) и в день оплодотворения вводили 1000 ИЕ хорионического гонадотропина (ХГч, Россия). Эмбрионы извлекали методом хирургической лапаротомии на 5-7 сутки после оплодотворения [3]. Морфологичекая оценка эмбрионов. Морфологическую оценку эмбрионов проводили по общепринятой методике с использованием фазово-контрастный микроскоп Axiostarplus с объективами Achrostigmat LD 20x и 40x (Zeiss, Germany) и фазово-контрастный микроскоп Nikon Alphaphot 2 YS2 с цифровым фотоаппаратом Nikon Coolpix 4500 с разрешающей способностью 4 Mега пкс [4]. Криоконсервация и оттаивание эмбрионов. Криоконсервацию эмбрионов проводили с использованием диметилсульфоксида (DMSO, Sigma, USA) [5]. Растворы криопроектора были приготовлены на фосфатно-солевом буфере Дюльбекко (DPBS, Sigma, USA) в различных концентрациях: 1) 0,25 М ДМСО, эмбрионы эквилибрировали в течение 5 мин.; 2) 0,5 М ДМСО (5 мин.); 3) 1,0 М ДМСО (10 мин.); 4) 1,5 М ДМСО (20 мин.). Для криоконсер-вации использовали переносной программируемый замораживатель DB1 EmbryoFreeze (Biotronics ltd, UK). Замораживание эмбрионов с криопротектором, помещенных в соломинки, проводили по следующему температурному режиму охлаждения (Рис. 1). Рисунок 1. График температурного режима замораживания. 1. Стабилизация температуры соломинок с эмбрионами в криопротекторе +200С, которая длится 5 мин; 2. Охлаждение соломинок с эмбрионами в криопротекторе до температуры –70С со скоростью охлаждения 50С/мин. 3. Точка кристаллизации достигается, когда соломинки охладятся до температуры –70С, происходит касание рамки замораживателя тех областей соломинок, где расположены эмбрионы. 4. Замораживание соломинок до температуры –300С при скорости охлаждения 0,30С/мин. 5. Замораживание соломинок до температуры –1500С, происходило при скорости охлаждения 350С/мин, после чего соломинки с замороженными эмбрионами переносятся в жидкий азот и хранятся в сосудах Дьюара до размораживания. Эмбрионы оттаивали на водяной бане от – 196оС до 20оС со скоростью 12оС/мин. Раствор криопротектора (ДМСО) удаляли в шесть этапов: вначале эмбрионы выдерживали 10 мин. В 1,5 М растворе ДМСО, а затем проводили эмбрионы по растворам с более низкими концентрациями 1,0М; 0,75М; 0,5М и 0,25М. Отмытые эмбрионы суспендировали 20 мин. в фосфатно-солевом буфере Дюльбекко при комнатной температуре. Затем эмбрионы были поделены на две группы: 1–я группа эмбрионов была подвергнута криоконсервации с применением в качестве криопроектора ДМСО, после оттаивания эти эмбрионы были оцене-ны по морфологическим признакам и кратковременно культивированы in vivo до 12 часов в организмах двух промежуточных реципиентов (маток той же породы, что и матки доноры, синхронные по эстральному циклу). После кратковременного культивирования была проведена морфологическая оценка замороженно-оттаянных культивированных эмбрионов и эмбрионы, признанные годными были трансплантированы реципиентам [6]; 2-я группа эмбрионов также была подвергнута криоконсервации с применением в качестве криопроектора ДМСО, после оттаивания эти эмбрионы были оценены по морфологическим признакам и трансплантированы реципиентам. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Индукция суперовуляции и извлечение эмбрионов овец. В ходе эксперимента были получены следующие данные: у 7 подопытных маток-доноров была индуцирована суперовуляторная реакция, в результате которой путем хирургической лапаратомии было извлечено 63 зародыша на различных стадиях развития (Табл. 1). Таблица 1.Влияние гонадотропинов на количество и качество эмбрионов (Folligon (Intervet Из общего количества вымытых зародышей, были признаны пригодными для криоконсервации и дальнейшей трансплантации 42 эмбриона, находящихся на стадии развития – морула, что составило 66,6% от общего количества вымытых зародышей. Затем, эмбрионы были поде-лены на две группы, 1-я группа эмбрионов составила 22 эмбриона, 2-я группа 20 эмбрионов. Криоконсервация и оттаивание эмбрионов. Криоконсервацию обеих групп эмбрионов проводили по вышеописанной методике. В результате замораживания-оттаивания были получены следующие результаты. В 1-ой группе были заморожены 22 эмбриона, после оттаивания (через 10-15 суток после замораживания) и морфологической оценки были признаны годными для дальнейшего кратковременного культивирования in vivo 14 эмбрионов, что составило 63,6% от общего количества замороженных эмбрионов в 1-ой группе, потери составили 8 эмбрионов (36,4%). Во 2-ой группе из 20 эмбрионов были признаны годными 13 эмбрионов (65%) и признаны непригодными для дальнейшей трансплантации 7 эмбрионов (35%) (Табл.2). Таблица 2. Морфологическая оценка количества и качества замороженно-оттаянных эмбрионов из различных групп Эти показатели достаточно близки и позволяют сделать заключение о том, что применение 1,5М ДМСО в качестве криопротектора, примененный температурный режим охлаждения и оттаивания, а также удаления ДМСО из эмбрионов позволили получить достаточно высокий выход жизнеспособных эмбрионов для трансплантации. Тринадцать эмбрионов 2-ой группы, признанные годными были трансплантированы по одному реципиентам, для изучения приживляемости. Четырнадцать эмбрионов 1-ой группы, признанные пригодными для дальнейшей трансплантации, были кратковременно культивированы in vivo, до 12 часов в промежуточных реципиентах. Промежуточные реципиенты в количестве 2 овцематок были той же породы, что и овцематки-доноры эмбрионов. Реципиенты были подобраны по соответствию их половых циклов срокам развития эмбрионов. Эмбрионы подсаживали хирургическим путем в рога матки со стороны овуляции. Таким образом, гормональный фон рога матки соответ-ствовал стадии развития эмбриона и создавал наиболее благоприятные условия для дальней-шего развития и имплантации эмбрионов. Затем эмбрионы были извлечены, и нами была проведена морфологическая оценка замороженно-оттаянных культивированных эмбрионов. В результате этих исследований нами было выявлено, что из 14 эмбрионов, подвергшихся кратковременному культивированию, были признаны годными для дальнейшей трансплантации 9 эмбрионов, что составило 40,1% от общего количества замороженных 22 эмбрионов 1ой группы. Также нами были признаны непригодными 5 эмбрионов (22,7%) от общего количества замороженных 22 эмбрионов. Девять эмбрионов были трансплантированы реципиентам. Исходя из изложенного, нами были проведены исследования, позволившие уменьшить риски по трансплантации замороженно-оттаянных эмбрионов, так как проведенные нами изучение морфологии эмбрионов и кратковременное культивирование позволило избежать трансплантации заведомо нежизнеспособных эмбрионов. Изучение приживляемости замороженно-оттаянных эмбрионов. Приживляемость эмбрионов из различных групп проводилось на основе проверки суягности овцематок-реципиентов по наличию эструса в следующих половых циклах, т.е. отсутствие эструса в следующих половых циклах свидетельствовало о суягности овцематок-реципиентов и имплантации трансплантированных эмбрионов. Из общего количества реципиентов, которым были трансплантированы замороженнооттаянные культивированные эмбрионы 1-ой группы, у 8 голов реципиентов не было выявлено стадии эструса в следующих двух половых циклах, что свидетельствует о нормальной суягности и имплантации трансплантированных эмбрионов, а во 2-ой группе - у 6 голов. Таким образом, был выявлен процент приживляемости, на основе проверки суягности по группам: 1-я группа – 36,4% от общего количества 22 замороженных эмбрионов, 2-я группа – 30,0% от общего количества замороженных 20 эмбрионов (Табл. 3). Таблица 3. Изучение приживляемости замороженно-оттаянных эмбрионов Таким образом, исходя из проведенных исследований, нами была выявлена закономер-ность, которая заключается в том, что кратковременное культивирование in vivo заморожен-нооттаянных эмбрионов позволяет увеличить приживляемость замороженно-оттаянных эмбрионов при их дальнейшей трансплантации за счет отсева нежизнеспособных эмбрионов. А также появилась необходимость разработки и совершенствования методов культивирования эмбрионов in vivo и in vitro для использования в исследованиях по криоконсервации эмбрионов. ЛИТЕРАТУРА 1. Morand-Fehr P., Boyazoglu J. Present state and future outlook of the small ruminant sector // Small Ruminant Research. 1999. V.34. P.175-188. 2. Solti L., Crichton E.G., Loskutoff N.M., Cseh S. Economical and ecological importance on indigenous livestock and the application of assisted reproduction to their preservation // heriogenology 2000. V.53. P.149-162. 3. МухамедгалиевФ.М., ТойшибековМ.М. и др. Трансплантация эмбрионов в племенном овцеводстве. Алматы, Изд-во «Наука». 1981. 169с. 4. ТойшибековМ.М., Даминов Б. Трансплантация эмбрионов каракульских овец. // В кн. Генетика и биотехнология животных. Алматы. 1998. C.19-23. 5. Kaidi S., Donnay I., Lambert P. Osmotic behavior of in vitro produced bovine blastocysts in cryoprotectant solutions predictive test of survival // Cryobiology. 2000. V.41. P.106-115. 6. ДаминовБ. Повышение приживляемости ранних эмбрионов овец при трансплантации путем отбора их жизнеспособности методом культивирования // Извест.АН КазССР, сер. биол. 1990. №2. С.81-87. *** Автор диметилсульфоксид криопротекторын пайдалана отырып, ºой эмбриондарын криоконсер-вация т¸сілін пайдаланды. М½здатылып ерітілген ºой эмбриондарыны» ¼сіп ¼німділік ж¸не морфо-логиялыº ºалыптасты¹ына диметилсульфоксидті» тигізетін ¸серлері зерттелді. ²азаºстанда¹ы ба¹алы ºой т½ºымдарын жоймай, оларды саºтап ºалуда¹ы ¹ылыми зерттеулерді ке»ейте т¾седі. *** The author applied a technique of sheep embryos cryopreservation with application dymethilsulphxide. Influence DMSO on morphology is investigated and development frozen-thawed sheep embryos. The received data will help to expand scientific knowledge of influence DMSO on the morphological condition and viability frozen -thawed sheep embryos. These researches will help with further to solve a problem of preservation of valuable and disappearing sheep breeds of the Kazakhstan.