Молекулярные технологии

R
ТС/40/9
ОРИГИНАЛ: английский
ДАТА: 8 января, 2004 г.
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СОЮЗ ПО ОХРАНЕ НОВЫХ СОРТОВ РАСТЕНИЙ
ЖЕНЕВА
ТЕХНИЧЕСКИЙ КОМИТЕТ
Сороковая сессия
Женева, 29 – 31 марта 2004 г.
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
Документ подготовлен Бюро Союза
1.
На своей тридцать девятой сессии, состоявшейся в Женеве 7 – 9 апреля 2003 г.
Технический Комитет (ТС) обсудил предложение Технического Рабочего Органа по
плодовым культурам (TWF) о подготовке документа о потенциальном использовании
молекулярных маркеров в экспертизе ООС. Было согласовано, что Бюро Союза в
сотрудничестве с председателями ТС и Рабочей группы по биохимическим и
молекулярным технологиям и частичному профилированию ДНК (ВМТ) воспользуется
существующими материалами и, в частности, документом TC/38/14 ADD.-CAJ/45/5
ADD., чтобы подвести итог текущему положению дел, которое было бы обсуждено ТС
на сороковой сессии, планируемой к проведению весной 2004 г. ТС затем обсудил бы,
следует ли привлекать Административный и Законодательный Комитет (CAJ) к
изучению этого документа.
2.
Приложение к настоящему документу содержит проект документа о
потенциальном использовании молекулярных маркеров в экспертизе ООС, который
был подготовлен в соответствии с запросом ТС.
ТС предлагается:
(а) дать комментарий на Приложение к настоящему
документу.
(b) решить, следует ли задействовать CAJ для
изучения документа; и
(c) согласовать, может ли документ использоваться
как подводящий итог текущей позиции УПОВ.
7.
[Приложение следует]
D:\681468693.doc
ТС/40/9
ПРИЛОЖЕНИЕ
Ситуация в УПОВ, касательно
потенциального использования молекулярных маркеров в экспертизе ООС
1.
ВВЕДЕНИЕ
Цель настоящего документа состоит в разъяснении ситуации в УПОВ
относительно возможности использования молекулярных маркеров в испытаниях
отличимости, однородности и стабильности (ООС). Документ начинается с
разъяснений требований по экспертизе ООС, вслед за этим следует краткий обзор
относящихся к делу молекулярных технологий, и в заключении – пояснение текущего
положения дел в УПОВ в отношении потенциального использования молекулярных
маркеров в экспертизе ООС.
ЭКСПЕРТИЗА ООС
…
Общее введение и признаки как основа для экспертизы ООС
…
2.2.5 Следует отметить, что не существует требования, согласно которому признак
должен обладать некоторой присущей ему коммерческой ценностью или качеством.
Однако, если признак, несущий коммерческую ценность или качество, удовлетворяет
всем критерием для включения, он может рассматриваться в обычном порядке.
…
2.
3.
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
3.1
Растительный геном
3.1.1 ДНК растения располагается в ядрах и органеллах (хлоропласты и митохондрии).
Ядро содержит около 109 пар оснований (base pairs – bp), в то время как хлоропласт –
150 000 пар, или 150 к(ило)пар (kb) и митохондтрия – 220-2500 kb. Хлоропластовая и
митохондриальная ДНК очень консервативны и кодируют сравнительно небольшое
число генов.
3.1.2 В среднем ген насчитывает 4 kb. Однако 2% ДНК в ядрах существует в форме
генов, кодирующих клеточные компоненты, и среднее число таких «кодирующих»
генов составляет от 15000 до 50000. Остающиеся 98% ДНК существуют в форме не
кодирующих ДНК-последовательностей. Эта не кодирующая ДНК может быть в форме
повторяющихся ДНК последовательностей, либо цепочек повторностей (повторяемых
последовательностей, одна за другой), или дисперсных повторностей (повторяемые
последовательности, разбросанные по геному). Цепочки повторностей не кодирующей
ДНК известны под названием сателлитной ДНК.
3.1.3 Большинство генов встречаются в геноме лишь один раз, и известны как гены с
одной копией. В случае диплоидов хромосомы присутствуют в гомологических парах,
где каждая хромосома содержит свою версию гена, известную под названием аллель.
Если две версии гена, т.е. аллели, одинаковы, то растение гомозиготно по этому гену,
но если аллели – разные, то растение гетерозиготно по этому гену.
3.2
Полиморфизм
ТС/40/9
Приложение, стр. 2
3.2.1 Изменчивость ДНК (полиморфизм) может наблюдаться при обрезке, или
«переваривании» ДНК, ограничительными ферментами. Ограничительные ферменты
способны распознавать определенные последовательности из 4 – 6 нуклеотидов
(ограничительные участки) и разрезать ДНК внутри или рядом с этими
последовательностями. Любая мутация, произошедшая на этих ограничительных
участках, делает фермент неспособным к распознаванию и, следовательно, к
разрезанию последовательности. Таким образом, ограничительные участки будут
отличаться, и разные растения могут производить ограничительные фрагменты
(фрагменты ДНК, полученные после работы ограничительного фермента) различных
размеров.
3.2.2 Для разделения ограничительных фрагментов на геле может использоваться
электрофорез, - в соответствии с их размерами, и тем самым давая спектр, характерный
для каждой конкретной ДНК. Однако, ядерные ДНК производят сотни тысяч полос
каждого размера, полученного после расщепления, давая пятна на геле. В методе RFLP
(Restriction Fragment Length Polimorphism – полиморфизм по длине вырезанного
фрагмента) используется тот факт, что нити дополняющей ДНК спонтанно
связываются друг с другом. «Проба», состоящая из конкретной ДНКпоследовательности, добавляется в гель и оставляется для связывания (гибридизации) с
подходящей ей последовательности в пятне. Если проба до гибридизации была
помечена радиоактивным или биохимическим способом, можно будет локализовать
конкретную последовательность ДНК в геле. Пробы могут быть разных типов:
геномная ДНК (гДНК), дополняющая ДНК (дДНК) или синтетические ДНКпоследовательности. Пробы могут использоваться для изучения единственного локуса
(участка гена на хромосоме) или множества локусов.
3.2.3 Полиморфизм наблюдается на монолокусных пробах, главным образом, из-за
мутаций в обрезанных участках, приводящих к различиям в длине обрезанных
фрагментов.
И наоборот, мультилокусные пробы, которые обычно являются
сателлитной ДНК, обнаруживают другой тип изменчивости вследствие различий в
числе повторностей конкретных последовательностей исследуемой ДНК. В сравнении
с монолокусными пробами, мультилокусные пробы дают более сложные спектры. Они
дают больше информации на гель, являются ко-доминантными (т.е. все аллели
выражены) и наследуются по Менделю.
3.2.4 Еще один подход основан на технике, известной под названием PCR (Polymerase
Chain Reaction – цепная реакция полимеризации), в результате которой особые части
генома умножаются полимеразным ферментом и затем могут быть визуализированы на
геле. Этот метод требует, во-первых, чтобы была известна ДНК-последовательность
двух концов этой особой части ДНК, и, во-вторых, для того чтобы эта полимераза
могла умножать часть ДНК, должны быть созданы две дополняющих
последовательности (праймеры) для двух концов – «включатель» и «выключатель».
3.2.5 Полиморфизм в умноженных продуктах может возникнуть либо из-за мутации в
последовательности, гибридизирующейся с праймером, либо из-за мутации между
двумя праймерами.
3.2.6 Некоторые, основанные на PCR методы, (напр., RAPD – Random Amplified
Polymorphic DNA – умножение случайных участков ДНК и AFLP – Amplified Fragment
Length Polymorphism – полиморфизм длины умноженных фрагментов) не требуют
предварительной информации о подлежащей умножению ДНК. В качестве праймеров
ТС/40/9
Приложение, стр. 3
используются две случайные последовательности длиной от 10 до 20 оснований. Если в
геноме существуют дополняющие последовательности, и если они расположены не
слишком далеко друг от друга, то участок ДНК между этими праймерами умножается.
Иногда обнаруживаются множество дополняющих последовательностей, так что
электрофорез умноженных фрагментов дает «отпечаток», который может быть высоко
полиморфным.
3.2.7 Технология PCR также используется для исследования полиморфизма
«микросателлитов»
путем
использования
«микросателлитных
маркеров».
Микросателлиты – это короткие последовательности, длиной в 2-5 оснований,
повторяющиеся множество раз и граничащие с уникальными (кодирующими)
последовательностями ДНК. Полизморфизм обычно обнаруживается как разница
длины умножаемой последовательности. Разница в длине может быть очень мала,
например, две пары основания.
3.2.8 Самый частый тип генетических вариаций – полиморфизмы одного нуклеотида
(SNPs – single nucleotide polymorphisms), который заключается в мутациях,
вызывающих изменение одного основания в молекуле ДНК. Например, может быть
изменена ДНК последовательность с ATCTG на ACCTG. SNPs могут быть обнаружены
с применением высокопроизводительных методов скрининга (выбраковывания), таких
как «генные чипы» или микромассивы. В подобных методах несколько различных
последовательностей ДНК располагаются на матрице (напр., стеклянной) и
выдерживаются
с
образцами
растительной
ДНК.
Дополняющие
ДНКпоследовательности, если они присутствуют в растительной ДНК, будут
гибридизироваться с конкретной последовательностью и могут наблюдаться, например,
путем флуоресценции.
3.2.9 Качества упомянутых выше методов находятся под воздействием контекста, в
котором методы используются. В следующем разделе рассматривается использование
молекулярных технологий в экспертизе ООС.
4.
ОБСУЖДЕНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В
ЭКСПЕРТИЗЕ ООС
3.1
Вопросы, подлежащие обсуждению
4.1.1 УПОВ следит за прогрессом молекулярных технологий, и уже обсуждал, какую
роль, если таковая обнаружится, могли бы играть подобные технологии в экспертизе
ООС. В качестве точки отсчета при таких рассмотрениях признавалось, что всякие
новые методы должны будут согласовываться с Конвенцией УПОВ. К тому же,
признавалось, что практикуемые в настоящее время методы проведения экспертизы
ООС весьма эффективны и гарантируют, что охрана, предлагаемая по системе УПОВ,
обладает высокой ценностью. Следовательно, было бы нежелательно вводить новые
методы, которые бы оказали негативное воздействие на силу охраны в сравнении с той,
что обеспечивается текущими методами оценки, и тем самым подрывать
эффективность охраны, предлагаемой по системе УПОВ. В этой связи отмечалось, что
молекулярные технологии могут обнаруживать очень малые отличия на уровне ДНК,
которые могут быть не отражены в признаках из методик. Так, отмечалось, что сорта,
которые признавались неотличимыми с использованием признаков из методик, могут
посчитаться отличимыми при использовании молекулярных технологий.
ТС/40/9
Приложение, стр. 4
4.1.2 Тем не менее, УПОВ признавал, что как и для всех новых методов, важно
рассмотреть потенциальные преимущества использования подобных технологий в
экспертизе ООС, если озабоченности удастся учесть удовлетворительным способом. В
частности, было очевидно, что технологии весьма ускоряют экспертизу ООС и, повидимому, меньше подвержены воздействию окружающей среды, в которой
выращивается сорт. Одновременно с обсуждением потенциала технологий было также
признано, что, как и для всех методов экспертизы ООС, существенным является
изучение надежности этих технологий на техническом уровне и гарантирование, что
все методы будут разрабатываться согласованным путем.
4.1.3 Таким образом, очевидно, что есть вопросы, подлежащие обсуждению как на
техническом, так и на административном и правовом уровнях. В следующем разделе
поясняется, как УПОВ учитывает эти различные аспекты.
4.2
Процедура рассмотрения молекулярных технологий
4.2.1 В качестве первого шага в рассмотрении разных аспектов, связанных с
молекулярными технологиями, УПОВ образовал Рабочую группы по биохимическим и
молекулярным технологиям и частичному профилированию ДНК (ВМТ). ВМТ
является группой, открытой для экспертов, проводящих ООС, биохимиков и
селекционеров растений, и играет роль органа, предназначенного для обсуждения
технических аспектов молекулярных технологий, как изложено в Appendix 1. Кроме
того, созданы целевые подгруппы по культурам для обсуждения разработок на
специфическом уровне культур. Роль подгрупп по культурам состоит в подготовке
документов и формулировании предложений, которые могут служить основой для
дальнейших дискуссий на ВМТ, Технических рабочих органах и ТС.
4.2.2 Для того чтобы гарантировать, что все разработки, касающиеся потенциального
использования молекулярных технологий рассматриваются с учетом их более
широкого воздействия на УПОВскую систему охраны сортов растений, УПОВ основал
целевую Подгруппу технических и правовых экспертов по биохимическим и
молекулярным технологиям («Группа обзора ВМТ»). Роль Группы обзора ВМТ состоит
в оценке потенциального использования моделей, предложенных ТС на основе работы
ВМТ и подгрупп по культурам, с целью приложения биохимических и молекулярных
методов к экспертизе ООС в разрезе:
(а) соответствия Конвенции УПОВ и
(b) потенциального воздействия на усиление охраны в сравнении в той, что
обеспечивается текущими методами проведения экспертизы, и совета, может ли это
подорвать эффективность охраны, предлагаемой по системе УПОВ.
4.2.3 Группа обзора ВМТ отчитается о своей оценке, как изложено выше,
Административному и Законодательному Комитету и ТС, но эта оценка не будет
довлеть на позицию этих Комитетов.
4.3
Текущий статус молекулярных технологий
4.3.1 Предложения, обсуждаемые Группой обзора ВМТ
По запросу ТС Группа обзора ВМТ рассмотрела следующие варианты, разработанные
подгруппами по культурам и самой ВМТ, на основе детальных предложений,
ТС/40/9
Приложение, стр. 5
представленных соответствующими членами Союза, как дано в Appendix 2 к
настоящему документу:
Вариант 1: Молекулярные признаки как предсказатели традиционных признаков
(а) Использование молекулярных признаков, которые непосредственно
связаны с традиционными признаками (ген-специфические маркеры)
Вариант 2: Калибрация пороговых уровней для молекулярных признаков по
минимальному расстоянию у традиционных признаков
Вариант 3: Разработка новой системы
4.3.2 Рекомендации группы обзора ВМТ
4.3.2.1 Группа обзора ВМТ сделала следующие выводы:
Предложение по Варианту 1(а) (Ген-специфический маркер фенотипического
признака) состояло в том, что оно на основе допущений в предложении, оно
приемлемо в терминах Конвенции и не будет подрывать эффективность охраны,
предложенной по системе УПОВ.
Предложение по Варианту 2 (Калибрация пороговых уровней для молекулярных
признаков по минимальному расстоянию у традиционных признаков у
масличного рапса, кукурузы и розы соответственно) при использовании для
ведения реферативных коллекций состояло в том, что на основе допущений в
предложении, оно приемлемо в терминах Конвенции УПОВ и не будет подрывать
эффективность охраны, предложенной по системе УПОВ.
Относительно предложений по Варианту 3 применительно к розе и пшенице,
отмечено отсутствие консенсуса о приемлемости этих предложений в терминах
Конвенции УПОВ, и нет консенсуса о том, будет ли подорвана эффективность
охраны, предлагаемой по Конвенции УПОВ. Высказаны озабоченности, что в
этих предложениях, с использованием данного подхода, окажется возможным
использовать неограниченное число маркеров для поиска различий между
сортами. Также высказано беспокойство, что различия будут обнаруживаться на
генетическом уровне, которые не были отражены в морфологических признаках.
4.3.2.2 Были сделаны также общие замечания. Во-первых, выражено беспокойство
относительно приемлемости методов, охватываемых патентами. Во-вторых, Группа
обзора ВМТ подчеркнула важность рассмотрения, будет ли наличествовать выигрыш
по стоимости в результате применения новых подходов. В-третьих, обсуждалась
важность взаимосвязи между фенотипическими признаками и молекулярными
технологиями. Наконец, была подчеркнута важно изучения однородности и
стабильности на тех же самых признаках, которые используются для оценки
отличимости.
4.3.3. Мнение ТС и СAJ относительно рекомендаций группы обзора ВМТ
4.3.3.1 ТС рассмотрел выводы Группы обзора ВМТ и согласился с заключениями, а
именно, что предложения по Вариантам 1(а) и 2 могли бы быть приняты на основе
ТС/40/9
Приложение, стр. 6
допущений, в то же время, признавая необходимость дальнейшей работы по изучению
этих допущений, и в случае Варианта 2 – по усилению взаимосвязи между
морфологическими и молекулярными расстояниями. Также отмечен разброс мнений,
которые были высказаны в отношении предложений из Варианта 3.
4.3.3.2 CAJ согласился с заключениями Группы обзора ВМТ и принял мнение ТС.
4.4
Ведущиеся разработки
4.4.1 В разделе 4.3 изложена текущая позиция УПОВ в отношении молекулярных
технологий. Однако ситуация постоянно отслеживается в свете текущих разработок,
касающихся молекулярных технологий, и потребности разрабатывать подходящие
молекулярные методы с учетом текущей позиции. В частности, текущая работа может
быть подытожена следующим образом:
(а) Разработка улучшенных предложений по Варианту 1(а), где оценивались бы
допущения и вопросы стоимости, и были учтены вопросы применимости и
однородности и стабильности. Такие улучшенные предложения подлежат обсуждению
соответствующими подгруппами по культурам, Группой обзора ВМТ, ТС и CAJ;
(b) Разработка улучшенных предложений по Варианту 2, где оценивались бы
допущения и вопросы стоимости, и были учтены вопросы применимости и
однородности и стабильности, и было улучшена взаимосвязь между морфологическими
и молекулярными расстояниями. Такие улучшенные предложения подлежат
обсуждению соответствующими подгруппами по культурам, Группой обзора ВМТ, ТС
и CAJ;
(с) Рассмотрение новых предложений по Варианту 1, 2 или 3 со стороны ВМТ,
соответствующими подгруппами по культурам, Группой обзора ВМТ, ТС и CAJ;
(d) Подгруппам по культурам продолжить обсуждение разработок на культуроспецифическом уровне с образованием новых подгрупп по мере необходимости; и
(е) ВМТ продолжить отслеживание эволюции молекулярных технологий и
разрабатывать руководства и способствовать гармонизации в отношении
использования молекулярных методов.
4.4.2 Настоящий документ будет обновляться для отражения всех существенных
изменений.
Далее следуют приложения.