Применение тонкослойной хроматографии для исследования липофильных пигментов растений

Применение тонкослойной хроматографии для
исследования липофильных пигментов растений
Автор: Крепак Алексей Игоревич
Белгородский инженерный
юношеский лицей-интернат, 10 класс
Научный руководитель:
Дьяченко Валентина Ивановна
Белгородский инженерный
юношеский лицей-интернат, учитель
химии
г. Белгород, 2013
Содержание:
Введение ………………………………………………………………………………………..3
1.Обзор литературы
1. 1.Хроматография……………………………………………………………………………..4
1.1.1. История открытия………………………………………………………………………...4
1.1.2. Основы метода ТСХ ………………………………………………………………..........4
1.1.3. Выбор сорбента и растворителя………………………………………………………....5
1.1.4. Идентификация разделенных веществ………………………………………………….7
1.2. Растительные пигменты…………………………………………………………………...7
1.2.1. Хлорофиллы………………………………………………………………………………8
1.2.2. Каротиноиды……………………………………………………………………………...8
2. Экспериментальные исследования…………………………………………………………..9
2.1. Выделение пигментов из растительного сырья…………………………………………...9
2.2. Разработка ТСХ методики………………………………………………………………...10
2.2.1. Выбор подвижной фазы…………………………………………………………………10
2.2.2. Определение устойчивости пробы при хроматографировании………………………13
2.2.3. Идентификация пигментов……………………………………………………………...13
2.3. Анализ экстрактов разных растений…...………………………………………………...14
Выводы …………………………………………………………………………………………14
Заключение……………………………………………………………………………………...15
Приложения…………………………………………………………………………………….16
Список использованных источников…………………………………………………………20
Введение.
Впервые точное представление о пигментах зеленого листа высших растений было
получено благодаря работам крупнейшего русского ботаника М.С. Цвета (1872-1919). Он
разработал новый хроматографический метод разделения веществ и выделил пигменты
листа в чистом виде. Хроматографический метод разделения веществ основан на их
различной способности к адсорбции. В настоящее время этот метод получил широкое
применение для качественного и количественного анализа растительного сырья и является
общепринятым фармакопейным методом.
Оптимизация разделения сложных смесей веществ является важнейшим этапом
разработки
новых
методик
анализа
органических
соединений,
таких
как
фармацевтические препараты, биологически-активные компоненты природного сырья и
т.д. [1].
Растительные пигменты – это красящие вещества, придающие цвет растениям. В
растительных клетках чаще всего встречаются зеленые пигменты хлорофиллы, красные и
синие антоцианы, желтые флавоноиды, желто-оранжевые каротиноиды и темные
меланины. Основными пигментами зеленого листа являются хлорофиллы и каротиноиды.
Пигменты, содержащиеся в растительном сырье, играют важную роль в жизни
растений, оказывают влияние на фармакологическую активность и побочные действия.
Поэтому изучение веществ растительного сырья важно для расширения сведений о
химическом составе растений и для получения экстрактов с ожидаемым комплексом
биологически активных и сопутствующих веществ. В последнее время растительные
пигменты активно используются в качестве пищевых добавок и экологически безопасных
пищевых красителей.
Гипотеза – если спиртовые экстракты растительного сырья содержат различные
пигменты,
то
их
можно
разделить
хроматографическим
методом.
Такую
хроматографическую методику можно использовать для подтверждения подлинности
продуктов, содержащих растительные пигменты (пищевых красителей и добавок,
лекарственных и косметических средств и т.д.).
Объект исследования – растительное сырье (листья растений).
Предмет исследования – растительные пигменты хлорофиллы и каротиноиды.
Цели и задачи исследования:
- изучить литературные данные о свойствах липофильных растительных пигментов
(хлорофиллов и каротиноидов) и о хроматографических методах их разделения;
- изучить порядок разработки ТСХ методики анализа;
- исследовать влияние состава подвижной фазы на степень разделения пигментов на хро-
3
матограмме;
- выбрать оптимальные условия хроматографирования;
- подтвердить устойчивость пробы при хроматографировании;
- провести идентификацию хлорофиллов и каротиноидов на хроматограмме;
- получить спиртовые экстракты хлорофиллов и каротиноидов из листьев разных
растений;
- получить хроматограммы спиртовых экстрактов разных растений;
- проанализировать полученные результаты.
1. Обзор литературы
1.1. Хроматография
Хроматография – процесс, основанный на многократном повторении актов
сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль
неподвижного сорбента. Разделение сложных смесей хроматографическим способом
основано на различной сорбционной способности компонентов смеси [2].
1.1.1. История открытия
Хроматография впервые была введена в аналитическую практику русским
ботаником М.С. Цветом. Открытие хроматографии относится к периоду между 1900 и
1903 годами. В первых же работах с помощью этого метода М.С. Цвет установил, что
считавшийся однородным зеленый пигмент растений хлорофилл на самом деле состоит из
нескольких веществ. При пропускании экстракта зеленого листа через колонку,
заполненную порошком мела, и промывании петролейным эфиром он получил несколько
окрашенных зон, что несомненно говорило о наличии в экстракте нескольких веществ.
Этот метод он назвал хроматографией, хотя сам же указал на возможность разделения и
бесцветных веществ [2].
Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), получивший в настоящее время
широкое распространение, был разработан Н.А. Измайловым и М.С. Шрайбер в 1938 г.
1.1.2. Основы метода ТСХ
В методе ТСХ неподвижная твердая фаза тонким слоем наносится на стеклянную,
металлическую или пластмассовую пластинку. В 2–3 см от края пластинки на стартовую
линию вносят пробу анализируемой жидкости и край пластинки погружают в
растворитель. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя
сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их
разделению [2].
4
1.1.3. Выбор сорбента и растворителя
В качестве сорбента в ТСХ применяют силикагели, оксид алюминия, крахмал,
целлюлозу. Наиболее распространенным сорбентом является силикагель. Силикагель гидратированная кремниевая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот
на силикат натрия. Силикагель является полярным сорбентом, у которого активными
центрами являются группы -ОН. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует
водородные связи [2].
При выборе растворителя можно пользоваться так называемой схемой Шталя
(Рис.1).
Рис. 1.Схема Шталя для выбора сорбента и растворителя.
При вращении треугольника, расположенного в центре схемы, один из его углов
указывает на полярность разделяемых веществ, второй - на необходимую полярность
растворителя, третий - на активность сорбента. Например, если разделяемые вещества
имеют слабую полярность, то для разделения необходимо применять активный сорбент и
слабополярный или неполярный растворитель [3].
Адсорбционная способность функциональных групп возрастает в следующем
порядке [4]:
CH=CH<OCH3<COOR<C=O<CHO<SH<NH2<OH<COOH.
При разработке новой хроматографической методики наиболее продуктивным
способом разделения компонентов является оптимизация состава подвижной фазы. До сих
пор подбор оптимальных условий разделения разноплановых по химическому строению
смесей органических соединений методами хроматографии специалисты относят к
области изящного искусства с элементами творческой интуиции [4]. Но в последнее время
для этих целей все шире начинают применяться хемометрические методы [1].
Для вытеснения (элюирования) веществ должен применяться растворитель,
адсорбирующийся прочнее, чем эти вещества. Различные растворители обладают разной
элюирующей способностью, которая характеризуется полярностью и элюирующей
5
силой (Таблица 1) [5].
Таблица 1. Полярность и элюирующая сила растворителей.
Растворитель
Гексан
Бензол
Дихлорметан
Пропанол -2
Этилацетат
Метанол
Ацетон
Ацетонитрил
Вода
Полярность, Р
0,1
2,7
3,1
3,9
4,4
5,1
5,1
5,8
10,2
Элюирующая
способность,
ε0 (SiO2)
0,01
0,25
0,30
0,55
0,48
0,70
0,50
0,60
1,50
Группа
селективности
Снайдеру
VII
V
II
VIa
II
VIa
VIб
VIII
по
Растворители, применяемые в хроматографии, можно разделить на несколько
групп в соответствии с их протоно-донорными и протоно-акцепторными свойствами классификация Л.Р. Снайдера (Рис. 2).
Рис. 2. Классификация растворителей по Л.Р.Снайдеру.
Кругами с римскими цифрами выделены области, в которых группируются растворители
по селективности. Хе – способность к протонодонорным взаимодействиям, Хd –
способность к протоноакцепторным взаимодействиям, Хn – способность к дипольдипольным взаимодействиям.
Группы были пронумерованы следующим образом: I группа – диалкилэфиры; II –
алканолы; III - производные пиридина, тетрагидрофуран; IV - гликоли, уксусная кислота;
V - дихлорметан, 1,2-дихлорэтан; VI – диалкилкетоны, сложные эфиры; VII группа ароматические углеводороды и их производные; VIII группа - фторалканолы, вода.
6
Важное практическое следствие из такой классификации состоит в том, что если
какой-либо
растворитель,
например
этилацетат,
не
обеспечивает
приемлемой
хроматографической селективности, маловероятно, что другой растворитель из этой же
группы сможет ее обеспечить [5].
В тонкослойной хроматографии в качестве подвижной фазы используют либо
чистые вещества, либо смеси веществ в определенном соотношении (системы). Наиболее
популярным базовым растворителем в нормально-фазной хроматографии является гексан.
Гексан не обладает большой хроматографической активностью на силикагеле, поэтому
применяется
в
сочетании
с
модификаторами
(пропанол-2,
этилацетат,
галогенпроизводные углеводородов).
1.1.4. Идентификация разделенных веществ.
Высушенная пластинка является хроматограммой исследуемых веществ. Если
вещества являются окрашенными, то идентификация начинается с определения цвета
разделенных веществ. Для тонкослойной хроматографии существует несколько видов
качественного анализа (идентификации) разделенных веществ:
1. Физические методы.
Визуальные методы используются для определения местоположения пятен разделенных
веществ. Для этого пластинку рассматривают как в видимом свете, так и используя
ультрафиолетовый свет (в основном свет с длиной волны 365 и 254 нм).
2. Значение Rf.
Одним из основных показателей в ТСХ является показатель Rf.
Rf = х / хf , где х – смещение зоны компонента; хf – смещение фронта растворителя.
Значение Rf - величина безразмерная и имеет значение от 0 до 1.
3. Цветные реакции.
Цветные реакции служат не только для определения местоположения разделенных
компонентов, но и для определения как класса веществ, так и точной идентификации (при
наличии индивидуальных реакций).
4. Сравнение со свидетелем.
Самым надежным является метод свидетелей, когда на стартовую линию рядом с пробой
наносятся индивидуальные вещества, соответствующие компонентам смеси [2].
1.2. Растительные пигменты.
Растительные пигменты – это крупные органические молекулы, поглощающие свет
определенной длины волны. В большинстве случаев «ответственными» за появление ок7
раски являются определенные участки этих молекул, называемые хромофорами.
1.2.1. Хлорофиллы.
Самым главным пигментом растений, который обусловливает их принадлежность к
отдельному зеленому царству, является, конечно же, хлорофилл. Хлорофи́лл (от греч.
χλωρός, «зелёный» и φύλλον, «лист») — зелёный пигмент, обусловливающий окраску
хлоропластов растений. При его участии осуществляется процесс фотосинтеза.
Хлорофиллы имеют порфириновое строение и структурно близки гему [6].
Рис.3. Структурная формула хлорофилла.
В клетках всех высших растений имеется только две формы хлорофилла – зеленый
с синеватым оттенком - хлорофилл а и зеленый с желтоватым оттенком - хлорофилл b.
Бурые водоросли, кроме того, содержат хлорофилл с, а красные – хлорофилл d.
Спиртовой раствор хлорофилла имеет голубовато-зеленый цвет с темно-красной
флуоресценцией (хлорофилл а) или цвет от зеленого до желто-зеленого с красной
флуоресценцией (хлорофилл b). Этим способом можно идентифицировать хлорофиллы.
При взаимодействии со слабой кислотой извлеченный хлорофилл образует
соединение феофитин, у которого атом магния в центре молекулы замещен на два атома
водорода, и теряет зеленый цвет.
1.2.2.Каротиноиды
Каротиноиды (от лат. carota — морковь и греч. eidos — вид) — природные
органические пигменты, которые получаются в процессе фотосинтеза в бактериях, грибах,
водорослях и высших растениях.
Каротиноиды содержатся практически во всех органах растений: в цветках,
листьях, плодах и семенах. Каротиноиды нерастворимы в воде, но хорошо извлекаются из
пластид органическими растворителями (бензин, спирт).
Каротин — жёлто-оранжевый пигмент, непредельный углеводород из группы
каротиноидов.
8
Рис.4. Стуктурная формула β-каротина.
Эмпирическая формула каротина С40H56. Содержится в листьях всех растений, а также в
корне моркови, плодах шиповника и др. Является провитамином витамина А.
Различают два основных изомера каротина: α-каротин и β-каротин. β-каротин
встречается в жёлтых и оранжевых плодах и в зелёных листьях (морковь, тыква, томаты,
зеленый горошек, шпинат, салат и др.) [6], α-каротин, как правило, является спутником βкаротина, в значительных количествах содержится в красном пальмовом масле и в
листьях некоторых сортов чая.
Ксантофиллы (от греч. xanthós— жёлтый и phýllon — лист), кислородсодержащие
каротиноиды; главная составная часть жёлтых пигментов в листьях, цветках, плодах и
почках высших растений, а также во многих водорослях и микроорганизмах. В животном
мире ксантофиллы встречаются реже (в курином желтке, печени и жировой ткани
млекопитающих). В сочетании с флавоноидами создают осеннюю окраску листвы.
Известно более 50 ксантофиллов с разными функциональными группами (спирты, кетоны,
альдегиды, окиси, простые и сложные эфиры). Типичные представители – зеаксантин,
C40H56O2 и изомерный ему ксантофилл, или лютеин [7].
Рис. 5. Структурные формулы ксантофиллов.
лютеин
виолаксантин
неоксантин
2. Экспериментальные исследования.
2.1. Выделение липофильных пигментов из растительного сырья.
1. Выделение смеси липофильных пигментов из зеленых листьев.
Зеленые листья растения измельчают и растирают в фарфоровой ступке с 5 мл
пропанола-2, прибавив на кончике скальпеля натрия гидрокарбонат NaHСО3 (для
нейтрализа9
ции кислот клеточного сока). После отстаивания в течение 15 мин в темном месте зеленый
раствор осторожно декантируют в воронку с фильтром, фильтрат собирают в пробирку.
Спиртовая
вытяжка,
имеющая
зеленый
цвет,
использовалась
для
дальнейших
исследований.
2. Выделение β-каротина из моркови.
Основным пигментом, содержащимся в корнеплоде моркови является β-каротин –
его содержание составляет около 85% от суммы всех пигментов, поэтому вытяжку из
моркови можно использовать в качестве свидетеля для идентификации β-каротина. В
качестве растворителя для получения вытяжки был использован гексан, так как
растворимость каротинов в гексане лучше, чем в спиртах.
Измельченную морковь растирают в фарфоровой ступке с 5 мл гексана. После
отстаивания в течение 15 мин в темном месте раствор осторожно декантируют в воронку с
фильтром, фильтрат собирают в пробирку. Гексановая вытяжка, имеющая желтооранжевый цвет, использовалась в качестве свидетеля для идентификации β-каротина.
3. Выделение лютеина из желтых листьев.
Основным пигментом, содержащимся в желтых листьях, является лютеин, поэтому
вытяжку из желтых листьев можно использовать в качестве свидетеля для идентификации
лютеина. Растворимость ксантофиллов в спиртах лучше, чем в гексане, поэтому для
получения вытяжки был использован пропанол-2.
Желтые листья растения измельчают и растирают в фарфоровой ступке с 5 мл
пропанола-2. После отстаивания в течение 15 мин в темном месте раствор осторожно
декантируют в воронку с фильтром, фильтрат собирают в пробирку.
Спиртовая вытяжка, имеющая желтый цвет, использовалась в качестве свидетеля
для идентификации лютеина.
2.2. Разработка ТСХ методики.
Разделить липофильные пигменты зеленых листьев можно методом тонкослойной
хроматографии.
Для предварительной оценки разрабатываемой методики использовалась схема
Шталя (Рис. 1). Выделенные пигменты являются липофильными веществами, поэтому для
их разделения целесообразно использовать активный сорбент (силикагель) и неполярный
растворитель.
2.2.1. Выбор подвижной фазы.
В качестве основы подвижной фазы был выбран неполярный растворитель гексан.
При использовании чистого гексана на хроматограмме наблюдалось отделение только од10
ного желтого пятна в нижней части хроматограммы, зеленое пятно осталось на старте
(Приложение 1 (1)). Следовательно, для улучшения элюирующей способности гексана
необходимо использовать добавки более полярных растворителей.
В качестве модификаторов были выбраны дихлорметан (ε0 = 0,30), этилацетат (ε0 =
0,48) и пропанол-2 (ε0 = 0,55) (Таблица 1). Эти растворители относятся к разным группам
по классификации Снайдера (Рис. 2), и при их использовании может наблюдаться
различный порядок выхода компонентов на хроматограмме.
Были приготовлены подвижные фазы, содержащие гексан и каждый из
модификаторов в различных соотношениях. Соотношение гексана и модификатора
определяли эмпирически, наблюдая смещение пятен на хроматограмме от старта к
фронту.
Добавление дихлорметана к гексану не оказало значительного влияния на
элюирование пигментов, поэтому дихлорметан был признан непригодным для разделения.
Добавление этилацетата и пропанола-2 к гексану привело к разделению
компонентов на хроматограмме. Были исследованы подвижные фазы, содержащие гексан
и этилацетат в соотношениях
80:20, 70:30, 60:40, 50:50 и 40:60 и подвижные фазы,
содержащие гексан и пропанол-2 в соотношениях 95:5, 90:10, 85:15, 80:20 и 70:30.
Было определено количество пятен на хроматограммах и значения Rf при
использовании подвижных фаз с разным соотношением растворителей. Построены
графики зависимости значения Rf каждого компонента от содержания модификатора
(этилацетата и пропанола-2) в подвижной фазе (Таблица 2, Рис. 6; Таблица 3, Рис. 7). По
графикам определили максимальную разницу между значениями Rf при использовании
разных модификаторов.
Таблица 2. Зависимость значения Rf от содержания этилацетата в подвижной фазе.
Наименование
компонента
Гексан
Неоксантин
Виолаксантин
0,00
0,00
Rf при разном составе подвижной фазы
ГексанГексанГексанГексанЭтилацетат Этилацетат Этилацетат Этилацетат
(80 : 20)
(70 : 30)
(60 : 40)
(50 : 50)
0,00
0,00
0,02
0,03
0,00
0,00
0,05
0,12
ГексанЭтилацетат
(40 : 60)
0,05
0,17
Лютеин
Хлорофилл b
Хлорофилл а
Феофитин
Каротин
0,00
0,00
0,00
0,00
0,17
0,00
0,03
0,06
0,20
0,73
0,05
0,15
0,23
0,38
0,85
0,14
0,34
0,44
0,53
0,88
0,26
0,46
0,59
0,69
0,89
0,32
0,67
0,77
0,77
0,91
11
Рис. 6. Зависимость значения Rf от содержания этилацетата в подвижной фазе.
1
0,9
0,8
0,7
Хлорофилл А
Феофитин
0,6
Хлорофилл-B
0,5
β-каротин
0,4
Лютеин
Виолаксантин
0,3
Неоксантин
0,2
0,1
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Таблица 3. Зависимость значения Rf от содержания пропанола-2 в подвижной фазе.
Наименование
компонента
Гексан
Неоксантин
Виолаксантин
Лютеин
Хлорофилл b
Хлорофилл а
Феофитин
Каротин
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,17
Rf при разном составе подвижной фазы
ГексанГексанГексанГексанпропанол-2 пропанол-2 пропанол-2
пропанол-2
(95 : 5)
(90 : 10)
(85 : 15)
(80 : 20)
0,00
0,05
0,06
0,18
0,00
0,11
0,17
0,25
0,05
0,26
0,39
0,47
0,17
0,37
0,50
0,60
0,26
0,44
0,58
0,67
0,34
0,47
0,63
0,68
0,86
0,92
0,92
0,90
Рис. 7. Зависимость значения Rf от содержания пропанола-2 в подвижной фазе.
Гексанпропанол-2
(60 : 40)
0,80
0,80
0,85
0,93
0,94
0,95
1,00
1,2
1
Хлорофилл-А
0,8
Хлорофилл-В
Лютеин
0,6
β-каротин
Ф еофитин
Неоксантин
0,4
Виолаксантин
0,2
0
0
10
20
30
40
50
12
Полученные результаты показывают, что при использовании пропанола-2 лучше
разделяются пятна в нижней части хроматограммы, а при использовании этилацетата
наблюдается лучшее разделение феофитина и хлорофиллов (Приложение 1 (2), (3)).
Поэтому
была
сделана
попытка
эмпирически
подобрать
соотношение
обоих
модификаторов в подвижной фазе для получения оптимального разделения всех
компонентов. Для этого были проверены подвижные фазы с соотношением:
1) гексан – этилацетат – пропанол-2 75:20:5;
2) гексан – этилацетат – пропанол-2 75:18:7;
3) гексан – этилацетат – пропанол-2 75:15:10.
Наилучшее разделение наблюдалось при использовании соотношения 75:18:7
(Приложение 1 (4)). Дальнейшие работы проводились с использованием данного
соотношения растворителей в подвижной фазе.
2.2.2. Определение устойчивости пробы при хроматографировании.
На пластинку квадратной формы с левой стороны нанесли 5 мкл спиртового
экстракта и провели хроматографирование восходящим методом с использованием
выбранной подвижной фазы. Когда фронт подвижной фазы поднялся на 8 см, пластинку
вынули из камеры, высушили на воздухе до исчезновения запаха растворителей. Затем
вновь поместили пластинку в камеру левым боком вниз и хроматографировали
восходящим методом. Количество пятен на полученной двумерной хроматограмме не
отличается от количества пятен на одномерной хроматограмме, все пятна расположены на
диагонали (Приложение 2). Это свидетельствует о стабильности веществ при
хроматографировании.
2.2.3. Идентификация пигментов.
Визуальным методом по окраске пятен и по сравнению со свидетелями были
идентифицированы наблюдаемые пятна пигментов на хроматограмме – хлорофиллов,
феофитина (продукт деградации хлорофиллов) и каротиноидов (Приложение 3).
Пятна хлорофиллов и феофитина были идентифицированы по окраске:
- хлорофилл а – сине-зеленое пятно, Rf = 0,48;
- хлорофилл b – желто-зеленое пятно, Rf = 0,40;
- феофитин – серое пятно, Rf = 0,60.
Для идентификации пятен каротиноидов были получены растворы свидетелей:
- экстракцией гексаном из моркови был получен β-каротин;
- экстракцией пропанолом-2 из желтых листьев был выделен лютеин.
Таким образом, идентификацией по сравнению со свидетелем были определены:
- β-каротин – темно-желтое пятно с Rf = 0,91;
13
- лютеин – светло-желтое пятно с Rf = 0,20.
Два оставшихся светло-желтых пятна с Rf = 0,09 и Rf = 0,04 были определены по
литературным данным, как виолаксантин и неоксантин. Подобрать сырье, из которого
можно было бы выделить указанные пигменты в индивидуальном виде, не удалось.
2.3. Анализ экстрактов разных растений.
На хроматографическую пластинку Армсорб размером 10х10 см нанесли с
помощью микрошприца 5 мкл спиртового экстракта листьев. Пластинку высушили на
воздухе и поместили в камеру с подвижной фазой гексан – пропанол-2 – этилацетат
(75:7:18). Хроматографировали восходящим методом. Когда фронт подвижной фазы
поднялся на 8 см, пластинку вынули из камеры и высушили на воздухе до исчезновения
запаха растворителей. Оценили наблюдаемые пятна пигментов.
С использованием данной методики были исследованы экстракты листьев мяты,
крапивы, петрушки, смородины, подорожника, полыни и клевера (Приложение 4).
На хроматограммах всех экстрактов наблюдаются пятна хлорофиллов а и b,
каротина и лютеина. Сравнительный анализ размеров и интенсивности пятен показывает,
что содержание хлорофиллов в разных образцах изменяется незначительно.
Заметно
изменяется
содержание
β-каротина
–
максимальное
содержание
наблюдается в листьях петрушки, минимальное – в листьях полыни.
Также
в
значительном
диапазоне
варьируется
содержание
ксантофиллов.
Например, на хроматограмме экстракта листьев петрушки наблюдается дополнительное
пятно желтого цвета, которое по месту расположения можно отнести к ксантофиллам. В
то же время, на хроматограммах экстрактов мяты и крапивы не обнаружено пятно
неоксантина, а на хроматогамме экстракта полыни не обнаружены пятна виолаксантина и
неоксантина. На хроматограмме экстракта мяты наблюдается светло-коричневое пятно на
старте, что, вероятно, свидетельствует о присутствии гидрофильных пигментов, которые
не разделяются в данных условиях.
Выводы
1. Получены спиртовые экстракты зеленых листьев растений – мяты, крапивы,
петрушки, смородины, подорожника, полыни и клевера, а также экстракты желтых
листьев и корнеплода моркови, использованные в дальнейшем для идентификации
лютеина и β-каротина.
2. Разработана ТСХ методика анализа, позволяющая разделять липофильные
пигменты, содержащиеся в листьях растений:
- исследовано влияние состава подвижной фазы на разделение пигментов;
14
- эмпирически было установлено оптимальное соотношение обоих модификаторов
в подвижной фазе: гексан – пропанол-2 – этилацетат (75:7:18), при котором наблюдается наилучшее разделение.
3. Подтверждена устойчивость компонентов пробы при хроматографировании в
выбранных условиях.
4. Проведена идентификация пятен компоненов пробы визуальным методом по
окраске пятен и по сравнению со свидетелями.
5. Проведен анализ спиртовых экстрактов листьев мяты, крапивы, петрушки,
смородины, подорожника, полыни и клевера. Результаты показывают, что в
зеленых листьях растений всегда содержатся хлорофиллы и каротиноиды, но в
зависимости от вида растения их качественный и количественный состав может
изменяться.
Заключение.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в зеленых листьях растений
содержится смесь липофильных пигментов – хлорофиллов и каротиноидов. Метод
ТСХ позволяет разделять пигменты растений. Разработка ТСХ методики является
сложной аналитической задачей.
Метод ТСХ позволяет устанавливать качественный состав растительного сырья и
проводить определение его подлинности.
Показано, что при правильном выборе подвижной фазы метод ТСХ может
использоваться для определения подлинности растительных экстрактов по их
качественному и количественному составу, для выявления фактов фальсификации
растительных экстрактов, для исследования роли пигментов в процессе фотосинтеза,
для исследования влияния
факторов окружающей среды на пигментный состав
растений и т.д.
15
ПРИЛОЖЕНИЕ 1.
Разделение липофильных пигментов при использовании в качестве подвижной фазы
гексана (1), смеси гексан – этилацетат 50:50 (2), смеси гексан – пропанол-2 85:15 (3),
смеси гексан – этилацетат – пропанол-2 в соотношении 75:18:7 (4).
1
2
3
4
16
ПРИЛОЖЕНИЕ 2.
Определение устойчивости пробы при хроматографировании.
17
ПРИЛОЖЕНИЕ 3.
Идентификация лютеина и β-каротина по сравнению со свидетелем:
1 – испытуемый раствор, 2 – лютеин, 3 - β-каротин.
1
2
3
18
ПРИЛОЖЕНИЕ 4.
Хроматограммы спиртовых экстрактов листьев растений:
1 - клевер,
2 - петрушка,
3 - мята,
4 - крапива,
5 – смородина,
6 – подорожник,
7 – полынь.
19
Список использованных источников.
1. Бойченко А.П., Чухлеб М.А., Фролова А.М., Логинова Л.П. Новый хемометрический подход для оптимизации разделения в нормально-фазовой тонкослойной
хроматографии // Методы и объекты химического анализа. - 2010. - Т. 5, № 1. - С.
38–
45.
2. http://www.chem-astu.ru/chair/study/PCMA/r3_1.htm
3. Хроматография в тонких слоях. Под редакцией Э. Шталя. Издательство «Мир»,
Москва, 1965.
4. http://www-chemistry.univer.kharkov.ua/files/Lecture19.pdf
5. Рудаков О.Б., Селеменев В.Ф. Физико-химические системы сорбат – сорбент –
элюент в жидкостной хроматографии. - Воронеж, 2003. – 240 с.
6. www.Wikipedia.org
7. Кретович В. Л., Основы биохимии растений, 5 изд., М., 1971.
20