МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ 1.1 Требования к студентам Приступая к изучению данной дисциплины, студент должен владеть компетенциями, знаниями и умениями, сформированными в среднем общеобразовательном учебном заведении. 1.2 Цели освоения дисциплины Целями дисциплины «Методы исследования биологических макромолекул» являются подготовка студентов, способных выполнять исследования, самостоятельно планировать ход работы и подбирать необходимые методы для решения конкретных задач. В курсе изучаются теоретические основы биохимических методов исследований, основные методологические и методические приемы, необходимые для успешного применения этих методов. Особое внимание в курсе отводится современным хроматографическим и электрофоретическим методам исследований, видам современного лабораторного оборудования и приемам работы с ним. Успешное освоение курса «методы биохимических исследований» подготовит студентов к проведению научных исследований в области биологии. 1.3 Краткая характеристика дисциплины Дисциплина «Методы исследования биологических макромолекул» относится к профессиональному циклу подготовки и входит в вариативную часть, определяемую выбором студента. При изучении «Методы исследования биологических макромолекул» используются знания и навыки, полученные студентами при изучении курсов общей и теоретической физики, химии, математического анализа, а также школьные знания студентов по биологии. Особенность курса состоит в фундаментальном характере изложения предмета. Материал излагается от простого к сложному, от молекулярного уровня до организменного. Основное внимание уделяется освещению физической природы биологических явлений и процессов. Большое внимание уделяется применению современных физических и химических методов для изучения биологических систем на различных уровнях организации. Данная дисциплина подготовит студента к оперированию специальной терминологией, пониманию основных понятий, законов и моделей, применяемых в методах исследования биологических макромолекул, теоретических и экспериментальных методов исследований, приобретению способности к системному мышлению. 1.4 Учебные задачи дисциплины: ОК-1 способен представить современную картину мира на основе целостной системы естественно-научных и математических знаний, ориентироваться в ценностях бытия, жизни, культуры ПК-1 способен грамотно и самостоятельно проводить теоретическую и экспериментальную научно-исследовательскую работу в области биоинженерии, биоинформатики и смежных дисциплин, а также оформлять ее в письменной форме, излагать в устной форме, и участвовать в различных формах дискуссий 1.5 Формы работы студентов: лекции, лабораторные занятия, написание рефератов, выполнение домашних заданий и контрольные работы. 1.6 Виды контроля: для контроля знаний студентов проводятся: модульные контрольные, проверка домашних заданий, ответы на лабораторных занятиях, проверка протоколов практикума, рефераты. Итоговый контроль: экзамен (8 семестр). 1.7 Методика формирования результативной оценки. Учебным планом по данной дисциплине предусмотрен экзамен. Максимальное количество баллов, которое может набрать студент, 100. За выполнение заданий текущего и промежуточного контроля студент может набрать максимальное количество баллов: За первый модуль – 30 баллов. За второй модуль – 30 баллов. За третий модуль – 40 баллов. Сумма баллов складывается следующим образом: полный ответ на семинарском занятии – 2 балла, дополнение на семинарском занятии – 1 балл, доклад на семинарском занятии – до 3-х баллов, проверочная работа на лекции – до 2-х баллов, модульная контрольная работа – 10 баллов. При успешном освоении курса студент, набравший 60 баллов или более, может быть освобожден от зачета и получить оценку, в соответствии с количеством набранных им баллов. 2. СТРУКТУРА ИЗУЧЕНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ Всего часов (общая трудоемкость в часах) 144 В т.ч. Аудиторных занятий Из них лекции 16 Семинарских/практических занятий 0 Лабораторных занятий 34 Практикумов 0 Самостоятельных занятий 94 Изучение основной и дополнительной литературы 7 Написание рефератов 22 Выполнение письменных домашних заданий 22 Выполнение контрольных работ, тестов 7 Подготовка к экзамену, экзамен 36 РАЗДЕЛ 3. ТЕМАТИЧЕСКИЙ ПЛАН ИЗУЧЕНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ Темы, разделы Тема 1.Введение. История развития методов биохимических исследований Содержание Вид занятия Форма занятия Кол-во часов История развития методов биохимических Аудиторн Лекция 2 исследований. Роль методического обеспечения в ое развитии биохимии. Классификация методов Аудиторн Лабораторн исследования в биохимии. Применение ое ая работа биохимических методов в медицине, биотехнологии, экологии и др. отраслях Самостоя Изучение 8 тельное литературы, электронных библиотечн ых ресурсов Тема 2. Методы Особенности биологических макромолекул как Аудиторн Лекция 2 препаративной объектов исследования: высокая молекулярная масса, ое химии и денатурация, полиэлектролитная природа, низкая биохимии. скорость диффузии. Методы Оборудование биохимической лаборатории, Аудиторн Лабораторн 4 ое ая работа выделения специальные материалы и реактивы. Отделение органелл. осадков и нерастворимых веществ. Методы Центрифугирование. Ультрафильтрация. Некоторые дифференциаль- приемы, используемые при работе с белковыми Форма контроля Опрос, проверка домашних заданий, проверка доклада Опрос, проверка домашних заданий, проверка доклада ного растворами. Диализ. Самостоя Изучение 13 центрифугирован Разделение белков путем осаждения. Общие тельное литературы, ия. положения. Растворимость белков при низкой электронны концентрации солей. Высаливание при высокой х концентрации соли. Осаждение белков органическими библиотечн растворителями. Осаждение белков органическими ых ресурсов полимерами и другими веществами. Осаждение вследствие избирательной денатурации. Осаждение нуклеиновых кислот. Кристаллизация белков. Методы выделения органелл Приготовление экстракта. Исходный материал. Особенности различных видов живых организмов в качестве исходного материала биохимических исследований. Свежесть сырья и его хранение. Разрушение клеток и экстракция. Способы разрушения клеток. Растворы, используемые для экстракции. Буферные растворы и специальные добавки. Оптимизация и осветление экстракта. Особенности приготовления экстрактов растительных тканей и микроорганизмов. Методы, используемые при очистке белков, ассоциированных с частицами. Детергенты и их применение. Методы дифференциального центрифугирования Центрифуга, ее устройство. Силы, действующие на частицу в роторе центрифуги. Скорость осаждения частиц. Константа седиментации. Раздельное осаждение частиц. Дифференциальное центрифугирование. Центрифугирование в градиенте плотности. Методы получения ступенчатых и непрерывных градиентов плотности. Тема 3. Хроматография Классификация и элементы теории хроматографии Аудиторн Лекция 2 Классификация хроматографических методов. ое Классификация по принципу фракционирования. Аудиторн Лабораторн 6 Классификация по способу элюции. Классификация ое ая работа по расположению неподвижной фазы. Самостоя Изучение 10 Элементы теории хроматографической элюции. тельное литературы, Хроматографический процесс. Хроматографическая электронны зона. Концепция теоретических тарелок. х Кинетическая теория хроматографии. Разрешение библиотечн близко мигрирующих зон. Оптимизация условий ых ресурсов фракционирования. Градиентная элюция. Хроматография макромолекул. Материалы матриц сорбентов и обменников Целлюлоза. Гели на основе декстрана (сефадексы). Агароза. Полиакриламидный гель. Сефакрилы. Ультрогели. Полистирольные смолы. Полиамидные смолы. Кизельгур (целит, диатомовая земля). Силикагель. Окись алюминия. Пористое стекло. Оксиапатит. Техника колоночной хроматографии Хроматография при низком давлении. Хроматографические колонки. Резервуары для элюента. Смесители. Внесение препарата в колонку. Перистальтические насосы. Детекторы. Коллекторы фракций. Вспомогательное оборудование. Опрос, проверка домашних заданий, проверка доклада Хроматография при высоком давлении. Колонки. Внесение препарата. Задание градиента элюции. Детекторы. Хроматография при умеренном давлении. Гель-фильтрация Общая характеристика метода. Принцип метода. Коэффициенты распределения. График селективности. Эффективность фракционирования. Характеристика продажных матриц. Методические особенности гель-фильтрации при низком давлении. Подготовка матрицы. Набивка колонки. Проверка качества набивки. Определение V0. Внесение препарата. Поддержание рабочего режима. Регенерация колонки. Выбор параметров хроматографического процесса. Выбор матрицы. Размеры колонки. Выбор элюента. Скорость элюции. Оптимизация условий эксперимента. Области применения. Очистка и фракционирование макромолекул. Определение молекулярной массы белка. Обессоливание и смена буфера. Гель-фильтрация при высоком давлении. Гельфильтрация в тонком слое. Распределительная хроматография Принцип метода. Нормальнофазовая распределительная хроматография. Распределительная хроматография в обращенных фазах. Обратнофазовая гидрофобная хроматография при низком давлении. Немодифицированная сефароза. Элюция снижающимся градиентом концентрации соли. Гидрофобизированные гели агарозы. Распределительная хроматография при высоком давлении. Адсорбционная хроматография Принцип метода. Сорбенты. Приготовление оксиапатита. Сорбционные свойства оксиапатита. Сорбция белков. Сорбция нуклеиновых кислот. Некоторые особенности хроматографии на оксиапатите. Фракционирование и очистка белков. Фракционирование и очистка нуклеиновых кислот. Разделение двунитевой и однонитевой ДНК. Очистка гибридов ДНК-РНК. Ионообменная хроматография Принцип метода. Компоненты хроматографической системы. Ионообменники. Элюент. Хроматографируемые вещества. Хроматографический процесс. Ионные взаимодействия вещества и сорбента. Управление силой ионного взаимодействия. Неионные взаимодействия вещества и сорбента. Характеристики продажных ионообменников. Подготовка обменников к набивке в колонку. Преформирование и промывка. Перевод в нужную ионную форму. Опасность поглощения СО2. Применение статической ионообменной хроматографии. Нейтрализация щелочи или кислоты без образования соли. Замена ионов. Обессоливание растворов. Удаление некоторых органических примесей. Концентрирование препаратов. Разделение компонентов смеси, сильно различающихся сродству к обменнику. Выбор условий динамической ионообменной хроматографии. Выбор ионообменника. Выбор типа элюции. Выбор рН буфера для элюции. Выбор концентрации соли. Сохранение нативности препарата. Выбор объема элюента. Выбор размеров колонки. Выбор скорости элюции. Сбор и обработка фракций. Регенерация ионообменника. Применение динамической ионообменной хроматографии. Ионообменная ЖХВД белков. Хроматофокусирование. Принцип метода. Колонки для хроматофокусирования. Фракционирование белков. Аффинная хроматография Принцип метода. Компоненты аффинного сорбента. Матрицы. Активация матриц. Спейсеры. Активированные спенсеры. Лиганды с индивидуальной специфичностью. Лиганды с групповой специфичностью. Посадка лигандов на активированные матрицы. Посадка лигандов на спейсеры с помощью конденсирующих агентов. Характер закрепления лиганда на матрице. Иммобилизация нуклеиновых кислот в качестве лигандов. Сорбенты для ковалентной хроматографии. Выбор условий хроматографии. Выбор сорбента и характера хроматографического процесса. Выбор концентрации лиганда. Загрузка сорбента. Выбор буфера для посадки вещества. Выбор элюента и метода элюции. Биоспецифическая элюция. Проведение эксперимента. Электрофоретическая элюция. Аффинная элюция с ионообменника. Применение аффинной хроматографии. Аффинная ЖХВД. Аффинный электрофорез Тонкослойная хроматография. Особенности метода. Техника ТСХ. Приготовление пластинок. Нанесение препаратов. «Проявление» пластинок (хроматографическая элюция). Обнаружение пятен или полос. Элюция вещества с пластинки. Применение ТСХ. Тема 4. Электрофорез Теоретические и методические основы электрофореза Аудиторн Лекция 2 Принципы электрофореза. Электрофорез с подвижной ое границей. Зональный электрофорез без Аудиторн Лабораторн 6 поддерживающей среды. Непрерывный электрофорез ое ая работа в тонком слое жидкости (проточный электрофорез в Самостоя Изучение 12 свободной среде). Зональный электрофорез в тельное литературы, градиенте плотности. электронны Зональный электрофорез в поддерживающей среде с х капиллярной структурой. Электрофорез на библиотечн фильтровальной бумаге. Электрофорез на ацетате ых ресурсов целлюлозы. Электрофорез в колонках и блоках гранулированной Опрос, проверка домашних заданий, проверка доклада поддерживающей среды. Электрофорез в агаровом и агарозном гелях. Теория электрофореза в агаровом (агарозном) геле. Аналитический электрофорез в агаровом (агарозном) геле. Препаративный электрофорез в агаровом и агарозном гелях. Электрофорез в крахмальных гелях. Электрофорез в полиакриламидном геле. Теория электрофореза в полиакриламидном геле. Физикохимические свойства составных частей геля. Аналитический электрофорез в полиакриламидных гелях. Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле Изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез Изоэлектрическое фокусирование. Принцип метода. Формирование градиентов рН. Методические приемы изоэлектрического фокусирования. Трудности, связанные с разделением белков методом ИЭФ. Аналитическое и препаративное изоэлектрическое фокусирование Изотахофорез Обнаружение, количественное определение и характеристика макромолекул после электрофореза Выявление макромолекул по поглощению ультрафиолетового света и флуоресценции. Выявление разделенных при электрофорезе компонентов путем их окрашивания. Сканирование окрашенных электрофореграмм. Фотографирование электрофореграмм. Высушивание полиакриламидных гелей. Разрезание полиакриламидных гелей. Выявление радиоактивности после электрофореза. Электрофорез белков Поведение белков при электрофорезе. Разделение белков в соответствии с размерами молекул: определение их молекулярной массы. Двухмерный электрофорез. Окрашивание белков на электрофореграммах. Обнаружение белков по их ферментативной активности. Электрофорез нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов Электрофоретические методы разделения нуклеиновых кислот и полинуклеотидов. Электрофорез нуклеиновых кислот в агаровом и агарозном гелях. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидных гелях. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидно-агарозных гелях. Особые проблемы, возникающие при электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот. Изоэлектрофокусирование нуклеиновых кислот. Обнаружение нуклеиновых кислот после электрофореза. Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот в геле. Микрометоды электрофоретического разделения нуклеиновых кислот. Определение молекулярной массы полинуклеотидов. Электрофорез нуклеопротеидных частиц. Тема 5. Спектр электромагнитного излучения, его основные Аудиторн Спектральные характеристики и способы их выражения (длина ое Лекция 2 Опрос, проверка методы волны, частота, волновое число, поток излучения, Аудиторн Лабораторн 6 интенсивность). Ультрафиолетовая, видимая и ое ая работа инфракрасная области спектра. Классификация Самостоя Изучение 12 спектроскопических методов. тельное литературы, Спектрофотометрический метод анализа. Сущность электронны метода. Законы поглощения электромагнитного х излучения и способы их выражения. Закон Бугерабиблиотечн Ламберта-Бера, его математическое выражение. ых ресурсов Величины, характеризующие поглощение. Молярный коэффициент поглощения. Оптическая плотность. Оптимальный интервал измеряемых значений оптической плотности (кривая ошибок). Критерии соблюдения законов поглощения и оценка чувствительности фотометрической реакции. Построение калибровочного графика. Способы определения концентраций веществ. Дифференциальный метод. Спектрофотометрическое титрование. Использование спектрофотометрии в хроматографии. Фотоэлектроколориметры и спектрофотометры. Применение колориметрии и спектрофотометрии. Флюориметрические методы анализа. Различные виды люминесценции и их классификация. Основные закономерности молекулярной фотолюминесценции. Независимость спектров люминесценции от длины волны возбуждающего света. Тушение люминесценции: температурное, концентрационное, тушение посторонними примесями. Практическое домашних заданий, проверка доклада применение метода. Хемилюминисцентный анализ. Тема 6. Методы Радиоактивные изотопы, используемые в биологии. Аудиторн Лекция 2 меченых атомов Измерение радиоактивности. Авторадиография: ое принцип метода, техника проведения Аудиторн Лабораторн 4 авторадиографии, преимущества и недостатки. ое ая работа Сцинтилляционные счетчики излучения: принцип Самостоя Изучение 7 действия, сцинтилляторы. Счет радиоактивности на тельное литературы, фильтрах. Введение радиоактивной метки в электронбиологические препараты in vivo и in vitro. ных Радиоиммуноанализ. библиотечн ых ресурсов Тема 7. Принцип иммунного анализа. Получение антител с Аудиторн Лекция 2 Иммуноферментн требуемой специфичностью. Пришивание фермента к ое ый анализ антителам. Варианты методик ИФА. Современная Аудиторн Лабораторн 4 аппаратура. ое ая работа Самостоя Изучение 6 тельное литературы, электронны х библиотечн ых ресурсов Тема 8. Масс- Принцип метода. Возможности качественного и Аудиторн Лекция 2 спектрометричес количественного анализа. Требования к исследуемым ое кий анализ образцам. Современная аппаратура. Аудиторн Лабораторн 4 ое ая работа Опрос, проверка домашних заданий, проверка доклада Опрос, проверка домашних заданий, проверка доклада Опрос, проверка домашних заданий, Самостоя Изучение 13 тельное литературы, электронны х библиотечн ых ресурсов проверка доклада РАЗДЕЛ 4. ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЕ ВОПРОСЫ 1. Общие принципы биохимического исследования. Биохимические исследования на различных уровнях организации живой материи. 2. Центрифуга, ее устройство. Скорость осаждения частиц. Константа седиментации. 3. Дифференциальное центрифугирование. Центрифугирование в градиенте плотности. Методы получения ступенчатых и непрерывных градиентов плотности. 4. Разделение белков путем осаждения. Растворимость белков при низкой концентрации солей. Высаливание при высокой концентрации соли. 5. Осаждение белков органическими растворителями. Осаждение белков органическими полимерами и другими веществами. 6. Осаждение вследствие избирательной денатурации. Осаждение нуклеиновых кислот. 7. Особенности различных видов живых организмов в качестве исходного материала биохимических исследований. 8. Разрушение клеток и экстракция. Способы разрушения клеток. 9. Растворы, используемые для экстракции. Буферные растворы и специальные добавки. 10. принципу Классификация хроматографических методов. Классификация по фракционирования. Классификация по способу элюции. Классификация по расположению неподвижной фазы. 11. Элементы Хроматографический теории процесс. хроматографической Хроматографическая зона. элюции. Концепция теоретических тарелок. Кинетическая теория хроматографии. Разрешение близко мигрирующих зон. Оптимизация условий фракционирования. Градиентная элюция. Хроматография макромолекул. 12. Техника колоночной хроматографии. Хроматографические колонки. Резервуары для элюента. Смесители. Внесение препарата в колонку. Перистальтические насосы. Детекторы. Коллекторы фракций. Вспомогательное оборудование. 13. Гель-фильтрация. Общая характеристика метода. Очистка и фракционирование макромолекул методом гель-фильтрации. 14. Определение молекулярной массы. Области применения гельфильтрации. 15. Распределительная хроматография. Нормальнофазовая и обратнофазовая распределительная хроматография. 16. Методические особенности обратнофазовой гидрофобной хроматографии при низком давлении. 17. Адсорбционная хроматография. Сорбенты. Особенности хроматографии на оксиаппатите. 18. Тонкослойная хроматография. Приготовление пластинок. Нанесение препарата. 19. «Проявление» пластинок (хроматографическая элюция). Обнаружение пятен или полос. Применение ТСХ. 20. Ионообменная хроматография. Ионообменники. Элюэнт. 21. Ионные и неионные взаимодействия вещества и сорбента. Управление силой ионного взаимодействия. 22. Применение статической ионообменной хроматографии. Выбор условий динамической ионообменной хроматографии. Способы элюции с ионообменника. 23. Аффинная хроматография. Применение. Матрицы, их активация. Спейсеры. Активированные спейсеры. 24. Лиганды с групповой и индивидуальной специфичностью. Посадка лигандов 25. Принцип электрофореза. Зональный электрофорез. электрофореза в ПААГ. Разделение белков в присутствии ДСН. Теория 26. Спектрофотометрический метод анализа. Законы поглощения электромагнитного излучения. 27. Молярный коэффициент поглощения. Оптическая плотность. Способы определения концентраций веществ. 28. Фотоэлектроколориметры и спектрофотометры. 29. Флюорометрические методы анализа. Различные виды люминесценции. 30. Основные закономерности молекулярной фотолюминесценции. Практическое применение метода. 31. Методы меченых атомов. Радиоактивные изотопы, используемые в биологии. 32. Измерение радиоактивности. Авторадиография. 33. Введение радиоактивной метки в биологические препараты in vivo и in vitro. 34. Радиоиммуноанализ. Применение в молекулярной биологии. РАЗДЕЛ 5. УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРОГРАММЫ ЛИТЕРАТУРА Базовый учебник. 1. Коничев, А.С. Молекулярная биология: учебник для студ. вузов. – М., 2008. – 398 с. Основная литература. 1. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002. 2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 2002. 3. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 Т. Т.1,2. – Минск: Беларусь, 2002. 4. Биохимия / под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. 5. Пустовалова Л.М. Основы биохимии. – Ростов-на-Дону: Феникс, 2003. 6. Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. – М., 2005. – 256 с. 7. Ю.Б. Филиппович Основы биохимии – М.: Агар, 1999. Интернет-источники 1. www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed - Свободный доступ в крупнейшую базу научных данных в области биомедицинских наук MedLine, включая биохимию 2. www.molbiol.ru - Учебники, научные монографии, обзоры, лабораторные практикумы в свободном доступе на сайте практической молекулярной биологии , на сайте www.nature.ru. 3. http://isir.ras.ru/ - Интегрированная Cистема Информационных Ресурсов Российской Академии Наук. 4. http://www.viniti.msk.su/ - Всероссийский Институт Научной и Технической Информации (ВИНИТИ РАН). 5. www.chem.qmul.ac.uk/iubmb - Биохимическая классификация и номенклатура ферментов. Свободный доступ на сайте Международного союза биохимии и молекулярной биологии. 6. www.swissprot.com – свободный доступ к международной базе данных по первичным и 3D структурам ферментов. 7. http://journal.issep.rssi.ru/ - Соросовский образовательный журнал – свободный доступ к обзорным статьям по биологии. Ссылка в ПТК «УМКа» http://umka.volsu.ru/newumka3/