На правах рукописи ПАХОМОВА Оксана Анатольевна НОВЫЕ ЭКСТРАКЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

На правах рукописи
ПАХОМОВА Оксана Анатольевна
НОВЫЕ ЭКСТРАКЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
-АМИНОКИСЛОТ В ВОДНЫХ СРЕДАХ
02.00.02 – Аналитическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Саратов 2007
Работа выполнена на кафедре аналитической химии ГОУ ВПО
Воронежская государственная технологическая академия
Научный руководитель: заслуженный деятель науки и техники РФ,
доктор химических наук, профессор
КОРЕНМАН Яков Израильевич
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор
ГУСАКОВА Наталья Николаевна
кандидат химических наук, профессор
ЯСТРЕБОВА Надежда Ивановна
Ведущая организация:
Белгородский государственный
университет
Защита диссертации состоится « 8 » ноября 2007 г. в 14 часов
на заседании диссертационного совета Д 212.243.07 по химическим наукам при Саратовском государственном университете по
адресу: 410012, Саратов, ул. Астраханская, 83.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке
Саратовского государственного университета по адресу:
410012, Саратов, ул. Астраханская, 83.
Автореферат разослан « »
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор химических наук
2
2007 г.
Сорокин В.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. α-Аминокислоты относятся к
важнейшим биологически активным веществам, которые в живых
организмах являются структурными элементами белков и эндогенных соединений. Аминокислоты и их смеси широко применяются в качестве добавок при производстве пищевых продуктов,
активных компонентов фармацевтических препаратов для парентерального и спортивного питания, лечения и профилактики заболеваний. Содержание аминокислот в продуктах питания и лекарственных препаратах строго регламентируется, поскольку терапевтический эффект достигается при определенной концентрации биологически активного вещества.
Актуальная задача аналитического контроля производства
аминокислотных препаратов связана с надежным определением
биологически активных веществ. Она относится к одной из приоритетных в аналитической химии, ее решение возможно с применением жидкостной экстракции и последующего анализа концентрата различными электрохимическими методами.
В качестве экстрагентов органических веществ разных
классов традиционно применяются гидрофобные растворители.
Анализ известных коэффициентов распределения α-аминокислот
в разнохарактерных экстракционных системах приводит к выводу о малой эффективности гидрофобных растворителей и их неприменимости для извлечения аминокислот из водных сред,
например, из ферментационных растворов и белковых гидролизатов.
Гидрофильные растворители образуют двухфазные системы
в присутствии высаливателей, изменяющих активность воды.
Такие экстрагенты обеспечивают практически полное извлечение
аминокислот из водных сред, при этом возможны определения
компонентов в равновесной органической фазе в отсутствии стадии реэкстракции. Применение гидрофильных экстрагентов расширяет возможности титриметрического анализа. Это связано с
тем, что в среде органического растворителя сила слабых аминокислот возрастает, становится возможным их селективное определение без предварительного разделения.
3
Цель работы  Теоретическое и экспериментальное
обоснование применения гидрофильных растворителей различных классов, а также их смесей для экстракционного извлечения
α-аминокислот из водных сред.
При этом решались следующие задачи:
– установление общих закономерностей межфазного распределения α-аминокислот в системах органический растворитель
– водно-солевой раствор;
 разработка математической модели и оптимизация
условий экстракционного извлечения α-аминокислот методами
математического планирования эксперимента;
– изучение влияние физико-химических свойств экстрагентов и α-аминокислот на эффективность межфазного распределения;
– применение изученных систем для разработки новых
способов определения α-аминокислот в водных средах.
Научная новизна.
В идентичных условиях изучено
межфазное распределение 15 α-аминокислот в системах с 6 гидрофильными растворителями разных классов в присутствии высаливателя – сульфата лития. Установлена зависимость экстракционных характеристик α-аминокислот от свойств и строения
аналитов и экстрагентов.
Впервые для извлечения α-аминокислот из водных сред
применена экстракция трехкомпонентной смесью гидрофильных
растворителей н.бутиловый спирт  этилацетат – ацетон. По полученным результатам установлен состав комплексов, образующихся при извлечении α-аминокислот трехкомпонентной смесью
растворителей из водно-солевого раствора.
Методами математического планирования эксперимента
оптимизированы составы тройных смесей растворителей, обеспечивающих практически полное извлечение α-аминокислот из
водно-солевых растворов.
Для определения α-аминокислот в экстрактах на основе
гидрофильных растворителей применены электрохимические методы анализа.
Практическая значимость. На основании установленных закономерностей межфазного распределения α-аминокислот
разработан комплекс способов их определения в водных средах и
4
фармацевтических препаратах, включающих экстракционное извлечение и потенциометрический, кондуктометрический, электрофоретический анализ экстракта. Предложена математическая
модель межфазного распределения аминокислот, позволяющая
оптимизировать условия экстракционного извлечения и повысить
количественные характеристики экстракции. Новизна и оригинальность практических разработок подтверждены материалами
Роспатента. Способы апробированы в производственных лабораториях ОАО «Хлебозавод № 2», ОАО «Хладокомбинат», ОАО
«Экспериментальный комбикормовый завод» (Воронеж).
К защите представляются:
– закономерности экстракции α-аминокислот гидрофильными растворителями и их смесями, обобщающие влияние
свойств изученных систем на межфазное распределение αаминокислот;
– установленные в идентичных условиях экстракционные
характеристики α-аминокислот;
– новые способы извлечения и раздельного определения
α-аминокислот в бинарных смесях, применимые для анализа водных сред и фармацевтических препаратов;
– математическая модель экстракции α-аминокислот гидрофильными растворителями и их смесями.
Апробация работы Материал диссертации доложен на
XV и XVI Российских молодежных конференциях «Проблемы
теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, 2005,
2006); 71  73 конференциях «Науковi досягнення молодi  виришенню проблем харчування людства в XXI столiттi» (Киев,
2005  2007); Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005); III Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005), International Congress on
Analytical Sciences ICAS 2006 (Moscow, 2006); XXI International
Symposium on Physico- Chemical Methods of Separation «Ars Separatoria 2006» (Torun, Poland, 2006); Общероссийских конференциях
молодых ученых «Пищевые технологии» (Казань, 2006, 2007), Всероссийской конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2007), II Всероссийской конференции
5
«Аналитика России» (Краснодар, 2007), отчетных конференциях
ВГТА (2005 – 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 34
работы, в том числе 13 статей, материалы 13 докладов всероссийских и международных конференций, 8 патентов РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, включающего 172
источника, и приложения (акты апробации и внедрения практических разработок, материалы Роспатента РФ). Работа изложена на
151 странице машинописного текста, включает 34 таблицы и 29
рисунков.
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Приведен обзор современных способов извлечения и концентрирования аминокислот.
Обобщены известные способы определения аминокислот в водных средах, пищевых продуктах, фармацевтических препаратах.
Сделан вывод об отсутствии систематических исследований экстракции -аминокислот гидрофильными растворителями.
ГЛАВА II. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА. Приведены
структурные формулы и некоторые свойства объектов исследования  -аминокислот (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин,
треонин, лизин, аргинин, аспарагиновая кислота, аспарагин, глутамин, метионин, фенилаланин, тирозин, триптофан). В качестве
экстрагентов изучены гидрофильные растворители: спирты (пропиловые, бутиловые), кетон (ацетон), эфир (этилацетат) и их смеси.
Обязательным условием применения гидрофильных растворителей как экстрагентов является насыщение водной фазы
электролитом. В качестве высаливателя наиболее эффективен нерастворимый в спиртах, кетонах и эфирах сульфат лития, который
"положительно" гидратируется, т.е. стабилизирует структуру
водного раствора. В водной фазе, содержащей Li2S04, отсутствует
органический растворитель, мольные соотношения соль  вода
практически постоянны и не зависят от природы экстрагента.
Экстракты анализировали методами потенциометрического
(иономер И-130) и кондуктометрического титрования (2ВМ-509
TESLA) и методом капиллярного электрофореза (Капель-105).
6
ГЛАВА III. МНОГОФАКТОРНЫЕ МОДЕЛИ ЭКСТРАКЦИИ
АМИНОКИСЛОТ ГИДРОФИЛЬНЫМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ.
Для исследования влияния различных факторов на экстракцию аминокислот применены методы планирования эксперимента, построены математические модели экстракции двух видов:

для систем с неограниченно растворимым в воде экстрагентом (изопропиловый спирт, модель 1) ;

для систем с частично растворимым в воде экстрагентом
(этилацетат, модель 2).
В качестве основных факторов, влияющих на экстракцию,
изучены: Х1 – массовая доля высаливателя (сульфат лития), мас.
%; Х2 – соотношение объемов водной и органической фаз (r) ; Х3 –
продолжительность экстракции, , мин. Выходной параметр –
соответствующий коэффициент распределения (Y). Применено
центральное композиционное униформ-планирование и выбран
полный факторный эксперимент 23.
В результате статистической обработки экспериментальных
данных (табл. 1) получены уравнения регрессии, адекватно описывающие процесс экстракции с учетом влияния учитываемых
факторов. В качестве примера приводим данные планирования
эксперимента для аланина при экстракции изопропиловым спиртом.
Таблица 1. Матрица планирования эксперимента
Номер
эксперимента
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Кодированные значения факторов
Y
Х2
Х3
20
1
1
1
36
+1
1
1
44
+1
1
1
78
+1
+1
1
26
1
1
+1
29
+1
1
+1
35
+1
1
+1
50
+1
+1
+1
10
0
0
1,682
89
0
0
+1,682
97
0
0
1,682
13
0
0
+1,682
37
0
0
1,682
78
0
0
+1,682
62
0
0
0
54
0
0
0
53
0
0
0
64
0
0
0
55
0
0
0
59
Х1
7
Модель 1
Y = 36,889 + 7,140X1 – 13,100X2 + 3,137X3 + 1,000X1X2 – 8,750X1X3 +
+ 8,000X2X3 11,351X12 2,290X22  2,664X32
Модель 2
Y = 27,691 + 13,374X1 – 9,015X2 + 6,253X3 + 5,14X1X2 – 2,63X1X3 +
+ 2,11X2X3  5,63X12 1,63X22  3,13X32
На основании анализа полученных уравнений регрессии
выделены факторы, оказывающие наибольшее влияние на экстракцию аминокислот. Значения коэффициентов b1 и b2 в уравнениях свидетельствуют о том, что в бòльшей степени на экстракцию влияют содержание высаливателя (Х1) и соотношение объемов водной и органической фаз (Х2). Знак «плюс» указывает на
то, что повышение концентрации высаливателя сопровождается
возрастанием коэффициентов распределения.
Для установления оптимальных условий экстракции применен "ридж-анализ", основанный на методе неопределенных
множителей Лагранжа. При оптимизации условий экстракции руководствовались максимальными значениями коэффициентов
распределения.
При экстракции аминокислот установлены следующие оптимальные интервалы значений параметров:
 в системах с неограниченно растворимыми экстрагентами:
содержание высаливателя 24 – 25 мас.%, соотношение объемов
фаз r = 9 – 10; продолжительность экстракции 12 – 14 мин;
 в системах с ограниченно растворимыми экстрагентами: содержание высаливателя 18  22 мас.%, соотношение объемов
водной и органической фаз r = 10; продолжительность экстракции 13  15 мин.
Для повышения степени извлечения аминокислот из водных
сред изучена экстракция трехкомпонентными смесями растворителей н.бутиловый спирт  этилацетат  ацетон, состав которой
оптимизировали методом симплекс-решетчатого планирования
эксперимента.
8
ГЛАВА IV. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭКСТРАКЦИИ
АМИНОКИСЛОТ.
Изучено влияние структуры растворителей и строения
аминокислот на экстракционные характеристики в системе гидрофильный экстрагент – насыщенный водно-солевой раствор
аминокислот. Установлено, что эффективность распределения
аминокислот в таких системах определяется способностью экстрагентов образовывать с извлекаемым веществом устойчивые
комплексы  сольваты, гидрато-сольваты, ионные ассоциаты.
Процессы гидратации и сольватации аминокислот обусловлены присутствием воды в равновесных фазах экстракционной
системы. Наличие воды в обеих фазах способствует распределению аминокислот из насыщенного водно-солевого раствора в органическую фазу.
Установлено, что ацетон наиболее эффективен как экстрагент в отношении гидрофильных аминокислот (табл. 2).
Таблица 2. Коэффициенты распределения и степень извлечения
аминокислот при экстракции ацетоном; r = 10; n = 4, Р = 0,95
Аминокислота
D
R, %
Аминокислота
D
R, %
Глицин
98,3 ± 7,2
90,8
88,4 ± 6,5
89,8
Аланин
Валин
Лейцин
Изолейцин
Треонин
Лизин
Аргинин
45,5 ± 3,7
38,5 ± 2,8
50,7 ± 4,3
34,4 ± 3,5
84,3 ± 6,1
90,2 ± 6,8
78,4 ± 5,3
81,9
79,4
83,5
77,5
89,4
90,0
88,7
Аспарагиновая
кислота
Аспарагин
Глутамин
Метионин
Фенилаланин
Тирозин
Триптофан
74,6 ± 5,6
69,2 ± 3,8
65,4 ± 4,3
62,3 ± 4,5
73,3 ± 5,0
44,8 ± 3,2
88,2
87,4
86,7
86,1
87,9
81,8
Коэффициенты распределения глицина, треонина, лизина,
аргинина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, глутамина и метионина в системах ацетон – водно-солевой раствор значительно
выше, чем других аминокислот. Ацетон в присутствии 20 – 25
мас.% сульфата лития  эффективный экстрагент аминокислот,
однако не обеспечивает практически полного их извлечения из
насыщенных водно-солевых растворов.
9
При экстракции этилацетатом коэффициенты распределения более гидрофобных аминокислот (аланин, валин, лейцин,
изолейцин, фенилаланин, тирозин, триптофан) выше, чем кислот
с гидрофильным радикалом (табл. 3). Это связано с невысоким
содержанием воды в этилацетатном экстракте, сольватация гидрофильных кислот при этом затрудняется.
Таблица 3. Коэффициенты распределения и степень извлечения
аминокислот при экстракции этилацетатом; r = 10; n = 4, Р = 0,95
Аминокислота
Глицин
73,8 ± 5,4
R,
%
88,1
Аланин
Валин
Лейцин
Изолейцин
Треонин
Лизин
Аргинин
70,3 ± 4,9
76,4 ± 5,2
69,3 ± 4,7
62,1 ± 4,9
29,5 ± 2,8
34,7 ± 3,2
24,5 ± 2,2
87,5
88,4
87,1
86,1
74,7
77,6
71,0
D
Аминокислота
Аспарагиновая
кислота
Аспарагин
Глутамин
Метионин
Фенилаланин
Тирозин
Триптофан
D
R, %
52,6 ± 4,1
84,1
43,8 ± 2,9
40,1 ± 3,5
24,8 ±3,2
97,4 ± 7,6
133 ± 8
85,8 ± 6,2
81,4
80,0
71,3
90,7
92,9
89,5
Изучена экстракция ассоциированным растворителям (бутиловые и пропиловые спирты (табл. 4). Взаимодействие аминокислоты и спирта можно представить схемой:
H3 N+
H
C4H9
O
O
H
CH
R
O
H
C
O
Согласно схеме, спирт проявляет свойства донора протонов, при формировании молекулярных комплексов образуются
водородные связи между СООН- или NН3-группой аминокислоты
и ОН-группой спирта.
Экстракционные характеристики аминокислот в системе с
трет.бутиловым спиртом ниже, чем при экстракции спиртом нормального строения. Это объясняется положительным индукционным эффектом алкильных групп углеводородного радикала  возрастает плотность электронов на атоме кислорода, участвующем
в образовании водородной связи между СООН-группой аминокислоты и ОН-группой спирта. Наиболее эффективные экстрагенты аминокислот – бутиловые спирты (табл. 4).
10
Таблица 4. Коэффициенты распределения и степень извлечения аминокислот при экстракции
пропиловыми и бутиловыми спиртами; r = 10; n = 4, Р = 0,95
Аминокислота
11
Глицин
Аланин
Валин
Лейцин
Изолейцин
Треонин
Лизин
Аргинин
Аспарагиновая
кислота
Аспарагин
Глутамин
Метионин
Фенилаланин
Тирозин
Триптофан
н.Пропиловый
спирт
D
R, %
89,4 ± 6,8
89,9
107 ± 9
91,5
132 ± 10
92,9
116 ± 9
92,0
120 ± 10
92,3
124 ± 9
92,6
87,4 ± 7,2
89,7
78,9 ± 5,9
88,7
54,8 ± 4,3
84,6
Изопропиловый
спирт
D
R, %
74,3 ± 4,8
88,1
98,4 ± 7,3
90,8
101 ± 8
91,0
102 ± 9
91,1
95,3 ± 7,5
90,5
113 ± 9
91,8
76,4 ± 5,8
88,4
65,6 ± 4,6
86,8
48,1 ± 3,7
82,8
н. Бутиловый
спирт
D
R, %
99,4 ± 7,8
90,9
137 ± 9
93,2
157 ± 10
94,0
124 ± 12
93,1
147 ± 11
93,6
166 ± 13
94,3
97,4 ± 7,2
90,6
95,9 ± 8,4
90,5
76,8 ± 5,3
88,5
трет. Бутиловый
спирт
D
R, %
89,3 ± 5,9
81,7
108 ± 9
91,6
132 ± 12
92,9
116 ± 9
92,1
126 ± 10
92,7
143 ± 14
93,5
86,4 ± 6,8
89,6
79,6 ± 5,4
88,4
58,9 ± 3,7
85,4
42,2 ± 3,9
40,3 ± 3,7
38,4 ± 3,4
87,8 ± 7,5
76,1 ± 5,1
96,5 ± 7,8
30,2 ± 2,9
24,9 ± 2,2
30,6 ± 3,1
80,8 ± 6,3
67,3 ± 4,2
80,5 ± 6,0
59,2 ± 4,4
51,1 ± 4,1
47,9 ± 3,2
89,2 ± 6,5
103 ± 10
90,5 ± 8,2
49,2 ± 2,7
44,9 ± 2,2
39,6 ± 2,3
87,4 ± 5,9
75,3 ± 5,2
97,9 ± 8,9
80,8
80,1
79,3
89,8
88,4
90,6
75,1
71,3
75,4
88,9
87,1
88,8
85,5
83,6
82,7
89,9
91,2
90,0
83,1
81,8
79,8
89,7
88,2
90,7
Изучено влияние строения аминокислот на экстракцию.
Наличие в молекулах аминокислот ОН-, NН2-, СООН-групп обусловливает различный механизм экстракции. Так, при экстракции
спиртами коэффициенты распределения фенилаланина значительно ниже, чем тирозина. Электронодонорные свойства заместителя (полярная ОН-группа тирозина), влияющие на прочность
образующихся связей между аминокислотой и экстрагентом, способствуют повышению коэффициентов распределения
Экстракционные характеристики кислых (метионин, аспарагиновая кислота, аспарагин, глутамин) и оснòвных (лизин, аргинин) аминокислот с заряженными R-группами обусловлены присутствием в них различных функциональных групп. Аминогруппа
(лизин, аргинин) снижает экстракционные характеристики аминокислот вследствие влияния ее донорных свойств на степень
сольватации аминокислот.
Аспарагиновая кислота содержит две карбоксильные группы, которые участвуют в образовании водородных связей между
аминокислотой и экстрагентом. Этим объясняются более высокие
коэффициенты распределения аспарагиновой кислоты при экстракции гидрофильными растворителями по сравнению с аспарагином, глутамином, лизином и аргинином.
При сопоставлении коэффициентов распределения кислых
аминокислот установлены следующие закономерности. Независимо от природы экстрагента коэффициенты D возрастают с
уменьшением рК COO кислот в воде. Максимальные коэффициенты распределения характерны для аспарагиновой кислоты (рК


COO = 1,88), затем они снижаются в ряду аспарагин (рК COO =


2,02)  глутамин (рК COO = 2,16)  метионин (рК COO = 2,28).
Для повышения эффективности извлечения аминокислот из
водных сред применяли бинарные и трехкомпонентные смеси
гидрофильных растворителей, содержащие н. бутиловый спирт,
этилацетат и ацетон.
Степень извлечения гидрофильных аминокислот зависит от
содержания воды в экстракте. Экстракты на основе ацетона в отличие от других изученных систем содержат максимальное количество воды. Экстракция смесями этилацетат – ацетон и
н.бутиловый спирт – этилацетат – ацетон описывается синергети-
12
ческими кривыми (рис.1). Синергизм количественно оценивали
по коэффициентам синергетности (табл. 5).
D
600
4
500
Рис. 1. Экстракция аспарагиновой
кислоты смесью н.бутиловый
спирт – этилацетат – ацетон при
различном содержании
1 н.бутилового спирта (мол. доли):
0 (1), 0,1 (2), 0,2 (3), 0,3 (4).
400
300
200
3
100
2
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1
мольная доля ацетона
Таблица 5. Коэффициенты синергетности при экстракции
аминокислот смесями растворителей
Аминокислота
Глицин
Треонин
Лизин
Аргинин
Аспарагин
Глутамин
Смесь растворителей
н.бутиловый спирт 
этилацетат
0,19
0,25
0,22
0,18
0,08
0,17
этилацетат –
ацетон
0,27
0,32
0,25
0,20
0,13
0,21
н.бутиловый спирт 
этилацетат – ацетон
0,32
0,38
0,40
0,32
0,43
0,39
При относительно невысоком содержании воды в ацетоновых экстрактах синергетический эффект практически отсутствует,
увеличение содержания ацетона в смеси повышает количество
воды в экстракте, коэффициенты распределения заметно возрастают.
Ассоциация неполярных групп гидрофобных аминокислот
снижает их растворимость в воде. Экстракция таких аминокислот смесями на основе ацетона сопровождается антагонистическим эффектом. Антагонизм обусловлен вытеснением
аминокислот менее активным компонентом (ацетон) из сольватов с эффективными экстрагентами (этилацетат, н.бутило13
вый спирт). Константы вытеснения аминокислот из сольватов
минимальны при содержании ацетона в смеси не более 0,2 мол.
доли (табл. 6). В таких условиях малоактивный компонент смеси
практически не влияет на прочность образующегося сольвата.
Таблица 6. Константы вытеснения при экстракции
аминокислот смесями растворителей
Аминокислота
Аланин
н.Бутиловый спирт –
Этилацетат –
ацетон
ацетон
содержание ацетона,
мол. доли
0,2
0,4
0,2
0,4
1,24
2,21
1,08
2,53
Валин
1,18
2,56
1,25
2,67
Лейцин
1,38
2,37
1,32
3,24
Изолейцин
2,16
3,03
1,15
3,15
Фенилаланин
1,35
2,87
2,06
3,59
Триптофан
1,65
2,96
1,27
3,18
Для извлечения аминокислот с гидрофобным углеводородным радикалом рекомендуются смесь н.бутиловый спирт –
этилацетат или трехкомпонентные смеси с невысоким содержанием ацетона (не более 0,3 мол. доли).
При экстракции трехкомпонентными смесями гидрофильных растворителей достигается практически полное извлечение
всех изученных аминокислот из водных сред.
Для оптимизации состава трехкомпонентной смеси растворителей построены контурные кривые коэффициентов распределения . По
номограммам находили соотношения компонентов в смеси растворителей, обеспечивающие максимальные экстракционные характеристики аминокислот. В качестве примера приводим номограмму коэффициентов распределения глицина (рис.2).
Максимальные коэффициенты распределения и оптимальные составы смесей растворителей для извлечения аминокислот приведены в табл.7.
14
этилацетат
1,0
0,2
Коэффициенты D
785
700
600
500
400
0,8
0,4
0,6
0,6
0,4
0,8
0,2
1,0
ацетон
0
0,2
0,6
0,4
0,8
1,0
н.бутиловый спирт
Рис. 2. Номограмма коэффициентов распределения глицина
Таблица 7. Коэффициенты распределения и степень извлечения аминокислот в системе смесь гидрофильных растворителей 
водно-солевой раствор; r = 10, n = 4, Р = 0,95
Аминокислота
Аланин
Валин
Лейцин
Изолейцин
Тирозин
Фенилаланин
Триптофан
Глицин
Треонин
Лизин
Аргинин
Аспарагиновая
кислота
Аспарагин
Глутамин
Метионин
Состав смеси экстрагентов,
мол. доли
Коэффициент Степень
н.бутилоэтилацетон распределения извлечения, %
вый спирт ацетат
0,2
0,6
0,2
566 ± 15
98,3
0,1
0,7
0,2
530 ± 10
98,1
0,3
0,6
0,1
634 ± 22
98,4
0,2
0,6
0,2
428 ± 13
97,7
0,5
0,3
0,2
706 ± 25
98,6
0,6
0,2
0,2
685 ± 17
98,5
0,6
0,3
0,1
510 ± 12
98,1
0,5
0,2
0,3
785 ± 23
98,7
0,5
0,3
0,2
655 ± 14
98,5
0,3
0,2
0,5
598 ± 18
98,3
0,6
0,2
0,2
689 ± 25
98,5
0,5
0,1
0,4
835 ± 15
98,8
0,4
0,6
0,4
0,3
0,2
0,1
0,3
0,2
0,5
15
710 ± 12
625 ± 19
543 ± 11
98,6
98,4
98,2
ГЛАВА V. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ
В ВОДНЫХ СРЕДАХ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ
ПРЕПАРАТАХ.
На основании данных об экстракции аминокислот индивидуальными растворителями и их смесями разработаны способы
определения аминокислот в водных средах и фармацевтических
препаратах.
Определение аспарагиновой кислоты, глицина, лизина, валина основано на предварительном экстракционном извлечении
аминокислот из водных растворов и анализе концентратов методами потенциометрического или кондуктометрического титрования. Предлагаемые аналитические решения проверены методом
«введено-найдено» (табл. 8), погрешность определений не превышает 10 %, продолжительность анализа – 20 – 40 мин.
Таблица 8. Определение аминокислот
в водном растворе; n = 4, Р = 0,95
Введено, мг
Найдено, мг
Аспарагиновая кислота
0,0100
0,0098 ± 0,0002
0,1000
0,0960 ± 0,0010
Глицин
0,0500
0,0047 ± 0,0003
0,1000
0,1030 ± 0,0010
Лизин
0,500
0,4950 ± 0,0020
1,000
0,9650 ± 0,0210
Валин
0,0200
0,0016 ± 0,0004
0,0500
0,0052 ± 0,0002
Sr
0,00007
0,0008
0,00009
0,0007
0,0006
0,0065
0,00012
0,00006
Анализ аминокислотных препаратов. В связи с возросшими
объемами фальсификации лекарственных средств актуальность
приобретает разработка способов определения аминокислот в составе фармацевтических препаратов.
Анализ аминокислотных препаратов включает предварительную подготовку образцов (удаление мешающих веществ, перевод определяемых компонентов в раствор), экстракционное извлечение и определение аминокислот методами потенциометрического титрования или капиллярного электрофореза непосредственно в экстрактах.
16
Анализ препарата «МЕТИОНИН» (производство ООО
«ОЗОН» и ООО «СТИ-МЕД-СОРБ»). Подлинность препарата
определяли по характерным качественным реакциям согласно
соответствующей фармакопейной статье. Отсутствие характерного окрашивания при реакциях с нингидрином и нитропруссидом
натрия, а также запаха сероводорода и меркаптана при реакции с
серной кислотой свидетельствуют об отсутствии метионина в
препарате фирмы «СТИ-МЕД-СОРБ».
Экстракт метионина анализировали методами потенциометрического титрования и капиллярного электрофореза (рис. 3,
табл. 9). Расхождения между результатами двух методов не превышают 3 %.
Полученные данные сопоставлены с заявляемым содержанием аминокислоты в препарате «МЕТИОНИН» (25 мг): 4,92 мг
метионина, найденного в экстракте, соответствуют 24,6 мг аминокислоты в препарате. С учетом погрешности определения и потерь при фильтровании подлинность препарата установлена по
качественному и по количественному признакам.
метионин
м е т и о н ин
57 mAU
8
9
10
11
мин, мин
Рис. 3. Электрофореграмма метионина
Таблица 9. Определение активного компонента в препарате
«МЕТИОНИН»; n = 4, Р = 0,95
Capel 7
Введено, мг
Найдено, мг
потенциометрическое титрование
5,00
4,92 ± 0,038
капиллярный электрофорез
5,00
5,05
17
Анализ препарата «ANABOLYC FUELE». Препарат предназначен для питания спортсменов и содержит смесь аминокислот (аргинин, лизин, изолейцин). Анализ включает подготовку
образца и экстракцию активных компонентов смесью гидрофильных растворителей. Экстракт анализировали методом капиллярного электрофореза (рис.4).
лизин
л и зи н
а р ги н и н
аргинин
изолейцин
и -л ей ц и н
47.2 mAU
6
34
Capel
7
8
9
10
11
мин
, мин
Рис. 4. Электрофореграмма препарата «ANABOLYC FUELE»
Результаты определения представлены в табл. 10. Заявляемое содержание аргинина и изолейцина в составе фармацевтического препарата соответствует найденному в экстракте. Количество лизина в препарате занижено в 3 раза.
Таблица 10. Определение аминокислот в препарате
«ANABOLYC FUELE»
Аминокислота
аргинин
лизин
изолейцин
Заявлено
производителем, мг
8,5
6,0
13,0
Найдено
в экстракте, мг
8,42
2,03
13,1
Новизна предлагаемых аналитических решений подтверждена материалами Роспатента, разработанные способы определения аминокислот в водных средах апробированы в лабораториях ОАО «Хлебозавод № 2», ОАО «Хладокомбинат», ОАО «Экспериментальный комбикормовый завод» (Воронеж).
18
Выводы
1. Изучена экстракция - аминокислот в системах с индивидуальными гидрофильными растворителями и их смесями в присутствии высаливателя – сульфата лития. Исследовано влияние
строения аминокислот, свойств и состава экстрагентов, концентрации высаливателя на количественные характеристики экстракции. Установлено, что для извлечения α-аминокислот с гидрофильными углеводородными радикалами наиболее эффективны
бинарные и трехкомпонентные смеси гидрофильных растворителей на основе ацетона, для экстракции α-аминокислот с гидрофобными углеводородными радикалами – смеси на основе этилацетата и н.бутилового спирта. Степень извлечения α-аминокислот
в таких системах достигает 97 – 98 %.
2. С применением математических методов планирования
эксперимента оптимизированы факторы, влияющие на эффективность экстракции α-аминокислот (концентрация высаливателя,
соотношение объемов водной и органической фаз, продолжительность экстракции). В оптимальных условиях экстракционные
характеристики α-аминокислот максимальны. Состав трехкомпонентных смесей экстрагентов оптимизирован методом симплексрешетчатого планирования эксперимента. На основании полученных уравнений регрессии построены номограммы, позволяющие
надежно прогнозировать экстракционные характеристики аминокислот в зависимости от соотношения компонентов в смеси растворителей.
3. Для количественной оценки синергизма при экстракции αаминокислот
рассчитаны
коэффициенты
синергетности
(Кс).Синергетический характер распределения α-аминокислот в
системах с трехкомпонентными смесями растворителей обусловлен изменением активности воды и распределяемых гидратосольватов.. Наибольшие коэффициенты Кс характерны для аминокислот с гидрофильным углеводородным радикалом при экстракции смесями растворителей с повышенным содержанием ацетона.
4. Изучены условия алкалиметрического определения αаминокислот в гидрофильных экстрактах. Установлено, что метод
потенциометрического титрования применим для надежного
определения α-аминокислот в системах с повышенным содержанием ацетона (более 0,4 мол. доли), кондуктометрическое определение α-аминокислот возможно в среде смеси на основе бути19
лового спирта и этилацетата при содержании ацетона не более 0,2
мол.доли.
5. На основании проведенных исследований разработаны
новые способы практически полного (97–98 %-ного) извлечения и
селективного определения α-аминокислот в водных средах и
фармацевтических препаратах с применением трехкомпонентных
смесей растворителей (однократная экстракция). Анализ включает предварительную подготовку образцов (удаление мешающих
веществ, перевод определяемых компонентов в раствор), экстракционное извлечение и определение аминокислот методами потенциометрического титрования и капиллярного электрофореза.
Способы определения аминокислот в водных средах реализуются
в диапазоне концентраций 0,01 – 1,00 мг/дм3.
Основное содержание диссертации изложено
в следующих работах
Изобретения
1. Мокшина Н.Я., Нифталиев С.И., Пахомова О.А. Способ
селективного определения тирозина и фенилаланина в водном
растворе: Патент № 2276784: Заявл.15.03.2005.Опубл. 20.05.2006
Бюл. № 14.
2. Мокшина Н.Я., Нифталиев С.И., Пахомова О.А. Способ
определения глицина в водном растворе. Патент № 2277085. Заявл. 15.03.2005. Опубл. 27.05.2006 Бюл. № 15.
3. Мокшина Н.Я., Нифталиев С.И., Пахомова О.А. Способ
раздельного определения аспарагиновой кислоты и глутамина в
водном растворе. Патент № 2294537. Заявл. 13.02.2006. Опубл.
27.02.2007. Бюл. № 6.
4. Мокшина Н.Я., Нифталиев С.И., Пахомова О.А. Способ
определения лизина в водном растворе. Патент № 2299433. Заявл.
13.02.2006. Опубл. 11.06.2007. Бюл. №14.
5. Мокшина Н.Я., Нифталиев С.И., Пахомова О.А. Способ
определения аланина в водном растворе. Решение о выдаче патента от 4.04.2007. Заявка № 2006122929/ 04 (024883).
6. Мокшина Н.Я., Нифталиев С.И., Пахомова О.А. Способ
раздельного определения триптофана и тирозина в водном растворе. Решение о выдаче патента от 4.04.2007. Заявка №
2006105566 /04 (006022).
7. Мокшина Н.Я., Нифталиев С.И., Пахомова О.А. Способ
селективного определения триптофана и фенилаланина в водном
20
растворе. Решение о выдаче патента от 4.04.2007. Заявка №
2006122128/04 (024029).
8. , Мокшина Н.Я., Нифталиев С.И., Пахомова О.А. Способ
определения валина в водном растворе. Решение о выдаче патента от 4.04.2007. Заявка № 2006122891/ 04(024845).
Статьи
9. Нифталиев, С.И. Экстракция некоторых алифатических
аминокислот из водных растворов с применением смеси гидрофильных растворителей [Текст] / С.И. Нифталиев, Н.Я. Мокшина,
О.А. Пахомова // Хим. технология. 2005. № 5. С. 44 – 46.
10. Пахомова, О.А. Экстракция тирозина и фенилаланина
смесью гидрофильных растворителей из водно-солевого раствора
[Текст] / О.А. Пахомова, Н.Я. Мокшина, С.И. Нифталиев, // Изв.
вузов. Химия и хим. технология. 2005. Т. 48, № 1. С. 109 – 112.
11. Мокшина, Н.Я. Распределение тирозина и триптофана в
системе вода – бутиловый спирт – ацетон – этилацетат – сульфат
лития [Текст] / Н.Я. Мокшина, С.И. Нифталиев, О.А. Пахомова //
Сорбц. и хроматогр. процессы. 2006. Т. 6, №4. С. 642 – 646.
12. Нифталиев, С.И. Экстракция аспарагина гидрофильными
растворителями из водных растворов [Текст] / С.И. Нифталиев,
Н.Я. Мокшина, О.А. Пахомова // Изв. вузов. Химия и хим. технология 2006. Т.49, № 4. С. 8 – 11.
13. Pakhomova, O.A. Biologically active substance analyses utilizing
spectral methods [Текст] / O.A. Pakhomova, N.Ya. Mokshina // Ecological
Congress (USA). 2006. V. 9, № 1. P 5 – 7.
14. Mokshina, N.Ya. Determination of essential amino acids in
the production of fermented solution using extraction from a ternary
mixture of hydrophilic solvents [Текст] / O.A. Pakhomova, N.Ya.
Mokshina // Ecological Congress (USA). 2006. V. 9, № 1. P 9 – 12.
15. Pakhomova, O.A. Extraction-potentiometric determination of
some alyphatic amino acids in extracts based on hydrophilic solvents
[Текст] / O.A. Pakhomova, N.Ya. Mokshina // Ecological Congress
(USA). 2006. V. 9, № 1. P 25 – 27.
16. Пахомова, О.А. Селективное определение триптофана и
фенилаланина в водном растворе [Текст] / О.А. Пахомова, Н.Я.
Мокшина, С.И. Нифталиев, И.В. Трепов //Сб. «Химические науки
- 2006». Вып.3. С. 117 – 121.
17. Нифталиев, С.И. Селективное определение ароматических аминокислот в экстрактах на основе гидрофильных растворителей [Текст] / С.И. Нифталиев, Н.Я. Мокшина, О.А. Пахомова
// Хим. технология. 2006. № 7. С. 45 – 47.
21
18. Нифталиев, С.И. Оптимизация состава трехкомпонентного экстрагента для извлечения аспарагиновой кислоты и глутамина из водных сред [Текст] / С.И. Нифталиев, Н.Я. Мокшина, О.А.
Пахомова // Сорбц. и хроматогр. процессы. – 2006. Т. 6, № 6. С.
1414 – 1418.
19. Мокшина, Н.Я. Электрохимическое определение ароматических аминокислот в экстрактах на основе гидрофильных растворителей [Текст] / Н.Я. Мокшина, О.А. Пахомова, С.И. Нифталиев //
Журн. аналит. химии. 2007. Т.62, № 10. С. 1072–1078.
20. .Пахомова, О.А. Моделирование процесса экстракции ароматических аминокислот в анализе фармацевтических препаратов
[Текст] / О.А. Пахомова, Н.Я. Мокшина, С.И. Нифталиев // Фундаментальные исследования. Хим. науки. 2007. № 2. С. 21 – 25.
21. Коренман, Я.И. Экстракционное разделение тирозина и
глицина [Текст] / Я.И. Коренман, О.А. Пахомова // Современные
наукоемкие технологии. 2007. № 5. С. 16 – 18.
Тезисы некоторых докладов
22. Сорокин, А.Н. Потенциометрическое определение аланина в неводных экстрактах на основе изопропилового спирта, этилацетата и ацетона [Текст] / Сорокин А.Н., Трунова Т.В., Пахомова О.А., Нифталиев С.И., Коренман Я.И. // XV Рос. конф. «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». Екатеринбург, 2005. С.64 - 65.
23. Пахомова, О.А. Применение математических методов
моделирования процессов межфазного распределения аланина,
валина, глицина [Текст] / О.А. Пахомова, Т.В. Трунова, Н.Я. Мокшина // 71 наук. конф. молодих вчених, аспiрантiв i студентiв.
Кiiв, Украiна, 2005. С.82.
24. Мокшина, Н.Я. Раздельное определение тирозина и фенилаланина в водном растворе [Текст] / Н.Я. Мокшина, О.А. Пахомова // II межд. сим. «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии». Краснодар, 2005. С.220.
25. Пахомова, О.А. Моделирование процесса экстракции
ароматических аминокислот из водных растворов методами математической статистики [Текст] / О.А. Пахомова, Я.И. Коренман,
А.С. Сорокин, Т.В. Трунова, М.С. Попков, А.С. Матыцина // III
Междун. конф. «Экстракция органических соединений». Воронеж, 2005. С. 104.
26. Пахомова, О.А. Раздельное определение аспарагиновой
кислоты и глутамина в составе пищевых добавок [Текст] / О.А.
22
Пахомова, И.В. Трепов, Я.И. Коренман // 72-а наук. конф. молодих
вчених, аспiрантiв i студентiв, Киïв, Украiна, 2006. Ч. I. - С. 83.
27. Пахомова, О.А. Селективное определение аспарагиновой
кислоты и глутамина в белковых смесях [Текст] / О.А. Пахомова,
Я.И. Коренман // International Congress on Analytical Sciences ICAS
2006. Москва, 2006.  С. 575.
28. Трепов, И.В. Селективное определение аспарагиновой
кислоты и глутамина в экстрактах на основе гидрофильных растворителей [Текст] / И.В. Трепов, О.А. Пахомова, С.И. Нифталиев, Я.И. Коренман // XVI Рос. конф. «Проблемы теоретической и
экспериментальной химии». Екатеринбург, 2006. С. 49 – 50.
29. Булахтина, И. Н., Трунова Т.В., Пахомова О.А., Коренман Я.И. Экстракционно-потенциометрическое определение аспарагина с применением органических растворителей и их бинарных смесей [Текст] / И. Н. Булахтина, Т.В. Трунова, О.А. Пахомова, Я.И. Коренман //. XVI Рос. конф. «Проблемы теоретической и
экспериментальной химии». Екатеринбург, 2006. С.33  34.
30. Pakhomova, O.A. Selective determination of triptophan and
tyrosine in biologically active food additives [Текст] / O.A.
Pakhomova, N.Ya. Mokshina, S.I. Niftaliev, S. Kopacz, L. Zapała, J.
Kalembkiewicz,// XXI International Symposium on Physico-Chemical
Methods of Separation “Ars Separatoria 2006”. Torun, Poland, 2006. Р.
107.
31. Пахомова, О.А. Электрохимическое определение ароматических аминокислот в пищевых добавках [Текст] / О.А. Пахомова, Н.Я. Мокшина, С.И. Нифталиев // Общерос. конф. «Пищевые
технологии». Казань, 2006. С.198 – 199.
32. Пахомова, О.А. Анализ аминокислотных препаратов методом капиллярного электрофореза [Текст] / О.А. Пахомова, Я.И. Коренман, С.И. Нифталиев // Всерос. конф. «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования». Воронеж, 2007. С. 321.
33. Пахомова, О.А. Экстракционное разделение незаменимых аминокислот в производстве ферментационных растворов
[Текст] / О.А. Пахомова, Я.И. Коренман, С.И. Нифталиев // Всерос.
конф. «Пути и формы совершенствования фармацевтического
образования». Воронеж, 2007. С. 324.
34. Пахомова, О.А.Электрофоретическое определение аминокислот в синтетических лекарственных препаратах [Текст] / О.А.
Пахомова, Г.В. Клоков, Я.И. Коренман // 73 конф. молодих вчених,
аспiрантiв i студентiв, Киïв, Украiна, 2007. Ч. I. С. 111.
23
____________________________________________________________________
Соискатель выражает благодарность доценту кафедры физической и
коллоидной химии Мокшиной Н.Я. и профессору кафедры общей и неорганической химии Нифталиеву С.И. Воронежской государственной технологической
академии за помощь и консультации при работе над диссертацией.
____________________________________________________________________
24