ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ТАТАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
реклама
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ТАТАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ГУМАНИТАРНО-ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» На правах рукописи АНИКИНА ТАТЬЯНА АНДРЕЕВНА ПУРИНЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ СЕРДЦА КРЫС В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ 03.00.13 –физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Казань 2009 Работа выполнена на кафедре анатомии и физиологии Государственного образовательного учреждения Высшего профессионального образования «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» Научный консультант доктор биологических наук, профессор Ситдиков Фарит Габдулхакович Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор Раевский Владимир Вячеславович доктор биологических наук, профессор Нигматуллина Разина Рамазановна доктор медицинских наук, профессор Азин Александр Леонидович Ведущая организация: Государственное учебно-научное учреждение Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Защита состоится «____» __________2009 г. в «_____» на заседании диссертационного совета Д 212.078.02 при ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарнопедагогический университет» по присуждению ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.13-физиология по адресу: г.Казань, ул.Татарстан, д.2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстан, д.2. Автореферат разослан «_____»____________2009 года Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор Зефиров Т.Л. 2 Актуальность исследования. Недавно установленные функции внеклеточной АТФ как трансмиттера и котрансмиттера, регулирующего разнообразные функции организма, в настоящее время находят все новые подтверждения и общее признание. Сегодня трудно найти клетку, в которой нет рецепторов для внеклеточной АТФ. А разнообразие и количество этих рецепторов превышает все известные подтипы рецепторов для «классических» нейромедиаторов и гормонов. Одним из объектов, в котором пуриновые соединения могут играть важную роль является сердце. АТФ проявляет множество эффектов в сердечно-сосудистой системе, включая хронотропный, инотропный и сосудистый. Иммуногистохимический анализ тканей сердца показал широкое распространение чувствительных к внеклеточной АТФ Р2рецепторов на сарколемме проводящих и сократительных кардиомиоцитах (T.Webb et al., 1996; M.Hansen et al., 1999). В сердце крысы обнаружены ионотропные Р2Х1,2,4,5 и метаботропные Р2У1,2,4,6,11 - подтипы пуринорецепторов (G.Vassort, 2001). Интерес к изучению влияния АТФ на деятельность сердца основывается на различных, нередко противоположных результатах. Попрежнему остается нерешенным вопрос том, какое именно соединение оказывает эффект на пуринорецепторы сердца: АТФ или продукт ее гидролиза аденозин? Результаты ранее проведенных исследований привели к убеждению, что механизм действия АТФ основан на непрямом эффекте, наступающем в результате гидролиза АТФ до активного аденозина, действующего на собственные Р1-рецепторы (G. Burnstock and P. Meghji, 1983; G. Froldi et al., 1994, 1997; L.Ren et al., 2003). Согласно последним литературным данным вероятность собственного эффекта АТФ высока. Механизмы положительного хронотропного и инотропного влияния экзогенной АТФ при стимуляции Р2-рецепторов представлены в работах Benham et al., 1987; F.Scamps et al., 1990; J.Zheng et al., 1992; A. Qi and Y.Kwan, 1996; M.Pucéat and G.Vassort, 1996; M. Shoda et al., 1997; M.Jaconi et al., 2000; Q.Liu, R.Rosenberg, 2001; Q.Mei, B.Liang, 2001; J.Shen et al., 2007. Действие АТФ может быть реализовано ее прямым влиянием на кардиомиоциты и изменением активности регуляторных каналов сердца. В настоящее время известно, что АТФ находится в везикулах вместе с АХ или НА и участвует в передаче нервных импульсов, выполняя функции котрансмиттера (G.Burnstock et al., 1989, 1999, 2006, 2009; L.Fieber et al., 1991; A.Pelleg et al., 1997). Исследования подтверждают наличие совместной секреции норадреналина, ацетилхолина и АТФ из симпатических и парасимпатических нервов и способность АТФ модулировать нервную передачу в сердце, увеличивая или ослабляя эффекты, производимые классическими медиаторами (S.Ennion 2000; C.Sesti et al., 2002; S.Boehm et al., 2003). Показано, что АТФ ингибирует освобождение НА через пресинаптические Р2У-рецепторы и ослабляет положительный инотропный 3 эффект при стимуляции симпатических нервов в предсердиях крыс, (I. Kugelgen et al., 1996; B.Sperlagh et al., 2000; D.McKitrick, 2000). Известно, что внеклеточная АТФ вызывает депрессорные рефлексы и брадикардию сердца за счет стимуляции Р2Х-рецепторов, расположенных на вагусных афферентных волокнах, что имеет важное значение при ишемии и гипоксии сердца (G.Katchanov, 1996; A.Pelleg et al., 1997; Z.Xiang, 1998; J.Xu, 2005). Представление о физиологической роли пуриновых рецепторов будет неполным, если не рассмотреть их взаимоотношения с рецепторами для других нейромедиаторов. В литературе имеются сведения о функциональном взаимодействии пуриновых рецепторов с холинорецепторами (A.Шакирзянова и др., 2005; E.Silinsky, R.Redman, 1996; R.Giniatullin, E.Sokolova, 1998; T.Searl, 1998). Исследования, проведенные на кардиомиоцитах предсердий, показали, что экзогенная АТФ на фоне карбахолина двухфазно изменяет длительность потенциала действия, что подтверждает способность АТФ модулировать эффекты основного медиатора (Y.Hara, H.Nakaya, 1997). Взаимодействие между адренорецепторами и пуринорецепторами в сердце может проявляться и при активации внутриклеточных сигнальных путей (M.Pucéat et al., 1998). Согласно гипотезе Д. Бернстока функцию медиатора АТФ начала выполнять еще на начальных этапах эволюции, задолго до появления основных медиаторов. АТФ считается одним из наиболее филогенетически древних нейромедиаторов. Подтверждением этой гипотезы является тот факт, что внеклеточный эффект АТФ обнаруживается у бактерий и диатомовых морских водорослей (G.Burnstock, 1996). Возможно, ионотропные Р2Х-рецепторы, обнаруженные у примитивных организмов появились раньше метаботропных Р1 и Р2У-рецепторов (G. Burnstock, A. Yerhratsky, 2009). Известно, что и в онтогенезе пуринорецепторы появляются одними из первых. Рецепторы к внеклеточной АТФ, наряду с Мхолинорецепторами являются первыми функционально активными мембранными рецепторами, выявляемыми в период формирования зародыша (J.Liou, 1995; L.Sun et al., 1996; J.Shacher, 1997). На сегодняшний день изучение пуринергической регуляции сердца в онтогенезе затрагивает только неонатальный период развития (T.Webb et al., 1996; Y.Bogdanov et al., 1998; M.Hansen et al., 1999; K.Cheung et al., 2003). Многие аспекты функционирования Р2-рецепторов на важнейших этапах раннего постнатального онтогенеза остаются малоизученными, а постсинаптические эффекты АТФ отличаются в различных тканях и на разных этапах онтогенеза. (G.Vassort, 2001). Правомерно было бы предположить, что на ранних этапах постнатального онтогенеза, в условиях незрелости симпатических и парасимпатических регуляторных влияний на сердце, его рецепторного аппарата, возможны разные механизмы влияния АТФ на эффекты основных 4 медиаторов и модулирующее влияние АТФ зависит от этапов биологического созревания организма. Цель и задачи исследования Целью исследования является определение семейства и подтипа Р2пуриноцепторов, участвующих в регуляции сердечной деятельности и изучение влияния стойких аналогов АТФ на функциональную активность адрено- и холинорецепторов миокарда крыс в раннем постнатальном онтогенезе. В работе решались следующие задачи: 1. Установить дозозависимое влияние АТФ на показатели сердечной деятельности крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста in vivo. 2. Изучить влияние АТФ на хронотропную функцию сердца при блокаде β-адренорецепторов и М-холинорецепторов сердца. 3. Изучить дозозависимое влияние стойкого аналога АТФ - α,βметиленАТФ на показатели сердечной деятельности крыс 14-, 21-, 56-, 100суточного возраста in vivo. 4. Определить влияние АТФ и α,β-метилен-АТФ на хронотропную реакцию сердца при блокаде Р2-, и Р2У- рецепторов. 5. Определить влияние α, β–метилен-АТФ на хронотропную реакцию сердца при блокаде Р2Х 1 - рецепторов. 6. Установить дозозависимое влияние АТФ на сократимость миокарда крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста in vitro. 7. Изучить дозозависимое влияние стойкого аналога АТФ - 2метилтиоАТФ на сократимость миокарда крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста in vitro. 8. Изучить влияние 2-метилтиоАТФ на сократимость миокарда крыс 14 - 100-суточного возраста при блокаде Р2Х и Р2У-рецепторов. 9. Изучить дозозависимое влияние агониста Р2Х1-рецепторов β¸γ – метиленАТФ на показатели сердечной деятельности крыс 14-, 21-, 56-, 100суточного возраста в условиях in vivo и in vitro. 10. Определить влияние β¸γ –метилен-АТФ на сократимость миокарда при блокаде Р2Х1 – рецепторов. 11. Исследовать влияние совместного внутривенного введения α,βметиленАТФ с норадреналином и ацетилхолином на показатели сердечной деятельности крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста in vivo. 12. Исследовать совместное влияние 2-метилтио-АТФ и карбахолина, 2-метилтио-АТФ и изопротеренола на сократимость миокарда крыс 14-, 21-, 56-, 100-суточного возраста. 5 Положения, выносимые на защиту: 1. АТФ и ее стойкие аналоги повышают сократимость миокарда и частоту сердечных сокращений у крыс 14-100 – суточного возраста за счет активации Р2Х1-рецепторов. 2. На ранних этапах постнатального онтогенеза наблюдается гетерохронное проявление функциональной активности разных подтипов Р2Х-рецепторов в предсердиях и желудочках сердца крыс. Роль Р2Хрецепторов в положительном инотропном эффекте от 14- к 100-суточному возрасту в предсердиях снижается, а в желудочках возрастает. 3. Чувствительность сердца к агонистам Р2-пуриноцепторов от 14- к 100-суточному возрасту снижается. 4. Стойкие аналоги АТФ модулируют адренергическую и холинергическую регуляцию сократимости миокарда разнонаправленно на разных этапах раннего постнатального онтогенеза крыс. Научная новизна В работе впервые показано, что все используемые агонисты Р2пуриноцепторов: АТФ, ά,β –метиленАТФ, 2–метилтиоАТФ и β,γметиленАТФ вызывают дозозависимое увеличение частоты сердечных сокращений и силы сокращения миокарда предсердий и желудочков. Концентрации агонистов, вызывающие положительный инотропный и хронотропный эффект от 14- к 100-суточному возрасту повышаются, что указывает на более высокую чувствительность миокарда к агонистам Р2Хрецепторов на ранних этапах постнатального онтогенеза, это 14- и 21суточные животные. Использование селективного агониста и блокатора пуриноцепторов β, γ-метиленАТФ и TNP АТФ позволило установить подтип Р2Х-рецепторов, участвующих в повышении частоты сердечных сокращений и силы сокращения миокарда. Доказано, что в реализации положительного хронотропного и инотропного эффекта принимают участие Р2Х1-рецепторы. Впервые показаны возрастные особенности реакции сократимости миокарда на стимуляцию агонистами Р2-пуринорецепторов. Максимальная реакция силы сокращения миокарда на 2–метилтиоАТФ и β,γ-метиленАТФ наблюдается у 21- и 14-суточных крысят достоверно снижаясь к 100суточному возрасту. Проведенные серии экспериментов с использованием разнообразных агонистов и блокаторов позволили получить новые данные о возрастных особенностях реакции различных подтипов Р2-рецепторов в регуляции сократимости миокарда в постнатальном онтогенезе. Впервые показано гетерохронное проявление функциональной активности разных подтипов Р2Х - рецепторов в предсердиях и желудочках крыс в раннем постнатальном онтогенезе. Роль Р2Х - рецепторов в увеличении силы и длительности сокращения в предсердиях от 14- к 100-суточному возрасту снижается, а в желудочках возрастает. Участие Р2Х4 -рецепторов в повышении 6 сократимости миокарда желудочков на ранних этапах онтогенеза незначительно и проявляется только у 100-суточных крыс. При изучении совместного влияния 2-метилтиоАТФ, карбахолина и изопротеренола выявлено, что АТФ модулирует адренергическую и холинергическую регуляцию сократимости миокарда разнонаправлено на разных этапах раннего постнатального онтогенеза крыс. У крыс 21- и 56суточного возраста совместное действие агонистов β – адренорецепторов изопротеренола и Р2Х-рецепторов 2-метилтиоАТФ приводит к развитию однонаправленного, аддитивного эффекта в увеличении сократимости миокарда. Эффект совместного влияния агонистов Р2-рецепторов 2-метилтиоАТФ и М2-холинорецепторов карбахолина на сократимость миокарда может быть усиливающим или ингибирующим в зависимости от возраста крыс. У 21суточных крысят 2-метилтиоАТФ снижает угнетающий эффект КХ на сократимость миокарда предсердий и желудочков и усиливает у 14суточных. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты значительно расширяют представление о физиологической роли внеклеточной АТФ, участии разных подтипов Р2Хрецепторов в сердечной деятельности крыс в раннем постнатальном онтогенезе. Результаты проведенного исследования углубляют имеющиеся на настоящее время сведения о роли АТФ в качестве модулятора эффектов классических медиаторов на ранних этапах постнатального онтогенеза крыс, в условиях незрелости регуляторных симпатических и парасимпатических влияний на сердце. Материалы исследований заслуживают внимания со стороны специалистов по возрастной и нормальной физиологии и кардиологии. Апробация работы Материалы исследований доложены на Всероссийской научной конференции «Физиология сердца» (Казань, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); ХХ Съезде Физиологического Общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); VII Всероссийском научном симпозиуме «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке», (Казань, 2006); Всероссийской конференции по физиологии кровообращения, ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова (Москва, 2008); VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); IX Всероссийской научно-теоретической конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма» (Казань, 2006, 2008); на заседании Татарского отделения Физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 2009); Международной конференции «Физиология развития человека» Института возрастной физиологии РАО (Москва, 2009); на итоговых научных конференциях профессорско-преподавательского состава Татарского 7 государственного гуманитарно-педагогического университета (2005-2008), на заседаниях кафедры анатомии, физиологии и охраны здоровья человека ТГГПУ (Казань, 2005-2009). Основное содержание работы отражено в 32 работах. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 287 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания организации и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 48 таблиц и 37 рисунков. Список литературы включает 511 источников, из них 115 отечественных и 396 зарубежных авторов. ОРГАНИЗАЦИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводились в условиях in vivo и in vitro. Исследования проведены на 1052 разнополых лабораторных беспородных белых крысах стадного разведения. Исследовали 4 возрастные группы животных: 14-, 21-, 56-, и 100-суточного возраста. Методика регистрации сократимости полосок миокарда. Сократительную активность миокарда в эксперименте in vitro изучали на полосках предсердий и желудочков. Определение реакции сократительной функции миокарда на действие агонистов проводили на установке "PowerLab" ("ADInstruments") с датчиком силы "MLT 050/D" ("ADInstruments"). Запись кривой регистрировали на персональном компьютере при помощи программного обеспечения "Chart 5.0". Рассчитывали абсолютные значения силы сокращения в граммах и общую длительность изометрического сокращения полосок миокарда в секундах, а также оценивали процент изменения на действие агониста в процентах от исходных показателей, которые принимали за 100%. Из правого желудочка и предсердия при помощи специальных ножниц и пинцетов препарировали полоски. Длина полосок составляла 1,5-2 мм, ширина не превышала 1мм. Препарат фиксировали вертикально одним концом к датчику силы, другим — к точке опоры, затем каждый препарат погружали в отдельный резервуар объемом 10 мл, в который подавался рабочий раствор. Состав раствора Кребса (в г/л): NaСl- 8 г; KCl- 0,3г; CaCl2- 3 мл; MgSO4 –0,5 мл; NaH2PO4- 0,04 г; глюкоза – 2 г; Trizma HCl- 2.4-3.9 г/л; Trizma base- 0.25 г/л (Sigma). Раствор постоянно аэрировали карбогеном 95% O2 и 5% CO2, рН поддерживали в пределах 7.3-7.4 После погружения препаратов в резервуары следовал "период приработки" в течение 40-60 мин, в ходе которой мышечным полоскам постепенно придавалось оптимальное натяжение. По окончании приработки 10 мин регистрировали исходные параметры сокращения, затем в течение 20 мин с добавлением в рабочий раствор агониста одной из концентраций. Агонисты Р2-рецепторов: АТФ, 2-метилтиоАТФ, β,γ-метиленАТФ добавляли в различных концентрациях и оценивали изменения сокращений полосок миокарда крыс. По окончании стимуляции агонистами препараты трехкратно 8 отмывали рабочим раствором в течение 10 мин, затем регистрировали исходные показатели для каждой последующей дозы. Для изучения совместного влияния 2-метилтио-АТФ карбахолина и изопротеренола записывали влияние карбахолина или изопротеренола в контроле, затем полоски отмывали, записывали исходную сократимость в течение 10 мин, вновь добавляли карбахолин или изопротеренол и на 10 мин добавляли 2метилтиоАТФ. Также проводили эксперименты с обратной последовательностью подачи веществ, когда карбахолин или изопротеренол добавляли на фоне действия 2-метилтиоАТФ. Методика регистрации электрокардиограммы и реограммы. В экспериментах in vivo регистрировали ЭКГ на электрокардиографе ЭК1Т04, с которого сигналы через аналого-цифровой преобразователь передавались на ЭВМ и для визуального контроля параллельно поступали в осциллограф С1- 83. Для определения величины ударного объема крови сердца растущих крыс, применяли метод тетраполярной реоплетизмографии, разработанный Кубичеком с соавторами (W.Kubicek, 1974) в модификации Б.С. Кулаева и Р.А. Абзалова. Регистрация дифференцированной реограммы осуществлялась при естественном дыхании, параллельно с электрокардиограммой с помощью реоплетизмографа РПГ - 204. Статистической обработке подвергались ЧСС, УОК и 2 параметра вариационной пульсограммы - амплитуда моды (АМо) и вариационный размах (ΔХ), отражающие активность симпатической и парасимпатической нервной системы. Фармакологические препараты в условиях in vivo вводили в яремную или бедренную вену. В экспериментах использовали следующие вещества: агонисты Р2Х-пуринорецепторов аденозинтрифосфорную кислоту (АТФ) 104 М (0,02 мг/кг); α,β-метилен АТФ 10-4М (0,02 мг/кг); β,γ-метилен АТФ (Во, 2002); сурамин (20мг/кг) (McQueen, et al., 1998); реактив голубой-2 (5 мг/кг) (Kichenin et al., 2000); TNP-АТР (0,8 мг/кг) (King et al., 2004); ацетилхолин хлорид 10-4М (20 мкг/кг); норадреналин битартрат (3,2 мкг/кг). Препараты АТФ, α,β-метилен АТФ, сурамин, реактив голубой-2, РРADS, TNP-АТР, β,γметилен АТФ, ацетилхолин, карбахолин, изопротеренол производства фирмы «Sigma». Все остальные вещества отечественного производства. Достоверность различий в экспериментах в условиях in vitro определяли с использованием непараметрического парного и непарного критерия Стьюдента. В экспериментах in vivo достоверность различий в связанных группах устанавливали с использованием непараметрического критерия Вилкоксона. Достоверными считались результаты при р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние экзогенных АТФ и аденозина на деятельность сердца крыс в онтогенезе. Для определения влияния АТФ в зависимости дозаэффект животным внутривенно вводили растворы АТФ в концентрации 10-3 10-6М объемом 0.075 мл (Рис. 1). Введение раствора АТФ в концентрации 10 9 М не оказало действия. АТФ в концентрации 10 -5М в течение 1 мин вызывала небольшое, но достоверное увеличение ЧСС. К концу 1-й минуты ЧСС возвращалась к исходным значениям и сохранялась на этом уровне в течение 10 мин наблюдения. Увеличение концентрации АТФ до 10 -4М (0,02мг/кг) привело к усилению хронотропного эффекта с 387±10,5 уд/мин до 415± 13,4 уд/мин (n=12; р<0,05). Также определяли дозозависмый эффект на введение АТФ животным 14-, 21-, 56- и 100-суточного возраста. Внутривенное введение АТФ в концентрации 10-6М вызывает увеличение частоты сердечных сокращений без изменения ударного объема крови у 14- и 21-, -суточных крыс, а в концентрации 10-4М у 56- и 100-суточных. Наблюдаемые изменения ЧСС могли быть связаны как с прямым эффектом АТФ на сердце, так и с действием аденозина, который образуется при гидролизе АТФ и может действовать через собственные Р1-рецепторы. Введение аденозина в концентрации 10-4М не привело к изменению основных показателей работы сердца. Следовательно, увеличение ЧСС было вызвано прямым действием экзогенной АТФ. 6 ЧСС уд/мин * АТФ 10-3М АТФ 10-5М 7м ин 10 ми н 5м ин 3м ин 2м ин 1м ин 40 с 20 с АТФ 10-4М 10 с ис хо д. 420 410 400 390 380 370 360 350 340 Рис. 1. Изменение ЧСС при внутривенном введении АТФ разных концентраций животным 100 – суточного возраста; * - р ≤0,05. Положительное хронотропное действие АТФ на сердце могло быть обусловлено как действием АТФ на миокард, так и изменением активности симпатических и парасимпатических каналов регуляции. В следующей серии экспериментов изучали влияние экзогенной АТФ на фоне блокады βадренорецепторов обзиданом и М-холинорецепторов атропином. При введении АТФ 10-4М при блокаде β- адренорецепторов наблюдали такое же, как в контроле, увеличение ЧСС к 20секунде (р<0,05) (Рис.2). При воздействии АТФ на фоне блокады М-холинорецепторов атропином характер изменений ЧСС был таким же. Сохранение положительного эффекта АТФ на фоне блокады как β- адренорецепторов, так и Мхолинорецепторов, позволяет высказать предположение о прямом действии АТФ на сердце. * 10 ЧСС уд/мин 410 390 370 350 330 310 290 270 250 АТФ 10-4М на фоне обзидана АТФ 10-4М на фоне атропина * исх. 10с 20с 40с 1мин 2мин 3мин 5мин 7мин 10мин Рис. 2. Динамика ЧСС при введении АТФ на фоне блокады М-холинорецепторов и β-адренорецепторов сердца 100 – сут. животным Влияние α,β – метиленАТФ на деятельность сердца крыс в онтогенезе. Известно, что АТФ является неcтойким веществом и в присутствии экто-АТФазы быстро разрушается до аденозина при однократном прохождении через сердце (G. Vassort, 2001). Поэтому в следующей серии экспериментов был использован стойкий аналог АТФ - α,β – метиленАТФ. Устойчивый к энзиматическому распаду α,β – метиленАТФ является агонистом преимущественно для Р2Х-рецепторов. Для определения зависимости доза-эффект использовали растворы α,β – метиленАТФ в концентрации 10-11–10-4М. Стойкий аналог АТФ α,β-метилен АТФ увеличивает ЧСС в концентрациях 10-10М у 14 -суточных крысят, 10-7М у 21и 56-суточных и 10-4М – у 100- суточных. Эффект экзогенного α,β – метиленАТФ был кратковременным, таким же как действие АТФ, что возможно, вызвано быстрой десенситизацией Р2рецепторов сердца. Известно, что α,β – метилен АТФ селективно снижает чувствительность Р2Х-рецепторов к агонистам (V.Ralevic et all., 1998). Влияние сурамина на показатели сердечной деятельности крыс. Для подтверждения влияния АТФ и ее аналогов на Р2-рецепторы в следующей серии экспериментов изучали влияние экзогенных пуринов на сердечную деятельность в условиях их блокады. Неселективным блокатором Р2-рецепторов является сурамин. Блокада сурамином Р2-рецепторов в концентрации 20 мг/кг при внутривенном введении длится более часа (McQueen et al., 1998). Внутривенное введение экзогенных АТФ и α,βметилен АТФ на фоне неселективного антагониста Р2-рецепторов сурамина не вызывает достоверных изменений ЧСС, УОК у крыс 14 - 100-суточного возраста. Следовательно, положительное хронотропное влияние экзогенных АТФ и α,β-метилен АТФ осуществляется через Р2-рецепторы сердца крыс. Влияние АТФ и α,β – метиленАТФ на показатели деятельности сердца при блокаде Р2У-рецепторов. Для определения семейства Р2рецепторов, участвующих в положительном хронотропном эффекте 11 использовали селективный блокатор Р2-рецепторов реактив голубой-2 с преимущественным действием на Р2У-рецепторы. Свой блокирующий эффект реактив голубой-2 (производное антрахиносульфаниловой кислоты) проявляет в узком диапазоне концентраций и коротком времени инкубации, которая длиться не более 60 минут (A.Зиганшин и др., 1999; Hopwood, 1987). Для Р2-рецепторов сердца крысы подтверждено существование эффективной блокады Р2У-рецепторов реактивом голубым-2 (G.Burnstock, 2006). Введение АТФ в концентрации 10-6-10-4М, α,β-метилен АТФ в концентрации 10-10 - 10 -4М животным 14 - 100-суточного возраста на фоне реактива голубого-2 увеличивает ЧСС к 15-17 секунде после введения во всех возрастных группах. Введение α,β-метилен АТФ в концентрации 10-10М на фоне реактива голубого-2 14-суточным крысятам увеличивает ЧСС с 357±3,6 уд/мин до 369±4,1 уд/мин (р<0,05). У 21-суточных крысят положительный хронотропный эффект с 438 ±2,2 до 450 ±3,3 уд/мин (р<0,05) возникает при введении α,β-метиленАТФ в концентрации 10-7М (р<0,05). Введение α,β-метилен АТФ в концентрации 10-4М на фоне реактива голубого-2 у 56-суточных крыс увеличивает ЧСС с 394±2,8 уд/мин до 405±2,3 уд/мин (р<0,05) и 100-суточных с 354±3.0 уд/мин до 364±2,7 уд/мин (р<0,05). Таким образом, появление положительного хронотропного эффекта у крыс всех возрастных групп при введении АТФ и α,β-метиленАТФ на фоне блокады Р2У-рецепторов указывает на активацию Р2Х-рецепторов. Влияние α,β – метиленАТФ на показатели сердечной деятельности крыс при блокаде Р2Х1 – рецепторов. Для определения подтипа Р2Хрецепторов, участвующих в положительной хронотропной реакции при влиянии АТФ и ее аналогов использовали селективный блокатор TNP-АТФ (2´,3´-о-(2,4,6-тринитрофенил) аденозин- 5 – трифосфат), который является производным АТФ. Это сильный и неконкурентный антагонист Р2Х1пуриноцепторов сердца (G.Vassort, 2001; P.Honore et al., 2002; J. Xu et al., 2004). Он используется для характеристики нативных Р2Х1- Р2Х2/3- и Р2Х3рецепторов в низкой наномолярной концентрации (E.Burgard et al., 2000). Длительность ингибирующего эффекта TNP-АТФ в концентрации 0,8 мг/кг составляет более 15 минут (K.King еt al., 2004). Внутривенное введение α,βметилен-АТФ в концентрации 10-10М 14-суточным и в концентрации 10-7М 21-суточным крысятам на фоне TNP-АТФ не приводит к изменению основных показателей деятельности сердца. Введение α,β-метилен-АТФ в концентрации 10-4М 56- и 100- суточным крысам на фоне TNP-АТФ не вызывает изменений ЧСС, УОК, АМо и ∆Х . Влияние агониста Р2Х1 - рецепторов на деятельность сердца крыс в онтогенезе. Синтетическим аналогом АТФ является β,γ-метиленАТФ. В некоторых литературных источниках его определяют как селективный агонист Р2Х1-пуринорецепторов (X.Bo, 2002; B.Hu et al., 2002). Другие исследователи считают, что к нему чувствительны Р2Х1-, Р2Х3- и Р2Х 2/3 – рецепторы (A.Nort, 2002). Этот агонист является нестойким соединением и 12 во многих тканях распад β,γ-метиленАТФ до аденозинового аналога происходит за 1 мин (A.Nort., 2002), поэтому введение препарата проводили в яремную вену. В доступной нам литературе не удалось найти ссылок на дозировку используемого агониста, рекомендуемую в опытах in vivo. Влияние агониста на деятельность сердца изучали в большом диапазоне концентраций с 10-14 по 10-4М (рис. 3). Нами установлено, что β,γ-метиленАТФ в концентрации 10-13–10-8М вызывает дозозависимое увеличение ЧСС в зависимости от возраста крыс. Внутривенное введение агониста к 15-17 секунде повышает ЧСС 14-сут. животным в концентрации 10-13М эксперимента, 21-суточным крысятам в концентрации 10-11М, 56-и 100 суточным крысам в концентрации 10-8М (р<0,05). Полученные результаты подтверждают участие Р2Х1-пуриноцепторов в реализации положительного хронотропного эффекта. ЧСС уд/мин А 380 * 375 370 365 10-11М 360 10-12М 355 10-13М 350 10-14М 345 340 335 330 исх 17с 35с 1мин 2мин 3мин 5мин 7мин 10мин ЧСС уд/мин Б 435 430 * 425 10-8М 420 10-7М 415 10-9М 410 405 400 исх 15с 30с 45с 1мин 2мин 3мин 5мин 7мин 10 мин Рис. 3. Изменение частоты сердечных сокращений 14- (А) и 56 -суточных крыс (Б) при внутривенном введении раствора различных концентраций β,γ-метилен АТФ. * достоверно по сравнению с исходным значением *р<0,05 Таким образом, все используемые агонисты Р2-пуриноцепторов: АТФ, α,β–метилен-АТФ и β,γ-метилен-АТФ вызывают дозозависимое от возраста увеличение ЧСС. От 14 к 100-суточному возрасту концентрации АТФ и ее аналогов, вызывающие положительную хронотропную реакцию снижаются. Полученные результаты указывают на более высокую чувствительность 13 сердца к агонистам Р2Х - рецепторов на ранних этапах постнатального онтогенеза. Все агонисты Р2Х-рецепторов вызывают кратковременное, но достоверное увеличение ЧСС у 14-100 суточных крыс. Данный эффект развивается быстро и длится недолго. В основе механизма положительного хронотропного эффекта АТФ лежит возбуждение Р2Х–рецепторов, активация неселективных катионных каналов с преобладанием проницаемости для ионов кальция. Вызванная деполяризация клетки является достаточной для активации потенциалзависимых Са2+ каналов и дополнительному току Са2+ внутрь клетки. В ряде работ показана значительная роль внеклеточной АТФ в появлении кальциевых токов и развитии ПД в клетках синусно-предсердного узла (F.Scamps and G. Vassort, 1990; A.Christie, 1992; Y.Qi and Y.Kwan, 1996). С другой стороны, трудно ожидать значительный эффект на ритм синусного узла, потому что внеклеточная АТФ активирует независимый от времени, слабо входящий неселективный катионный ток (M.Shoda et al., 1997). Таким образом, АТФвызванные неспецифические катионные токи деполяризуют клеточную мембрану и вызывают спонтанную автоматию. Влияние совместного введения норадреналина и α, β-метилен-АТФ на показатели сердечной деятельности крыс в онтогенезе. Введение НА в концентрации 10-5М 14-суточным крысятам увеличивает ЧСС на 5%, УОК достоверно не меняется. Совместное введение НА и α¸β-метиленАТФ приводит к увеличению ЧСС на 20% (р<0,005) и не изменяет УОК (Рис. 4). Введение НА 21-сут. крысам увеличивает ЧСС на 21%, УОК на 12% (р<0,005). Совместное введение НА и α¸β-метиленАТФ приводит также к достоверному увеличению ЧСС и УОК на 17%. Введение НА 56-сут. животным увеличивает ЧСС на 14%, УОК на 47% (р<0,005). Совместное введение НА и α¸β-метилен-АТФ приводит к увеличению хронотропной реакции на 18% и увеличению УОК на 75% (р<0,005). У 100-сут. крыс введение НА увеличивает ЧСС на 20%, УОК на 42% (р<0,005). Совместное введение НА и α¸β-метилен-АТФ повышает ЧСС только на 7% (р<0,05), УОК при этом не изменяется (Рис. 5). Хронотропная реакция сердца на введение НА меняется в постнатальном онтогенезе. Минимальная реакция ЧСС наблюдается у 14-сут. животных (р<0,05), которые не имеют сформированную симпатическую иннервацию сердца и максимальная у 21- и 100-суточных животных. Совместное введение α,β-метилен-АТФ и норадреналина достоверно уменьшает хронотропный ответ у 100-суточных крыс на 13% (р<0,05) и увеличивает его у 14- суточных на 15% (р<0,05) по сравнению с введением норадреналина. 14 450 * ЧСС, уд/мин 400 350 300 250 200 НА 10-5М НА 10-5М + α,β-метилен АТФ 10-10М исх. реакция макс. реакция Рис. 4. Изменение ЧСС у 14-суточных крыс при внутривенном введении растворов НА 10-5М и НА с α,β -метилен АТФ 10-10М. * достоверно по сравнению с исходным значением *р<0,05. 500 ЧСС, уд/мин 450 ** * 400 350 300 250 200 НА 10-5М НА 10-5М + α,β-метилен АТФ 10-10М исх. реакция УОК, мл 0,23 макс. реакция * 0,175 0,12 0,065 0,01 НА 10-5М НА 10-5М + α,β-метилен АТФ 10-10М макс. реакция исх. реакция Рис. 5. Изменение показателей сердечной деятельности 100-суточных крыс при внутривенном введении растворов НА 10-5М и НА с α,β -метилен АТФ 10-4М. * достоверно по сравнению с исходным значением *р<0,05, **р<0,005 Влияние совместного введения ацетилхолина и α,β-метиленАТФ на показатели сердечной деятельности крыс в онтогенезе. У 14-суточных крысят введение АХ в концентрации 10-4М увеличивает ЧСС на 8% и уменьшает УОК на 12% (р<0,05). Совместное введение АХ и α,β-метилен15 АТФ приводит к положительному хронотропному эффекту, который составляет 4% и отсутствию изменений УОК. Максимальное снижение ЧСС и УОК на введение АХ наблюдается у 21-суточных крысят и составляет 12% и 16% соответственно. Совместное введение АХ и α,β-метиленАТФ уменьшает ЧСС на 3% и УОК на 2% (Табл. 1, 2). У 56-суточных крыс введение АХ снижает ЧСС на 4%, УОК на 18% (р<0,05). Совместное введение агонистов приводит к появлению положительной хронотропной реакции (5%) и снижению УОК на 18%. У 100-суточных животных введение АХ уменьшает ЧСС на 5% и повышает УОК на 13% (р<0,05). При совместном введении агонистов ЧСС уменьшается на 13%, а УОК повышается на 17% (р<0,05). В наших экспериментах влияние АХ вызывает разную реакцию на ЧСС и УОК в онтогенезе. Хронотропная реакция сердца при введении АХ снижается от 21 - к 100-суточному возрасту. У 21-и 56-суточных крысят совместное введение АХ и α, β – метиленАТФ приводит к появлению кардиотропного эффекта АТФ. Ингибирующий эффект ацетилхолина уменьшается у 21-суточных, а у 56суточных отрицательный хронотропный эффект АХ меняется на положительный (р<0,05). У 100-суточных животных совместное действие агонистов усиливает хронотропный эффект АХ и значительно повышает УОК (р<0,05). Таблица 1 Показатели сердечной деятельности 21-суточных крыс при введении ацетилхолина 10-4М Показатели сердечной деятельности ЧСС, уд/мин время исх 456±7,0 0,0143± УОК мл 0,0007 15с 402±10,2 ** 0,0121± 0,0008 * 30с 45с 1мин 3мин 5мин 10мин 415±10,2 428±8,5 442±9,4 446±5,6 450±5,5 456±6,5 0,0147± 0,00144± 0,0145± 0,0154± 0,0150± 0,0147± 0,001 0,001 0,0008 0,001 0,001 0,0009 Таблица 2 Показатели сердечной деятельности 21-суточных крыс при совместном введении ацетилхолина 10-4М и α,β-метилен АТФ 10-7М Показатели сердечной деятельности ЧСС, уд/мин УОК мл время исх 458±5,4 15с 441±7,3 * 30с 45с 1мин 3мин 5мин 10мин 448±7,2 451±6,3 461±7,8 460±6,0 457±3,6 456±3,7 0,0145± 0,0141± 0,0148± 0,0150± 0,0150± 0,0149 0,0148± 0,0144± 0,0008 0,0008 0,0009 0,001 0,001 0,001 0,001 0,003 * - достоверно по сравнению с исходным значением *р<0,05, ** р<0,005 16 В экспериментах на целостном организме трудно разграничить сердечные, сосудистые и регуляторные влияния экзогенной АТФ. Известно, что АТФ регулирует сосудистый тонус, освобождаясь как котрансмиттер с НА из симпатических нервов, вызывая вазоконстрикцию и вазодилатацию при участии пуринорецепторов на гладкомышечных стенках сосудов и эндотелиальных клетках внутри просвета сосуда. АТФ также модулирует активность регуляторных каналов сердца. Для изучения прямого влияния АТФ на сердце следующие серии экспериментов проводили in vitro - на полосках миокарда. Влияние АТФ и аденозина на сократимость миокарда крыс в раннем постнатальном онтогенезе. АТФ является агонистом всех подтипов Р2-рецепторов. Однако, ее действие как агониста Р2-рецепторов очень кратковременно вследствие быстрого разрушения внеклеточными нуклеотидазами. АТФ в концентрации 10-7М–10-6М вызывает увеличение силы сокращения миокарда желудочков (Рис. 5). Увеличение концентрации АТФ до 10-5-10-4М угнетает сократимость полосок миокарда. Чем же вызван отрицательный эффект высоких концентраций АТФ на сократимость миокарда? Долгое время влияние АТФ на сердце связывали с ее распадом до аденозина, который оказывает отрицательное хронотропное и инотропное действие через Р1-пуринорецепторы. Однако, существует ряд экспериментальных доказательств прямого действия АТФ на сердце через свои собственные Р2-рецепторы, независимо от ее превращения в аденозин. Поэтому в следующей серии экспериментов изучали влияние АТФ на сократимость полосок миокарда на фоне неселективного блокатора Р1пуринорецепторов 8-фенилтеофелина в концентрации 10-3М (A.Rubino et al., 1992). При блокаде Р1-рецепторов отрицательный инотропный эффект высоких концентраций АТФ не сохраняется (Рис. 6). Следовательно, внеклеточная АТФ вызывает положительный инотропный эффект миокарда желудочков за счет активации Р2-пуринорецепторов. 50 % 40 30 20 10 0 -10 -8 -20 -30 -40 -50 14 дней * * * * -7 -6 -5 lg, концентрации -4 * * 21 дней 56дней 100дней Рис. 5. Влияние АТФ на сократимость миокарда желудочков растущих крыс * - достоверно по сравнению с исходным значением: р<0,05 17 40 % * * 35 30 25 * * * 20 * 15 * * * 10 5 0 -8 -7 14 -6 lg, концентрации 21 56 -5 -4 100 Рис. 6. Влияние АТФ на сократимость полосок желудочков миокарда крыс после блокады Р1 пуринорецепторов 8-фенилтеофеллином. *- достоверно по сравнению с исходным значением *р<0,05 Влияние 2-метилтиоАТФ на сократимость миокарда крыс в постнатальном онтогенезе. Подтипы Р2-рецепторов отличаются не только особенностями молекулярной структуры, но и чувствительностью к действию различных производных пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Выбор препарата 2-метилтиоАТФ определялся тем, что он является стойким аналогом АТФ, а также агонистом как Р2Х-, так и Р2Y1рецепторов сердца. Установлено, что 2-метилтиоАТФ в концентрации 10-10М–10-6М вызывает дозозависимое увеличение силы сокращения полосок миокарда предсердий и желудочков 14-100 суточных крыс (Рис. 7; табл. 2). У 14суточных 2-метилтиоАТФ в концентрации 10-8М увеличивает сократимость предсердий на 15,4+2,06% (р<0.01), желудочков на 25,8+6,1% (р<0.01). У 21дневных агонист в концентрации 10-7М увеличивает силу сокращения предсердий и желудочков приблизительно на 31,3± 5,8 % (р<0.01). У 56суточных при действии 2-метилтио-АТФ в концентрации 10-9М сила сокращения миокарда предсердий и желудочков возрастает на 11,6+0,6% (р<0.05) и 13,3+0,8% (р<0.05). У 100-суточных крыс увеличение силы сокращения миокарда на 2-метилтиоАТФ в концентрации 10-6М составило всего 6,5+0,2%. Длительность сокращения увеличивается у 14- и 21суточных крысят (р<0.05). 18 50 % 40 * 30 * 20 * 10 0 -10 -10 -9 14 -8 -7 lg концентрации, М 21 56 -6 -5 100 Рис. 7. Влияние 2-метилтио-АТФ на силу сокращений миокарда желудочков сердца крыс. * - достоверно по сравнению с исходным значением *р<0,05 Таблица 2 Влияние 2-метилтиоАТФ на силу и длительность сокращения миокарда 14-100 суточных крыс возраст Концент Fi исх (g) Fiмах (g) Tисх (с) Тмах (с) желудочек 0,06400±0,001000 0,07900±0,004898* 1,21140±0,01500 1,86280±0,08757* предсердия 0,02890±0,00300 0,035374±0,00074* 0,64825±0,01490 0,55226±0,01200* желудочек 0,14137±0,00285 0,18581±0,00424* 1,45158±0,07765 1,90302±0,01408* предсердия 0,10120±0,02000 0,11638±0,00593* 1,34695±0,01440 1,54337±0,06482* желудочек 0,14230±0,00436 0,16133±0,00543* 0,40634±0,07002 0,45347±0,00027 предсердия 0,11186±0,00402 0,12483±0,00075* 1,18140±0,13050 1,05329±0,11900 желудочек 0,12978±0,01441 0,13834±0,01542 1,20444±0,03365 1,28272±0,002950 предсердия 0,06187±0,00745 0,06588±0,00792 0,01940±0,00299 0,01981±0,003052 рация 14 сут. 10-8М 21сут. 10 М 56 сут. 10 М 100сут. 10 М -7 -9 -6 Примечание: * - достоверность по сравнению с исходным значением: р<0,05 Влияние 2-метилтиоАТФ на сократительную активность миокарда при блокаде Р2У-рецепторов. Для определения семейства Р2-рецепторов, участвующих в положительном хронотропном и инотропном эффекте, использовали селективные блокаторы Р2Х и Р2У-рецепторов. Реактив голубой-2 - антагонист с преимущественным действием на Р2Yпуринорецепторы. В нашем случае 2-метилтиоАТФ является агонистом Р2У1-рецепторов сердца, а реактив голубой -2 показывает стойкий ингибирующий эффект по отношению к этим рецепторам (А. Hopwood, 1987). Блокатор добавляли в концентрации 1,5 мМ (G.Burnstock, 2006). При блокаде Р2У-рецепторов 2-метилтиоАТФ достоверно увеличивает силу сокращения предсердий и желудочков во всех возрастных группах. Это доказывает участие в реализации положительного инотропного эффекта Р2Хрецепторов сердца, однако, их функциональная активность на разных этапах 19 онтогенеза различна. В наших экспериментах на изолированных полосках предсердий и желудочков 2-метилтиоАТФ при блокаде Р2У-рецепторов проявил разную эффективность в зависимости от возраста животных. Так, в предсердиях у 21-суточных крысят сила и общая длительность сокращения полосок миокарда предсердий на действие агониста достоверно выше, чем у 100-суточных (р<0,05) (Рис. 8). У 56- и 100-суточных животных сила сокращения миокарда желудочков на действие агониста выше, чем у 14суточных (р<0,05). Следовательно, роль Р2Х-рецепторов в увеличении сократительной активности от 14-к 100-суточному возрасту в предсердиях снижается, а в желудочках возрастает. Возможно, это связано с более ранними сроками развития миокарда предсердий (В.Швалев и др.1992; 2001). Влияние 2-метилтиоАТФ на сократительную активность миокарда при блокаде Р2Х-рецепторов. В настоящее время установлено, что PPADS (пиридоксальфосфат-6-азофенил-24-дисульфоновая кислота) является антагонистом всех рецепторов семейства Р2Х, кроме Р2Х4 – и Р2Х6 – подтипов, а в больших концентрациях угнетает Р2У1-рецепторы (G. Сollo et al., 1996; M.Boarder et al., 2001; G.Vassort, 2001). Однако, однозначного ответа о выраженности блокирующего эффекта РРАDS по отношению к Р2У1-рецепторам не существует. Показано, что этот агонист бывает инертен по отношению Р2У1-опосредованному ответу (A.Зиганшин, 2004; Рычков, 2007; I. Chessel, 2001; G. Burnstock, 2009). 160 А 140 120 160 % 140 * * * Б % * 120 100 100 80 80 60 * * * 21 56 * 60 14 исходные 21 56 100 14 Возраст(сутки) 2-метилтио-АТФ исходные 100 Возраст (сутки) 2-метилтио-АТФ Рис. 8. Влияние 2-метилтио-АТФ на силу сокращений миокарда предсердий (А) и желудочков (Б) сердца растущих крыс после блокады Р2Y рецепторов RB2 * - достоверно по сравнению с исходным значением *р<0,05 В наших экспериментах РРАDS, блокатор Р2Х-рецепторов в концентрации 30 микроМ (A. Rubino, 1992) достоверно снижала эффекты 2метилтиоАТФ у 14-, 21-и 56-суточных крысят. У 100-суточных животных РРАDS не устраняет положительного инотропного влияния 2-метилтиоАТФ на сократительную активность миокарда. Сила сокращения миокарда 20 повышается на 21%, что указывает на участие Р2Х4 – рецепторов (р<0,05; рис. 9). Таким образом, наблюдается гетерохронное проявление функциональной активности разных подтипов Р2Х-рецепторов в предсердиях и желудочках сердца крыс. 140 * 120 100 80 60 14 21 56 исходные 100 2-метилтио-АТФ Рис. 9. Влияние 2-метилтио-АТФ на силу сокращения миокарда желудочков сердца растущих крыс после блокады Р2Х рецепторов PPADS * - достоверно по сравнению с исходным значением *р<0,05 Иммуногистохимический анализ тканей сердца крысы показал присутствие Р2Х 1,2,4,5 –подтипов пуриноцепторов на сарколемме рабочих кардиомиоцитов (M.Hansen et al., 1999). Характер действия РРАDS и ответы агониста могут также косвенно указывать на участие в повышении сократимости и Р2У1-рецепторов. Подтверждением выдвинутого предположения являются иммунигистохимические данные о возрастных особенностях локализации Р2У-рецепторов в сердце. Так, экспрессия Р2Урецепторов в целом сердце и отдельных кардиомиоцитах меняется в онтогенезе и для Р2У1-рецепторов она усиливается (T.Webb, 1996; G. Vassort, 2001). Влияние агониста Р2Х1–рецепторов на сократимость миокарда. Для определения подтипа Р2Х-рецепторов, участвующего в реализации положительного инотропного эффекта использовали селективный агонист и антагонист этих рецепторов. Известно, что β, γ-метиленАТФ оказывает свое преимущественное действие на Р2Х1-пуринорецепторы сердца. В экспериментах на полосках миокарда нами установлено, что β, γ метиленАТФ в концентрации 10-13–10-10М вызывает дозозависимое увеличение силы сокращения миокарда предсердий и желудочков крыс в постнатальном онтогенезе. 21 50 % * 40 30 20 10 * * * * * * 0 -13 -12 -11 -10 -10 -9 * -20 14 21 56 100 Рис. 10. Влияние бета, гамма- метилен АТФ на силу сокращения миокарда желудочков растущих крыс *- достоверно по сравнению с исходным значением *р<0,05 При добавлении β,γ-метиленАТФ сила сокращения предсердий возрастает в концентрации 10-13М на 12,1±1,7% у 14-суточных и в концентрации 10-12-10-11М на 4,4±0,9% у 21-суточных (р<0,05). У 56суточных крысят при добавлении агониста в концентрации 10-12М, максимальная сократительная активность миокарда предсердий составляет 7,7± 1,5% (р<0,05). А у 100-суточных в концентрации на два порядка ниже – 10-10М сократимость увеличивается на 5,3% ±0,8% (р<0,05). Селективный агонист вызывает положительный инотропный эффект желудочков в каждом исследуемом возрасте в двух концентрациях. У 14- и 21-суточных крысят повышение сократительной активности происходит при действии β,γметиленАТФ в концентрации 10-12-10-13М (Рис. 10). Максимальное увеличение силы сокращения желудочков при добавлении β,γ-метиленАТФ в концентрации 10-12М составляет у 14-суточных 31,2±4,7%, у 21-суточных 24,5±3,3% (р <0,01). У 56 - суточных животных оказываются эффективными концентрации β,γ-метиленАТФ 10-12 и 10-11М. Наибольший сократительный эффект желудочков наблюдался в концентрации 10-11М и составил 21,4±3,8 % (р<0,05). У 100-суточных крыс максимальный эффект β,γ-метиленАТФ оказывает в концентрации 10-10М, сократимость увеличивается на 13,6±1,8% (р<0,05). Увеличение концентрации β,γ-метиленАТФ угнетает сократимость миокарда предсердий во всех исследуемых возрастных группах. Отрицательный эффект высоких концентраций β,γ-метиленАТФ на сократимость полосок миокарда вызван его распадом до аденозина, который оказывает эффект через Р1-рецепторы. Полученные результаты повышения сократимости миокарда, опосредованные Р2Х1–рецепторами свидетельствуют о высокой 22 чувствительности миокарда к агонистам Р2Х-рецепторов у 14- и 21-суточных крысят, особенно в желудочках. Доказательством участия Р2Х1- рецепторов служили эксперименты с селективным антагонистом Р2Х1- Р2Х2/3 –рецепторов TNP-АТФ. Добавление данного блокатора полностью предупреждает влияние β,γ-метиленАТФ на сократимость миокарда предсердий и желудочков всех возрастных групп, что подтверждает участие Р2Х1-рецепторов в реализации положительного инотропного эффекта. Совместное влияние карбахолина и 2-метилтио-АТФ на сократимость миокарда крыс 14-100-суточного возраста. Изучение взаимодействия адренорецепторов, холинорецепторов и пуриноцепторов сердца является необходимым, так как исследуемые системы функционируют одновременно и имеют ярко выраженные возрастные особенности на ранних этапах постнатального онтогенеза. Для определения возрастных особенностей чувствительности, активности М-холинорецепторов и β-адренорецепторов миокарда изучали дозозависимое влияние на сократимость миокарда карбахолина (КХ) агониста М2-холинорецепторов и изопротеренола – агониста β1,2 – адренорецепторов. В наших экспериментах на изолированных полосках предсердий и желудочков карбахолин проявляет разную эффективность в зависимости от возраста животных, что позволяет судить о функциональной активности М2холинорецепторов в онтогенезе. Так, реакция М2-ХР, определяющих сократимость предсердий и желудочков при действии КХ снижается от 14 к 100-суточному возрасту и является наименьшей у 14-сут. крысят (р<0,05). У 21-суточных животных реакция сократимости выше по сравнению с 100-сут. (р<0,05). Таким образом, реакция сократимости миокарда предсердий и желудочков на КХ снижается от 21- к 100-суточному возрасту. Совместное влияние КХ и 2-метилтиоАТФ (2-мАТФ) изучали при последовательном добавлении стойкого агониста Р2Х- и Р2Y1-рецепторов2-метилтиоАТФ на фоне угнетающего действия карбахолина. Также проводились эксперименты с обратной последовательностью подачи веществ, когда КХ добавляется на фоне положительного эффекта агониста Р2-пуринорецепторов. Совместное действие КХ и 2-метилтиоАТФ у 14-суточных крысят усиливает отрицательный эффект карбахолина на сократимость миокарда (Рис. 11 А). 23 140 % 120 А КХ 2-м-АТФ 2-м-АТФ 100 КХ 80 2-м-АТФ+КХ * * КХ 2-м-АТФ 60 40 исх 5 1 0 * КХ+2-м-АТФ 1 5 2 0 Минуты 140 % КХ Б 2-м-АТФ 120 2-м-АТФ 100 2-м-АТФ+КХ * * 80 КХ КХ+2-м-АТФ * КХ 60 40 исх 2-м-АТФ 5 1 0 1 5 2 0 Минуты Рис. 11. Совместное влияние КХ и 2-м-АТФ на силу сокращения миокарда желудочков у крыс (А) 14- сут. и предсердий 21- сут. (Б) возраста. * - достоверно по сравнению с исходным значением *р<0,05 У 21-суточных крысят карбахолин в контроле уменьшает силу сокращения предсердий на 39,1±2,7% и желудочков на 37,0±4,2%. При добавлении 2-метилтиоАТФ эффект карбахолина в предсердиях составляет 28,0±1,2%, а в желудочках 28,4±3%. В этом возрасте 2-метилтиоАТФ снижает угнетающий эффект КХ на сократимость миокарда (Рис. 11Б). При обратной последовательности подачи веществ на фоне агониста Р2пуринорецепторов угнетающий эффект КХ на сократимость миокарда замедляется и составляет всего +3,6±1,7% в предсердиях и -7,7±1,4% в желудочках, что достоверно меньше эффекта КХ в контроле (р<0,001). Следует отметить появление фазы «плато» в сократимости миокарда желудочков после добавления КХ, что подтверждает «кардиотропный» эффект АТФ. У 56- и 100-суточных животных совместное влияние агонистов не вызывает достоверных изменений силы и длительности сокращения миокарда. 24 Совместное влияние изопротеренола и 2-метилтио-АТФ на сократимость миокарда крыс 14-100-суточного возраста. Для определения возрастных особенностей чувствительности и реактивности миокарда к агонисту β-адренорецепторов изучали влияние изопротеренола в диапазоне концентраций 10-2-10-13М. У 14-сут. крысят величина пороговой концентрации изопротеренола, вызывающей -3 положительную инотропную реакцию составила 10 М, у 21-сут. – 10-12М, у 56-сут. – 10-11М, а у 100-сут.- 10-6М. У 14-сут. крысят сила сокращения желудочков возрастает на 122,5±9,40%, предсердий на 96,96±25,5%, у 21-сут. сократимость предсердий увеличивается на 43,9±4,7%, желудочков на 29,31±1,85%. Реакция на агонист в предсердиях достоверно больше, чем в желудочках (р<0,05). У 56-сут. сила сокращения предсердий возрастает на 40,8±14,6%, желудочков на 44,95±1.85,0%. У 100 сут. сократимость предсердий увеличивается на 23,10±3,20%, желудочков на 54,60±6,70%. Следует отметить, что у 100-сут. крыс сократимость миокарда желудочков при действии изопротеренола достоверно выше, чем сократимость предсердий (р<0,05). Сила сокращения желудочков на действие пороговой концентрации агониста увеличивается от 21- к 100-суточному возрасту и достигает достоверных величин (р<0,05). У 14-сут. животных эффект одного изопротеренола в контроле составляет 181,03±18,02%. Добавление 2-метилтиоАТФ уменьшает положительный инотропный эффект на 6,3% и совместное влияние обоих агонистов составляет 171,31±21,11%. Таким образом, усиливающие влияние 2-метилтио-АТФ на сократимость миокарда желудочков, которое в контроле составляло 25,8%, не сохраняется (Рис. 12). При обратной последовательности подачи веществ общее увеличение сократимости миокарда составило 173,56±13,46%. 220% 200 180 160 140 120 100 изопротеренол контроль изоп+2-мАТФ 2-мАТФ+изоп. Рис. 12. Совместное влияние изопротеренола и 2-метилтиоАТФ на силу сокращения миокарда желудочков у 14 сут. крыс. У 21-суточных животных в контроле изопротеренол увеличивает силу сокращения миокарда предсердий на 137,61±4,5%. При добавлении 2-мАТФ на фоне изопротеренола сила сокращения увеличивается на 156,89±8,44%, что превышает действие одного изопротеренола в контроле (р<0,05), но не 25 достигает суммарного ответа при независимой активации рецепторов, который составляет 168,7% (Рис. 13). Добавление 2-мАТФ на фоне изопротеренола увеличивает сократимость желудочков на 139,26%, что больше действия одного изопротеренола в контроле (124,84±1,72; р<0,05). При обратной последовательности подачи веществ общий эффект влияния обоих агонистов составляет 141,61±4,02%. % 180 * 160 140 120 100 изопротеренол контроль изоп+2-мАТФ 2-мАТФ+изоп. Рис. 13. Совместное влияние изопротеренола и 2-метилтиоАТФ на силу сокращения миокарда предсердий у 21- суточных крыс. * достоверно по сравнению с влиянием изопротеренола в контроле (р<0,05). Аналогичный эффект мы наблюдали при анализе сократимости миокарда предсердий и желудочков у 56-суточных крыс. При добавлении 2мАТФ на фоне изопротеренола сила сокращения предсердий увеличилась на 143,14±2,63%,что превышает действие одного изопротеренола в контроле (р<0,05). При обратной последовательности подачи веществ общий эффект сократимости при совместном влиянии обоих агонистов достигает 147,34±2,51%. Совместное влияние 2-мАТФ на фоне изопротеренола увеличивает силу сокращения миокарда желудочков на 150,03±4,03% и превышает действие одного изопротеренола в контроле (р<0,05). При обратной последовательности подачи веществ, на фоне 2-мАТФ изопротеренол увеличивает силу сокращения желудочков на 157,62±9.07%. Результаты сократимости предсердий и желудочков между прямой и обратной последовательностью подачи веществ не отличаются во всех возрастных группах, что указывает на суммацию эффектов изопротеренола и 2-метилтиоАТФ. У 100-суточных крыс усиление влияния изопротеренола на сократимость миокарда в желудочках при добавлении 2-метилтиоАТФ не наблюдается. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Кроме хорошо известно роли АТФ как внутриклеточного энергетического субстрата, АТФ может регулировать внутриклеточные процессы через специфические Р2-пуринорецепторы. В литературе показано наличие функционально активных Р2-рецепторов в сердечно-сосудистой системе, которые присутствуют на сарколемме рабочих кардиомиоцитов предсердий, желудочков, проводящей системы сердца, эндотелии и 26 гладкомышечных клетках сосудов (Y.Hu et al., 2001; G. Vassort, 2001; Jiang et al., 2005). Исследования микросрезов ткани из разных частей сердца крысы выявили присутствие Р2Х1, Р2Х2, Р2Х4 –пуринорецепторов в предсердии и Р2Х4 - рецепторов в желудочке (G. Vassort, 2001). АТФ и аденозин освобождаются во внеклеточную жидкость в физиологических и патологических условиях. При нервной стимуляции, гипоксии, ишемии, рабочей нагрузке содержание внеклеточной АТФ увеличивается (T. Forrester et. al.; A. Kuzmin et al. 1998; TLee et al., 2002; G.Crover et al., 2002). АТФ выделяется как контрансмиттер из симпатических и парасимпатических нервных терминалей вместе с классическими нейромедиаторами (G. Burnstock, 1990; P. Richardson et al., 1987). При исследования роли Р2-пуриноцепторов в регуляции сердца крыс в раннем постнатальном онтогенезе мы изучали эффекты экзогенной АТФ и ее стойких аналогов на хронотропную и инотропную активность сердца. Нами выбраны животные нескольких возрастных групп. У 14-суточных крысят симпатическая иннервация сердца еще не сформирована. Для этого возраста характерно ее минимальное присутствие. 21-суточные крысята характеризуются повышением активности симпатической нервной системы. У 21 и 28 – суточных животных зафиксировано максимальные значения ЧСС (Т.Л.Зефиров и Ф.Г.Ситдиков, 2005), что соответствует результатам других авторов. По данным других авторов у крыс с 3 по 6 неделю происходит становление симпатической регуляции сердца (S.Rockson et al.,1981; R.Xiao et al., 1995). Возраст 7-8 недель (56-суточные крысы) соответствует пубертатному периоду развития, сопровождающемуся выраженными изменениями эндокринной системы, оказывающей активное влияние на регуляцию сердечной деятельности. На этом этапе онтогенеза нарушается возрастное урежение ЧСС и вновь наблюдается ее увеличение (Зефиров Т.Л., 1999). Многие авторы подчеркивают возрастную зависимость влияния эндокринной системы на механизмы, регулирующие хронотропную и инотропную функции сердца (Slavicova et al., 1993; Mac Gregor et al., 1995). В литературе имеются данные, что парасимпатическая нервная система в онтогенезе крыс начинает функционировать раньше симпатической (Б.Кулаев, 1981, Ф.Г.Ситдиков, Т.Л.Зефиров , 2006). Следует отметить, что на данном этапе постнатального развития белых крыс установлены максимальные среднесуточные приросты массы сердца (с 21 по 30 день, Р.Нигматуллина, 1991). Деление кардиомиоцитов у крыс полностью прекращается к 21 суткам жизни и в период с 21 по 30 день идет усиленный рост образовавшихся кардиомиоцитов (Ф.Меерсон, 1968). Высокий уровень метаболизма в растущем организме сопровождается ускорением синтеза и распада АТФ, что приводит к увеличению АТФ во внеклеточной среде. Выход АТФ в межклеточное пространство может проходить не только путем контрансмиссиии, но и через гемиканалы, что 27 показано на сердечных фибробластах в условии механического напряжения (S. Soleymani et al., 2008). Функциональная активность Р2-рецепторов имеет ярко выраженные возрастные особенности. Все агонисты Р2-пуриноцепторов: АТФ, ά,β – метиленАТФ, 2–метилтиоАТФ и β,γ-метиленАТФ вызывают дозозависимое увеличение частоты сердечных сокращений и силы сокращения миокарда предсердий и желудочков. Пороговая концентрация агонистов от 14- к 100суточному возрасту повышается, что указывает на снижение чувствительности миокарда к агонистам Р2Х-рецепторов на наблюдаемом отрезке онтогенеза. Известно, что изменение чувствительности клетки, ткани, органа, зависит от концентрации агониста и плотности рецепторов на мембране кардиомиоцитов, находящихся в обратно-пропорциональной зависимости. Использование различных агонистов и блокаторов выявило гетерохронное проявление активности разных подтипов Р2Х-рецепторов в предсердиях и желудочках сердца крыс. Полученные данные свидетельствуют о том, что роль Р2Х-рецепторов в увеличении сократительной активности предсердий от 14-к 100-суточному возрасту снижается, а желудочков возрастает. Как показывают наши эксперименты, эффекты АТФ и ее аналогов на сердце зависят от уровня симпатической и парасимпатической активности. При изучении совместного влияния аналогов АТФ, карбахолина и изопротеренола выявлено, что АТФ модулирует адренергическую и холинергическую регуляцию сократимости миокарда разнонаправлено на разных этапах раннего постнатального онтогенеза крыс. У 21-суточных крысят при высокой функциональной активности М2-холинорецепторов и Р2-рецепторов сердца 2-метилтио-АТФ снижает угнетающий эффект КХ на сократимость миокарда. При предварительной активации Р2-рецепторов, добавление КХ приводит к появлению фазы «плато» в сократимости миокарда предсердий и желудочков что подтверждает «кардиотропный» эффект АТФ. В основе наблюдаемого явления лежит АТФ-вызванная стимуляция Р2Х-рецепторов, открытие неселективных ионных каналов, затем потенциалзависимых кальциевых каналов L-типа. Повышение уровня внутриклеточного кальция вызывает сократительный ответ. Исследования подтвердили, что на фоне активации М-холинорецепторов карбахолином, наблюдаются двухфазные изменения потенциала действия кардиомиоцитов при действии внеклеточной АТФ. Связывание агонистов с рецепторами вызывает усиление наружу направленного К+-тока через ацетилхолинзависимые и АТФ-зависимые калиевые каналы, что приводит к укорочению длительности потенциала действия, которое затем отменяется. (Y.Hara, H.Nakaya, 1997). При повышении уровня симпатической активности, на фоне высокой функциональной активности β – адренорецепторов и Р2Х-рецепторов сердца 28 крыс 21-, 56- суточного возраста совместное действие агонистов приводит к развитию дополняющего друг друга эффекта в увеличении сократимости миокарда. Повышение сократимости миокарда при совместном влиянии агонистов является результатом активации β-адренорецепторов и Р2Х-, в частности Р2Х1-рецепторов. При возбуждении β-адренорецепторов увеличивается уровень цАМФ и стимулируется протеинкиназа А. Происходит открытие Са2+-каналов L – типа и увеличивается вход Са2+ в цитозоль клетки. Внеклеточная АТФ стимулирует Р2Х-рецепторы, входящий неселективный катионный ток. Вызванная деполяризация приводит к дополнительному току Са2+ внутрь клетки через потенциалзависимые кальциевые каналы L-типа и дополнительному поступлению Са2+ из саркоплазматического ретикулума. Свободный кальций саркоплазмы соединяется с регуляторным белком тропонином, увеличивая образование актомиозиновых комплексов и запуская сократительный ответ. Оба пути вызывают усиление сокращения миокарда. У 14-суточных крысят совместное действие изопротеренола и 2метилтиоАТФ уменьшает силу сокращения миокарда. Изопротеренол в миллимолярной концентрации является пороговой дозой для 14-суточных крысят, и относится к субмаксимальной, не физиологической. Такая низкая чувствительность миокарда к агонисту β-адренорецепторов подтверждает мнение многих исследователей, что в этом возрасте симпатическая иннервация сердца еще не сформирована. Возможным механизмом уменьшения сократимости является снижение содержания цитозольной АТФ в результате активации аденилатциклазы при взаимодействии βадренергических рецепторов с изопротеренолом. Известно, что снижение концентрации внутриклеточной АТФ до микромолярных концентрации, например, при искусственном стрессе, вызванном большими дозами изопротеренола, вызывает появление КАТФ токов, приводящих к гиперполяризации (Nakashima M., 2005). Для Р2У1-и Р2У11 - рецепторов сердца активными являются только пуриновые соединения и 2-метилтиоАТФ в ряду эффективности агонистов стоит на втором месте. Следовательно, при совместном влиянии выбранных агонистов происходит активация β-адренорецепторов и Р2У - рецепторов, которые являются метаботропными рецепторами и имеют общий механизм внутриклеточной регуляции с участием цАМФ. Роль этого вторичного посредника при взаимодействии классического нейромедиатора норадреналина с β–адренорецепторами считается общепризнанной. При активации Р2У 11-рецепторов в желудочках у крысят увеличивается уровень цАМФ (M. Pucéat et al., 1998; J. Balogh et al., 2005). И АТФ и изопротеренол увеличивают уровень цАМФ в кардиомиоцитах. Однако, в кардиомиоцитах крысы пуринергическая и бета-адренергическая стимуляция активируют разные изоформы аденилатциклазы (M. Pucéat et al., 1998). Следовательно, изопротеренол и АТФ активируют одинаковый каскад 29 внутриклеточных биохимических реакций, но осуществляются они через разные мембранные ферменты. Также при взаимодействии АТФ с Р2У1,2,3,4,6рецепторами происходит активация основного внутриклеточного сигнального пути с участием фосфолипазы С, приводящая к увеличению концентрации кальция в цитозоле и сократимости миокарда. Подтверждением возможного участия Р2У1-рецепторов в реализации наблюдаемого эффекта является увеличение экспрессии этого подтипа рецепторов в онтогенезе. Таким образом, в раннем постнатальном онтогенезе, влияния АТФ на эффекты основных медиаторов определяются активностью симпатических и парасимпатических регуляторных влияний на сердце, функциональной активностью адрено-, холинорецепторов, пуриноцепторов и этапами биологического созревания организма. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. ВЫВОДЫ Внутривенное введение АТФ в концентрации 10-6-10-4М вызывает увеличение частоты сердечных сокращений без изменения ударного объема крови у 14-, 21-, 56- и 100-суточных крыс. Стойкий аналог АТФ α,β-метилен АТФ увеличивает ЧСС в концентрациях 10-10М у 14 -суточных крысятам, 10-7М у 21- и 56суточных и 10-4М – у 100- суточных. Неселективный антагонист Р2-пуринорецепторов сурамин предотвращает положительный хронотропный эффект АТФ и α,βметилен АТФ у крыс всех возрастных групп, что обусловлено активацией Р2-пуриноцепторов. При введении селективного антагониста Р2У-пуринорецепторов реактива голубого-2 сохраняется положительный хронотропный эффект АТФ и α,β-метилен АТФ у крыс всех возрастов, что указывает на активацию Р2Х-пуринорцепторов сердца. Селективный агонист Р2Х1-пуринорецепторов β,γ-метилен АТФ приводит к развитию положительного хронотропного эффекта у 14суточных крысят в концентрации 10-13М, 21-суточных в концентрации 10-11М, у 56- и 100-, суточных крыс в концентрации 10-8М. Селективный антагонист этих рецепторов TNР-АТР устраняет положительный хронотропный эффект пуринов у крыс всех возрастных групп что свидетельствует об участии Р2Х1-пуриноцепторов сердца. Совместное введение α,β-метилен АТФ и норадреналина уменьшает хронотропный ответ у 21- и 100-суточных крыс и увеличивает его у 14и 56- суточных животных по сравнению с введением норадреналина. Совместное введение ацетилхолина и α,β-метилен АТФ уменьшает отрицательный хронотропный ответ у 21-суточных крыс и усиливает у 100-суточных крыс по сравнению с введением ацетилхолина. 30 8. АТФ в концентрации 10-7М увеличивает сократимость желудочков у 14, 21-суточных крысят, а в концентрации 10-6М у 56-и 100-суточных крыс. Длительность сокращения желудочков уменьшалась у 21-и 56суточных крысят. 9. Антагонист Р1-рецепторов 8-фенилтеофеллин устраняет отрицательный инотропный эффект, вызванный большими концентрациями АТФ у крыс 21-,56- и 100-суточного возраста. 10.Стойкий аналог АТФ - 2-метилтиоАТФ оказывает дозозависимое увеличение сократимости предсердий и желудочков у 14-суточных в концентрации 10-8М, у 21-суточных - 10-7М и 56-суточных - 10-9М. 11.При блокаде Р2Y-рецепторов реактивом голубым-2 добавление 2метилтио-АТФ сохраняет положительный инотропный эффект у крыс всех возрастных групп, что указывает на активацию Р2Х-рецепторов сердца. У 21-суточных крысят сила сокращения предсердий и общая длительность сокращения на 2-метилтио-АТФ выше, чем у 100суточных, что указывает на разную функциональную активность Р2Хрецепторов на разных этапах онтогенеза. 12.При блокаде Р2Х-рецепторов РРАDS положительный инотропный эффект сохраняется в миокарде желудочков только у крыс 100суточного возраста. 13. Селективный агонист Р2Х1-рецепторов β,γ-метиленАТФ вызывает дозозависимый положительный инотропный эффект миокарда предсердий и желудочков у 14-и 21-суточных крыс в концентрации 1012 М, у 56-суточных - 10-11М и 100-суточных - 10-10М. Блокатор Р2Хрецепторов TNР-АТР устраняет положительный инотропный эффект у крыс всех возрастных групп, что подтверждает участие Р2Х1рецепторов. 14. Агонист β-адренорецепторов изопротеренол оказывает дозозависимое увеличение сократимости миокарда у 14-суточных крыс в концентрации 10-3М, 21-суточных в концентрации 10-12М, у 56-суточных – 10-11М, у 100-суточных – 10-6М. Реакция β-адренорецепторов в сократимости миокарда предсердий от 21- к 100-суточному возрасту снижается, а в желудочках повышается. 15. У 21-суточных крысят 2-метилтио-АТФ снижает отрицательный эффект карбахолина на сократимость миокарда и усиливает его эффект у 14-суточных крыс. Карбахолин ингибирует положительный инотропный эффект 2-метилтио-АТФ во всех возрастных группах. 16. У 21- и 56- суточных крысят совместное действие изопротеренола и 2метилтио-АТФ приводит к развитию однонаправленного, дополняющего друг друга эффекта в увеличении сократимости миокарда. Положительный инотропный эффект совместного влияния агонистов превышает влияние одного изопротеренола в контроле. 31 Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Аникина Т.А. Холинергическая и адренергическая регуляция сердца в онтогенезе / Аникина Т.А., Гильмутдинова Р.И. // Тез. Конференции Традиционные и нетрадиционные методы оздоровления.- Дубна, 1995.- С. 2. Аникина Т.А. Адренергические и холинергические факторы регуляции сердца в онтогенезе у крыс / Ситдиков Ф.Г., Аникина Т.А. Гильмутдинова Р.И., // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1998.- №9.- С. 318-320. 3. Аникина Т.А. Особенности адренергической и холинергической регуляции сердца крысят / Ситдиков Ф.Г. Гильмутдинова Р.И., Аникина Т.А. // Тез. XVII съезда Всероссийского физиологического общества.- Ростов на Дону, 1998.- С. 318. 4. Аникина Т.А. Реактивность и чувствительность сердца крыс к симпатическим воздействиям в онтогенезе / Аникина Т.А., Билалова Г.А., Ситдиков Ф.Г. // Тез. IX международной конференции Эколого- физиологические механизмы адаптации.Москва, 2000.- С. 36. 5. Аникина Т.А. Влияние экзогенного АТФ на сердечную деятельность крыс / Ситдиков Ф.Г., Билалова Г.А., Аникина Т.А., Гиниятуллин Р.А. // Бюлл. эксп. биол. и мед.- 2000.-№ 4.- С.377-380. 6. Аникина Т.А. Влияние электрической стимуляции правого звездчатого ганглия на деятельность сердца крыс в постнатальном онтогенезе / Билалова Г.А., Аникина Т.А., Ситдиков Ф.Г. // Бюлл. эксп. биол. и мед.- 2002. – Т.133. - №4. – С.377-379. 7. Аникина Т.А. Становление экстракардиальных влияний на сердце в онтогенезе / Ситдиков Ф.Г., Аникина Т.А., Билалова Г.А. // Тез. XI международной конференции «Эколого-физиологические механизмы адаптации», Москва.- 2003.- С.487488. 8. Аникина Т.А. Влияние блокады β-адренорецепторов на сердечную деятельность крыс в постнатальном онтогенезе / Аникина Т.А., Билалова Г.А., Ситдиков Ф.Г. // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 2003.-Т. 136.-№ 9.-С.265-268. 9. Аникина Т.А. Реакция сердца крыс в онтогенезе при симпатической стимуляции / Аникина Т.А., Билалова Г.А., Ситдиков Ф.Г. // Тез. III Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем», С-Петербург.-2003. – С.300-301. 10. Аникина Т.А. Гетерохронность становления нейрогуморальных регуляторных влияний на сердце / Ситдиков Ф.Г., Миннахметов Р.Р., Билалова Г.А., Гильмутдинова Р.И., Аникина Т.А. // Тез. II Международного симпозиума «Проблемы ритмов естествознания», Москва, РУДН.- 2004.-С.378-380. 11. Аникина Т.А. Влияние экзогенного АТФ на сердечную деятельность крыс 21- и 30 дневного возраста / Хамзина Е.Ю., Аникина Т.А., Билалова Г.А. // Тез. VII Всероссийского симпозиума и школы молодых ученых, учителей «Растущий организм: адаптация к учебной и физической нагрузке», Наб.-Челны.- 2004.-Т. 2.- С. 89-90. 12. Аникина Т.А. Участие АТФ в регуляции сердечной деятельности крыс / Аникина Т.А., Ситдиков Ф.Г. Билалова Г.А., Хамзина Е.Ю. // Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова.- 2004.-Т.90.- №8.- – С.421. 13. Аникина Т.А. Взаимокомпенсация и гетерохронность в деятельности сердца в постнатальном онтогенезе / Ситдиков Ф.Г., Билалова Г.А., Гильмутдинова Р.И., Гиззатуллин А.Р., Миннахметов Р.Р., Аникина Т.А. // Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова, Т.90, №8, 2004. – С.455. 14. Аникина Т.А. Возрастные особенности ударного объема крови крыс на стимуляцию симпатического ганглия после блокады β-адренорецепторов / Ситдиков Ф.Г., Билалова Г.А., Аникина Т.А. // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- Т. 138.-№ 10.- 2004.-С.393396. 32 15. Аникина Т.А. Принцип взаимокомпенсации в регуляции деятельности сердца / Ситдиков Ф.Г., Аникина Т.А. // Тез. Третьей Всероссийской с Международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения, Москва.-2004.-С.97-99. 16. Аникина Т.А. Влияние экзогенного АТФ на сердечную деятельность крыс 21, 56, 100-дневного возраста / Ситдиков Ф.Г., Аникина Т.А., Хамзина Е.Ю., Билалова Г.А., // Бюллетень Сибирской медицины.- Томск.-2005.-С.21. 17. Аникина Т.А. Участие пуринорецепторов в сердечной деятельности крыс в онтогенезе / Ситдиков Ф.Г., Аникина Т.А., Билалова Г.А., Хамзина Е.Ю. // Научные труды I Съезда физиологов СНГ.- Москва.-Т.1.-2005.-С. 77. 18. Аникина Т.А. Участие Р2-пуринорецепторов в сердечной деятельности крыс в постнатальном онтогенезе / Ситдиков Ф.Г., Аникина Т.А., Билалова Г.А., Хамзина Е.Ю. // Материалы всероссийской научной конференции Физиология сердца.- Казань, 2005.С.76-77. 19. Аникина Т.А. Участие пуринорецепторов в сердечной деятельности крыс в онтогенезе / Аникина Т.А., Ситдиков Ф.Г., Хамзина Е.Ю., Билалова Г.А. // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 2005.- Т.140.-№11.-С.490-492. 20. Аникина Т.А. Участие адрено- и пуринорецепторов в сердечной деятельности крыс в онтогенезе / Билалова Г.А., Аникина Т.А., Хамзина Е.Ю., Ситдиков Ф.Г. // Тез. VI школы по эволюционной физиологии, посвященной памяти академика Л.А. Орбели и 50-летию Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова.- Санкт-Петербург.- 2006.- С.31-32. 21. Аникина Т.А. Участие Р2Х-рецепторов в сердечной деятельности крыс в онтогенезе / Аникина Т.А., Хамзина Е.Ю., Ситдиков Ф.Г., Билалова Г.А., // Тез.. VIII Всерос.симп. и школы – семинара молодых ученых и учителей. Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке.- Казань, 2006.- С.10-11. 22. Аникина Т.А. Влияние 2-метилтио-АТФ на сократимость полосок миокарда крыс в онтогенезе / Аникина Т.А., Ситдиков Ф.Г., Зверев А.А. // Тез. 8 Всероссийского научного симпозиума. Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке: 2006г.- Казань: 2006.-С. 39-40. 23. Аникина Т.А. Участие Р2Х-рецепторов в сердечной деятельности крыс в онтогенезе / Аникина Т.А., Ситдиков Ф.Г. // Тез. 8 Всероссийского научного симпозиума. Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке: 2006г.- Казань: 2006.-С.9-10. 24. Аникина Т.А. Участие Р2Х-рецепторов в сердечной деятельности крыс в онтогенезе / Ситдиков Ф.Г., Аникина Т.А., Билалова Г.А., Хамзина Е.Ю., Зверев А.А. // Тез. ХХ съезда физиологов России Общества им. И.П. Павлова - Москва: 2007. С 11. 25. Аникина Т.А. Роль Р2Х- и Р2У-рецепторов в сократимости миокарда крыс в онтогенезе / Аникина Т.А., Билалова Г.А., Ситдиков Ф.Г., Зверев А.А. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. -2007. № 6. – С. 637-640. 26. Аникина Т.А. Влияние АТФ и его аналогов на сократимость миокарда крыс в онтогенезе / Аникина Т.А., Билалова Г.А., Зверев А.А., Ситдиков Ф.Г. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. -2007. № 7. – С. 7-10. 27. Аникина Т.А. Участие Р2Х-рецепторов в положительном инотропном эффекте миокарда крыс в онтогенезе / Зверев А.А., Аникина Т.А., Ситдиков Ф.Г. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. -2008. № 2. – С. 133-135. 28. Аникина Т.А. Участие Р2Х1, Р2Х2 пуринорецепторов в хронотропной и инотропной функции сердца крыс в раннем постнатальном онтогенезе / Ситдиков Ф.Г., Аникина Т.А., Зверев А.А., Хамзина Е.Ю. Тез.VI Сибирского физиологического съезда.Барнаул: 2008. – С. 53. 33 29. Аникина Т.А. Пуринорецепторы сердца в онтогенезе / Ситдиков Ф.Г., Аникина Т.А., Зверев А.А. Тез. Четвертой всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения. - ФМГУ им. М.В.Ломоносова, Факультет фундаментальной медицины.:2008.-С.90. 30. Аникина Т.А. АТФ модулирует холинергические влияния на сократимость миокарда в зависимости от возраста крыс. / Аникина Т.А., Зверев А.А., Ситдиков Ф.Г., Трофимова И.Н. // Тез. 9 Всероссийской научно-теоретической конференции. Физиологические механизмы адаптации растущего организма. 2008.-С.17. 31. Аникина Т.А. Функциональная активность Р2Х-реепторов крыс в раннем постнатальном онтогенезе. / Зверев А.А., Аникина Т.А., Ситдиков Ф.Г., Билалова Г.А. // Тез. 9 Всероссийской научно-теоретической конференции. Физиологические механизмы адаптации растущего организма. 2008.-С.51. 32. Аникина Т.А. Пуринергическая регуляция деятельности сердца крыс в онтогенезе / Ситдиков Ф.Г., Аникина Т.А., Зверев А.А., Билалова Г.А., Хамзина Е.Ю. // Жур. Онтогенез. -2008. № 5.- С.333-339. 34
