Начало формы О.А. САПКО, А.Ш. УТАРБАЕВА, Р.М. КУНАЕВА

О.А. САПКО, А.Ш. УТАРБАЕВА, Р.М. КУНАЕВА
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАБОЛИЗМА ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
КЛЕТКАХ ALHAGI KIRGHISORUM
(Институт молекулярной биологии и биохимии имени М.А.Айтхожина МОиН РК)
Из культивируемых клеток выделены и идентифицированы кверцетин, изорамнетин, 3-0неогесперидозид изорамнетина, ретузин, 8-метилретузин, каликозин и формононетин.
Исследованы закономерности изменения метаболизма ФС, индуцированные грибным
элиситором Helminthosporium sativum. Обработка клеток элиситором стимулировала
накопление растворимых ФС, вызвала 10-кратное увеличение активности фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ) и 2-кратное - пероксидазы (ПО). Засоление и засуха усиливали
накопление ФС и повышали активность ФАЛ и ПО. Высокие уровни засоления NaCI изменяли
качественный состав ФС
Фенольные соединения (ФС) - один из важнейших классов вторичных веществ, имеющих
всеобщее распространение в растениях. Разнообразие функций ФС в растительной клетке в
сочетании с широким спектром биологического действия на животный организм определяют
актуальность и интерес к изучению этого класса соединений. Для решения вопросов,
связанных с образованием, метаболизмом и функциями ФС широко используется метод
культивируемых клеток и тканей /1/. Многочисленные исследования показывают, что клетки in
vitro, как правило, сохраняют способность к синтезу ФС, присущих исходному
растению.Однако, в подавляющем большинстве случаев наблюдается заметное снижение
уровня биосинтеза ФС, уменьшается их разнообразие.
Биосинтез ФС может индуцироваться воздействием различных стрессовых факторов,
поскольку ФС играют важную роль во многих защитных реакциях клетки. ФС являются одним
из факторов адаптивной изменчивости растений при инфицировании, засухе и засолении.
Повышение общего содержания ФС, накопление фитоалексинов, увеличение активности
ферментов их биосинтеза в устойчивых растениях в ответ на заражение являются
защитными реакциями, обуславливающими невосприимчивость растений /2/.
Норма реакции фенольного комплекса в ответ на действие засоления различна и зависит от
концентрации и качества засоления, от сортовой природы растений /3/. Механизмы
устойчивости к условиям засоления и водному стрессу различны и до конца не изучены.
Целью настоящего исследования было изучение особенностей образования ФС и выявление
роли ФС в ответных реакциях клеток in vitro верблюжьей колючки при инфицировании и в
условиях водного и солевого стрессов. Верблюжья колючка - растение семейства бобовых
(Leguminosae) с большим содержанием ФС, обладающих высокой биологической
активностью.
Материалы
и
методы
Объектом исследования служили культивируемые in vitro клетки верблюжьей колючки.
Условия получения и культивирования каллусных и суспензионных культур верблюжьей
колючки описаны в работе /4/. Патогенный гриб Helminthosporium sativum выращивали на
синтетической среде Чапека /5/ в термостате при температуре 240С. Грибной элиситор
получали по методике /6/. В качестве засоляющих агентов использовали NaCI, в
концентрациях 0,5-2,0%, в качестве осмотика - ПЭГ 6000 в концентрациях 5-15%. Сумму
растворимых ФС извлекали из высушенной и измельченной клеточной массы (100 мг)
экстракцией 96% этанолом при соотношении сырье - растворитель 1:10. Количественное
содержание ФС (%) определяли спектрофотометрически с реактивом Фолина-Дениса по
поглощению при 725 нм /7/. Выделение ФС проводили с использованием хроматографических
методовидентификацию - на основании физико-химических методов (УФ-, ИК-, ПМР- и массспектроскопия), как описано в работе /8/. Для характеристики роста клеток определяли
ростовой индекс. Качественный анализ ФС проводили методом восходящей двумерной
бумажной хроматографии в системе растворителей: н-бутанол-уксусная кислота- вода
(40:12,5:29) (БУВ) и 15%-й уксусной кислоте. Активность ФАЛ определяли по образованию
транс-коричной кислоты из L-фенилаланина по поглощению при 290 нм /9/. Активность ПО
отмечали по начальной скорости окисления о-дианизидина при комнатной температуре при
460 нм /10/. Белок определяли спектрофотометрическим методом по разности длины волн
при 230 и 260 нм /11/.
Результаты
и
их
обсуждение
Культура клеток верблюжьей колючки послужила удобной модельной системой для изучения
различных аспектов биосинтеза ФС. Анализ ФС показал, что в культивируемых клетках
происходит снижение общего уровня биосинтеза растительных полифенолов по сравнению с
исходным растением в 7-12 раз (до 0,8-1,4% в каллусных и 0,5-0,8% - в суспензионных
культурах, изменяется качественный состав. Наиболее стабильным, сохраняющимся в
каллусных и суспензионных клетках является биосинтез изофлавоноидов. В длительно
культивируемых клетках биосинтез изофлавоноидов не только сохраняется, но и усиливается
до 26-30% от суммы растворимых форм при заметном ослаблении биосинтеза других классов
ФС. Четыре вещества этого класса, преимущественно накапливающиеся в культуре были
выделены и идентифицированы как ретузин, метилретузин, каликозин и формонетин.
Стабильным оказался также синтез веществ, отнесенных к конъюгатам фенолкарбрновых
кислот (кофейной, п-кумаровой и хинной) и углеводов (глюкозы и рамнозы). Синтез других
классов ФС менее стабилен. Биосинтез таких классов ФС, как катехины, проантоцианидины и
их полимерные формы, содержание которых в исходном растении очень велико и может
достигать 10-12%, ингибирован полностью уже на начальных этапах культивирования.
Образование простых катехинов, (+)-катехина и (-)-эпикатехина, наблюдали только в
стерильных проростках и гетерогенных каллусных культурах 0-3-го пассажей. Заметно
ослаблен синтез другого класса ФС - флавонолов и их гликозидов, из которых
идентифицированы кверцетин, изорамнетин и 3-0-глюкорамнозид изорамнетина.
Инициировать биосинтез других классов
ФС
- олигомерных и полимерных
полипроантоцианидинов в культуре in vitro не удалось. Были исследованы возможности
инициации процессов биосинтеза вторичных соединений. Механизм активации метаболизма
ФС в целом, роль отдельных веществ и групп была выявлена при изучении влияния на
культуру клеток стрессовых условий: инфицирования патогенами и засоления.
Обработка суспензионных клеток грибным элиситором подавляла рост культуры (на 13-18%),
снижала жизнеспособность клеток. При этом в клетках увеличивалось содержание суммы
растворимых ФС, возросла активность ферментов их обмена - ФАЛ и ПО (рис. 1, 2).
Наблюдаемые изменения являются типичным для интактных и культивируемых in vitro клеток
ответом на инфицирование несовместимыми патогенами и их культуральными фильтратами
/12/. Усиление активности ФАЛ может быть связано как с синтезом лигнина, повышающим
механическую устойчивость клеточных стенок, так и с накоплением фунгицидов. В культуре
клеток верблюжьей колючки добавление элиситора вызвало изменения количественного и
качественного состава ФС. В 1,5-2,5 раза увеличивалось содержание ФС. Содержание пяти
основных веществ увеличивалось в 3-6 раз. Четыре из них были идентифицированы как 5дезоксиизофлавоны каликозин, формононетин, ретузин и 8-метилретузин. Последнее было
отнесено к гликозидам изофлавонов. Значительное увеличение содержания этих веществ в
ответ на обработку клеток элиситором, говорит о том, что изофлавоны играют
антибиотическую защитную роль.
Рис.1. Изменение содержания ФС (%) в интактных (1) и обработанных элиситором (2) клетках
суспензии.
Рис. 2. Изменение активности ФАЛ (1) и ПО (2) в клетках суспензии после добавления
элиситора
Культивирование клеток верблюжьей колючки в условиях солевого и водного стресса
выявило их чувствительность к этим факторам. Рост клеток наблюдали на средах с
минимально испытуемыми концентрациями соли (0,5%) и ПЭГ (5%). При всех испытанных
концентрациях соли отмечали повышенное содержание ФС. Максимальное количество ФС
фиксировали на средах с 1,0-1,5% NaCI, превышающее содержание ФС в контрольных
клетках в 7-8 раз. На средах с ПЭГ количество ФС мало отличалось у контрольных и опытных
вариантов (рис.3).
Рис.3. Содержание ФС в суспензионных клетках при засолении.
Солевой и осмотический стрессы вызвали увеличение активностей ФАЛ и ПО, которые
коррелировали с концентрациями NaCI и ПЭГ. Максимум активности ПО и ФАЛ отмечался
через 6 и 24 часов соответственно. Прямой корреляции между содержанием ФС и
активностью ФАЛ и ПО не наблюдали. Обратимое увеличение активностей ФАЛ и ПО носит
неспецифический характер и является защитной реакцией клеток на действие многих
стрессовых факторов (механическое поранение, инфицирование патогенами, гормональный,
температурный и другие стрессы) /13/. При действии засоления при высоких концентрациях
NaCI наблюдали изменения качественного состава ФС. В каллусных культурах
синтезировалось около 10 веществ, отсутствующих в контрольных клетках. Предварительный
анализ ФС позволил отнести эти вещества к классу фенолкарбоновых кислот, ауронам и
флавоноидам. Из фенолокислот идентифицировали хлорогеновую, феруловую, сиреневую и
синаповую кислоты. Повышенное содержание феруловой кислоты обнаружено во всех
вариантах опыта. Возможно биосинтез этой кислоты определяет специфичность ответа
клеток верблюжьей колючки при засолении.
Полученные результаты подтверждают, что культивируемые клетки верблюжьей колючки
сохраняют способность к синтезу отдельных классов биологически активных ФС. Показано,
что индукция биосинтеза ФС достигается при стрессовых условиях, при этом различные
стрессовые условия вызывают образование специфических ФС, участвующих в защитных
реакциях клетки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Barz W., Wiermann R. Recent aspects of flavonoid biosynthesis and degradation in plant .
Proceedings of International Bioflavonoid. Munich . FRG, 1981, P.185-210.
2. Lyens P.C., Weod K.V., Nicholson R.L. Caffeoyl aster accumulation in corn leaves inoculated with
fungal pathogens. Phytochemistry, 1990, V.29, N1, P. 97-101.
3. Клышев Л.К., Приходько Л.С., Достанова Р.Х. и др. Биохимические механизмы
интоксикации растений при засолении среды. Алма-Ата: Наука, 1980, с. 83-117.
4. Сапко О.А., Шамина З.Б., Кунаева Р.М. Действие N-нитрозо-N-метилмочевины на
вариабельность клоновых популяций Alhagi kirghisorum in vitro. Физиол. Растений, 1993, т.40,
с.314-318.
5. Кирай З., Клемент З., Шоймоши Ф., Вереш И. Методы фитопатологии, М.: Колосс, 1974.
6. Климчук И.С., Сапко О.А., Мухамеджанов Б.Г., Кунаева Р.М. Влияние грибного элиситора
Helmintosporium sativum на фенольный метаболизм культуры клеток alhagi kirghisorum.
Прикладная биохим. и микробиол., 1993, т.29, в. 4, с. 547-552.
7. Пашинина Л.Т. Методические указания к практикуму по качественнщму и количественному
анализу природных полифенолов и углеводов.-А-Ата:КазГУ,1979, с.47.
8. Сапко О.А., Кунаева Р.М. Фенольные соединения культуры клеток Alhagi kirghisorum. Химия
прир. соед., 1999, N 2, c.182-184.
9. Zucker M. Induction of phenylalanine-deaminase by light and its relations to chlorogenic acid
synthesis in potato tuber tissue. J.Plant Physiology,1965,V.40,N5,P.779-784.
10. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления одианизидина Н О в присутствии пероксидазы хрена. Биохимия, 1977, т.42, с. 1372-1379.
11. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1971, 352с.
12. Kochs G.,Weile R., Grisebach H. Differential induction of enzyme in soybean cell cultures by
elicitor or osmotic stress. Planta, 1987, V.171, P.519-524.
13. Сергейчик А.А. Фенилаланин-аммиак-лиаза и фенилпропаноидный метаболизм.
Физиология и биохимия культ. растений, 1987, т.19, N 3, с. 211-220.
SUMMARY
Quercetin, isorhamnetin, 3-0-rhamnoglucoside of sorhamnetin, retusin, 8-methylretusin, kalikosin
and formononetin are chosen and identified. Changes in the metabolism of PhC were studied in
cells infected with the fungal elicitor Helminthosporium sativum. The treatment of cells with the
elicitor stimulated the accumulation of soluble PhC and caused a 10-fold increase of phenylalanine
ammonia-lyase (PAL) activity and 2-fold increase of peroxidase activity. The content of phenolic
compounds and activity of phenylalanin ammonia- lease and peroxidase was increased at salinity
and drought. With increasing of salt concentration (1,0-1,5%) the qualitative composition were
changed.