Плазма крови

Введение
Данная работа посвящена изучению трансмембранного транспорта одного из
важнейших метаболитов, которым является глюкоза. Способом изучения транспорта
является наблюдение оптическим методом с помощью специального прибора КИНОКС
осмотического шока, вызванного добавлением в межклеточную среду избыточного
количества глюкозы. Давление – физический фактор, варьируя который, можно
воздействовать на мембрану исследуемых клеток, выясняя нюансы механизма транспорта
глюкозы в них. Сравнивая процессы при разных давлениях, можно выяснить особенности
проникновения глюкозы (какая часть идет по порам, какая нет). В качестве
экспериментальной модели выбраны эритроциты человека. Понимание деталей механизма
прохождения неспецифическим образом молекул глюкозы через липидные мембраны,
например, важно для решения проблем нормализации углеводного обмена при сахарном
диабете.
Актуальность проблемы
Данная работа посвящена изучению трансмембранного транспорта глюкозы.
Глюкоза представляет собой углевод и является одним из важнейших метаболитов,
обеспечивающих нормальную деятельность клеток ЦНС и большинства мышц. Ее
содержание в плазме крови на порядок превышает содержание других метаболитов
(жирных и аминокислот и др.). Наличие глюкозы в клетке необходимо для ее деления, так
как нужная для этого энергия запасается в виде гликогена, составными частями которого
являются молекулы глюкозы. Почти все системные заболевания (сахарный диабет,
атеросклероз, церебральный паралич, почечная недостаточность и др.) связаны с
нарушением углеводного обмена.
Избыток или недостаток глюкозы в клетке приводит к нарушению функций и
структур многих типов клеток. Поэтому очень важно изучить механизмы, определяющие
транспорт глюкозы через мембрану и найти факторы, позволяющие корректировать такие
нарушения.
В работах Фока М.В. и его группы было выяснено, что давление влияет на
проницаемость мембраны клеток, а, следовательно, и на функции клеток []. Поэтому
изменение давления представляется перспективным методом воздействия на клеточный
метаболизм с целью его корректировки в нужном направлении.
1
Постановка задачи
Дипломная работа является начальной частью большой работы по изучению
влияния проницаемости биомембран для глюкозы. Она посвящена созданию
специальной установки, позволяющей применять ранее разработанный в ФИАНе
прибор «КИНОКС» в условиях повышенного давления и разработке
соответствующих методик проведения опытов и анализа полученных данных.
Объект исследования
Объектом исследования являются эритроциты.
Этот выбор основан на том, что:
1.
Метаболизм эритроцитов наиболее прост, по сравнению с другими клетками,
что существенно облегчает экспериментальные исследования;
2.
Поскольку вода практически несжимаема (а значит, заметное изменение
коэффициента диффузии вряд ли будем иметь место), и внутри эритроцитов
нет никаких структур, имеющих свою мембрану, то это обеспечит
достоверность экспериментальных данных, основанных на предположении о
том, что внешнее избыточное давление влияет именно на
цитоплазматическую мембрану;
3.
Необходимые препараты крови гораздо легче приготовить, чем препараты
клеток других тканей;
4.
Известна высокая корреляция между изменениями свойств мембран
эритроцитов и клеточных мембран других тканей, что позволяет
рассматривать мембраны эритроцитов как естественную модель для
исследования общих характеристик всех биологических мембран;
5.
За проницаемостью эритроцитарных мембран, которая является
динамической величиной, можно наблюдать оптическим методом с
помощью прибора КИНОКС (разработанного в ФИАНе), что тоже очень
удобно. Только с помощью оптики можно, не разрушая клетку, следить за
прохождением сквозь ее мембрану молекул О2, глюкозы, Н2О, ионов и др. А
эритроциты плавают в плазме, и потому можно следить за ними, не разрушая
ткани, то есть, не изменяя их взаимодействия с другими клетками.
2
Литературный обзор
1. Объект исследования. Эритроцит, форма, структура, содержание. Метаболизм.
Реология (взаимодействие с внешним миром. Физические параметры.
2. Трансмембранный транспорт молекул через мембраны. Общие представления.
Специфический и неспец, Активный и пассивный
3. Физические модели транспорта. Регуляция несп прониц. Структура липидов…
4. Приложение. Где могут быть использованы знания эти.
 Эритроцит
Кровь
Кровь является циркулирующей по кровеносным сосудам жидкой тканью, состоящей из
двух основных компонентов, — плазмы и форменных элементов. Кровь в организме
человека составляет, в среднем, около 5 л. Различают кровь, циркулирующую в сосудах, и
кровь, депонированную в печени, селезенке, коже.
Плазма составляет 55—60 % объема крови, форменные элементы – 40—45%. Отношение
объема форменных элементов ко всему объему крови называется гематокритным
показателем, и составляет в норме 0,40 – 0,45. Термин гематокрит используют для
названия прибора (капилляра), который предназначен для измерения гематокритного
показателя.
Основные функции крови





дыхательная функция (перенос кислорода из легких во все органы и углекислоты
из органов в легкие);
трофическая функция (доставка органам питательных веществ);
защитная функция (обеспечение гуморального и клеточного иммунитета,
свертывание крови при травмах);
выделительная функция (удаление и транспортировка в почки продуктов обмена
веществ);
гомеостатическая функция (поддержание постоянства внутренней среды
организма, в том числе иммунного гомеостаза).
Через кровь транспортируются также гормоны и другие биологически активные вещества.
Все это определяет важнейшую роль крови в организме. Анализ крови в клинической
практике является одним из основных в постановке диагноза.
Плазма крови
Плазма крови представляет собой жидкое (точнее коллоидное) межклеточное вещество.
Она содержит 90% воды, около 6,6—8,5 % белков и другие органические и минеральные
соединения - промежуточные или конечные продукты обмена веществ, переносимые из
одних органов в другие.
3
К основным белкам плазмы крови относятся альбумины, глобулины и фибриноген.
Альбумины составляют более половины всех белков плазмы, синтезируются в печени.
Они обусловливают коллоидно-осмотическое давление крови, выполняют роль
транспортных белков для многих веществ, включая гормоны, жирные кислоты, а также
токсины и лекарства.
Глобулины – неоднородная группа белков, в которой выделяют альфа- бета- и гаммафракции. К последней относятся иммунноглобулины, или антитела, - важные элементы
иммунной (т.е. защитной) системы организма.
Фибриноген – растворимая форма фибрина, - фибриллярного белка плазмы крови,
образующего волокна при повышении свертываемости крови (например, при образовании
тромба). Главная роль фибриногена – обеспечение свертываемости крови.
Форма и строение эритроцитов
Популяция эритроцитов неоднородна по форме и размерам. В нормальной крови
человека основную массу составляют эритроциты двояковогнутой формы — дискоциты
(80—90 %). Кроме того, имеются планоциты (с плоской поверхностью) и стареющие
формы эритроцитов — шиповидные эритроциты, или эхиноциты, куполообразные, или
стоматоциты, и шаровидные, или сфероциты. Результатами старения эритроцитов могут
быть — кренирование (т.е. образованием зубцов на мембране) или инвагинация
(впячивании) участков мембраны.
Обязательной составной частью популяции эритроцитов являются их молодые
формы, называемые ретикулоцитами или полихроматофильными эритроцитами. В норме
их от 1 до 5 % от количества всех эритроцитов. В них сохраняются рибосомы и
эндоплазматическая сеть, формирующие зернистые и сетчатые структуры.
Размеры эритроцитов в нормальной крови также варьируют. Большинство
эритроцитов имеют диаметр около 7,5 мкм.
Мембрана эритроцита состоит из бислоя липидов и белков, представленных
приблизительно в равных количествах, а также небольшого количества углеводов,
формирующих гликокаликс. Отрицательный заряд находится на внутренней поверхности
мембраны, а своим электрическим полем он притягивает катионы из плазмы крови. Эти
катионы не прижаты непосредственно к мембране, а образуют слой толщиной около 20 Å
(толщина определяется концентрацией катионов в плазме).
В мембране эритроцита идентифицировано 15 главных белков. Более 60 % всех
белков составляют: примембранный белок спектрин и мембранные белки — гликофорин и
т.н. полоса 3.
Спектрин является белком цитоскелета, связанным с внутренней стороной
мембраны, участвует в поддержании двояковогнутой формы эритроцита. Молекулы
спектрина имеют вид палочек, концы которых связаны с короткими актиновыми
филаментами цитоплазмы, образуя т.н. «узловой комплекс». Цитоскелетный белок,
связывающий спектрин и актин, одновременно соединяется с белком гликофорином.
4
На внутренней цитоплазматической поверхности мембраны образуется гибкая
сетевидная структура, которая поддерживает форму эритроцита и противостоит давлению
при прохождении его через тонкий капилляр.
Соединение спектринового цитоскелета с мембраной обеспечивает внутриклеточный
белок анкирин. Анкирин связывает спектрин с трансмембранным белком мембраны
(полоса 3).
Гликофорин — трансмембранный белок, который пронизывает мембрану в виде
одиночной спирали, и его большая часть выступает на наружной поверхности эритроцита,
где к нему присоединены 15 отдельных цепей олигосахаридов, которые несут
отрицательные заряды. Гликофорины относятся к классу мембранных гликопротеинов,
которые выполняют рецепторные функции. Гликофорины обнаружены только в
эритроцитах.
Полоса 3 представляет собой трансмембранный гликопротеид, полипептидная цепь
которого много раз пересекает бислой липидов. Этот гликопротеид участвует в обмене
кислородом и углекислотой, которые связывает гемоглобин — основной белок
цитоплазмы эритроцита.
Цитоплазма эритроцита состоит из воды (60 %) и сухого остатка (40 %),
содержащего, в основном, гемоглобин.
Количество гемоглобина в одном эритроците называют цветовым показателем. При
электронной микроскопии гемоглобин выявляется в гиалоплазме эритроцита в виде
многочисленных плотных гранул диаметром 4—5 нм.
Гемоглобин - это сложный пигмент белковой природы, состоящий из 4
полипептидных цепей глобина и гема (железосодержащего порфирина), обладающий
высокой способностью связывать кислород (O2), углекислоту (CO2), угарный газ (CO).
Гемоглобин способен обратимо связывать кислород в легких, при этом в
эритроцитах образуется оксигемоглобин. В тканях выделяемая углекислота (конечный
продукт тканевого дыхания) поступает в эритроциты и соединяясь с гемоглобином
образует карбоксигемоглобин.
Разрушение эритроцитов с выходом гемоглобина из клеток называется гемолизом.
Утилизация старых или поврежденных эритроцитов производится макрофагами главным
образом в селезенке, а также в печени и костном мозге, при этом гемоглобин распадается,
а высвобождающееся из гема железо используется для образования новых эритроцитов.
Другие реакции и функции гемоглобина: При взаимодействии молекулярного
кислорода с гемоглобином существует небольшая, но конечная вероятность окисления
последнего: молекула О2 не присоединится, но окислит железо: Fe2+ + O2  Fe3+ O2.
Поэтому при дыхании в эритроцитах непрерывно образуется метгемоглобин. Для его
восстановления в эритроците существует специальная ферментативная система,
восстанавливающая
метгемоглобин
и
превращающая
его
в
нормальный
дезоксигемоглобин. При нарушении этой системы возникает тяжелое заболевание –
метгемоглобинемия, при котором гемоглобин перестает быть переносчиком кислорода.
5
В цитоплазме эритроцитов содержатся ферменты анаэробного гликолиза, с помощью
которых синтезируются АТФ и НАДН, обеспечивающие энергией главные процессы,
связанные с переносом О2 и СО2, а также поддержание осмотического давления и
перенос ионов через мембрану эритроцита. Энергия гликолиза обеспечивает активный
транспорт катионов через мембрану, поддержание оптимального соотношения
концентрации К+ и Na+ в эритроцитах и плазме крови, сохранение формы и целостности
мембраны эритроцита. НАДН предотвращает окисление Hb в метгемоглобин.
Эритроциты участвуют в транспорте аминокислот и полипептидов, регулируют их
концентрацию в плазме крови, т.е. выполняют роль буферной системы. Постоянство
концентрации аминокислот и полипептидов в плазме крови поддерживается с помощью
эритроцитов, которые адсорбируют их избыток из плазмы, а затем отдают различным
тканям и органам. Таким образом, эритроциты являются подвижным депо аминокислот и
полипептидов.
Средняя продолжительность жизни эритроцитов составляет около 120 дней. В
организме ежедневно разрушается (и образуется) около 200 млн эритроцитов. При их
старении происходят изменения в мембране эритроцита: в частности, в гликокаликсе
снижается содержание сиаловых кислот, определяющих отрицательный заряд оболочки.
Отмечаются изменения цитоскелетного белка спектрина, что приводит к преобразованию
дисковидной формы эритроцита в сферическую. В мембране появляются специфические
рецепторы к аутологичным антителам (IgGl, IgG2), которые при взаимодействии с этими
антителами образуют комплексы, обеспечивающие «узнавание» их макрофагами и
последующий фагоцитоз таких эритроцитов. При старении эритроцитов отмечается
нарушение их газообменной функции.
Таблица 1. Количественный состав веществ внутри и вне эритроцита
мМоль/
литр
Эритроцит
Плазма
Hb
5
0
Глю
2,3
АТФ
Лактат
коза
ДФГ
5
1,8
5
2,9
-3
5
10
2,5
P
Cl-
K+
Na+
Ca2+ Mg2+ Итого
1
1
76
110
132
4
19
120
10-4
1.5
4
1.7
249,7
245,7
Эритроцит человека и других млекопитающих является монофазной клеткой, т. е.
не имеет эндоплазматических мембран. Снаружи эритроцит окружен белково-липидной
мембраной.
Рис.1. Средние размеры эритроцита.
Он заполнен гемоглобином, молекулы которого вблизи от мембраны расположены
упорядоченно, а в более глубоких слоях - хаотично. Плоскость "упаковки" молекул
гемоглобина в эритроците такова, что даже в центральных частях подвижность его
каждой молекулы ограничена пространством в 10 Å.
Строение мембраны эритроцита подобно строению других клеточных мембран.
Цитоскелет эритроцита способен к деформации, что позволяет ему проникать в мелкие
каппиляры. Кроме того, эритроциты несут антигены, определяющие группу крови
человека.
Эритроциты способны депонироваться в определенных органах, предохраняя от
разрушения системы сосудов при увеличении объема крови. Так как объем крови сильно
варьируется, эти депо просто необходимы. Исследования Barkroft и его школы показали,
что селезенка и печень являются главными резервуарами эритроцитов.
По данным Faghraene, Allen и Reene резервуаром для эритроцитов являются те
части организма, которые содержат эритроцитов больше, чем это необходимо для их
тканей, таким образом, речь идет не об истинных, а о функциональных резервуарах.
6
Кроме селезенки к ним относятся печень, подкожные сосудистые сплетения и другие
части кровообращения[27].
Мембрана эритроцита состоит из бислоя липидов и белков, а также небольшого
количества углеводов, формирующих гликокаликс. В силу своей специализации (перенос
кислорода от легких к тканям) эритроцит по механическим свойствам является
уникальной клеткой, так как в отличие от других клеток постоянно подвергается
выраженным деформирующим воздействиям в кровеносном русле [28]
 Мембрана
Структура биологической мембраны
Структура и функции биологических мембран хорошо и наиболее полно
представлены в книге Р. Геннис «Биомембраны. Молекулярная структура и функции»[9].
Но информации о неспецефической проницаемости биомембран очень мало, особенно для
естественных мембран.
Большую роль в проницаемости мембраны играет ее структура. Биологические
мембраны существенно гетерогенны. [30,37-47]
Работы Фока отличается более детальным описанием структуры мембран на
субмолекулярном уровне. Особая роль выделена коллективному изменению конформаций
молекул липидов – наклонов головок. В этих работах была уточнена мозаичная
жидкокристаллическая модель мембран. [9]
Мембраны играют ключевую роль, как в структурной организации, так и в
функционировании всех клеток – прокариотических и эукариотических, растительных и
животных. Мембраны формируют внутриклеточные компартменты (отсеки), с их
помощью происходит разделение содержимого компартментов и окружающей их среды.
Мембраны также участвуют в регуляции всех связей и взаимодействий, которые
осуществляются между наружной и внутренней сторонами этих компартментов. Это
может проявляться в виде физического переноса ионов или молекул через мембрану
(внутрь компартмента или из него) или в форме передачи информации при помощи
конформационных изменений, индуцируемых в мембранных компонентах. Кроме того, с
мембранами связаны многие клеточные ферменты. Некоторые их них катализируют
трансмембранные реакции, когда реагенты находятся по разные стороны мембраны или
когда каталитический акт сопровождается транспортом молекул. Другие ферменты
образуют своеобразные комплексы, которые осуществляют цепь последовательных
превращений, причем благодаря тому, что эти ферменты располагаются в плоскости
мембраны, повышается эффективность всего процесса. Имеются ферменты, которые,
действуя на мембраносвязанные субстраты, участвуют тем самым в биосинтезе мембран.
С участием мембран в той или иной степени осуществляется большинство жизненно
важных клеточных функций, например, протекают такие разные процессы, как
репликация прокариотической ДНК, биосинтез белков и их секреция, биоэнергетические
процессы и функционирование систем гормонального ответа.
Таким образом, видим, что роль мембраны в биологических процессах велика. И
очень важно иметь полное представление на молекулярном уровне об ее функциях.
7
Толщина биологических мембран не превышает 100 Å. Важнейшая функция
биологических мембран – регулирование транспорта ионов, сахаров, аминокислот и
других продуктов обмена веществ.
Функциональные свойства биологических мембран тесно связаны с их структурной
организацией и в значительной степени определяются ею.
Методом электропроводности удалось измерить электрическую ёмкость клеточной
мембраны, равную 1 мкФ/см2, и рассчитать толщину её липидного слоя, которая оказалась
равной 55 Å..
Методами рентгеноструктурного анализа, электронной микроскопии, а также
оптическими и биохимическими методами показано, что поверхностная клеточная
мембрана и мембраны субклеточных частиц – митохондрий, ядер, микросом, лизосом и
др. – имеют сходную структуру. Они состоят из бимолекулярного липидного слоя (в
основном из фосфолипидов) толщиной 35 Å и двух нелипидных слоев толщиной 20 Å
каждый (американский исследователь Дж. Робертсон).
Основными компонентами мембран являются белки и липиды. На долю углеводов
может приходиться около 10% массы мембран, при этом они всегда входят в состав
гликолипидов или гликопротеинов. Соотношение между белками и липидами в
мембранах значительно варьирует [52].
В работе Черницкого Е.Л. и Воробья А.В. [Черницкий Е.А., Воробей А.В.
Структура и функция эритроцитарных мембран. – Минск, 1981. – 286 с.] в общем виде
показано, как устроена цитоплазматическая мембрана, как в ней расположены липиды,
уже идет разговор о липидном бислое и о том, какие белки в него встроены, какие есть
рецепторы и переносчики. То есть структура и функции мембран описаны на
современном уровне, за исключением молекулярного механизма авторегуляции
неспецифической проницаемости мембран.
В работе по реологии крови [] представлен широкий круг вопросов: механические
свойства, оптические характеристики, реологические свойства крови, ее
электрофоретические характеристики. Отчасти описаны свойства гемоглобина.
В опытах показано, что при деформирующем эритроцит сдвиговом напряжении
около 6 Н/м2, создаваемом обтеканием закрепленного на стекле эритроцита, он
удлиняется на 80% по сравнению с длиной при 0,6 Н/м2. Упрощенные расчеты привели к
величине «модуля Юнга» для эритроцита целиком порядка 7*103 Н/м2, характерной для
легко деформируемых материалов.
Известно, что при всестороннем сжатии мембраны модуль Юнга ее одностороннего
сжатия в латеральном направлении больше чем на порядок превышает его значение в
направлении нормали к поверхности мембраны.
Отсюда следует, что при всестороннем сжатии, вызванном избыточным давлением в
среде, окружающей клетки, диаметр пор должен уменьшаться и соответственно должна
уменьшаться неспецифическая проницаемость для частиц, способных проходить по ним
внутрь клетки.
В работах Атауллаханова Ф.И. в полном объеме представлена биохимия
метаболических процессов эритроцитов, описаны соответствующие реакции и ферменты в
них участвующие.
В работе [] более подробно представлены структуры основных крупных белков в
мембране эритроцитов и их функции.
Иржак Л.И. в своей работе [] описал все свойства гемоглобина (в частности сродство
к кислороду), их виды, подвиды.
8
Блюменфельд Л.А. дал полную теорию взаимодействия кислорода с гемом (с
двухвалентным железом) как для миоглобина, так и для гемоглобина и провел сравнение
и подтвердил все это экспериментально в своих работах [].
Проницаемость мембраны
Коэффициент диффузии характеризует способность разных частиц перемещаться
вследствие теплового движения, но он относится только к их диффузии в однородной
среде. А как быть с диффузией сквозь мембрану? Как известно, мембраны в организме
пропускают не все частицы. Сквозь цитоплазматическую мембрану (оболочку клетки)
сравнительно легко проходят молекулы воды и другие мелкие молекулы, но почти не
проходят ионы натрия и калия, из-за того, что они окружены гидратной оболочкой,
образованной прочно приставшими к иону молекулами воды. А молекулы белков,
например, гемоглобина и вовсе не проходят. Как видно, способность молекул
диффундировать сквозь мембрану надо характеризовать как-то иначе. Для этого
используют понятие проницаемость мембраны для данных молекул. Когда по обе стороны
мембраны находится один и тот же растворитель (в организме - вода), то диффузионный
поток какого-либо вещества сквозь мембрану равен произведению проницаемости
мембраны для молекул этого вещества на разность его концентраций по разные стороны
мембраны и на площадь ее поверхности. Разумеется, поток течет в сторону меньшей
концентрации. Проницаемость мембраны для разных молекул различается гораздо
сильнее, чем коэффициент диффузии тех же молекул. Так, сквозь цитоплазматическую
мембрану легко проходят молекулы воды, кислорода, двуокиси углерода, а ее
проницаемость для глюкозы много меньше. Проходят, конечно, и ионы, но их поток
зависит также и от напряженности электрического поля в мембране.
Заметим, что оба эти параметра, характеризующие способность к диффузии суть
результаты усреднения. Коэффициент диффузии — усреднения по объему растворителя,
охватывающему много неоднородностей, все время возникающих и исчезающих в нем изза теплового движения, а проницаемость — усреднения по достаточно большому участку
поверхности мембраны, насчитывающему много тысяч молекул. По толщине
цитоплазматической мембраны усреднить количество неоднородностей невозможно из-за
малости ее толщины — в ней всего два мономолекулярных слоя.
Проницаемость биологических мембран – важнейшее свойство биологических
мембран, заключающееся в их способности пропускать в клетку и из неё различные
метаболиты (аминокислоты, сахара, ионы и т.п.). Проницаемость имеет большое значение
для осмотической регуляции и поддержания постоянства состава клетки, её физикохимического гомеостаза; играет важную роль в генерации и проведении нервного
импульса, в энергообеспечении клетки, сенсорных механизмах и др. процессах
жизнедеятельности. Проницаемость биологических мембран обусловлена особенностями
строения мембран, являющихся осмотическим барьером между клеткой и средой, и
служит характерным примером единства и взаимосвязи между структурой и функцией на
молекулярном уровне.
Клетки могут изменять проницаемость своей цитоплазматической мембраны в
соответствии со своими потребностями в данный момент. Далее описан молекулярный
механизм перестройки мембраны, обеспечивающий эти изменения проницаемости.
Молекулярный механизм изменения проницаемости цитоплазматической мембраны
9
Как хорошо известно, цитоплазматическая мембрана состоит из липидного
матрикса, в который встроены молекулы белка, причем, далеко не все они находятся
целиком внутри матрикса. Так, спектрин внедрен в матрикс в отдельных точках, а
остальная часть его находится в цитоплазме. В мембране эритроцитов есть еще один
неглобулярный белок – гликофорин. Он находится на внешней стороне мембраны и почти
весь погружен в плазму крови. Поэтому, хотя около половины массы цитоплазматической
мембраны приходится на белки, по площади они занимают значительно меньше
половины, а большая часть поверхности мембраны представляет собой липидный
матрикс.
Матрикс представляет собой пленку, состоящую из двух мономолекулярных слоев
липидов, общая толщина которой (0,006 – 0,007)мкм. Молекула липида состоит из двух
частей – дипольной «головки» и углеводородного «хвоста». Хвост представляет собой две
цепочки атомов углерода, к каждому из которых присоединен один или два атома
водорода. Разные липиды различаются по длине этих цепочек, но в среднем, в них
находится десятка по полтора атомов углерода. По своему составу и строению эти
цепочки сродни молекулам парафина и тоже не смачиваются водой, гидрофобны. А
дипольные головки, напротив, гидрофильны, так как их диполи могут притягиваться к
диполям воды. Поэтому молекулы липидов ориентированы в матриксе так, что в каждом
монослое их дипольные головки направлены в сторону водной среды, то есть, наружу, а
углеводородные хвосты – подальше от воды, то есть внутрь слоя.
В каждом мономолекулярном слое липидов дипольные головки могут быть в одном
из двух устойчивых положений – таком, когда их диполи ориентированы почти
перпендикулярно плоскости слоя, или в таком, когда они сильно наклонены. Но
расположены они так тесно, что сильно наклониться или выпрямиться из сильно
наклоненного положения ни одна головка не может в одиночку, поскольку ей мешают
соседние головки. Перейти из одного положения в другое они могут только все вместе на
довольно большом участке матрикса, размеры которого определяются количеством
встроенных в матриксе белков. То есть существует кооперативный эффект.
Если головки перпендикулярны плоскости слоя, то одноименные заряды соседних
головок находятся ближе друг к другу, чем разноименные и головки взаимно
отталкиваются. Слой не распадается благодаря водородным связям между
углеводородными хвостами и притяжению дипольных головок к молекулам воды, так как
они тоже имеют дипольный момент. При такой ориентации дипольных головок
положение молекул липидов упорядочено только в одном направлении – все они
вытянуты параллельно друг другу и перпендикулярно плоскости слоя, а их концы не
выступают из его плоскости. Но в двух других направлениях они могут сравнительно
легко перемещаться друг относительно друга, наподобие молекул в жидкости. Поэтому,
как и в трехмерной жидкости, тепловое движение не дает установиться дальнему порядку
в плоскости слоя. Слой в таком состоянии можно назвать двумерной жидкостью. Как и в
трехмерной жидкости, в нем все время возникают и исчезают сгущения и разрежения,
которые живут очень недолго – порядка десятимиллиардной доли секунды или даже
меньше. Возможна даже диффузия в плоскости слоя – «латеральная» диффузия.
Если же головки наклонены так сильно, что «плюс» на вершине каждой головки
оказывается ближе к «минусу» в основании одной из соседних, то головки взаимно
притягиваются. При этом противоположные заряды соседних головок стремятся
расположиться как можно ближе друг к другу. Это упорядочивает взаимное расположение
молекул липидов также и в двух других направлениях. Возникают параллельные друг
другу правильные ряды молекул. В таком состоянии мономолекулярный слой липидов
подобен мономолекулярному слою в трехмерном кристалле и его можно назвать
двумерным кристаллом.
10
Встроенные в матрикс молекулы белков разделяют его на отдельные участки –
блоки, которые могут независимо друг от друга переходить из состояния двумерного
кристалла в состояние двумерной жидкости и обратно. При этом на каждом таком блоке
матрикса не обязательно оба липидных монослоя должны быть в одинаковом состоянии.
Один из них может быть в жидком, а другой – в кристаллическом состоянии. Но если оба
они находятся в состоянии двумерного кристалла, то ряды молекул в одном из них в
точности соответствуют рядам в другом. Если же в двух соседних независимых блоках
оба монослоя находятся в состоянии двумерного кристалла, то ряды молекул в одном
блоке ориентированы под случайным углом к рядам в другом участке и не могут плавно
переходить друг в друга. На границе между этими блоками возникают долгоживущие
уплотнения и разрежения. То же самое наблюдается и между монокристаллическими
блоками трехмерного кристалла, но там такие разрежения, называемые каналами краевых
дислокаций, пронизывают не два, а много тысяч мономолекулярных слоев. Как
показывает опыт, по этим каналам атомы примесей движутся в кристалле в тысячи раз
быстрее, чем в поперечном направлении. В липидном матриксе всего два слоя и каналы
краевых дислокаций, конечно, пронизывают его насквозь. По ним кислород, а также
другие мелкие молекулы (например, глюкоза), могут легко проходить сквозь мембрану.
Но для этого необходимо, чтобы в состоянии двумерного кристалла были оба монослоя
двух соседних блоков матрикса. Если же хотя бы в одном из соседних независимых
блоков матрикса хотя бы один монослой перейдет в состояние двумерной жидкости, то
тепловое движение быстро закроет каналы краевых дислокаций. Хотя области разрежения
и будут возникать в жидком монослое, но в случайных местах, не связанных с местами
разрежения в кристаллическом монослое. Конечно, изредка такое разрежение может
возникнуть и против канала краевой дислокации в кристаллическом монослое, но оно
продержится там лишь менее одной десятимиллиардной доли секунды, и очень
маловероятно, что в это самое время возле него окажется молекула кислорода, а соседние
молекулы воды толкнут ее прямо в эту пору, а не куда-нибудь в сторону. На такой
границе между независимыми блоками матрикса мембрана практически непроницаема
для кислорода. Проницаемость мембраны пропорциональна общей длине границ
между независимыми блоками матрикса, у которых оба монослоя находятся в
состоянии двумерного кристалла.
Тепловое движение все время стремится перевести каждый монослой в каждом
блоке из одного состояния в другое. То, сколько, в среднем, их будет в жидком и сколько
в кристаллическом состоянии, зависит от соотношения между глубинами
соответствующих минимумов потенциальной энергии, которые, в свою очередь, зависят
от напряженности имеющегося в мембране электрического поля. В каждом монослое
возникает динамическое равновесие между блоками в состоянии двумерной жидкости и
двумерного кристалла, но устанавливается оно, по молекулярным масштабам времени,
очень медленно – за сотые доли секунды, если не дольше. Примерно столько же времени в
матриксе могут сохраняться сквозные поры, образованные областями разрежения краевых
дислокаций на границах кристаллических блоков матрикса. Этим они отличаются от пор,
возникающих в жидком монослое, которые живут меньше миллиардной доли секунды.
Поэтому проницаемость мембраны для кислорода и других мелких молекул определяется
не ими, а долгоживущими порами.
Количество долгоживущих пор в мембране, а значит, и ее проницаемость, зависит от
напряженности электрического поля в матриксе. По привычным меркам, приходящаяся на
мембрану разность потенциалов очень мала – сотые доли вольта, а толщину матрикса
трудно себе представить – она чуть больше двухмиллионной доли сантиметра. Поэтому
напряженность поля в мембране велика – десятки тысяч, а в некоторых клетках – больше
сотни тысяч вольт на сантиметр. Именно поэтому оно и может влиять на структуру
матрикса. А электрического пробоя не получается, потому что для него нужны многие
вольты, а тут всего сотые доли вольта.
11
При отсутствии внешнего поля минимум потенциальной энергии, соответствующий
наклонным головкам настолько глубже минимума, соответствующего выпрямленным
головкам, что оба монослоя находятся в состоянии двумерного кристалла. Проницаемость
мембраны в таких условиях должна быть велика. Но поле в мембране имеется
практически всегда. А так как липидные молекулы и в том и в другом монослое матрикса
ориентированы дипольными головкам в сторону водной среды, то их дипольные моменты
направлены в противоположные стороны, и поле в матриксе действует на них по-разному.
Поскольку цитоплазма всех клеток заряжена отрицательно, то поле в мембране
направлено так, что оно стремится еще сильнее наклонить головки в наружном слое и
выпрямить их во внутреннем (соприкасающимся с цитоплазмой) слое. Но если
напряженность поля не слишком велика, то во внутреннем слое минимум потенциальной
энергии, соответствующий наклонным головкам остается все же заметно глубже
минимума, соответствующего выпрямленным. Тогда почти все независимые блоки
матрикса имеют оба монослоя в состоянии двумерного кристалла, между ними много
краевых дислокаций, а значит много долгоживущих сквозных пор и проницаемость
мембраны велика. По мере усиления поля в матриксе минимум потенциальной энергии,
соответствующий выпрямленным головкам становится все глубже. Соответственно
возрастает количество блоков, находящихся в состоянии двумерной жидкости и
проницаемость мембраны уменьшается. Этим клетки и пользуются для регуляции
проницаемости своей цитоплазматической мембраны – они изменяют напряженность
имеющегося в ней электрического поля.
 Сахарный диабет
Системное заболевание, каким.является сахарный диабет (СД), широко
распространен. Так в западных странах им страдают 2-5% населения, а в развивающихся
— 10-15 %. Каждые 15 лет число больных удваивается. Если в 1994 году в мире
насчитывалось 120,4 млн больных СД, то к 2010 году их число по прогнозам
специалистов, составит 239,3 млн. В России сахарным диабетом страдают около 8 млн
человек.
Поэтому в настоящее время сахарный диабет (СД) является острейшей медикосоциальной проблемой. Драматизм и актуальность проблемы определяются широкой
распространенностью СД, высокой смертностью и ранней инвалидизацией больных.
По определению ВОЗ (1981 г.) сахарный диабет — это состояние хронической
гипергликемии, которое может развиться в результате воздействия многих экзогенных и
генетических факторов, часто дополняющих друг друга.
Гипергликемия — это стойкое повышение сахара в крови, которое у больных не
редко может сменяться резким падением до уровня ниже нормального. В случае
достижения низкого критического уровня глюкозы (2,5 ммоль) человек может потерять
сознание и даже погибнуть.
Наиболее полное представление о характере заболевание можно найти в работе
[И.И. Дедов, В.В. Фадеев «Введение в диабетологию», М., 1998]. В ней даны подробная
классификация СД, его симптоматика и клинические проявления, а также осложнения и
методы лечения и профилактики.
При СД происходит устойчивое и необратимое нарушение работы системы
гомеостаза сахара во внутренней среде организма. Необратимость в том смысле, что сама
система восстановиться не может и требуется врачебная помощь.
Считается, что причиной СД 1-го типа является абсолютная нехватка инсулина, а СД
2-го типа – относительная, что в начале вызывает нарушение углеводного обмена, а затем
12
всех видов обмена веществ, что в конечном итоге приводит к поражению всех
функциональных систем организма. Подробное освещение проблемы патогенеза и
протекания стадий СД даны в работе [Балаболкин М.И. «Сахарный диабет»,М., 1994].
Инсулин – это пептид, который является одним из важнейшим анаболиком,
недостаток поступления в клетки которого сразу приводит к угнетению энергетического
метаболизма чувствительных к нему клеток. Таких клеток большинство в организме. А
так как клетки взаимодействуют друг с другом, то сразу произойдет ухудшение
самочувствия и сокращения функциональных возможностей систем и организма в целом.
Причиной недостатка инсулина может быть ослабление функций бетаклеток
островков Лангерганса (?) поджелудочной железы и его выделение не хватает на все
инсулин чувствительные клетки (СД 1-го типа). С другой стороны масса тела может быть
настолько большой, что количества произведенного инсулина также не будет хватать всем
чувствительным к инсулину клеткам (СД 2-го типа).
В итоге в организме больного со сложившимся диабетом наблюдается общее
ослабление функций всех систем из-за ослабления энергетического метаболизма клеток. А
это в свою очередь приводит к обеднению белкового пула всех клеток. В том числе
уменьшается аффиность (чувствительность к ассоциации с молекулами инсулина),
количество инсулиновых рецепторов в мембранных структурах [ссылка на книгу
Инсулиновые рецепторы и функции] и белков, ассоциированных с мембраной.
Складываются условия для формирования порочных кругов: уменьшение аффиности и
числа рецепторов ослабляют энергетику клетки, в свою очередь эти специализированные
клетки все в большей степени теряют способность к выполнению функции, что влияет на
клетки, производящие анаболик, и порочный круг закрывается.
Основой развития патологии является прогрессирующее понижение уровня
энергетического метаболизма клеток. Поэтому лечебные мероприятия направлены на
коррекцию нарушений путем заместительной терапии, восполняя недостаток анаболиков
в организме, в первую очередь инсулина (инсулинотерапия).
Влиять на энергетический метаболизм можно не только анаболиками, но и
изменением трансмембранного транспорта субстратов и конечных продуктов реакций,
протекающих в клетках. В первую очередь интересен метаболизм глюкозы и ее транспорт.
Молекулы глюкозы проходят через липидные мембраны неспецифично.
13
Приборная часть
Составные части экспериментальной установки:
1) Прибор «БароКИНОКС»;
2) Барокамера на 3л;
3) Комплекс оборудования для создания необходимых условий в камере:
 Система обеспечения прибора газовой смесью заданного состава;
 Система подачи заданного количества 40%-го раствора глюкозы в кювету
с пробой;
4) Электронная часть;
5) Регистрационная часть на основе компьютера;
Основные узлы и элементы прибора «БароКИНОКС»
1.
2.
3.
4.
5.
Оптоэлектронный блок, включающий в себя светодиоды, работающие в
красной и инфракрасной областях спектра (на длинах волн 0,65 мкм и 0,96
мкм соответственно) и фотодиод;
Цилиндрический металлический корпус;
Кювета, выполненная из прозрачного материала (оргстекла);
Механическая мешалка с двумя лепестками, выполненными из гибкого
пластика, толщину и жесткость которых можно варьировать;
Шаговый двигатель, с помощью которого вертится мешалка.
14
Схема оптических измерений с помощью прибора КИНОКС
Принцип действия прибора «БароКИНКС»
Поскольку проницаемость мембран, в том числе эритроцита, определяет скорость
обмена веществом между системами, разделенными мембраной, то она является сугубо
кинетическим параметром и может быть определена только посредством наблюдения за
кинетикой неравновесного процесса обмена этим веществом.
В кювете имитируются процессы кислородного обмена между эритроцитами и
тканями-потребителями кислорода. При этом взаимодействие эритроцитов со стенками
кюветы и лепестками мешалки имитирует взаимодействие со стенками капилляров.
Степень этого взаимодействия определяет величину проницаемости мембран
эритроцитов.
Оптические характеристики крови зависят от объема, то есть от показателя
гематокрита.
Оптическая система регистрации отраженного от крови света, испускаемого двумя
светодиодами в красной и инфракрасной областях (0,65 нм и 0,95 нм), реагирует,
например, на изменение объема эритроцитов при наблюдении установления
осмотического равновесия между плазмой и цитоплазмой клеток, вызванного
искусственным добавлением гиперосмолярного раствора глюкозы.
15
.
Система подачи заданного количества 40%-го раствора глюкозы в кювету с
пробой
Основным узлом системы подачи глюкозы является пластиковый шприц с изогнутой
иглой, на которую надет кембрик, по которому глюкоза подается в кювету.
Поршень шприца можно приводить в движение с помощью специального реечного
механизма с червячной передачей, сопряженной с шаговым двигателем. Для
осуществления этого процесса и его регулировки был разработан и испытан узел
электропитания и управления.
Регулирование движения в одном и в другом направлении осуществляется с
помощью двух реле, одно из которых включает или выключает шаговый двигатель, а
второе может менять полюса шагового двигателя, осуществляя тем самым реверс. Более
подробно об этом написано ниже.
Преобразование крутящего движения в поступательное производится с помощью
червячного механизма и линейки, связанной с поршнем шприца.
Система обеспечения прибора газовой смесью заданного состава
Система обеспечения прибора газовой смесью выполнена на основе стандартного
40 л баллона высокого давления (до 150 атм) накачанного специальной смесью. Баллон
оснащался стандартным редуктором, понижающим на выходе давление газа до
необходимой величины. Редуктор гибкими трубопроводами соединялся со стандартным
игольчатым натекателем, допускающим тонкую регулировку скорости протока газовой
смеси. После натекателя устанавливался водяной затвор, выполненный в виде стеклянной
емкости с двумя отделениями, разделенными стеклянной перегородкой, имеющей окно у
дна сосуда. Два штуцера в верхней части водяного затвора (по одному с каждой стороны)
обеспечивали вход газовой смеси в затвор и ее выход. Сам сосуд был заполнен водой до
уровня, расположенного выше окна в стеклянной перегородке. При подаче газа во
входную часть затвора вода из этой части вытеснялась в другую половину сосуда до тех
пор, пока газ через окно в перегородке не начинал поступать в выходную часть затвора.
Проходя через толщу воды в виде пузырьков, газ поступал в выходной штуцер и далее по
присоединенному к нему гибкому трубопроводу направлялся в полость кюветы, где
контактировал с кровью. Превышение уровня воды в выходной части затвора над уровнем
во входной части составляло 1-2 см. Скорость натекания газа оценивалась по количеству
выходящих пузырьков в единицу времени и могла регулироваться с помощью натекателя.
Вторым назначением водяного затвора являлось увлажнение газовой смеси почти до ста
100% во избежание высыхания крови в кювете. Таким образом, основными элементами
систем обеспечения работы КИНОКСа являются 40-литровый баллон, двухкамерный
стандартный редуктор, гибкие резиновые трубопроводы, игольчатый натекатель (на
рисунке не указан), водяной затвор-увлажнитель. Все узлы являются стандартными.
16
Система обеспечения прибора КИНОКС газовой смесью:
1- баллон высокого давления; 2 – двухкамерный редуктор;
3 – гибкие трубопроводы; 4 – водяной затвор-увлажнитель;
5 – крышка кюветы со штуцером; 6 – прибор КИНОКС в барокамере.
Кроме того, в систему обеспечения работы КИНОКСа входят компьютер и
специальный блок питания, о которых будет подробнее сказано в соответствующем
разделе.
Подготовка печатных плат
Электронный блок включает многие нестандартные элементы, поэтому были
разработаны и изготовлены оригинальные печатные платы и произведена их набивка.
Прежде чем изготовить саму плату нужно развести все детали, разместить их на
плате. Для этого применялась специальная программа ARCAD, в которой создавались и
разводились электронные схемы. В этой работе я принимала непосредственное участие.
Также мною была в полной мере освоена методика изготовления печатных плат и
их набивка. Использовались следующие материалы: стеклотекстолит (стеклоткань,
пропитанная эпоксидной смолой) или гетинакс (картон, пропитанный специальным
клеем); работали с односторонними и двусторонними пластинами (слой меди с одной или
двух сторон подложки). Мною было освоено несколько методов изготовления печатных
плат:
 В платах небольшого размера с небольшим количеством деталей использовался
метод нанесения рисунка через рейсфедер нитролаком, который смывается
ацетоном. После высыхания рисунок протравливался в растворе FeCl3.
 В двухсторонних или крупных платах с большим количеством деталей
использовались печатные рисунки: на подложку наносился фоточувствительный
лак, пластина просушивалась в сушильном шкафу. На бумагу с распечатанной
платой наносился просветлитель; далее накладывалась бумага на подложку со
стороны аэрозоля, прикрывалась оргстеклом и засвечивалась УФ лампой в течение
нескольких минут. Далее выдержка в темноте, проявка в растворе каустической
соли (NaOH 7 г на 1 л) и просушка в течение получаса в шкафу. Затем, как и в
первом варианте, протравка в растворе FeCl3.
Отверстия для набивки деталей, просверливались до нанесения рисунка платы.
Диаметр сверла 0,5-1,0 мм в зависимости от размера ножек деталей.
Все изготовленные платы задействованы в установке.
Пример платы в приложении 2.
17
Схема для измерений в камере под избыточным давлением (электронная часть)
Камера предназначена для снятия кривых оксигенации крови в условиях избыточного
давления. Она представляет собой кювету, помещенную в изолированную камеру. Кроме
того, в камере расположена дозирующая система для подачи глюкозы в кювету с кровью
во время измерений. Блок-схема измерительной системы показана на Рис. 1. Датчики
кислорода (КЕ-25), углекислого газа (TGS-4160) и скорости протекания газовой смеси
(AWM-2100v) предполагается использовать в следующем варианте измерительной схемы.
В данном варианте они отсутствуют.
Камера во время измерений находится под избыточным давлением и изолирована от
окружающей среды. Кювета с образцом крови перемешивается шаговым двигателем SM1
со скоростью несколько оборотов в секунду. Дозирующая система представляет собой
шприц с управлением от второго шагового двигателя SM2 с возможностью смены
направления вращения. Оба шаговых двигателя работают от одной электронной схемы,
реверс и включение/выключение вращения двигателя SM2 осуществляются с помощью
электромагнитных реле типа РЭС22. Соединение с компьютером IBM PC осуществлено
через параллельный порт LPT. Это позволяет подключать как настольный компьютер, так
и ноутбук.
Рис. 5.1. Блок-схема измерений в камере избыточного давления (HPK0.SCH).
18
Полная измерительная схема включает в себя следующие блоки.
Блок управления светодиодами
Блок управления излучающими светодиодами (красный/инфракрасный) аналогичен
соответствующим узлам прибора КИНОКС. Нужный светодиод включается подачей
логической “1” на соответствующий бит данных LPT порта компьютера (красный – D0,
инфракрасный – D1).
Фотоприёмник
Фотоприемный диод, расположенный под дном кюветы внутри камеры, измеряет
свет, отраженный от крови, и усиливается усилителем сигнала до напряжения порядка 1
вольт. Через коммутатор сигналов это напряжение подается на 12-разрядный аналогоцифровой преобразователь и передается в компьютер.
Рис. 5.2. Схема управления красным и инфракрасным светодиодами (HPK4.SCH).
19
Рис. 5.3. Усилитель сигнала с фотоприемного диода.
Рис. 5.4. Универсальный АЦП с коммутатором каналов и оптоэлектронной развязкой.
Аналого-цифровой преобразователь с коммутатором каналов и оптоэлектронной
развязкой
Двенадцатиразрядный аналого-цифровой преобразователь с коммутатором каналов
и оптронной развязкой повторяет схему КИНОКС. В данном случае кювета одна, но
коммутатор АЦП понадобится в будущем для измерения состава газовой смеси и
скорости её протока в следующих вариантах прибора. Описание протокола работы
микросхемы
AD7893
можно
найти,
например,
в
http://www.ortodoxism.ro/datasheets/analogdevices/AD7893AN-2.pdf . Так как мы реализуем
протокол считывания данных АЦП программно, это описание использовано для
написания управляющего модуля программы.
Управление шаговыми двигателями
Управление обоими шаговыми двигателями происходит с помощью одной схемы
тактовых импульсов, раздельное включение и реверс направления вращения подачи
шприца осуществляются с помощью электромагнитных реле типа РЭС-22 с четырьмя
группами перекидных контактов (Рис. 5). Шаговые двигатели имеют четыре обмотки с
одним общим проводом (М1, М2, М3, М4 и Common). На обмотки поочередно подаются
импульсы напряжения в соответствии с описанием двигателя (работа шаговых двигателей
рассматривается, например, в http://telesys.ru/projects/proj077/index.shtml). При включении
реле, отвечающего за смену направления вращения двигателя SM2 (см. Рис. 5),
последовательность подачи импульсов М1–М2–М3–М4 заменяется последовательностью
М4–М3–М2–М1. Отключение двигателя SM2 производится вторым таким же реле,
20
которое отключает подачу импульсов на все четыре провода обмоток двигателя. При
использовании шаговых двигателей на 12 вольт это напряжение получается из
напряжения +18 вольт (земля PC_GND) с помощью стабилизатора 7812, не показанного
на схеме. Мы использовали двигатель от флоппи дисковода FDD 5’25 в качестве SM1 для
перемешивания крови и двигатель ST-28 со встроенным редуктором в качестве SM2 для
дозирующего шприца.
Рис. 5.5. Управление шаговыми двигателями.
Блок питания
Вся измерительная система питается от универсального блока питания, схема
которого приведена на Рис. 6. Силовой трансформатор имеет две изолированные
вторичные обмотки с выпрямленным напряжением 18 вольт. Питание гальванически
разделено на аналоговую часть и часть, связанную с компьютером. Аналоговая часть
обеспечивает напряжения +15в, –15в, +5в с землей AGND и служит для питания
усилителей фотосигнала, коммутатора и АЦП. Напряжение Vcc (тоже +5в) и земля
PC_GND связаны с частью, относящейся к приему-передаче данных через параллельный
порт компьютера (управление светодиодами и оптронная развязка). Напряжение +15
вольт получается из +18 вольт с помощью стабилизатора L7815. Для получения
напряжения +5 вольт (с током до 2 ампер) из +18 вольт применен импульсный
преобразователь с высоким КПД на микросхеме МС34063А (Рис. 7). Такой же
преобразователь применен для получения напряжения Vcc. Немного измененный
21
преобразователь используется для получения напряжения –15 вольт (см. Рис. 8).
Рассчитать параметры схемы преобразователя можно по описанию микросхемы
МС34063А,
приведенному,
например,
в
http://www.ortodoxism.ro/datasheets/aic/MC34063ACN.pdf
или
прямо
на
сайте
http://www.nomad.ee/micros/mc34063a/index.shtml .
Рис. 5.6. Блок питания системы.
Рис. 5.7. Блок +5 вольт (и Vcc) на микросхеме МС34063А (34063_1.SCH).
22
Рис. 5.8. Блок –15 вольт на микросхеме МС34063А (34063_4.SCH).
Структура программы обмена данными с компьютером.
Обмен данными измерительного блока с компьютером осуществляется через
параллельный порт IBM PC. Описание работы параллельного порта IBM PC можно найти,
например, в http://www.fapo.com/ieee1284.htm . Рассмотрим побитовое управление через
порт LPT компьютера. Мы используем шину данных (D0–D7) для передачи данных из
компьютера в схему управления. Для чтения данных из нашей схемы в компьютер
используется сигнал SELECT порта LPT (это ножка 13 разъёма).
Итак, АЦП начинает цикл преобразования при переходе от низкого логического
уровня на ножке 7 микросхемы AD7893 к высокому. На нашей схеме этот сигнал
соответствует биту данных D2. Однако, оптронная развязка и два триггера Шмитта
инвертируют этот сигнал по пути от разъёма LPT до AD7893. Значит, для старта АЦП мы
должны программно переключить бит D2 с высокого уровня в низкий.
АЦП оцифровывает входное напряжение и ждёт, что мы считаем данные с его
выхода (ножка 5), для считывания мы должны подавать на SCLK (ножка 4) тактирующие
импульсы. Тактирующие импульсы с учетом такой же инверсии сигнала подаются через
бит D3 порта LPT. Для этого мы попеременно переключаем этот бит то в низкий, то в
высокий уровень, считывая при этом сигнал SELECT порта по одному из 16
последовательных бит результата оцифровки АЦП. При считывании также надо
учитывать инвертирование данных из-за оптронной развязки. Кроме того, следует
выдерживать временные соотношения согласно паспорту работы AD7893. Весь
программный алгоритм оцифровки оформлен в виде функции float adcN_m3(unsigned int
BASE,unsigned char Pr,int M). Здесь BASE – адрес порта LPT (обычно 0x378), Pr – байт
данных, который передаётся в порт LPT. Функция возвращает результат измерения,
усреднённый по М точкам. Переключение каналов АЦП происходит через биты данных
D4 и D5 порта LPT с учетом инверсии сигнала из-за оптронной развязки.
Таким образом, алгоритм работы выглядит так:
1. Включаем красный светодиод (D0 -> “1”)
2. Стартуем АЦП (D2-> “0”)
3. После задержки возвращаем обратно D2-> “1”
4. Цикл, повторяющийся 16 раз
{D3-> ”0”
читаем сигнал SELECT, инвертируем его и сдвигаем в свой разряд (поочередно от 15 до 0)
D3-> ”1”
}
5. Выключаем красный светодиод D0-> “0”.
Затем то же самое повторяем с инфракрасным светодиодом, измеряя соответствующий
сигнал. Данные записываем в файл для последующей обработки.
При измерениях следует учитывать, что отражение света от лепестков,
перемешивающих кровь, вносит вклад в сигнал фотоприемника. Форма сигнала имеет
период, совпадающий с частотой вращения перемешивающего устройства. Поэтому для
измерений программно выбирается часть периодического сигнала, когда лепестки
наименее всего влияют на отражение, то есть когда отражение от них минимально.
Программная синхронизация заключается в анализе периодичности измеренного сигнала
и отбрасывании информации, искаженной отражением от лепестков. В этом случае
аппаратная часть упрощается за счет некоторого усложнения программной части.
При измерении в течение заданного промежутка времени в файл записываются два
сигнала – сигнал при включенном красном светодиоде UR и сигнал при включенном
инфракрасном светодиоде UIR. В дальнейшем, при анализе информации мы следим за
эволюцией отношения этих сигналов (красного к инфракрасному), которое обозначаем
23
как (t)=UR/UIR . Типичная зависимость степени оксигенации (t) показана на Рис. 16.
После нескольких минут рост (t) прекращается и выходит на плато.
Типичная зависимость степени оксигенации (t) от времени (мин).
Отношение красного и инфракрасного сигналов дает степень оксигенации. А величина
объема эритроцитов определяется по красному сигналу.
24
Теоретическая часть
Общие фразы
Предполагается, что основной поток глюкозы проходит сквозь мембрану в
цитоплазму, так же как и молекулы кислорода, по долгоживущим порам в липидном
матриксе мембраны. Конечно по той же поре могут проходить и другие молекулы, если
только это допускают их геометрические размеры.
Измерение влияния на показатель гематокрита препарата крови при введения в нее
гиперосмолярного раствора глюкозы проводилось ранее при атмосферном давлении [].
При введении такого раствора в плазму крови глюкоза не сразу проникает внутрь
эритроцита, а сперва, вследствие повышения осмолярности плазмы крови и выхода воды
из клеток происходит осмотическое сжатие эритроцитов, и лишь затем их объем начинает
возрастать по мере поступления глюкозы в цитоплазму. По скорости уменьшения объема
эритроцитов можно судить о проницаемости клеток для воды, а по скорости возрастания
показателя гематокрита крови — о проницаемости эритроцитарной мембраны для
глюкозы.
Рассмотрим этот вопрос подробнее. Добавление гиперосмолярного раствора
глюкозы в плазму крови нарушает осмотическое
равновесие между плазмой и
цитоплазмой. Поскольку проницаемость эритроцитарной мембраны для воды значительно
больше, чем для глюкозы и для катионов, то вначале осмотическое равновесие
устанавливается в результате выхода воды из эритроцита. При этом его объем, а,
следовательно, и показатель гематокрита крови, уменьшается. Уменьшение объема
эритроцита вызывает повышение концентрации ионов в его цитоплазме и тем самым
нарушает равновесие крови по ионам.
В дальнейшем по законам диффузии происходят более медленные процессы
проникновения внутрь эритроцитов глюкозы и восстановления равновесия по другим
более крупным осмотическим частицам по обе стороны мембраны. Проницаемость
мембраны для анионов велика, но они могут проходить через мембрану только в паре с
катионами, так как иначе нарушается зарядовое равновесие. Поэтому скорость выхода
анионов ограничивается выходом катионов. До введения глюкозы в плазму крови
диффузионный поток положительных зарядов внутрь эритроцита и их выброс ионными
насосами полностью уравновешивают друг друга. Так как в результате сжатия эритроцита
концентрация катионов в его цитоплазме возросла, диффузионный поток внутрь клеток
уменьшился, а скорость работы ионных насосов возросла. И теперь выброс
положительных зарядов насосами не полностью уравновешивается диффузионным
притоком. Это превышение выброса над притоком и создает поток положительных ионов
наружу и равный ему поток анионов. Однако проницаемость мембраны для катионов
мала, поэтому за время опыта сквозь мембрану проходит незначительное количество
ионов, и его можно не учитывать.
Поэтому можно считать, что изменение гематокрита происходит, главным образом,
вследствие проникновения в цитоплазму глюкозы, а также воды, благодаря которой
сохраняется осмотическое равновесие по обе стороны мембраны. Расчет показывает, что
если гематокрит Н0 и осмолярность М0 исследуемой крови, а также концентрация в ней
глюкозы G0 были близки к норме, и при введении в кровь концентрированного раствора
глюкозы ее содержание в плазме возросло в 10-15 раз, то возрастание показателя
гематокрита Н(t) после резкого первоначального уменьшения идет по экспоненциальному
закону:
25
 e  k S  t 
H (t )  H 0  1 
,
1V 

(1)
где k=const в пределах одного опыта, S – общая площадь поверхности всех эритроцитов в
единице объема крови, - удельная проницаемость их мембран для глюкозы, а V – объем
введенного раствора глюкозы в расчете на единицу объема крови. Величина k зависит от
Н0, М0, G0, V и концентрации глюкозы Z во вводимом растворе. Однако все эти величины,
а значит, и k, не зависят от условий подготовки крови к опыту, определяющих величину
трансмембранной разности электростатических потенциалов, от которой зависит
неспецифическая проницаемость мембраны эритроцита. Поэтому мы не будем приводить
достаточно сложную формулу для k.
Исследование проницаемости эритроцитарной мембраны для глюкозы будет
проводиться при разных внешних избыточных давлениях. Затем производится сравнение
с такими же данными при атмосферном давлении с использованием формулы (1).
Таким образом отношение проницаемостей будет рассчитываться по формуле:
 изб
 атм
 H (t ) 

ln 1  изб   1  V 
H0 



 H (t ) 

ln 1  атм   1  V 
H0 


(2)
Для исследований была выбрана старая кровь (месячной давности), которая находится
вблизи равновесия. Таким образом исключается влияние неравновесных процессов.
26
Экспериментальная часть
Методика проведения эксперимента
Методика измерений включает две группы операций.
Первая группа операций
1.
Подготовка препарата крови
Работа проводилась на препаратах крови, приготовленных из эритроцитарной массы.
Для стабилизации параметров эритроцитов на все время измерения в препарат вводились
следующие вещества: цитрат натрия для предотвращения сворачивания крови, глюкоза –
для поддержания энергетического метаболизма, раствор Рингера для получения
необходимого показателя гематокрита.

Нужно сделать раствор:
Эритроцитарная масса — Х мл
Раствор Рингера — У мл
Цитрат Na 3,8% — (0,1Х+0,1У) мл
Раствор глюкозы 40% — Z мл
Значения X и Y берутся такими, чтобы в итоге получилось достаточное количество
препарата крови с нужным показателем гематокрита.
Перед началом опытов в препарат крови необходимо добавить небольшое
количество глюкозы, чтобы обеспечить энергией ферментную систему крови на время
эксперимента, то есть чтобы обеспечить нормальное функционирование эритроцитов во
время подготовки крови к эксперименту и во время самого эксперимента. Количество
глюкозы (значение Z) рассчитывается из условия, что в конечном растворе ее
концентрация составляла бы 10 ммоль/л (две нормы содержания глюкозы в крови
здорового человека).
Цитрат натрия препятствует сворачиванию крови, а также частично ингибирует
гликолиз, благодаря чему во время проведения эксперимента можно избежать
осмотических колебаний.

Выбор степени насыщенности крови кислородом
По совокупности ранее полученных экспериментальных и теоретических данных
известно, что проницаемость для глюкозы оксигенированной крови меньше
проницаемости деоксегинированной в 1,5 раза (значительная часть глюкозы
диффундирует непосредственно через липиды матрикса между атомами ацильных цепей).
Поэтому для экспериментов по изучению проницаемости мембран эритроцитов для
глюкозы лучше выбрать кровь, наиболее оксигенированную. Так как при этом
проницаемость мембраны будет меньше, то процессы релаксации объема клеток будут
идти медленнее, благодаря чему можно будет успеть проследить за ходом всего процесса.
27
Подбор объема образца крови, помещаемого в кювету
2.

Необходимо, чтобы слой препарата крови был не более 3 мм, так как дальше
кровь не проницаема для красного и инфракрасного света. Площадь дна
кюветы примерно 10см2 , следовательно, объем препарата 3 мл
соответствует 3 мм высоты слоя крови.
 Слой крови не должен быть очень тонким, чтобы можно было следить за
изменением объема эритроцитов.
 Было рассмотрено три случая: вливали в кювету препараты крови объемом 1
мл, 2 мл и 3 мл.
Проведенные эксперименты показали, что наиболее оптимальным является случай,
при котором объем помещаемой в кювету крови составляет 2 мл (эта кривая плавная и
идет круче верхней).
Получены зависимости сигнала с прибора от объема помещаемой крови в прибор.
ЗАВИСИМОСТЬ СТЕПЕНИ НАСЫЩЕНИЯ КИСЛОРОДОМ ОТ ВРЕМЕНИ ДЛЯ 1, 2 и 3 мл
ПРОБЫ КРОВИ
0,9
0,85
а, отн.ед.
0,8
0,75
0,7
0,65
0,6
0
1
2
3
4
5
6
t, мин
Нижняя (красная) кривая соответствует пробе 1 мл, средняя (фиолетовая) – 2 мл, верхняя
(зеленая) – 3 мл.
3.
Подбор мешалок
В кюветах имитируются процессы кислородного обмена между эритроцитами и
тканями-потребителями кислорода. При этом взаимодействие эритроцитов со стенками
кюветы и лепестками мешалки имитирует взаимодействие со стенками капилляров.
Степень этого взаимодействия определяет величину проницаемости мембран
эритроцитов. Чем жестче лепестки мешалки, тем сильнее «открывается» мембрана (тем
28
больше ее проницаемость). Это иллюстрирует рис. 7, на котором показан процесс
оксигенации крови с применением мешалок с лепестками, выполненными из лавсана
разной толщины и, следовательно, разной жесткости. Установлено, что при всех
прочих равных условиях (скоростью вращения мешалки, объема испытываемой пробы
крови одного и того же пациента, температуры и пр.) по мере увеличения жесткости
лепестков последовательно укорачивается время процесса насыщения крови
кислородом, что отражается на рисунке сдвигом кривой зависимости степени
оксигенации  от времени измерений t до тех пор, пока она не займет крайнее левое
положение.
Дальнейшее увеличение жесткости лепестков не приводило к изменению
положения кривой. Это объясняется тем, что максимальная проницаемость мембраны,
определяемая ее структурой (и в основном плотностью ассоциированных с ней белков)
была уже достигнута
Временной ход показаний
прибора КИНОКС для проб крови одного и того же пациента с применением мешалок
разной жесткости. Чем жестче мешалка, тем левее расположена экспериментальная
кривая.
Для проведения экспериментов по исследованию влияния давления на
неспецифическую проницаемость мембран эритроцитов для глюкозы выбрали мешалку с
лепестками относительно средней жесткости. Если бы мешалка была с более жесткими
лепестками, то проницаемость эритроцитов при соприкосновении с лепестками была бы
больше, и процессы выхода воды и входа глюкозы можно было бы не успеть увидеть
(пронаблюдать). А если взять мешалку с очень мягкими лепестками, то каждый опыт
длился бы по времени слишком долго. Мешалку с очень жесткими лепестками брать
вообще не рекомендуется, так как увеличится вероятность повреждения эритроцитов при
соприкосновении с ней.
4.
Подбор количества глюкозы, подаваемого в кювету
29
Надо добавлять столько, чтобы смещение сигнала не вышло за пределы
линейной зоны отображения сигнала на экране монитора (два больших деления
вверх и столько же вниз).
Слишком много глюкозы капать нельзя, так как иначе эритроциты могут
сжаться настолько сильно, что почти вся вода выйдет из них и они просто
перестанут нормально функционировать.
Расчет количества глюкозы, подаваемого в кювету, производился из
условия, что эритроциты должны сжаться не более чем на 20%.
Исходим их того, что уменьшение объема эритроцитов при добавлении
гиперосмолярного 40%-го раствора глюкозы произойдет не более, чем на 20%.
Осмолярность:
исходного препарата крови – 300 ммоль/л,
40%-го раствора глюкозы – 2220 ммоль/л.
Пусть:
показатель гематокрита исходного препарата крови H0;
объем препарата крови, подаваемого в кювету V0=2 мл;
объем эритроцитов в исходном препарате крови Vэ  H0  V0 ;
количество добавляемой в препарат крови глюкозы X мл;
объем сжатых эритроцитов после выхода воды Vсж.
Тогда:
Исходная осмолярность плазмы крови:
ммоль
0,3
 (1  H 0 )  V0 ;
мл
Исходное осмолярность цитоплазмы крови:
ммоль
0,3
 H 0  V0 ;
мл
Осмолярность плазмы крови после добавления глюкозы:
ммоль
ммоль
0,3
 (1  H 0 )  V0  2,22
X .
мл
мл
После осмотического выхода воды из клеток при добавлении раствора
глюкозы в препарат крови установится осмотическое равновесие, то есть число
осмотических частиц в плазме будет равно числу осмотических частиц в
цитоплазме. Таким образом средняя осмолярность во всем препарате крови до
входа глюкозы внутрь клеток будет равна осмолярности в цитоплазме клеток:
ммоль
ммоль
ммоль
ммоль
 (1  H 0 )  V0  2,22
 X  0,3
 H 0  V0 0,3
 H 0  V0
мл
мл
мл
мл

V0  X
Vсж
Считая, что объем эритроцитов должен уменьшаться не более чем на 20%, можно
записать:
Vсж  0,8  Vэ  0,8  H 0  V0
0,3
Подставляя это в выше написанное уравнение, получаем: X=0,08 мл
5.
Условия в барокамере
Газовая смесь, подаваемая в камеру: 150 мм рт. ст pO2 , остальное – аргон.
Диапазон рассматриваемых давлений: 0÷8 АТИ
Предполагается, что при избыточном давлении в 5÷6 атмосфер глюкоза будет
полностью задерживаться и не проходить внутрь эритроцитов.
30
Вторая группа операций включает подготовку прибора к работе и проведение измерений
Последовательность операций следующая:
1. в мешалку устанавливаются лепестки средней жесткости;
2. в кювету прибора, размещенного в барокамере, заливается готовый к
исследованию препарат крови объемом 1,5 мл с показателем гематокрита около
30% (выбор сделана основе калибровочной кривой, описанной в следующем
разделе);
3. кювета закрывается крышкой, закрывается барокамера, и включается система
обеспечения газовой смесью;
4. включается питание прибора;
5. включается работа мешалки;
6. включается регистрация параметров крови;
7. через минуту включается система подачи глюкозы в кювету (в течение 45 сек
подается 0,5 мл раствора, приготовленного на основе 40%-го раствора глюкозы и
физиологического раствора Рингера в пропорции 0,08 к 0,5;
8. наблюдение процесса релаксации объема велось до полного его завершения в
течение ? мин.
9. результаты измерений в цифровом виде (кривая зависимости показаний прибора от
времени) представляются на мониторе ЭВМ;
10. процесс контролируется визуально на мониторе ЭВМ прибора;
11. далее результаты измерений, которые выводились на монитор ЭВМ,
обрабатываются специально разработанной и отлаженной для этой цели
программой;
31
Экспериментальные данные
1. Калибровочная кривая
В результате серии экспериментов была получена калибровочная кривая,
устанавливающая соответствие между амплитудой сигнала с прибора и показателем
гематокрита.
0,9
0,88
Амплитуда сигнала, отн. ед.
0,86
0,84
0,82
0,8
0,78
0,76
0,74
0,72
0,7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Показатель гематокрита, %
Кривая имеет колоколообразную форму с максимумом около 40% . По мере
увеличения показателя гематокрита амплитуда сигнала растет, а затем, достигнув
максимума, падает. Это связано с тем, что имеется два процесса: рассеяние и поглощение
красного и инфракрасного света. По мере возрастания показателя гематокрита сначала
преобладает процесс рассеяния, затем, после максимума, – поглощение.
Таким образом для проведения экспериментов удобно работать на левой ветви
кривой, где сигнал прямо пропорционален показателю гематокрита.
2.Типичный ход релаксационных процессов (при атмосферном и избыточном
давлениях)
32
График зависимости показания прибора КИНОКС от времени t при нормальном (1) и
избыточном (2) давлениях
0,99
Показание прибора, отн.ед.
0,98
0,97
0,96
2
1
0,95
0,94
0,93
0,92
0,9
1
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
t, мин
Из рисунка видно, что ход кривых при атмосферном и при избыточном давлениях
различается. В первом случае кривая сначала возрастает быстро, а затем замедляется. Во
втором случае сначала кривая возрастает медленно, а через некоторое время гораздо
быстрее. Это связано с различной проницаемостью мембран клеток при различных
давлениях, так как под давлением проницаемость меньше. В связи с этим при добавлении
в препарат крови раствора глюкозы возникает разный градиент по глюкозе. А с
градиентом связан процесс шипования эритроцитов (на поверхности клеток начинают
образовываться шипики). При появлении шипиков резко увеличивается рассеяние
красного света.
Рассмотрим эти два случая подробнее.
1. При атмосферном давлении
Проницаемость большая (относительно второго случая). Следовательно, глюкоза
проходит через мембрану быстрее. Следовательно, создается меньший градиент по
глюкозе. Следовательно шипики образуются медленнее.
2. При избыточном давлении
Проницаемость маленькая. Следовательно, глюкоза проходит диффундирует через
мембрану гораздо медленнее, чем в первом случае. Следовательно, создается больший
градиент по глюкозе. Следовательно, процесс шипования эритроцитов протекает
гораздо быстрее по сравнению с первым случаем, что и видно из полученных кривых
(ход кривой при избыточном давлении резко меняется раньше, чем при атмосферном
давлении).
33
Для инфракрасного: Синий=на воздухе, Розовый=под давлением
1.0066
сигнал, отн. ед.
1.0016
0.9966
v03-ir
0.9916
d15-ir
0.9866
0.9816
0.9766
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
2
t, мин
34
Обсуждение результатов
На рис. № показан типичный ход интенсивности инфракрасного рассеянного света,
воспринимаемого датчиком нашего прибора при атмосферном (кривая 1) и избыточном
(кривая 2) давлениях. Изменение величины рассеяния света связано как с изменением
объема эритроцитов, так и их формы. При эхиноцитозе на поверхности клеток
возникают «шипики», линейные размеры которых составляют примерно 0,1 от размеров
эритроцитов (средний диаметр 7-8 мкм). При увеличении количества «шипиков»
увеличивается рассеяние, и, следовательно, увеличивается сигнал с прибора.
Во время проведения опытов появление «шипиков» неизбежно, оно связано с
изменением структуры липидного матрикса мембраны под действием электрического
поля, которое меняется вследствие внешних факторов (избыточного давления,
осмотического шока при добавлении раствора глюкозы и др.). При изменении давления
нарушается равновесие трансмембранного переноса ионов Na+ и K+. Баланс активного
(из-за действия К+/Na+ АТФазы) и пассивного потоков этих ионов смещен в сторону
увеличения отрицательного заряда эритроцита и роста поля в липидах. Это ведет к
изменению соотношения между доменами липидов, находящихся в разных фазовых
состояниях – жидком и кристаллическом, что в свою очередь приводит к образованию
«шипиков».
35
К таким же результатам приводит добавление в препарат крови гиперосмолярного
раствора глюкозы, вызывающего осмотический шок. Выход воды в плазму повышает
концентрацию ионов в цитоплазме клеток. Поскольку для ионов Cl- существуют
анионные каналы, то эти ионы быстро выходят из цитоплазмы, унося отрицательный
заряд из клеток, меняя трансмембранную разность потенциалов, что так же ведет к
образованию «шипиков», вследствие изменения структуры липидного матрикса
мембраны.
Для того чтобы минимизировать влияние изменения трансмембранной разности
потенциалов на проницаемость, для экспериментов была выбрана «старая» кровь, в
мембране эритроцитов которой помимо мелких пор со средним диаметром 7Å
присутствуют также поры гораздо большего диаметра, возникшие из-за перекисного
окисления в липидах. В «старой» крови процесс перекисного окисления начинает
доминировать над репарационными процессами в липидах, поэтому по мере «старения»
крови в липидах увеличивается число пор и их размеры. Таким образом из-за наличия
больших пор в липидном мактриксе мембран трансмембранный потенциал изменяется
незначительно при переходных процессах.
Благодаря минимизации всех процессов, описанных выше, в опытах удалось на
качественном уровне наблюдать влияние избыточного давления на проницаемость
мембран эритроцитов для глюкозы.
На рис. №
На начальном участке кривых 1 и 2 в кровь поступает гиперосмолярный раствор
глюкозы. Сигнал с датчика в обоих случаях (при атмосферном и избыточном давлениях)
растет практически сходным образом (кривые почти параллельны). Кривая 2 идет выше
первой. Рост сигнала в обоих случаях объясняется увеличением количества «шипиков»
и соответствующим рассеянием на них. Этот процесс доминирует над влиянием на
сигнал уменьшения объема, вызванного осмотическим выходом воды в плазму крови.
Более высокие значения сигнала в случае повышенного давления можно объяснить тем,
что кровь около 5 мин находилась под повышенным давлением. За это время прошли
ионные релаксационные процессы, которые в конечном итоге повысили
трансмембранную разность потенциалов и после перестройки структуры липидов
мембран эритроцитов в новых условиях рассеяние на клетках увеличилось.
Количество «шипиков», возникающих на поверхности мембраны ограничено. По
мере поступления раствора глюкозы в кровь наступает момент, когда достигается
максимум количества «шипиков» и сигнал с прибора в обоих случаях выходит на один и
тот же уровень…
Дальнейшие изменения сигнала можно отнести к влиянию релаксационных
процессов по глюкозе. По мере поступления глюкозы внутрь эритроцитов, за ней
движется вода, размеры эритроцита растут, согласно калиборовке, гематокрит растет, и
соответственно сигнал растет. Точка пересечения петлеобразной кривой соотвествует
примерно одинаковым размерам эритроцитов (и одинаковым гематокритам() для двух
рассматриваемых случаев. Ясно, что градиент по глюкозе после указанного момента для
случая, где меньшая проницаемость, больше, чем во втором случае. И соответственно
кривые начнут расходится. Меньший наклон во втором случае свидетельствует о том,
что проницаемость там меньше.
Если бы проницаемости были бы равными, то кривые проходили бы близко друг к
другу. Из рис. видно, что при повышенном давлении проницаемость для глюкозы
меньше.
Сравнивая последующий ход кривых, можно провести оценку, во сколько раз
уменьшилась проницаемость мембран эритроцитов из-за действия давления, однако
получать при этом заниженную величину, потому что градиент по концентрации
36
глюкозе в случае с давлением больше, но неизвестно какой конкретно, а релаксация
идет медленнее.
Скорость поступления глюкозы внутрь эритроцита оцениваем по формуле:
dn
   (ne  ni ) ,
dt
где n – концентрация глюкозы в момент времени t,
ne – концентрация глюкозы в плазме крови,
ni – концентрация глюкозы внутри эритроцитов,
Ω – проницаемость мембраны эритроцитов,
t – время.
Изменение концентрации глюкозы прямо пропорционально изменению объема
эритроцитов (согласно сделанному выбору по калибровочной кривой), а следовательно
и показателя гематокрита, во времени:
dn dH
~
dt dt
dH
– это наклон соответствующей кривой, полученной в ходе эксперимента.
dt
Таким образом сравнить проницаемости мембран эритроцитов для глюкозы при
атмосферном и избыточном давлениях можно путем сравнения наклонов участков
полученных кривых, соответствующих процессу входа глюкозы внутрь клеток (на
графике – это те участки, где кривые начинают заметно расходиться). Анализирую
таким образом полученные кривые, получаем, что проницаемость при атмосферном
давлении в 2,3 раза выше, чем при избыточном давлении.
А
При давлениях порядка 6-8 АТИ примерно половина пор диметром 7 Å
закрывается. (следует из водолазного дела)
Про радиус Дебая вставить
Выполненные оценки показывают, что эксп проводился в условиях,
соответствующих положениям, укзанных в теор части. То есть наличие в мембране
крупных пор, в которых могут формироваться двойные электрические слои из
электролитов плазмы и цитоплазмы, которые не позволяют существенным образом
повышаться трансмембранному потенциалу. Так как быстро происходит который таким
образом не препятствует проведению
И в течение всего опыта поле в мембране практически постоянно и находится на
низком уровне. Следовательно, на опыте наблюдалось в чистом виде давления на
неспецифическую проницаемость.
Данные по различию проницаемостей находятся за пределами ошибок.
37
Модель
Физическая модель
Будем считать, что под воздействием давления изгибается только директор
молекул липидов, причем его длина остается такой же. Упругий изгиб происходит за счет
поворота вокруг С-С связей….
Математическая модель
Будем считать, что под действием давления диаметр и длина поры изменяются на
одинаковую величину Δ:
d  l  l0
рис
d0  l0
l1  l0 ,
где d – диаметр поры,
l – длина поры,
l0 – начальная длина поры,
l1 – длина сжатой под действием избыточного давления поры.
Так как для экспериментов взята старая кровь (месячной давности), то имеется две
группы пор в липидном матриксе, существенно различающихся по размерам. К первой
группе относятся поры с меньшим диаметром, как в нативной крови (средний диаметр ~
7Å). Ко второй группе относятся поры с большим диаметром, возникающие вследствие
распада липидов под действием перекисного окисления (средний диаметр >> 7 Å).
Разброс размеров пор в обоих случаях подчиняется закону Гаусса. (рис.)
В первом приближении можно считать, что наиболее вероятный диаметр поры
совпадает со средним диаметром этой поры, то есть
d наиб.в ер.  d
Будем считать, что в обоих группах основное количество пор сосредоточено
(находится) в диапазоне размеров 0;2  d наиб.в ер.  , то есть в диапазоне 0;2  d .
Проведем оценку.
Известно, что при избыточном давлении p~20 АТИ снабжение клеток кислородом
существенным образом затруднено (следует из фактов погружения водолазов). То есть все
поры из первой группы (диаметром от 0 до 14 Ǻ) закрыты. В данной работе используются
давления ~10 АТИ. Можно принять, что размеры пор, согласно закону Гука (),
уменьшаются пропорционально величине давления. Таким образом при 10 АТИ диаметр
пор уменьшиться примерно в 2 раза. Следовательно, в процессе переноса молекул
глюкозы сквозь мембрану будет участвовать только половина пор из первой
рассматриваемой группы.
Проницаемость поры зависит от ее размеров следующим образом:
d2
~
l
38
Чем больше размер молекулы, тем менее вероятно ее прохождение по конкретной
поре. Поэтому вводим представление о рабочем диаметре, учитывая, таким образом, эту
вероятность.
Рабочий диаметр поры будет равен:
d раб  d эф  rм ,
где dэф – эффективный диаметр поры (при атмосферном давлении это средний
диаметр поры, при избыточном давлении – это
rм – радиус молекулы, проникающей сквозь пору, в данном случае радиус
молекулы глюкозы, равный ~ 2,5Ǻ.
Как известно, проницаемости всех пор складываются. Таким образом получается,
что при атмосферном давлении играть роль будут поры с большим диаметром и около
половины пор с малым диаметром.
Из экспериментальных данных известно, что проницаемость при атмосферном
давлении (Ωатм) приблизительно в 2 раза выше, чем при избыточном давлении ~ 10 АТИ
(Ωизб).
В итоге получаем:
2
2
атм 0,5  н  пер 0,5  d н  d пер
d н2


 1  0,5  2
2
изб
пер
d пер
d пер
Подставляя численные значения, получаем, что dпер≈?.
39
При нормальном давлении уменьшению толщины мембраны противодействует силы
упругости (согласно законуГука). В нормальном направлении эти силы обуславливаются
сопротивлением конформационнному переходу «хвостов» липидов из транс
конфигурации в гош и обратно, если директор молекулы изогнут из-за состоявшиегося
перехода хотя бы в одном звене. Если звено находится в трансконфишруации
(см. рис.), то энергетическое состояние моелкул характеризуется полождением
устойчивой точки, лежащей либо на левой, либо на правой стороне ветви. Их
устойчивость характеризуется равенством сил давления и сил упругости, возникающими
переходм системы из минимуму в выше упомянутое положение. Момент
препятствующего изгибу молекулы соответственно определяется формулой дУ/дф=-М
(М-момент изгиба вокруг Ц-Ц связи).
Если молекула уже в гош, то тоже самое,только на другой ветви.
Моментами сил препятствуют давлению. Под действием давления молеулы пытаются
изогнуться.
В латеральном направлении деформации под действием силы внешнего давления
противодействуют силы и моменты, обусловленные изгибами Ц-Ц связей (изменением из
углов в плоскости), которые значительно меньше. Ими в первом приближении можно
пренебречь.
Зависимость потенциальной энергии фрагмента цепи полиэтилена от внутреннего угла
вращения - - заместителей вокруг С-С связи будет меняться следующим образом:
40
Рис.12. Кривая потенциальной энергии конформационных изомеров в полиэтилене: а, в, д,
ж – заслоненная конформация; б,е – скрещенная гош-конформация; г – скрещенная трансконформация.
Максимумы на кривой характеризуют конфомационно нестабильные состояния цепи
(заслонённые изомеры); минимумы - стабильные состояния. Им соответствуют два гош- и
один транс-изомеры.
Разность в энергии гош- и транс-изомеров (Е) (см. рис.12) определяет
статистический вес этих изомеров в общей конформации цепи и тем самым характеризует
их так называемую термодинамическую гибкость, зависящую от химического строения
цепи. Величины барьеров, отделяющих гош- и транс-изомеры U’0 и U”0 характеризуют
энергию, которую необходимо преодолеть при переходе от одного к другому изомеру, т.е.
определяют кинетическую гибкость макромолекулы, зависящую от температуры, влияния
механического и других полей и т.д. Величины потенциальных барьеров у полимеров
обычно имеют следующие значения: Е = 2 - 6 КДж/моль, U”0 = 10 - 40 КДж/моль, т.е.
полимеры по своей гибкости могут различаться в 3-4 раза. Иными словами,
термодинамическая гибкость характеризует способность макромолекул изменять свою
конформацию под действием теплового броуновского движения составляющих ее звеньев
и сегментов. Кинетическая гибкость – это способность макромолекул изменять свою
конформацию под действием внешних воздействий (механического, электрического и др.
полей).
Поворотная И. обусловлена ограниченным вращением в молекуле атомов или групп
атомов вокруг углерод-углеродной (или любой другой) простой связи. Геометрические
41
формы, которые принимает при этом молекула, называются конформациями, а
соответствующие структуры — конформерами (конформационными, вращательными, или
поворотными изомерами). Существование предпочтительных конформаций связано с
взаимодействием валентно не связанных между собой атомов и групп атомов.
Теоретически молекула может принимать бесчисленное множество конформаций, однако
реализуются обычно немногие, выгодные энергетически. Например, из всех возможных
конформаций этана энергетически наиболее выгодна заторможенная конформация (а),
наименее — заслонённая (б):
(заторможенная конформация обладает минимальной энергией, заслонённая —
максимальной; у большинства соединений устойчивыми формами являются
заторможенные конформации). Разность энергий между конформациями а и б составляет
11,7 кдж/моль (2,8 ккал/моль); это энергетический барьер вращения вокруг связи С—С в
этане, т. е. энергия, необходимая для перехода из одной устойчивой (заторможенной)
конформации в другую. При вращении групп CH3 на 360° друг относительно друга
молекула этана трижды принимает каждую из указанных конформации. В этане все три
устойчивые конформации идентичны. Для замещенных этанов, например для 1,2дихлорэтана, они уже не все равноценны (возможны две заторможенные конформации и
одна заслонённая). Так, трансоидная конформация (в) выгоднее скошенной, или гошконформации (г), на 5,02 кдж/моль (1,2 ккал/моль), разность же между энергиями
трансоидной (в) и заслонённой (д) конформации составляет 20,93 кдж/моль (5 ккал/моль):
42
За исключением рассмотренного выше случая атропоизомерии, энергетические барьеры
конформационных переходов недостаточно велики, чтобы поворотные изомеры можно
было выделить, однако их можно наблюдать, например, методами инфракрасной
спектроскопии и особенно ядерного магнитного резонанса (часто только при пониженной
температуре). Исследование конформационных состояний имеет большое значение при
изучении физико-химических свойств веществ и их реакционной способности. См.
Конформационный анализ.
Лит.: Илиел Э., Стереохимия соединений углерода, пер. с англ., М., 1965; Терентьев А.
П., Потапов В. М., Основы стереохимии, М.—Л., 1964.
Б. Л. Дяткин.
43
ВЫВОДЫ
Установлено, что
избыточное давление
уменьшает неспецифическую
проницаемость клеток для глюкозы.
Подтверждена таким образом в экспериментах теоретическая модель влияния
давления на структуру липидного матрикса, определяющей неспецифическую
проницаемость мембран эритроцитов.
В процессе исследований удалось минимизировать влияние всех других факторов,
которые могли бы повлиять на результаты экспериментов. Это касается изменения
трансмембранной разности потенциалов на мембране эритроцитов, которые в первую
очередь влияют на структурные перестройки в липидном матриксе. По этой причине были
взяты препараты их «старой» крови, в которой значительная часть (до ½-¾) гемоглобина
окислена до мет формы, а репарационные процессы находятся на низком уровне, но
достаточны для поддержания целостности мембраны и допущения гемолиза.
Проведена оценка размеров пор, возникших на мембранах эритроцитов из-за
перекисного окисления и слабости репарационных процессов, которая совпадает со
значениями, полученными по другой методике (им. Грецкой-Бухманн Л.Ю.)
Исследование выполнено на качественном уровне и в том объеме, в котором было
запланировано.
При непосредственном участии создана установка, включающая …
Разработана система автоматизированного управления физическим экспериментом
по теме дипломной работы, обеспечивающей снятие данных на экспериментальная
установке.
Отлажена методика обработки полученных данных.
Проведены экспериментальные исследования по влиянию давления на неспец….
По утвержденному руководителем плану.
Разработана методика подготовки к эсеприменту…
Были получены следующие данные. При давлении 8 АТИ, газовой смеси,
состоящей из проницаемость уменьшается в 2 раза.
Удалось провести оценку состояния мембраны. Поры в результате перекисного
оксиления…
Выполненные оценки показывают, что эксп проводился в условиях,
соответствующих положениям, укзанных в теор части. То есть наличие в мембране
крупных пор, в которых могут формироваться двойные электрические слои из
электролитов плазмы и цитоплазмы, которые не позволяют существенным образом
повышаться трансмембранному потенциалу. Так как быстро происходит который таким
образом не препятствует проведению
И в течение всего опыта поле в мембране практически постоянно и находится на
низком уровне. Следовательно, на опыте наблюдалось в чистом виде давления на
неспецифическую проницаемость.
Данные по различию проницаемостей находятся за пределами ошибок.
44