114. Направленный синтез уксусной и пропионовой кислот. четырьмя способами.

114. Направленный синтез уксусной и пропионовой кислот.
Уксусная кислота как продукт микробного синтеза может быть получена
четырьмя способами.
1 способ. Окисление этанола уксуснокислыми бактериями. Бактерии
родов Acetobacter (A.aceti; A.xylinum; A.peroxydans) и Gluconobacter
(G.oxydans)
способны
ассимилировать
углеводсодержащие
и
спиртосодержащие субстраты, накапливая в культуральной жидкости
значительные количества ацетата. Они характеризуются специфическими
культуральными и физиологическими свойствами:
-
высокая ацидофильность, растут при рН 4,0; оптимум 5,0-6,0;
-
бактерии – строгие анаэробы, повышенная чувствительность к
недостатку кислорода связана с активностью фермента апиразы, под
действием которого АТФ быстро гидролизуется и становится недоступной
для метаболизма клеток;
-
выраженная
способность
окислять органические
вещества
в
частично окисленные продукты, наиболее характерна способность окислять
этанол в уксусную кислоту.
На первом этапе этанол окисляется до ацетальдегида при участии НАД
(НАДФ) – зависимой алкагольдегидрогеназы; далее происходит гидратация
ацетальдегида и повторное окисление, катализируемое НАД (НАДФ) –
зависимой ацетальдегидрогеназой.
Оптимальными условиями биосинтеза уксусной кислоты бактериями
Acetobacter aceti являются: температура 30оС; рН 5,0-6,0; интенсивная
аэрация среды; состав исходного субстрата – этанол и уксусная кислота в
соотношении 5,5% : 7,5%.
2 способ Образование уксусной кислоты гомоацетогенными бактериями.
Бактерии Cl.aceticum; Cl.thermoautofrophicim; Eubacterium limosum и др.
виды способны в анаэробных условиях утилизировать гексозы, пентозы и
молочную кислоту, образуя ацетат в качестве единственного продукта
метаболизма. Некоторые виды этой группы, например Acetoanaerobicum
woodii, Cl.thermoaceticum и Cl.formiaceticum, способны синтезировать
уксусную кислоту в результате ассимиляции муравьиной кислоты и
фиксации СО2.
Оптимальные условия для биосинтеза уксусной кислоты бактериями
температура
Cl.thermoaceticum:
60оС;
рН
6,7-7,4;
условия
строго
анаэробные.
3 способ. Биосинтез уксусной кислоты молочнокислыми бактериями
помеханизму
гетероферментативного
молочнокислого
брожения
с
фиксацией СО2. Метод не перспективен для получения уксусной кислоты
как целевого продукта.
4 способ. Биосинтез уксусной кислоты по механизму пропионовокислого
брожения.
Возбудителями
бактерии
рода
и
P.prendenreichii)
пропионовокислого
брожения
являются
Propionibacterium
(P.shermanii;
P.pentosaceum;
некоторые
клостридий
(Cl.propionicum).
виды
Специфическим свойством данной группы факультативно анаэробных
микроорганизмов является способность ассимилировать гексозы и, реже
пентозы с образованием пропионовой и уксусной кислот.
Ключевой
реакцией
биосинтеза
транскарбоксилирование
метилмалонилКоА
одной
пропионовой
молекулы
кислоты
ПВК
с
является
молекулой
с образованием пропионилКоА и ЩУК. Последняя
трансформируется в янтарную кислоту через стадии образования яблочной
и
фумаровой
кислот.
Янтарная
пропионилкоферментом А
кислота
вступает
в
реакцию
с
с образованием конечного продукта и
сукцинилКоА. Последний трансформируется в метилмалонилКоА под
действием фермента 6 - L- метилмалонилКоА-мутазы (кофермент В12).
Оптимальные условия биосинтеза кислот бактериями P.ghermanii –
температура 30оС, рН 5,0-6,0.
Принципы реализации биосинтетических процессов через ЦТК на
примере лимонной кислоты.
Некоторые микроорганизмы, в основном относящиеся к группе
мицелиальных
накапливать
грибов,
в
характеризуются
культуральной
уникальной
жидкости
способностью
значительные
количества
промежуточных продуктов цикла Кребса, в первую очередь, лимонной
кислоты.
Такой способностью обладают грибы родов Penicillium, Mucor.Наиболее
широко применяются некоторые штаммы Asp.niger.
Грибы-продуценты
лимонной
кислоты
характеризуются
специфическими биохимическими свойствами:
1.
Введение
избыточного
количества
углеродсодержащих
соединений в цикл Кребса. Этот эффект обеспечивается благодаря
способности грибов к фиксации СО2 на ПВК с образованием оксалоацетата.
Другим механизмом восполнения промежуточных продуктов ЦТК является
глиоксилатный цикл.
2.
Активация фермента цитратсинтазы и ингибирование других
ферментов цикла, в первую очередь, изоцитратдегидрогеназы и αкетоглутаратдегидрогеназы.
3.
Повышенная потребность в молекулярном кислороде на
реокисление образующихся в ЦТК восстановленных форм НАД и ФАД.
Оптимальные условия биосинтеза лимонной кислоты: температура
28-30оС; рН 2,0-4,0; интенсивная аэрация среды. Повышение температуры и
рН приводит к увеличению выхода других органических кислот, в первую
очередь, щавелевой и глюконовой.
Разработан альтернативный способ биосинтеза лимонной кислоты
дрожжами рода Candida (C.lipolytica) на н-алканах. Механизм биосинтеза в
данном случае аналогичен.
Биохимические закономерности направленного синтеза
глутаминовой кислоты.
Поскольку метаболическим предшественником глутаминовой кислоты
является α-кетоглутаровая кислота, важным условием биосинтеза данной
аминокислоты является постоянное восполнение в клетках продуцентов
ресурсов промежуточных метаболитов цикла Кребса. В связи с этим, для
продуцентов глутаминовой кислоты характерны:
1 – функционирование глиоксилатного шунка или других альтернативных путей синтеза промежуточных продуктов ЦТК;
2 – высокая потребность в кислороде на реокисление восстановленных
форм НАД и ФАД;
3 – высокая активность фермента глутаматдегидрогеназы, катализирующего реакцию восстановительного аминирования α-кетоглутаровой
кислоты.
α-кетоглутаровая
кислота
также
может
вступать
в
реакцию
переаминирования с аминокислотами, катализируемую трансамидазами
(кофермент – пиродоксальфосфат).
Коэнзим НАД-фосфат, участвующий в реакции восстановительного
аминирования, также специфичен для фермента изоцитратдегидрогеназы,
катализирующего образование α-кетоглутаровой кислоты в ЦТК. Таким
образом, необходимый для синтеза глутаминовой кислоты кофермент
постоянно регенерируется в цикле Кребса.
4- подавление активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, превращающей
α-кетоглутаровую кислоту в сукцинил-КоА.
5 – подавление активности НАДФ-зависимой оксидазной системы,
катализирующей окисление глутаминовой кислоты.
Важным условием сверхсинтеза глутаминовой кислоты является
обеспечение ее интенсивного выделения из клетки. Такие условия
создаются при лимите в среде биотина, добавлении в культуральную среду
некоторых антибиотиков.
При направленном синтезе глутаминовой кислоты продуцентами
Corynebacterium glutamicum максимальный выход целевого продукта
достигается при следующих условиях: температура (28÷30)оС; рН –
(7,0÷7,5); интенсивная аэрация среды.
Перспективным методом получения L-глутаминовой кислоты является
биотрансформация α-кетоглутаровой кислоты. Для этих целей могут быть
использованы бактериальные культуры родов Pseudomonas и Escherichia.
Механизмы направленного синтеза ароматических аминокислот на
примере триптофана.
Биосинтетическую активность в отношении ароматических аминокислот
проявляют бактерии родов Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus и
Escherichia. Их характеризует способность ассимилировать моносахара по
гексозомонофосфатному пути с образованием общего предшественника –
шикимовой кислоты
Обеспечение сверхсинтеза триптофана возможно при следующих
условиях:
- снятие репрессии синтеза фермента дезоксиарабиногептулозофосфатсинтаза (1) триптофаном и антраниловой кислотой;
-
повышение
устойчивости
фермента
антранилатсинтаза
(2)
к
ингибированию L- тирозином и L- фенилаланином;
- подавление активности ферментов пути биосинтеза L- тирозина и Lфенилаланина
(префенатсинтазы
(3),
префенатдегидрогеназы
(4),
префенатдегидратазы (5)).
Оптимальные условия биосинтеза L-триптофана штаммами Bac.subtilis:
температура 37-380С; рН 7,0-7,2; интенсивная аэрация среды.
Разработан метод биотрансформации антраниловой кислоты в Lтриптофан ферментными системами клеток дрожжей Can.utilis. Процесс
осуществляется при температуре 28-300С; рН 7,5-8,0.
Метаболические пути биосинтеза лизина.
Лизин синтезируется микроорганизмами двумя способами.
1 способ. Микромицеты и дрожжи продуцируют лизин из α-кетоглутаровой
кислоты
через
α-аминоадипиновую
кислоту.
Скорость
образования лизина по данной схеме лимитируется стадиями синтеза αкетоглутаровой кислоты и глутаминовой кислоты через цикл Кребса.
2 способ. Для бактериальных культур, относящихся к родам Brevibacterium; Corynebacterium характерен путь биосинтеза лизина из аспарагиновой
кислоты через диаминопомелиновую кислоту.
Помимо лизина по разветвленной схеме биосинтеза из аспарагиновой
кислоты образуются также метионин, треонин и изолейцин.
Повышенная биосинтетическая активность микроорганизмов по лизину
может быть вызвана следующими факторами:
- активация фермента
аспартаткиназы (1), ингибирование
которого
осуществляется одновременно лизином и треонином по принципу
«обратной связи»;
- активация фермента дигидродипиколинатсинтазы (2), ингибируемого
треонином, метионином и изолейцином;
- подавление активности ферментов гомосериндегидрогензы (3) и
гомосеринкиназы (4), которые у диких штаммов Brevibacterium и
Corynebacterium
в
15
раз
выше,
чем
активность
фермента
дигидродипиколинатсинтазы (2). Данный эффект достигается снижением
концентрации фосфат-ионов в среде, воздействием мутагенных факторов
(УФ-излучение; диэтилсульфат, нитрозоэтилмочевина).
Данный способ нашел широкое практическое применение. Наиболее
активными
продуцентами лизина являются мутированные штаммы
Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum. Оптимальные условия
биосинтеза
лизина
культурами
этих
микроорганизмов
температура 28-30оС; рН 7,0-7,5; интенсивная аэрация среды.
следующие:
Альтернативным является ферментативный способ, предусматривающий
введение в среду культивирования Brevibacterium, предшественника лизина
– диаминопимелиновой кислоты, получаемой химическим синтезом. Метод
не
нашел
широкого
диаминопимелиновой кислоты.
применения
вследствие
дороговизны