Биохимия Коляда - Астраханский Государственный
реклама
Федеральное агентство по рыболовству ФГОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет» Кафедра «Органическая, биологическая и физколлоидная химия» (ОРХ) КОЛЯДА М.Н. ОСНОВЫ БИОХИМИИ Астрахань - 2009 г Учебное пособие разработано к.б.н., доцентом кафедры органической, биологической и физколлоидной химии Коляда Маргаритой Николаевной. Учебное пособие рассмотрено и одобрено на заседании кафедры органической, биологической и физколлоидной химии 27.05.09г. протокол №5 РЕЦЕНЗЕНТ: кандидат химических наук, доцент кафедры органической, биологической и физколлоидной химии Фоменко Алевтина Ивановна. 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. Химический состав организмов Глава 2. Белки Глава 3. Нуклеиновые кислоты Глава 4. Биосинтез белка Глава 5. Биологический катализ. Ферменты. Глава 6. Витамины Глава 7 Углеводы Глава 8. Обмен веществ и энергии. Обмен углеводов. Глава 9 Липиды Глава 10. Обмен жиров Глава 11. Обмен белков Практикум. Техника безопасности работы в биохимической лаборатории Лабораторная работа №1 «Цветные реакции на белки» Лабораторная работа №2 «Реакции осаждения белков» Лабораторная работа №3 «Нуклеопротеиды» Лабораторная работа №4 «Качественные реакции на отдельные ферменты» Лабораторная работа №5 «Количественное определение аскорбиновой кислоты» Лабораторная работа №6 «Количественное определение углеводов» Лабораторная работа №7 «Жировые константы» Используемая литература Стр. 4 4 12 18 23 27 31 33 37 46 52 52 59 62 72 76 80 82 84 86 88 ВВЕДЕНИЕ Биохимия раскрывает законы жизнедеятельности организмов на молекулярном уровне, устанавливая причинно-следственные связи происходящих в организме процессов. Биохимию делят на несколько разделов. Статическая биохимия изучает химический состав живых организмов и свойства химических соединений, выделенных из живых тканей. Динамическая биохимия изучает все многообразие химических реакций в организме, их взаимосвязь и регуляцию, а также сопряженные с ними превращения энергии в процессах жизнедеятельности. Функциональная биохимия рассматривает биохимические процессы, лежащие в основе жизнедеятельности отдельных тканей и органов и проявления их специфической функции. ГЛАВА 1 ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ОРГАНИЗМОВ Элементный состав организмов Общее количество живого вещества на планете оценивается цифрами 10 13 -1014 тонн. В состав живых организмов входит более 60 химических элементов. По концентрации их можно разделить на 3 группы. Макроэлементы содержатся в количествах более 0,001%, к ним относятся С, Н, О, N, S, К, Р, Са, Мg, С1, Nа, Fе. 98-99% составляют: H, O, C, N и P. Первые четыре элемента обладают рядом особых качеств: способны образовывать друг с другом ковалентные кратные связи, что служит основой для большого разнообразия органических соединений. Это легкие элементы, их атомы отличаются малыми размерами, именно поэтому они образуют прочные связи друг с другом. Молекулы относительно плотные с минимальными межатомными расстояниями, что определяет их устойчивость к различным воздействиям. Микроэлементы составляют 0,001 -0,000001%: Zп, Си, В, Мо, Мп, Со и др. и ультрамикроэлементы (менее 0,000001%)- Нg, Аи, Аg и др. Легкие элементы оказались более пригодными для построения живых тел, так как они образуют газообразные, жидкие или твердые, но хорошо растворимые в воде соединения, что очень важно для организма, так как обеспечивает высокую скорость химических реакций в нем. Минеральный состав мяса гидробионтов во многом определяется содержанием минеральных элементов в среде их обитания, видовыми особенностями, физиологическим состоянием и другими факторами. Морские рыбы содержат минеральных веществ 4,2 – 8,9%, а пресноводные – 2,0 7,2% сухой массы. Ткани и органы морских рыб содержат больше железа, меди и йода по сравнению с пресноводными рыбами. В морских рыбах в наибольшем количестве содержится кальций, затем калий, фосфор, сера, хлор, натрий и магний. Химический состав клетки живого организма отражает такой важный признак живой материи, как высокий уровень структурной организации. Все химические элементы входят в состав органических и неорганических соединений организма, выполняющих определенные функции. Если все биологические вещества, функционирующие в клетке, расположить по сложности их строения, то получатся определенные уровни организации клетки. Первый уровень занимают низкомолекулярные предшественники клеточных компонентов, к которым относятся вода, углекислый газ, молекулярные кислород и азот, неорганические ионы, ряд химических элементов. На втором уровне стоят промежуточные химические соединения, такие как аммиак, органические кислоты и их производные, карбамоилфосфат, рибоза и др. Из соединений первого и второго уровней в ходе жизнедеятельности клеток образуются биологические мономеры, которые являются строительным материалом для биополимеров, имеющих большую молекулярную массу и отличающихся огромным разнообразием. Промежуточное положение между биологическими мономерами и биополимерами занимают витамины и коферменты, которые по молекулярной массе ближе к мономерам, но не являются строительными блоками биополимеров. Биополимеры способны ковалентно соединяться друг с другом, образуя сложные макромолекулы: липопротеины, нуклеопротеины, гликопротеины, гликолипиды и т. д. Взаимодействием простых и сложных макромолекул создаются надмолекулярные структуры (мультиэнзимы). Следующий уровень организации клетки — клеточные органеллы: митохондрии, ядра, рибосомы, и др. Система органелл образует клетку. Клетка живого организма — это химическая лаборатория, в которой происходят превращения большого числа органических соединений разных классов. Органические соединения - соединения углерода делятся на классы по типу функциональной группы (группы атомов, которые обусловливают характерные химические свойства членов этих классов). Таблица 1. Важнейшие классы органических соединений Название, общая формула Галогенпроизводные углеводородов Спирты R — ОН (R — алкильный радикал) Фенолы R — ОН (R — ароматический радикал) Простые эфиры Альдегиды Функциональная группа, отличительный признак Пример Кетоны Карбоновые кислоты Сложные эфиры Нитросоединения Структура, свойства и биологические функции воды Жизнь на планете Земля зародилась в водной среде. Ни один организм не может обходиться без воды. Несмотря на простоту химического состава и строения, вода является одним из удивительных соединений, обладает уникальными физико-химическими свойствами и биологическими функциями. Она удивительна своими самыми обычными свойствами Молекула воды нелинейна, строение ее таково: Амины α - Аминокислоты Атомы водорода и кислорода расположены в углах равнобедренного треугольникаю. Длина связи О-Н равна 0,0957 нм. Поскольку атомы водорода и кислорода имеют различную электроотрицательность (электронная плотность связи О – Н смещена к кислороду), а химические связи расположены под углом, отличным от 180 о (104,5о), молекула воды полярна. Важной особенностью воды является способность ее молекул объединяться в структурные агрегаты за счет образования водородных связей. Образующиеся ассоциаты (рис. 1) состоят из нескольких молекул воды, поэтому формулу воды правильнее было бы записать как (Н20)n, где n = 2, 3, 4, 5. Водородные связи имеют исключительно важное значение при формировании структур биополимеров, надмолекулярных комплексов. Если бы между молекулами воды не было водородных связей, вода кипела бы при Т = - 80оС. Это означает, что в обычных условиях Земли вода находилась бы в газообразном состоянии. Рис. 1. Ассоциат молекул воды. Точками обозначены водородные связи Водородная связь — это взаимодействие атома водорода, соединенного с электроотрицательным атомом с другим электроотрицательным атомом, имеющее частично донорно-акцепторный, частично электростатический характер. По энергии водородная связь занимает промежуточное положение между ковалентной (200—400 кДж/моль) и ионной химическими связями и слабыми ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями, находясь в пределах 12—30 кДж/моль. Необычная структура воды обусловливает ее уникальные физико-химические свойства. Все биохимические процессы в организме протекают в водной среде. Вещества, находящиеся в водном растворе, имеют водную (гидратную) оболочку, которая образуется в результате взаимодействия полярных молекул воды с заряженными группами макромолекул или ионов. Чем больше такая оболочка, тем лучше растворимо вещество. По отношению к воде молекулы или их части делят на гидрофильные (водорастворимые) и гидрофобные (водонерастворимые). Гидрофильными являются все органические и неорганические соединения, диссоциирующие на ионы, биологические мономеры и биополимеры, имеющие полярные группы. К гидрофобным следует отнести соединения, молекулы которых содержат неполярные группы или цепи (триацилглицерины, стероиды и др.). Молекулы некоторых соединений содержат как гидрофильные, так и гидрофобные группы; такие соединения называются амфифильными (от греч. amphy — двоякий). К ним относятся жирные кислоты, фосфолипиды и др. Физико-химические свойства воды определяют ее биологические функции: •Вода является прекрасным растворителем. •Вода выполняет функцию регулятора теплового баланса организма, так как ее теплоемкость значительно превышает 5 5 теплоемкость любого биологического вещества. Поэтому вода может долго сохранять тепло при изменении температуры окружающей среды и переносить его на расстояние. •Вода способствует сохранению внутриклеточного давления и формы клеток (тургор). •В определенных биохимических процессах вода выступает в качестве субстрата. Содержание воды зависит от возраста животного, от его физиологического состояния, степени упитанности и т.д. Чем моложе животное, тем выше содержание воды. У новорожденных вода составляет 75% от массы тела, у детей от 1 года до 10 лет — 60—65%, а у людей старше 50 лет — 50—55%. При повышении жирности количество воды в их тканях уменьшается. Внутри клеток содержится 2/3 общего количества воды, внеклеточная вода составляет 1/3. Необходимое содержание воды в организме человека поддерживается за счет поступления ее извне (примерно 2 л в сутки); около 0,3 л в сутки образуется в процессе распада веществ внутри организма. Нарушение водного баланса в клетках организма приводит к тяжелым последствиям вплоть до гибели клеток. Функции клеток зависят от общего количества внутриклеточной и внеклеточной воды, от водного окружения макромолекул и субклеточных структур. Потеря воды в количестве 1 % от массы тела человека приводит к появлению чувства жажды, а при потере организмом 20 % воды в клетках происходят необратимые изменения, приводящие к гибели. Суточная потребность взрослого мужчины в воде составляет 35 г на 1 кг массы тела, а грудного ребенка – в 3-4 раза больше. Неорганические ионы, их свойства и биологические функции Неорганические или, иначе, минеральные вещества находятся в клетках в виде ионов. Основными катионами в клетках и внеклеточных жидкостях организма человека являются: Na+, K+, Са2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+. Среди анионов преобладают РО32-, CI-, SО42-, НСО3-. Концентрации основных неорганических катионов и анионов в межклеточной жидкости и в плазме крови почти не отличаются (см. табл. 2). Таблица 2 Содержание основных катионов и анионов внутри клетки и во внеклеточных жидкостях организма человека (по А.Е. Строеву) Ионы Вне клетки, % плазма Внутри клетки, % межклето чная жидкость Катионы Na+ 92,7 94,0 7,5 К+ 3,0 3,0 1,3 2,7 2,0 1,3 75,0 2,5 15,0 С1- 69,0 76,0 7,5 НСО3PO3SO4органических кислот белков 17,0 1,4 0,6 2,0 10,0 19,0 l,4 0,7 2,0 0,6 5,0 50,0 10,0 2,5 25,0 Са2+ Mg2+ Анионы Как видно из таблицы 2, Na+ является основным катионом во внеклеточной среде, а К+ — внутри клеток. Из анионов вне клетки преобладает С1-, а внутри клетки — Р032-. Живой организм подчиняется физико-химическому закону электронейтральности: суммы положительных зарядов катионов и отрицательных зарядов анионов должны быть равны. Для соблюдения этого закона в организме не хватает некоторого количества неорганических анионов. Недостаток отрицательных зарядов компенсируют анионы органических кислот и белков. Неорганические ионы в клетке выполняют многочисленные биологические функции. Основными функциями катионов являются: •Транспортная — участвуют в переносе электронов и молекул простых веществ. •Структурообразующая — обусловлена комплексообразующими свойствами металлов, катионы которых участвуют в образовании функционально активных структур макромолекул и надмолекулярных комплексов. •Регуляторная — являются регуляторами (активаторами или ингибиторами) активности ферментов. •Осмотическая — регулируют осмотическое и гидроосмотическое давление. •Биоэлектрическая — связана с возникновением разности потенциалов на клеточных мембранах. Биологические функции анионов: •Энергетическая — участвуют в образовании главного носителя энергии в организме человека — молекулы АТФ — из АДФ и неорганических фосфатных анионов. •Опорная — анион фосфора и катион кальция входят в состав гидроксилапатита и фосфата кальция костей, определяющих их механическую прочность. 6 6 • Синтетическая — используются для синтеза биологически активных соединений (иодид-анион (I-) участвует в синтезе гормонов щитовидной железы). Вопросы для самоконтроля к главе 1 «Химический состав организмов» 1. Какие химические элементы относятся к группе макробиогенных? 2. Перечислите молекулярные уровни организации живой клетки. Приведите конкретные примеры соединений, относящихся к каждому из указанных уровней. 3. Почему вода играет исключительно важную роль в жизнедеятельности организма? 4.Какие соединения называются амфифильными? Приведите конкретные примеры. 5.Напишите структурные формулы следующих соединений: пропаналя, бутанола-2, этилацетата, 2-аминопропана. К каким классам органических соединений они относятся? Глава 2 БЕЛКИ Белки (протеины) - высокомолекулярные азотистые органические вещества, линейные гетеробиополимеры, мономером которых являются L,α-аминокислоты. Свое название белки получили от яичного белка, который с незапамятных времен использовался человеком как составная часть пищи. Белки – основная и необходимая составная часть всех организмов. К белкам относятся сократительные структуры, лежащие в основе движения, опорные ткани организма (коллаген костей, хрящей, сухожилий), покровы организма (кожа, волосы, ногти и т.п.), а также токсины, антигены и антитела, многие гормоны и другие биологически важные вещества. В природе существует примерно 1010-1012 различных белков, обеспечивающих жизнедеятельность организмов всех степеней сложности от вирусов до человека, они обеспечивают жизнь более 2 млн. видам организмов. Ни одно вещество из всех веществ биологического происхождения не имеет столь большого значения и не обладает столь многогранными функциями в жизни организма как белки. В организме человека насчитывается более 100 000 разнообразных белков. Общее содержание белков у гидробионтов может изменяться в широком диапазоне от 0,2 % у медуз до 28,8 % у китов. Удивительно, что все природные белки состоят из небольшого числа сравнительно простых структурных блоков, представленных мономерными молекулами – аминокислотами, связанными друг с другом в полипептидные цепи. Аминокислоты, входящие в состав белков (протеиногенные) – это , L-аминокислоты, органические соединения, содержащие в своем составе карбоксильную группу (- СООН)- и амино (-NH2)-группу, которая находится у ближайшего к карбоксильной группе углеродного атома, т.е. у α–углеродного атома (Табл.3). Нумерацию атомов углерода в аминокислоте ведут от СООН – группы, Первый от нее углеродный атом обозначают α, затем β, γ и т.д. Остальную часть молекулы аминокислоты принято называть радикалом (R). В общем виде такие аминокислоты можно записать так: H H2N C COOH R Так как α-углеродный атом является асимметричным (с ним связаны 4 разные группы), то возможно различное расположение замещающих групп и существование стереоизомеров в L и D – форме: По стереохимической конфигурации α–углеродного атома все они принадлежат к L-ряду. 7 7 Таблица 3 Протеиногенные аминокислоты Формула Название Глицин Алании ала Валин вал Лейцин лей Изолейцин иле Аспарагино-вая кислота асп Аспарагин асн Глутаминовая кислота 8 Сокращенное обозначение гли глу Глутамин глн Тирозин тир Серин сер Треонин тре Цистеин цис Метионин мет Аргинин арг Лизин лиз Гистидин гис Пролин про Фенилаланин фен 8 Приняты три классификации аминокислот: 1. структурная, т.е. по строению бокового радикала 2. электрохимическая, т.е. по кислотно-основным свойствам 3. биологическая, или физиологическая, т.е. по степени незаменимости аминокислот для организма. Аминокислоты проявляют свойства и кислот, и аминов. Так, они образуют соли (за счет кислотных свойств карбоксильной группы): NH2CH2COOH + NaOH глицин (NH2CH2COO)Na + Н2О глицинат натрия и сложные эфиры (подобно другим органическим кислотам): NH2CH2COOH + С2Н5ОН глицин NH2CH2C(O)OC2H5 + Н2О этилглицинат С более сильными кислотами аминокислоты проявляют свойства оснований и образуют соли за счет основных свойств аминогруппы: O O N H H 2C 2 C O H глицин + HC l N H H 3C 2 C + C l O H хлорид глициния Аминокислоты делятся на заменимые и незаменимые. Последние не могут синтезироваться в организме, поэтому они обязательно должны поступать извне (с пищей). Существует 8 незаменимых аминокислот: валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, лизин, метионин, треонин. Абсолютная незаменимость 8 аминокислот универсальна для всех видов организмов. Животные белки, в том числе белки гидробионтов, содержат все незаменимые аминокислоты, поэтому являются биологически полноценными белками. Общее содержание незаменимых аминокислот в белках рыб составляет 8890 % их содержания в белках крупного рогатого скота. Простейший белок — полипептид, содержащий в своей структуре не менее 70 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу свыше 10 000 Да (дальтон). Дальтон - единица измерения массы белков, 1 дальтон равен 1/16 массы атома кислорода (кислородная единица массы). Аналогичные соединения, состоящие из меньшего количества аминокислотных остатков, относят к пептидам. Пептидами по своей природе являются некоторые гормоны – инсулин, окситоцин, вазопрессин. Некоторые пептиды являются регуляторами иммунитета. Пептидную природу имеют некоторые антибиотики (циклоспорин А, грамицидины А, В, С и S), алкалоиды, токсины пчел и ос, змей, ядовитых грибов (фаллоидин и аманитин бледной поганки), холерный и ботулинический токсины и др. Уровни структурной организации белковых молекул. Молекула белка имеет сложное строение. Выделяют несколько уровней структурной организации белковой молекулы – первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры. Первичная структура определяется как линейная последовательность остатков протеиногенных аминокислот, связанных пептидными связями. Она генетически детерминирована для каждого конкретного белка в последовательности нуклеотидов информационной РНК. Первичная структура определяет и более высокие уровни организации белковых молекул. Вторичная структура — конформация (т. е. расположение в пространстве) отдельных участков белковой молекулы. Вторичная структура в белках может быть представлена -спиралью, -структурой (структура складчатого листа) (Рис.2). 9 9 α - спираль β-структура Рис.2. Вторичная структура белка Третичная структура — конформация всей молекулы белка. В ее формировании и стабилизации принимают участие все виды взаимодействий: гидрофобное, электростатическое (ионное), дисульфидные ковалентные связи, водородные связи, координационные связи с участием ионов металлов и т. д. Четвертичная структура белка. Под четвертичной структурой белков подразумевают способ укладки в пространстве отдельных полипептидных цепей (одинаковых или разных) с третичной структурой, приводящий к формированию единого в структурном и функциональном отношениях макромолекулярного образования (мультимера). Четвертичную структуру имеют не все белки. Примером белка, имеющего четвертичную структуру, является гемоглобин, который состоит из 4-х субъединиц. Этот белок участвует в транспорте газов в организме. Белки подразделяются на простые (протеины), состоящие только из аминокислот, и сложные (протеиды), содержащие, кроме аминокислот, другие небелковые вещества, например, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты и др. Вопросы и задания для самоконтроля к главе 2 «БЕЛКИ» 1. Приведите структурные формулы протеиногенных аминокислот: - незаменимых; - заменимых; - полярных; - неполярных; - «кислых» и «основных»; 2. Напишите в виде амфионов формулы: а) аланина; б) серина; в) фенилаланина; г) треонина. 3. Напишите формулы и назовите дипептиды, которые могут быть получены из следующих аминокислот: а) глицин и лейцин; б) аланин и валин; в)аланин и треонин; г) фенилаланин и глутамин. 4. Напишите формулы дипептидов: а) лейцилаланин; б) аспаргилаланин; в) глутамилглицин; г) изолейцилгистидин; 5. Приведите классификацию белков, основанную на их биологических функциях. 6. Охарактеризуйте физические свойства белков. 7. Дайте характеристику химическим свойствам белков. 8. Охарактеризуйте все виды взаимодействий, стабилизирующих третичную структуру белка. Глава 3 НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ Нуклеиновые кислоты являются высокомолекулярными соединениями, мономерами которых являются мононуклеотиды, состоящие из азотистого основания, рибозы у РНК или дезоксирибозы у ДНК - вместе они составляют нуклеозид, и остатка фосфорной кислоты. ТМФ 10 УМФ ЦМФ 1 0 ГМФ АМФ ТМФ встречается только в ДНК, а УМФ - только в РНК. В составе нуклеиновых кислот мононуклеотиды связаны 3’,5’-фосфодиэфирными связями между рибозами соседних мононуклеотидов через остаток фосфорной кислоты. Первичная структура нуклеиновой кислоты – это последовательность (порядок чередования) мононуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Э.Чаргафф установил закономерности химического состава ДНК (правила Чаргаффа): ∙Количество молекул пуриновых оснований равно количеству молекул пиримидиновых оснований (A+G = T+C); ∙Количество молекул аденина равно количеству молекул тимина (А = Т); ∙Количество молекул гуанина равно количеству молекул цитозина (G =C); ∙Количество оснований с 6-аминогруппами равно количеству оснований с 6-гидроксигруппами (А + С = G + Т); ∙Отношение G +C / A +T постоянно для клеток одного вида организмов, но резко отличается у разных видов. Это отношение называют фактором специфичности. Открытые закономерности совместно с рентгеноструктурным анализом ДНК позволили предложить модель вторичной структуры ДНК (Уотсон Дж., Крик Ф., 1953). Вторичная структура ДНК: это две правозакрученные вокруг одной общей оси спирали, которые соединены между собой водородными связями (Рис.3). Цепи антипараллельны, т.е. 3- Рис.3. Схематическое изображение двойной спирали ДНК по Уотсону и Крику : с - остаток дезоксирибозы, р - остаток фосфорной кислоты Вторичную структуру ДНК поддерживают: 1) водородные связи между определенными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями – это принцип комплементарности. Между аденином и тимином образуются две, а между гуанином и цитозином три водородные связи. 2) Гидрофобные взаимодействия между азотистыми основаниями, лежащими в соседних параллельных плоскостях. Расстояние между плоскостями соседних оснований 0,34 нм. Третичная структура ДНК – это способ упаковки ДНК в хромосомах. 11 1 1 Нуклеиновые кислоты встречаются в организме не в свободном виде, а в составе сложных белков - нуклеопротеинов. Молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно. Белковая часть нуклеопротеинов представлена основными белками, гистонами, которые несут положительный заряд. Таким образом, в данном сложном белке между белковой и небелковой частями образуются ионные связи. Биологическая роль нуклеиновых кислот . Нуклеиновые кислоты имеют фундаментальное биологическое значение, поскольку содержат в закодированном виде всю генетическую информацию любого живого организма, от человека до бактерий и вирусов, передаваемую от одного поколения другому. 1. ДНК: хранение генетической информации. Участок молекулы ДНК, несущий информацию о первичной структуре одного полипептида, называется ген. 2. РНК: а) хранение генетической информации у некоторых вирусов; б) реализация генетической информации: и-РНК (м-РНК) - информационная (матричная), т-РНК (транспортная), рРНК (рибосомальная) в) некоторые молекулы РНК способны катализировать реакции гидролиза 3’,5’-фосфодиэфирной связи в самой молекуле РНК. Такие РНК называют рибозимами. Функции мононуклеотидов 1. Структурная. Из мононуклеотидов построены нуклеиновые кислоты, нуклеотидную природу имеют небелковые части некоторых сложных биологических катализаторов (ферментов). Так, динуклеотидом по строению является система НАД (никотинамидадениндинуклеотид), небелковая часть сложных ферментов, ускоряющих окислительно-восстановительные реакции (Рис.4). Рис.4. Структура системы НАД. 2. Энергетическая. Мононуклеотидом является АТФ – аденозинтрифосфорная кислота – макроэргическое соединение, универсальный аккумулятор энергии. В качестве азотистого основания содержит аденин (А) (Рис.5). Рис.5. Структура АТФ 3. Регуляторная. Нуклеотидную природу имеют некоторые регуляторы активности ферментов, цАМФ (Рис.6) и цГМФ являются посредниками в передаче гормонального сигнала при действии многих гормонов на клетку (аденилатциклазная система). 12 1 2 Рис. 6. Структура циклического аденозинмонофосфата Вопросы для самоконтроля к главе 3 «Нуклеиновые кислоты» 1. 2. 3. 4. 5. 6. Охарактеризовать составные компоненты нуклеиновых кислот. Назовите виды нуклеиновых кислот. Каковы биологические функции ДНК? Каковы биологические функции мРНК, тРНК, рРНК? Как связаны нуклеотиды между собой в молекуле нуклеиновых кислот? Что такое ген? Глава 4 БИОСИНТЕЗ БЕЛКА Биосинтез белка – один из наиболее важных биохимических процессов в жизнедеятельности организма. Суть его заключается в передаче генетической информации от ДНК на индивидуальный белок. Этот процесс условно можно разделить на три последовательных этапа: I – cинтез мРНК (транскрипция); II – транспорт аминокислот к рибосомам; III – собственно синтез белка (трансляция). Биохимическая функция ДНК, как уже отмечалось, заключается в хранении генетической информации посредством определенной последовательности входящих в нее мононуклеотидов. Непосредственное отношение к синтезу белка имеют различные виды РНК – матричная или информационная (мРНК), транспортная (тРНК) и рибосомальная (рРНК). На этапе транкрипции биспираль ДНК на определенном участке раскручивается и на одной из ее цепей по принципу комплиментарности синтезируется мРНК. Эта РНК является переносчиком генетической информации от ДНК и служит основой (матрицей), на которой будет строиться белок. В молекуле мРНК выделяют триплеты (три последовательно соединенных мононуклеотида) – кодоны, каждый из которых кодирует определенную аминокислоту. Второй этап начинается с активирования аминокислот. При участии АТФ аминокислота присоединяется к соответствующей тРНК и в таком комплексе (в виде сложного эфира с соответствующей тРНК) переносится к рибосомам - особым органоидам клетки, где и синтезируется белок. тРНК имеет характерную вторичную структуру клеверного листа (Рис.7). Аминоацильный остаток присоединяется к акцепторному участку тРНК, напротив которого находится триплет нуклеотидов – антикодон. 13 1 3 Рис. 7. Структура тРНК Рибосомы состоят из рРНК (65%) и из специфических белков (35%), они имеют две субъединицы, при соединении которых рибосома является активной и обеспечивает синтез белка. Между субъединицами встраивается мРНК, причем на одной цепи мРНК могут находиться несколько рибосом, образуются полисомы (Рис.8), что намного ускоряет синтез белка. Рис.8. Схематическое изображение организации бактериальной полисомы и движения рибосом вдоль мРНК На участке мРНК, где соединяются две субъединицы рибосомы укладывается два кодона мРНК, к которым комплиментарными антикодонами последовательно присоединяются две молекулы тРНК. Аминокислота, соединенная с первой тРНК переносится к аминокислоте второй тРНК, между аминокислотами образуется пептидная связь. Далее первая из двух тРНК отщепляется от мРНК, рибосома передвигается на один триплет (кодон) вдоль мРНК. К новому кодону присоединяется соответствующая тРНК с аминокислотой, которая взаимодействует с уже образовавшимся дипептидом (рис. 9). Рис.9. Схема биосинтеза белка 14 1 4 Так продолжается до тех пор, пока не образуется именно тот полипептид, который по количеству и последовательности входящих в его состав аминокислот был закодирован на молекуле ДНК. В процессе синтеза цепь белка подвергается определенной упаковке, соответствующей структуре данного белка: образуются вторичная и третичная структуры. Таким образом, генетическая информация, закодированная на молекуле ДНК в виде последовательности мононуклеотидов, передается через мРНК и тРНК аминокислотам и таким образом преобразуется в последовательность аминокислотных остатков в белке (табл. 3). В ДНК имеются участки, которые отвечают за синтез или распад какого-либо вещества – опероны. В составе оперона выделяют регуляторный участок и группу структурных генов. В регуляторном участке различают ген-оператор, который контролирует работу структурных генов, обеспечивающих синтез нескольких мРНК. Последние отвечают за синтез белков-ферментов, ускоряющих превращения веществ. Таблица 3 Соответствие триплетов ДНК и РНК аминокислотам Аминокислота Лейцин Аргинин Лизин тРНК (антикодон) ГАА ГЦУ УУУ мРНК (кодон) ЦУУ ЦГА ААА ДНК ГАА ГЦТ ТТТ Живые клетки имеют точно запрограммированные механизмы, регулирующие синтез их белков таким образом, что в каждой клетке присутствует именно то количество молекул каждого белка, которое позволяет ей функционировать с максимальной эффективностью. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Вопросы для самоконтроля к главе 4 «Биосинтез белка» Дайте определение понятиям «триплет», «кодон», «антикодон». Где в клетке синтезируется белок? Что такое транскрипция? Что такое трансляция? Что такое ген? Что такое оперон? Глава 5 БИОЛОГИЧЕСКИЙ КАТАЛИЗ. ФЕРМЕНТЫ В настоящее время твердо установлено, что все без исключения химические процессы в клетке ускоряются специальными биологическими катализаторами, которые называются ферментами или энзимами. В настоящее время известно более 3200 ферментов. Ферменты имеют белковую природу (за исключением некоторых молекул РНК, способных к автокатализу и называемых «рибозимами»), им присущи все свойства белков. Ферменты, выполняя функцию катализатора, подчиняются общим законам катализа и обладают всеми свойствами неорганических катализаторов: а) катализируют только энергетически возможные реакции, т.е ферменты ускоряют реакции, которые могут протекать и без катализатора, но с малой скоростью; б) увеличивая скорость реакции, они не расходуются в процессе катализа и не претерпевают необратимых изменений, выходя из реакции в первоначальном виде; в) не смещают химического равновесия, а лишь ускоряют его достижение, т.к. в равной степени ускоряют как прямую, так и обратную реакции; 15 1 5 г) повышают скорость реакции, понижая энергию активации. Энергия активации - это дополнительное количество кинетической энергии, необходимое молекулам вещества, чтобы они вступили в реакцию. От неорганических катализаторов ферменты отличаются: а) высокой эффективностью действия. Скорость ферментативных реакций в 10 6-1012 раз выше, чем соответствующих реакций, катализируемых неорганическими катализаторами; б) действуют в мягких условиях клетки: физиологическом значении рН, температуры и постоянном атмосферном давлении, тогда как химические катализаторы действуют, как правило, в жестких условиях; в) обладают высокой специфичностью действия (избирательностью) т.е. способностью взаимодействовать лишь с одним или несколькими субстратами г) обладают способностью к регуляции. Ферменты, как и белки, делятся на простые (представлены только белковой молекулой) и сложные, которые помимо белковой части, называемой апоферментом, содержат еще небелковую часть (кофактор). Если кофактор прочно связан с апоферментом, он называется простетической частью, при непрочном связывании – коферментом. Кофермент может существовать самостоятельно, не проявляя заметной каталитической активности, и рассматривается как второй субстрат. Механизм действия ферментов. Строение фермента Ферменты, являясь катализаторами, не расходуются в ходе реакции, но это не означает, что они не участвуют в ней, просто они регенерируются. Фермент Е обратимо связывается с субстратом S с образованием промежуточного ферментсубстратного комплекса ES, который претерпевает дальнейшие превращения вплоть до образования конечных продуктов Р и регенерации фермента. Е+S→ E S → E + P Все ферменты представляют собой глобулярные белки, намного превосходящие по размерам субстрат. На поверхности фермента находится активный центр, комплементарный субстрату. Условно активный центр можно разделить на две части — связывающий центр и каталитический центр. Связывающий центр (субстратный центр) выполняет функцию специфического связывания субстрата и его оптимальной ориентации по отношению к катализирующим группам. В простом ферменте, который представляет собой простой белок, каталитический центр формируется боковыми радикалами аминокислотных остатков белка. Причиной всех этих уникальных свойств ферментов является их пространственное строение. Классификация ферментов. По типу катализируемой реакции все ферменты делятся на шесть классов. 1.Оксидоредуктазы. Катализируют окислительно-восстановительные реакции. Характерная особенность оксидоредуктаз – способность образовывать цепи окислительно-восстановительных реакций, в которых осуществляется перенос Н или е- от первичного субстрата к конечному акцептору – кислороду с образованием воды. Те оксидоредуктазы, которые переносят Н или электрон не на кислород, а на промежуточный акцептор, в роли которого выступает небелковая часть, называются дегидрогеназами. Те оксидоредуктазы, которые переносят Н или электрон непосредственно на кислород называются оксидазами. 2. Трансферазы. Катализируют реакции переноса группировок с одного соединения на другое. 3. Гидролазы. Ускоряют гидролитическое расщепление веществ. 4. Лиазы. Катализируют реакции негидролитического расщепления с образованием двойных связей или реакции присоединения по двойным связям. 5. Изомеразы. Катализируют реакции изомерации соединений. 6. Лигазы (синтетазы). Ускоряют реакции синтеза с использованием энергии макроэргических соединений. Каждый класс подразделяется на подклассы, подкласс — на подподклассы. В пределах подподкласса каждый фермент имеет свой порядковый номер. Все ферменты включены в «Каталог ферментов» под своим классификационным номером (КФ), состоящим из четырех цифр. Первая цифра указывает на принадлежность к одному из шести главных классов. Следующие две определяют подкласс и подподкласс, а последняя цифра — номер фермента в данном подподклассе. В сложных ферментах катализ осуществляет небелковая часть - кофактор, белковая часть обеспечивает связывание субстрата, специфичность действия фермента. Характерной особенностью действия ферментов является также высокая чувствительность активности ферментов к внешним условиям – рН среды и температуре. Ферменты активны лишь в достаточно узком интервале рН и температуры, причем для ферментов характерно наличие в этом интервале максимума активности при некотором оптимальном значении рН или температуры; по обе стороны от этого значения активность ферментов быстро снижается . Ингибирование ферментов. Кроме обычных факторов (растворитель, температура, рН), на скорость ферментативных процессов влияет присутствие некоторых специфических для данного фермента соединений, которые принято называть либо ингибиторами (если они снижают скорость ферментативной реакции), либо активаторами (если они ускоряют процесс). Эффекторы ферментативных реакций подразделяют на «обратимые» (связываются с ферментом нековалентно) и «необратимые» (образуют с ферментом ковалентные связи). В свою очередь обратимые эффекторы делят на конкурентные и неконкурентные. Конкурентный ингибитор конкурирует с истинным субстратом за центр связывания с ферментом. Как правило, конкурентные ингибиторы представляют собой аналоги субстрата, сохраняющие все (или большинство) функциональных 16 1 6 групп, необходимых для связывания с ферментом, но не способные претерпевать ферментативное превращение (отсутствие или модификация реагирующей группы). Таким образом, фермент может образовывать либо фермент-субстратный комплекс, который затем превращается в продукт, либо фермент-ингибиторный комплекс. Связывание с ферментом и субстрата и ингибитора одновременно невозможно. В случае неконкурентного ингибирования с ферментом связывается и ингибитор, и субстрат. Часто ингибитор взаимодействует с определенными группировками в аллостерическом (пространственно удаленном от активного центра участке белка) центре фермента. Например, ионы тяжелых металлов реагируют с -SH группами остатков аминокислоты цистеина в аллостерическом центре ферментов. Регуляция активности ферментов Кроме каталитической активности некоторые ферменты обладают также и регуляторной активностью. Они служат как бы «дирижерами», задающими темп метаболическим процессам, обеспечивая тем самым соответствие обмена веществ измененным условиям. Такие ферменты называются регуляторными, они, как правило, катализируют самую медленную реакцию, определяющую скорость всего процесса в целом. Известны два основных способа регуляции каталитической активности ферментов. 1. Аллостерическая регуляция. 2. Ковалентная модификация белка – чаще всего фосфорилирование и дефосфорилирование. В случае аллостерической регуляции аллостерические ферменты регулируют скорость реакций путем обратимого нековалентного присоединения специфических модуляторов, или эффекторов, к регуляторному, или аллостерическому, центру фермента. Такими модуляторами могут быть либо сами субстраты, либо какие-то промежуточные продукты метаболизма. В некоторых мультиферментных системах регуляторный фермент ингибируется конечным продуктом. В этом случае говорят об отрицательном модуляторе. Такой тип регуляции называется ингибированием по типу обратной связи или ретроингибированием. При повышении концентрации отрицательного модулятора в клетке, он связывается с аллостерическим центром фермента, активность которого при этом снижается. В результате замедляется функционирование всей ферментной системы в целом, что приводит скорость выработки конечного продукта в соответствие с потребностями клетки. В качестве положительного модулятора, активирующего регуляторный фермент, часто выступает субстрат данного фермента. К другому классу относятся регуляторные ферменты, способные изменять свою активность путем ковалентной модификации содержащихся в них специфических функциональных групп, необходимых для активности фермента. Например, перенос фосфорильных групп от АТФ к гидроксильным группам остатков серина в неактивной форме гликогенфосфорилазы переводит ее в активную форму. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Вопросы для самоконтроля к главе «Биологический катализ. Ферменты» Ферменты: определение, сущность действия. Сравнение ферментов и неорганических катализаторов. Особенности ферментативного катализа. Строение фермента. Коферменты, простетические группы. Классификация ферментов. Свойства ферментов. Ингибирование ферментов. Как осуществляется регуляция ферментативной активности? Глава 6 ВИТАМИНЫ Витамины – это абсолютно необходимые для нормальной жизнедеятельности низкомолекулярные органические вещества, которые не синтезируются данным организмом, либо их синтез затруднен, поэтому они должны поступать в организм извне. В отличие от белков, липидов и углеводов витамины не выполняют структурной (т.е. не включаются в состав тканей) и энергетической функций (т.е. не используются организмом как энергетический субстрат). Биохимическая функция большинства витаминов заключается в том, что они входят в состав небелковых частей (кофакторов) сложных ферментов. Витамины (Табл.4) делят на два типа: водорастворимые и жирорастворимые. Таблица 4 Витамины, их коферментные формы и катализируемые реакции Витам Коферментная форма ин Тип катализируемой реакции Водорастворимые витамины Тиамин (В1) Тиаминпирофосфат Рибофлавин (В2) Флавинмононуклеотид, флавинадениндинуклеотид Никотиновая Никотинамидадениндинукле Декарбоксилирование αкетокислот Окислительновосстановительные реакции Окислительно- 17 1 7 кислота (В5) отид, никотинамидадениндинуклео тидфосфат Кофермент (коэнзим) А Пантотеновая кислота (В3) Пиридоксин (В6) Биоти н Фолие вая кислота Витамин В12 Пиридоксальфосфат Биотицин Тетрагидрофолат Дезоксиаденозилкобаламин Аскорбинова я кислота (С) Не известна восстановительные реакции Перенос ацильных групп Перенос аминогрупп Перенос СО2 Перенос одноуглеродных групп Перенос связанного с углеродом атома водорода на соседний атом углерода Реакции гидроксилирования Жирорастворимые витамины Витамин А Витамин D Ретиналь 1,25Дигидроксихолекальциферол Не известна Витамин Е Витамин К Не известна Зрительный процесс Регуляция обмена Ca Защита мембранных липидов Реакции декарбоксилирования Кроме водорастворимых и жирорастворимых витаминов выделяют группу витаминоподобных веществ, которые лишь отчасти соответствуют определению витаминов и частично выполняют и энергетическую и структурную функции. Например, комплекс F – комплекс ненасыщенных жирных кислот. Часто в организм поступают не собственно витамины, а их предшественники - провитамины, которые преобразуются в витамины уже в самом организме. Вопросы для самоконтроля к главе 6 «Витамины» 1. Что такое витамины? 2. На чем основана классификация витаминов? Приведите примеры. 3. Какие витамины относятся к жирорастворимым? 4. Какие Вы знаете водорастворимые витамины? 5. Что такое провитамины? Глава 7 УГЛЕВОДЫ Классификация углеводов, строение, свойства Углеводы — самые распространенные на нашей планете органические вещества. Они представляют собой первичные продукты фотосинтеза и исходные продукты биосинтеза других веществ в растениях. Углеводы содержатся в клетках всех живых организмов. По строению углеводы являются полиоксикарбонильными соединениями и их производными. В молекуле этих соединений имеются функциональные группы разных типов: группы -ОН (гидроксигруппа, спиртовая O C функция) и карбонильная группа (альдегидная или кетонная функция). По отношению к реакции гидролиза углеводы делятся на простые, которые не гидролизуются и сложные (олигосахариды и полисахариды), которые подвергаются гидролизу. Простые углеводы называют моносахаридами или монозами. Важнейшие представители: альдоз — это глюкоза: кетоз — фруктоза: O C H C H OH HO C H H C H C C H2 O H C O HO C H OH H C OH OH H C OH C H2O H C H2 O H Глюкоза (виноградный сахар) и фруктоза (фруктовый сахар) являются структурными изомерами; их молекулярная формула С6Н12О6. Химические свойства. Моносахариды вступают во многие реакции, характерные для спиртов и карбонильных соединений. Так, они окисляются слабыми окислителями, например, реактивом Фелинга: 18 1 8 Этерификация глюкозы и фруктозы (например, уксусной кислотой) приводит к образованию сложного эфира по всем пяти группам ОН. Молекула глюкозы может существовать в трех изомерных формах, из которых две формы (α- и β-формы) циклические. В растворе все три формы находятся в состоянии равновесия, причем открытая (альдегидная) форма содержится в наименьшем количестве: O C CH2OH H OH H OH H O H H OH C H OH HO C H H C OH H C CH2OH H O H OH OH C H2O H OH α-D-Глюкопираноза H OH H H OH OH H β-D-Глюкопираноза D-Глюкоза Циклические формы глюкозы не содержат альдегидной группы. Они отличаются друг от друга только пространственным расположением атома Н и группы ОН у атома углерода С1 (рядом с кислородом в цикле). Таким образом, реакции, характерные для спиртов, протекают по циклической форме углеводов, причем в первую очередь взаимодействие идет по полуацетальному (гликозидному) гидроксилу (гидроксил, полученный в результате образования циклической формы), а реакции, характерные для альдегидов и кетонов, протекают по линейной форме углеводов. Глюкоза в водном растворе легко подвергается брожению в присутствии различных ферментов; наиболее важны в промышленности: а) спиртовое брожение дрожжи глюкоза 2C2H5OH + 2CO2 ↑ C5H12O6 этанол б) молочнокислое брожение C6H12O6 C H3 C H 2 C H3 глюкоза молочная кислота O H Дисахариды образуются из двух молекул моносахаридов путем межмолекулярной дегидратации. Так, сахароза C12H22O11 является продуктом соединения остатков глюкозы и фруктозы за счет отщепления воды: C H O H C H O H 2 C H O H 2 2 H H O O H H C H O H O 2O O H H H H +O HH H O H H O H O H H H O H H C H O HO O O H O HO 2 C H O H H 2 HO H H HO HO H При гидролизе сахарозы в кислой среде H O H образуются монозы – глюкоза и фруктоза. C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6 сахароза глюкоза фруктоза По отношению к слабым окислителям дисахариды делятся на восстанавливающие и невосстанавливающие. Восстанавливающие окисляются слабыми окислителями, восстанавливая последних. Невосстанавливающие не окисляются слабыми окислителями. Если дисахарид образован путем взаимодействия полуацетальных гидроксилов двух моносахаридов, то такой дисахарид является невосстанавливающим, т.к. не будет идти реакция серебряного зеркала (восстановление серебра, окисление дисахарида, соответственно) ввиду невозможности образования линейной формы дисахарида. Примером такого дисахарида является сахароза. 19 1 9 Если дисахарид образован путем взаимодействия полуацетального гидроксила одного моносахарида и другого спиртового гидроксила второго моносахарида, то такой дисахарид является восстанавливающим, то есть будет идти реакция серебряного зеркала, т.к. остается свободный полуацетальный гидроксил, благодаря которому возможно образование открытой линейной формы дисахарида. Примером такого дисахарида является мальтоза, которая вступает в реакции как по циклической форме: так и по открытой форме. Так, мальтоза окисляется слабыми окислителями: Из полисахаридов состоит большая часть сухой массы высших наземных растений и водорослей. Самый распространенный полисахарид — целлюлоза (клетчатка). Ее линейные молекулы построены из остатков глюкозы. Из этого полисахарида состоят клеточные стенки растений. Ежегодно на нашей планете образуется около 100 млрд. т целлюлозы, что составляет 1/4 часть от общей массы синтезируемого «живого вещества». Целлюлозу используют для производства бумаги, вискозного шелка, целлофана. Текстильная промышленность перерабатывает целлюлозные волокна: хлопок, лен. Широко применяются эфиры целлюлозы. К полисахаридам относятся также крахмал – резервный полисахарид растений, гликоген - резервный полисахарид животных. Эти сложные углеводы также состоят из остатков глюкозы. У рыб содержание гликогена настолько незначительно (до 0,6%) по сравнению с содержанием белков и липидов, что обычно при определении общего химического состава мяса рыбы гликоген в расчет не принимается. Биологические функции углеводов. Углеводы занимают очень важное место в питании человека и животных. На долю углеводов в условиях умеренного климата приходится около 60—70% пищевого рациона человека. Организм человека и животных неспособен синтезировать углеводы из неорганических веществ и получает их с различными пищевыми продуктами, главным образом растительного происхождения. Растения, напротив, синтезируют углеводы из углекислоты и воды в результате фотосинтеза, используя энергию солнечных лучей. В питании человека основным углеводом, имеющим питательную ценность, является крахмал. Большим содержанием крахмала отличаются зерна пшеницы, ржи, ячменя, овса, риса, кукурузы, а также клубни картофеля. Важнейшим углеводом с физиологической точки зрения является глюкоза; она встречается во всех тканях человека и животных и в определенных количествах всегда содержится в крови. Окисление глюкозы и гликогена в тканях в конечном счете и является одним из основных источников энергии, необходимой организму для осуществления разнообразных функций. К наиболее важным функциям углеводов относятся: энергетическая, опорная, защитно-механическая, связующая (структурная), гидроосмотическая и ионрегулирующая, кофакторная. Присоединение углевода к белку (при этом образуются сложные белки гликопротеины) придает белку антифризные свойства. Гликопротеины, содержащиеся в плазме крови полярных рыб, снижают температуру замерзания жидкостей тела до – 2,0-2,1оС. Морская вода замерзает при температуре -1,5оС. Таким образом, эти сложные белки защищают от замерзания гидробионтов в условиях, когда в окружающей морской воде плавают мельчайшие кристаллики льда, способные проникать через кожные покровы и инициировать кристаллизацию жидкостей тела. Вопросы для самоконтроля к главе 7 «Углеводы» 1. Дайте определение углеводам. 2. Перечислите функции углеводов. 3. Как классифицируются углеводы? 4. Что понимают под восстанавливающими свойствами углеводов? 5. Приведите примеры реакций по открытой таутомерной форме глюкозы, по циклической таутомерной форме. 20 2 0 Глава 8 ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ. ОБМЕН УГЛЕВОДОВ Обмен веществ и энергии - это совокупность физических, химических и физиологических процессов превращения веществ и энергии в живых организмах, а также обмен веществами и энергией между организмом и окружающей средой. Внутренний обмен – это совокупность реакций, которые протекают в строго определенной последовательности и регулируются множеством генетических и химических механизмов. Метаболизм можно разделить на два взаимосвязанных, но разнонаправленных процесса: анаболизм (ассимиляция) и катаболизм (диссимиляция). Анаболизм - это совокупность процессов биосинтеза органических веществ (компонентов клетки и других структур органов и тканей). Он обеспечивает рост, развитие, обновление биологических структур, а также накопление энергии (синтез макроэргических соединений). Макроэргические соединения – это соединения, содержащие макроэргическую связь ковалентную связь, при гидролизе которой выделяется не менее 30 кДж/моль энергии. Эта связь обозначается знаком ~. Универсальным аккумулятором энергии в организме является АТФ (Рис. 5). Катаболизм - это совокупность процессов расщепления сложных молекул до более простых веществ с использованием части из них в качестве субстратов для биосинтеза и расщеплением другой части до конечных продуктов метаболизма с образованием энергии. К конечным продуктам метаболизма относятся вода (у человека примерно 350 мл в день), двуокись углерода (около 230 мл/мин), окись углерода (0,007 мл/мин), мочевина (около 30 г/день), а также другие вещества, содержащие азот (примерно б г/день). Катаболизм обеспечивает извлечение химической энергии из содержащихся в пище молекул и использование этой энергии на обеспечение необходимых функций. Процессы анаболизма и катаболизма находятся в организме в состоянии динамического равновесия. Преобладание анаболических процессов над катаболическими приводит к росту, накоплению массы тканей, а преобладание катаболических процессов ведет к частичному разрушению тканевых структур. Состояние равновесного или неравновесного соотношения анаболизма и катаболизма зависит от возраста (в детском возрасте преобладает анаболизм, у взрослых обычно наблюдается равновесие, в старческом возрасте преобладает катаболизм), состояния здоровья, выполняемой организмом физической или психоэмоциональной нагрузки. Источником химической энергии, используемым организмом для выполнения всех видов работ является энергия химической связи. Высвобождение энергии осуществляется в результате окислительно-восстановительного распада углеводов, жиров, белков. Часть этой энергии затрачивается на синтез АТФ - аккумулятора энергии в организме. В ходе извлечения энергии из различных субстратов можно условно выделить три фазы. Первая фаза — подготовительная. Она необходима для перевода биополимеров, поступающих с пищей или находящихся внутри клетки, в удобную для извлечения энергии форму — мономеры. Осуществляется эта фаза с помощью гидролаз в кишечнике или внутри клетки. Энергетической ценности эта фаза не представляет, так как освобождается лишь до 1% энергии субстратов, но и она рассеивается в форме теплоты. Вторая фаза — частичный распад мономеров до ключевых промежуточных продуктов, например, щавелевоуксусной кислоты, 2-оксоглутарата. Для нее характерно частичное (до 20%) освобождение энергии, заключенной в исходных субстратах, происходящее в анаэробных условиях, т.е. без кислорода. Третья фаза — окончательный распад веществ до СО2 и Н2O с участием кислорода. Эта фаза — аэробного биологического окисления веществ, протекает с полным освобождением энергии. Примерно 80% всей энергии химических связей веществ освобождается в данной фазе. Биологическое окисление органических веществ похоже во многом на сжигание топлива в костре или топке. При биологическом окислении органические соединения сгорают, и конечными продуктами являются также вода и углекислый газ, но горение это происходит медленно. Высвобождающаяся энергия также постепенно запасается в виде химических связей синтезируемых соединений. Некоторая ее часть рассеивается в клетках, поддерживая необходимую для жизнедеятельности температуру. Синтез АТФ происходит главным образом в митохондриях (у растений еще и в хлоропластах) и обеспечивается в основном энергией, выделяющейся при расщеплении глюкозы, но могут использоваться и другие простые органические соединения — сахара, жирные кислоты и пр. ОБМЕН УГЛЕВОДОВ Переваривание и всасывание углеводов В сутки взрослый человек при сбалансированном питании получает около 500 граммов углеводов в основном в виде полисахаридов, переваривание которых начинается уже в ротовой полости под действием фермента - -амилазы слюны, который расщепляет -1,4-гликозидные связи в молекулах крахмала и гликогена: 21 2 1 В отличие от линейной структуры одной из фракций крахмала, амилозы, в составе которой только 1,4-гликозидные связи, молекулы другой фракции, амилопектина, а также молекулы гликогена разветвлены. Связи в точках ветвления - 1,6--гликозидные. Потенциально -амилаза слюны в ротовой полости способна расщепить пищевой крахмал или гликоген до дисахаридов мальтозы и изомальтозы. Это можно подтвердить, подержав длительное время во рту кусочек несладкого хлеба или булки. Через некоторое время можно почувствовать сладкий вкус, придаваемый образовавшейся мальтозой. Но в реальных условиях пища находится в ротовой полости не слишком длительное время и мальтоза не образуется. В этом случае -амилаза слюны успевает расщепить только некоторые 1,4--гликозидные связи, и образуются промежуточные продукты расщепления - декстрины, представляющие из себя полисахаридные фрагменты различной протяженности. В желудке углеводы не перевариваются, т.к. в кислой среде полости желудка амилаза теряет свою активность. Переваривание углеводов возобновляется в тонком кишечнике, где имеется слабощелочная среда, оптимальная для панкреатической -амилазы (она образуется в поджелудочной железе), которая завершает расщепление полисахаридов и олигосахаридов до дисахарида мальтозы. Дисахарид мальтоза и остальные дисахариды, поступившие с пищей, расщепляются ферментами пристеночного переваривания углеводов до моносахаридов. Эти ферменты выделяются слизистой оболочкой кишечника в составе кишечного сока. В ротовой полости рыб, как и других видов животных, нет слюнных желез, а слизь, которая вырабатывается железистыми клетками ротовой полости, не содержит пищеварительных ферментов. Гидролиз полисахаридов до простых углеводов, главным образом глюкозы, у рыб протекает в кишечнике. После всасывания глюкоза по системе воротной вены поступает в печень. В печени основное количество глюкозы идет на синтез гликогена, а остальная глюкоза идёт в общий кровоток для питания других клеток. Так происходит после принятия пищи, в состоянии "натощак" (вне приёма пищи) гликоген в печени постепенно распадается до глюкозы, и глюкоза из печени уходит в общий кровоток к другим тканям. Эти механизмы поддерживают концентрацию глюкозы в крови на постоянном уровне: 3.9 - 6.1 ммоль/л. Под действием инсулина (пептидного гормона, который образуется в поджелудочной железе) глюкоза проникает в клетки тканей, где фосфорилируется за счёт АТФ под действием фермента гексокиназы. Тем самым глюкоза активируется к дальнейшим превращениям, а также не выходит обратно из клетки. После образования глюкозо-6-фосфата начинается разветвление дальнейших путей метаболизма глюкозы. Таких главных путей три. 1.Синтез гликогена. 2. Дихотомический путь (непрямое окисление глюкозы). 3. Апотомический (прямое окисление глюкозы или пентозофосфатный цикл). 4. Различные виды брожения (характерно для микроорганизмов) 22 2 2 Синтез и распад гликогена. Синтез гликогена протекает не во всех тканях, а только в печени, мышцах и в лейкоцитах. Молекула гликогена синтезируется не с "нуля", а происходит постепенное удлинение уже имеющегося кусочка цепи: "затравки". И при распаде гликогена никогда не происходит полного разрушения его молекул. Для включения одного остатка глюкозы в молекулу гликогена клетка расходует 2 молекулы АТФ. При распаде гликогена эта АТФ не регенерирует, а освобождается только Фн (неорганический фосфат, ортофосфорная кислота). Гликоген, как резерв глюкозы, накапливается в клетках во время пищеварения. Расщепление гликогена в печени или его мобилизация осуществляется при участии фермента гликогенфосфорилазы часто называемой просто фосфорилазой. Этот фермент относится к классу трансфераз, поскольку суть происходящего заключается в переносе остатка глюкозы с невосстанавливающего конца гликогена на ортофосфорную кислоту (неорганический фосфат). Заметим, что расщепление гликогена до глюкозы не нуждается в дополнительном притоке энергии. ДИХОТОМИЧЕСКИЙ ПУТЬ РАСПАДА ГЛЮКОЗЫ Это главный путь распада углеводов до конечных продуктов. Так распадается 70-75% глюкозы, которая поступает в клетку. Во многих клетках это - единственный путь. Это самый длинный путь распада углеводов, который начинается с гликолиза. Гликолиз (греч. glykys сладкий + lysis расщепление)- анаэробное окисление глюкозы до молочной кислоты (неполное окисление глюкозы) - протекает в цитоплазме. Рассмотрим его основные этапы. Бескислородный гликолиз представляет собой сложный многоступенчатый процесс из десяти последовательных реакций. Каждая реакция катализируется специальным ферментом. В итоге, как правило, глюкоза окисляется не до молочной кислоты, а только до пировиноградной кислоты (ПВК): С6Н12О6(глюкоза) + 2Н3РО4 + 2АДФ = ПВК + 2АТФ + 2Н2О У молочнокислых бактерий и грибков, применяемых для приготовления кислого молока, простокваши, кефира, а также при силосовании кормов в животноводстве, две молекулы ПВК, приобретая атомы водорода, восстанавливаются в молочную кислоту С3Н6О3. Процесс превращения ПВК в клетках микроорганизмов и растений в устойчивые конечные продукты называют брожением. Так, дрожжевые грибки расщепляют ПВК на этиловый спирт и углекислый газ. Этот процесс, называемый спиртовым брожением, используют для приготовления кваса, пива и вина. Брожение других микроорганизмов завершается образованием ацетона, уксусной кислоты и т.д. Энергетический выход при гликолизе составляет две молекулы АТФ (четыре молекулы АТФ образуется путем субстратного фосфорилирования, две молекулы АТФ расходуются на активирование). Высокоэнергетические связи АТФ запасают 40% этой величины. Остальные 60% рассеиваются в виде тепла. Суть субстратного фосфорилирования заключается в том, что АТФ образуется путем фосфорилирования АДФ (присоединения к АДФ остатка фосфорной кислоты) за счет фосфорильной группы субстрата, содержащего макроэргическую связь, например, 1,3-дифосфоглицериновой кислоты : Основной выход энергии и молекул АТФ происходит на, кислородном этапе гликолиза, называемом еще аэробным дыханием, который протекает в митохондриях. Начинается он с окислительного декарбоксилирования пирувата (ПВК), ускоряемого комплексом ферментов - пируватдегидрогеназным комплексом, при этом образуется ацетил-коэнзим А (АцКоА) - Ко-энзим А производное уксусной кислоты. Ацетил-КоА вступает в цикл Кребса (цикл лимонной кислоты, цикл трикарбоновых кислот (ЦТК)), где полностью окисляется до углекислого газа и воды. АцКоА, вступающий в ЦТК, образуется не только из углеводов, но и из жиров и аминокислот. Следовательно, ЦТК - это конечный "котёл" для сжигания ацетильных остатков, образующихся из углеводов, жиров и белков. ЦТК объединяет все метаболиты, образующиеся при распаде углеводов, жиров и белков. В процессе окисления образуются сложные молекулярные соединения – восстановленные формы кофакторов (НАД, ФАД). Работа цикла Кребса сопряжена с функционированием дыхательной цепи. При этом образуется 12 АТФ в расчете на молекулу АцКоА, вступившую в цикл. Если рассчитать на 1 молекулу глюкозы, то образуется 24 АТФ. Дыхательная цепь (электронтранспортная цепь) - совокупность последовательных окислительно-восстановительных реакций, в ходе которых происходит многоступенчатый перенос электронов от восстановленных форм кофакторов (систем НАД, ФАД) через цепь промежуточных переносчиков в конечном итоге на кислород (Рис.10). 23 2 3 Рис.10. Схема дыхательной цепи. Каждый промежуточный переносчик (коэнзим Q (KoQ), цитохромы) вначале выступает в роли акцептора электронов и протонов и из окисленного состояния переходит в восстановленную форму. Затем он передает электрон следующему переносчику и снова возвращается в окисленное состояние. На последней стадии переносчик передает электроны кислороду, который затем восстанавливается до воды. Дыхательная цепь локализована во внутренней мембране митохондрий. Значение цепи биологического окисления заключается в том, что электроны, переходя от одного переносчика на другой, постепенно опускаются с более высокого на более низкий энергетический уровень, постепенно теряя при этом всю заключенную в них энергию, которая составляет в среднем 2377,2 кДж/моль (56,6 ккал/моль). Освободившаяся энергия частично рассеивается в виде тепла, а большая часть идет на образование АТФ. Если первичным акцептором водорода является НАД, то образуется три молекулы АТФ, если же ФАД,— то две молекулы АТФ. Такой путь синтеза АТФ носит название окислительного фосфорилирования, т. е. АТФ образуется путем присоединения к АДФ ортофосфорной кислоты с использованием энергии, освободившейся при окислении различных веществ. Из каждой молекулы глюкозы образуется 38 молекул АТФ. При интенсивной физической работе бывают ситуации, когда в клетку не успевает поступать кислород. При этом распад углеводов временно протекает в анаэробных условиях и гликолиз идет до конца, до молочной кислоты — токсичного для нервных и мышечных клеток соединения. Последнюю реакцию гликолиза ускоряет фермент лактатдегидрогеназа, содержащий в качестве небелковой части систему НАД (См. Рис.4). Уравнение протекающей реакции: При сохранении кровообращения этот наработанный в клетках лактат выносится кровью и основная его часть метаболизируется в печени или в сердечной мышце. В миокарде лактат окисляется до углекислого газа и воды; в печени же лишь примерно 1/5 поступающего лактата подвергается окислению до конечных продуктов, а 4/5 - ресинтезируются в глюкозу в ходе интенсивно идущего в печени процесса глюконеогенеза. Глюконеогенез представляет собой обращение процесса гликолиза, за исключением трех необратимых реакций. За сутки в организме человека за счет глюконеогенеза может быть синтезировано до 100-120 г глюкозы, которая в условиях дефицита углеводов в пище в первую очередь идет на обеспечение энергетики клеток головного мозга. Кроме того, глюкоза служит единственным видом энергетического топлива в мышцах в условиях гипоксии, её окисление является также единственным источником энергии для эритроцитов. Прямой путь окисления глюкозы. Прямой путь окисления глюкозы - пентозофосфатный цикл, преобладает в клетках тех органов и тканей, где интенсивно синтезируются жиры - в эритроцитах, половых железах, коре надпочечников, печени. Особенность этого процесса - образование пентоз, накопление восстановленной формы фосфорилированной системы НАД – НАДФ∙Н2 - кофермента дегидрогеназ, участвующих в синтезе нуклеиновых кислот, холестерина, жирных кислот, активировании фолиевой кислоты и образовании АТФ. Последовательная цепь реакций пентозного цикла приводит к образованию рибулозо-5-фосфата, который идет на построение нуклеотидов или серией обратных реакций преобразуется в гексозофосфаты с использованием их в гликолитическом цикле. Вопросы для самоконтроля к главе 8 «Обмен веществ и энергии. Обмен углеводов» 1. Дайте определение понятиям «обмен веществ», «катаболизм», «анаболизм», «свободная энергия». 2. Дайте определение понятиям: «макроэргическая связь», «макроэргическое соединение». 3. Приведите примеры макроэргических соединений. 4. Дайте характеристику этапов освобождения энергии питательных веществ. 5. Напишите формулу ацетил-КоА и укажите на его значение. 6. В чем заключается биологическое значение цикла Кребса? 7. Что происходит в дыхательной цепи? 8. Что такое субстратное фосфорилирование? 9.Что такое окислительное фосфорилирование? 10. При непосредственном соединении водорода и кислорода образуется гремучий газ, что сопровождается взрывом. Почему этого не происходит в живой клетке? Глава 9 ЛИПИДЫ К липидам относятся имеющие биологическое происхождение вещества самой различной химической природы, большинство из которых не растворимы в воде, но растворимы в органических растворителях (ацетоне, хлороформе, этиловом спирте). Липиды выполняют важные биологические функции: энергетическую (при окислении 1 г жира выделяется 38,9 кДж энергии, это почти в 2,5 раза больше, чем при сгорании углеводов, белков); структурную (они являются главными компонентами биомембран); резервную, тепло-,электроизолирующую, амортизирующую и др. Липиды делятся на простые (одно-, двухкомпонентные) и сложные (трех- и более компонентные). К простым липидам организма человека относятся свободные жирные кислоты, жиры, стерины. К сложным – фосфолипиды, гликолипиды. 24 2 4 Жиры представляют собой сложные эфиры глицерина и высших насыщенных (пальмитиновой С 15Н31СООН, стеариновой С17Н35СООН) или ненасыщенных (олеиновой С17Н33СООН, линолевой С17Н31СООН, линоленовой С17Н29СООН, арахидоновой С19Н31СООН) жирных кислот: Соотношение предельных и непредельных карбоновых кислот в составе жира определяет его консистенцию при обычных условиях. Если в составе жира преобладают непредельные кислоты, то жир жидкий (масло), если преобладают предельные, то жир твердый. Жиры рыб богаты полиеновыми кислотами, (полиненасыщенными, содержащими несколько двойных связей). В жире рыб, обитающих в холодных районах, преобладают ненасыщенные жирные кислоты, поэтому они имеют более низкую температуру плавления. Наиболее ненасыщенными являются жиры сельдевых рыб. Химические свойства жиров определяются химическими свойствами входящих в них жирных кислот. Ненасыщенные жирные кислоты являются более реакционноспособными соединениями (в связи с наличием в молекуле двойных связей), чем насыщенные. Они могут присоединять водород по месту двойных связей. При этом масла превращаются в твердые жиры. Этот процесс называется гидрогенизацией и используется в промышленности при изготовлении маргарина. При действии на жиры водных растворов кислот или щелочей происходит гидролиз жира - расщепление эфирной связи, кислоты и щелочи выступают в качестве катализатора. В результате этого процесса образуется глицерин и свободные кислоты, которые могут реагировать со щелочами, образуя соли, называемые мылами. В этом случае говорят об омылении жиров. О количестве содержащихся в жире свободных и связанных с молекулой глицерина жирных кислот судят по числу омыления — количеству миллиграммов КОН, которое необходимо для полного омыления 1 г жира. Содержание в жире свободных жирных кислот характеризуется таким показателем, как кислотное число — количество миллиграммов КОН, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира. Количество свободных жирных кислот возрастает в ходе гидролиза жира, а также с увеличением продолжительности его хранения. Известно, что при длительном хранении жира на воздухе и на свету он прогоркает, приобретая неприятные вкус и запах. Прогоркание жира начинается с окисления ненасыщенных жирных кислот кислородом воздуха. При этом кислород присоединяется по месту двойных связей, образуя перекиси: О О СН2 — СН = СН — СН2 — + О2 — СН2 — СН СН — СН2 — Образовавшиеся перекиси разлагаются до короткоцепочечных альдегидов, кетонов, придающих жиру неприятные запах и вкус. Растительные масла с высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот прогоркают быстрее, чем твердые жиры животного происхождения. Без доступа кислорода жиры могут сохраняться длительное время (в древних гробницах обнаружены жиры, пролежавшие без изменений тысячелетия). В настоящее время для предотвращения окислительного прогоркания жиров к ним добавляют антиокислители. Липиды рыб представлены главным образом триглицеридами, доля фосфолипидов и стеринов незначительна. Содержание жира в теле рыб (жирность) тесно связано с условиями и характером питания в течение года, с ростом, возрастом и полом рыб. По содержанию жира в мышцах рыб подразделяют на четыре группы: тощих (до 0,2 – 1,2 % жира – щука, бычки, навага, треска, окунь, судак), среднежирных (1,5–4,5 % – вобла, камбала,лещ, сазан), жирных (5 –15% – лососи, осетровые, скумбрия) и особожирных (более 15 % – угорь, минога, хамса). Количество жира в мясе рыб непрерывно увеличивается до наступления половой зрелости. Во время преднерестовых миграций эти гидробионты почти полностью теряют запасы жира, уменьшается содержание белков, при этом количество воды в мясе возрастает. Значение запасов жира особенно возрастает у рыб, не питающихся зимой, в частности карповых (карп, карась). В период зимнего голодания жир служит источником энергии, создает тепловую защиту внутренних органов и тканей и таким образом, регулирует тепловой обмен при низких температурах. В разных частях и органах тела рыбы жир накапливается и расходуется неравномерно в зависимости от видовой специфики, условий питания. При недостаточном питании линейный рост прекращается, но накопление жира продолжается, поэтому даже в неблагоприятных условиях у взрослых рыб идет развитие гонад. Естественный жир, получаемый из тканей и органов путем экстрагирования неполярными органическими растворителями, представляет собой сложную смесь различных триглицеридов и веществ, составляющих фракцию неомыляемых. жиров. В эту фракцию входят углеводороды, каротиноиды, стероиды, витамины, пигменты. Хотя количество этих веществ обычно не велико, однако, присутствие их в жире сильно влияет на некоторые его свойства и пищевую ценность. К группе стеринов относится холестерин, который является предшественником желчных кислот, кортикостероидных и половых гормонов, витамина D, повышает устойчивость эритроцитов к гемолизу, укрепляя мембраны клеток. Особенно много холестерина в мозгу, надпочечниках, крови и стенках сосудов. По строению холестерин представляет собой высокомолекулярный одноатомный ненасыщенный спирт: 25 2 5 К стеринам относятся также основные компоненты желчи - желчные кислоты, которые образуются в печени и выделяются с желчью в свободном виде или в виде парных соединений с аминокислотами - глицином или таурином: Молекулы этих соединений дифильны, т.е. имеют как гидрофильную, так и гидрофобную части. Желчные кислоты являются поверхностно-активными веществами (ПАВ) и принимают участие в эмульгировании жиров, снижая поверхностное натяжение жировых капель, а также в активировании липазы (фермента, расщепляющего жиры) и всасывании жирных кислот. Необходимо отметить, что состав желчных кислот рыб отличается большим разнообразием. Огромную роль в жизнедеятельности организма играют сложные липиды — фосфолипиды (фосфатиды). Они являются основными компонентами мембран клеток и субклеточных органелл, составляют большую часть тканей мозга, нервов, печени, сердца, входят в состав белково-липидных комплексов и участвуют в образовании липидной оболочки клеток. Фосфолипиды необходимы для нормального функционирования центральной нервной системы, участвуют в процессах биосинтеза белка, активации протромбина, транспорта липидов и жирорастворимых витаминов в крови и лимфе и т. д. В качестве примера фосфолипидов рассмотрим глицерофосфолипиды – это сложные эфиры, в состав которых входят глицерин, две молекулы жирной кислоты, фосфорная кислота и азотистые основания. Фосфатидилхолин (лецитины), содержит аминоспирт холин, фосфатидилэтаноламин (кефалины) содержит аминоспирт этаноламин (коламин). Эти фосфолипиды находятся в каждой клетке живого организма, но особенно много их в нервной ткани. Лецитин под действием ферментов фосфолипаз расщепляется на глицерин, жирные кислоты, фосфорную кислоту и холин: 26 2 6 Фосфолипиды входят в состав биомембран, т.е. выполняют структурную функцию. Молекулы этих соединений дифильны, т.е. содержат как гидрофобные группы (углеводородные радикалы высших жирных кислот), так и гидрофильные, эти вещества относятся к ПАВ. Схематично строение фосфолипидов записывается следующим образом: гидрофильную (полярную) часть обозначают в виде кружочка; гидрофобные углеводородные хвосты - в виде волнистых линий. В биомембранах они образуют фосфолипидный бислой (Рис. 11), который устроен таким образом: полярные головки липидов обращены в сторону водной среды, а гидрофобные хвосты составляют внутреннюю область, что обуславливает полупроницаемость мембран; замкнутые бимолекулярные слои непроницаемы для полярных соединений. Рис.11. Фосфолипидный бислой мембраны Биологические мембраны играют важную роль в жизнедеятельности клетки и всего организма в целом. Они отделяют клетки от окружающей среды, тем самым обуславливая их индивидуальность. Основными компонентами мембран, кроме липидов, являются белки, в них имеются также углеводные компоненты, связанные с липидами и белками. Мембраны являются также и активными биологическими системами, отвечающими за такие процессы, как селективный транспорт веществ внутрь и наружу клетки, связывание гормонов и других регуляторных молекул, передача электрических импульсов, синтез АТФ. Вопросы для самоконтроля к главе 9 «Липиды» 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Что такое липиды? Как липиды классифицируются? К какому классу органических соединений относятся жиры? Назовите основные функции жиров Что такое омыление жира? Что такое прогоркание жира? Что такое желчные кислоты? В чем состоит структурная функция фосфолипидов? Чем обьясняется полупроницаемость мембран? Глава 10 ОБМЕН ЖИРОВ Внешний обмен жиров Переваривание жиров в желудочно-кишечном тракте является гидролитическим процессом, идущим с участием фермента липазы. Происходит это преимущественно в тонком кишечнике; под действием липазы, содержащейся в соке поджелудочной железы и в кишечном соке, жиры подвергаются гидролизу, с образованием глицерина и жирных кислот: 27 2 7 Продукты расщепления липидов всасываются в кишечнике. Хорошо растворимый в воде глицерин и растворимые в воде жирные кислоты всасывается легко, а нерастворимые в воде жирные кислоты всасываются только в соединении с желчными кислотами в виде холеинового комплекса. В клетках стенки кишечника холеиновый комплекс распадается, освободившиеся желчные кислоты через систему воротной вены поступают снова в печень, а жирные кислоты в стенке кишечника соединяются с глицерином и образуют жир, специфичный для данного организма. Из клеток кишечника этот жир переходит в лимфатическую систему и частично в кровь, а затем в печень и другие органы, где подвергается разнообразным превращениям Большое значение в процессе переваривания жиров имеет желчь, содержащая соли желчных кислот, которые воздействуя на жиры и масла, переводят их в чрезвычайно тонкую эмульсию, диаметр частиц которой не превышает 0,5 мк. Эмульгирование жира приводит к значительному увеличению поверхности соприкосновения жира с водным раствором липазы, что облегчает ферментативный гидролиз жира. Кроме того, соли желчных кислот активируют малоактивную липазу сока поджелудочной железы, переводя ее в активное состояние. Окисление жирных кислот Окисление жирных кислот наряду с окислением углеводов является важным биоэнергетическим процессом. Остатки жирных кислот длиной до 18 углеродных атомов входят в состав жиров, которые являются важным энергетическим резервом живых организмов, и в состав важнейших фосфолипидов, из которых построены многочисленные мембраны. Жирные кислоты образуются при гидролизе сложноэфирных связей этих соединений внутриклеточными липазами и фосфолипазами или аналогичными ферментами в пищеварительном тракте высших организмов. У высших организмов окисление жирных кислот происходит преимущественно в матриксе митохондрий. Все стадии окислительной деструкции жирных кислот протекают с ацильными остатками, связанными тиоэфирной связью с коферментом А. Этим процессам предшествует образование ацилкофермента А из жирной кислоты и кофермента А, происходящее сопряженно с расщеплением АТФ до АМФ и неорганического пирофосфата (ФФн): После этого начинается цепочка превращений, приводящая к ступенчатой деградации углеводородной цепи (βокисление). Каждый цикл такой деградации приводит к укорочению цепи на два углеродных атома, при этом образуется ацетил-КоА и КоА-производное укороченной на два углеродных атома жирной кислоты. На последней стадии, если кислота содержит четное число атомов углерода, образуется две молекулы ацетилкофермента А: C o A S – C O C H C O C H C o A S H 2 3+ 2 C o A S – C O C H 3 Которые вступают в цикл Кребса и окисляются до углекислого газа и воды. Калорийность жиров в качестве продуктов питания выше, чем углеводов. Синтез жиров Для синтеза нейтрального жира необходим глицерин в активной форме - глицерол-3-фосфат (фосфоглицерин) и жирные кислоты в активной форме – Ацил-КоА. Жир может синтезироваться как из продуктов распада жира, так и из углеводов. Синтез эндогенного жира из углеводов протекает в печени и в жировой ткани. Синтез жирных кислот. Реакции синтеза жирных кислот до 16 углеродных атомов принципиально отличаются от реакций, обратных окислению Синтез жирных кислот идет в цитоплазме на мембранах эндоплазматического ретикулума путем постепенного удлинения ацетил-КоА - коэнзим А – производного уксусной кислоты на 2 углеродных атома за каждый оборот цикла. Ацетил-КоА в этом процессе служит затравкой, т.е. используется только один раз - в начале. Наращивание углеродной цепи (на два углеродных атома в ходе каждого оборота цикла) идет за счет производного ацетил-КоА - малонила-КоА, который образуется в реакции: 28 2 8 Такой путь синтеза жирных кислот объясняет распространенность в живой природе жирных кислот с четным числом углеродных атомов. Удлинение высших жирных кислот, содержащих более 16 углеродных атомов, идёт путём обращения реакций окисления. В ходе синтеза жирных кислот промежуточные продукты связаны с особым ацил-переносящим белком (АПБ). Это сложный белок, его небелковая часть похожа по строению на КоА. В качестве восстановителя используется НАДФ*Н 2 – восстановленная форма фосфорилированной системы НАД. Вопросы для самоконтроля к главе 10 «Обмен жиров» 1.Какие ферменты участвуют в переваривании жиров? 2. Какова роль желчных кислот в переваривании жиров? 3. Как происходит активирование жирных кислот? 4. В чем суть - окисления жирных кислот? 5. Как происходит биосинтез жирных кислот? С чем связана распространенность в природе высших кислот с четным числом углеродных атомов? 6. Какова роль ацетил-КоА в биосинтезе жирных кислот? ГЛАВА 11 ОБМЕН БЕЛКОВ Переваривание белков происходит в желудочно-кишечном тракте под действием целого комплекса гидролаз, которые гидролитически (т.е. с участием воды) расщепляют пептидные связи, поэтому являются пептидазами (протеиназами). Гидролиз белка начинается в желудке под действием пепсина и гастриксина, которые образуются в неактивной форме, в виде проферментов – пепсиногена и гастриксиногена. Активирование данных ферментов происходит в кислой среде, создаваемой соляной кислотой желудочного сока. Пепсин легко гидролизует белки мышц, а также яичный белок и казеин. Слабее проявляется протеолитическое действие пепсина на белки соединительной ткани (коллаген, эластин). Не расщепляются пепсином протамины (белки, входящие в состав хроматина) и кератины (белки шерсти и волос). Биохимические особенности пептидаз рыб зависят от вида рыбы, условий ее обитания, характера питания, физиологического состояния и др. Пепсин действует в сильно кислой среде (рН =1,0—1,5), гастриксин – в менее кислой, оптимум рН для него составляет 3,5—4,5. Данные гидролазы расщепляют не все пептидные связи, а только между определенными аминокислотами. Таким образом, в желудке образуются не отдельные аминокислоты, а фрагменты полипептидов. Дальнейший гидролиз протекает в тонком кишечнике под действием нескольких гидролаз, поступающих с пищеварительным соком поджелудочной железы и собственно кишечным соком (трипсин, химотрипсин, эластаза, аминопептидаза, карбоксипептидаза). Некоторые рыбы не имеют желудка, например, карповые, многие бычки. Таким образом, у этих рыб пепсин отсутствует и переваривание белков пищи происходит в кишечнике. Образовавшиеся при гидролизе белка аминокислоты всасываются стенками кишечника, поступают в кровь и разносятся по всему организму. Всосавшиеся аминокислоты в первую очередь используются в качестве строительного материала для сиитеза специфических тканевых белков, ферментов и биологически активных соединений. Другая часть аминокислот вместе с образующимися в организме аминокислотами — продуктами расщепления тканевых белков подвергается различным превращениям с образованием конечных продуктов белкового обмена и освобождением энергии. Наиболее распространенными и важными реакциями, в которых участвуют аминокислоты, являются трансаминирование (переаминирование), окислительное дезаминирование и декарбоксилированиее. Переаминирование представляет собой взаимопревращение α-аминокислоты и α -кетокислоты, катализируемое аминотрансферазой. Чаще всего в качестве а-кетокислоты используется а-кетоглутаровая кислота: 29 2 9 Окислительное дезаминирование аминокислот происходит в клетках печени и почек. В результате данной реакции образуются соответствующие α-кетокислоты и выделяется аммиак. Этот процесс катализирует дегидрогеназа, коферментом которой может быть как НАД, так и ФАД. Наиболее важной и распространенной является глугаматдегидрогеназа, катализирующая процесс: Декарбоксилирование аминокислот — важный метаболический процесс, в результате которого из аминокислот образуются биологически активные амины (биогенные амины). Декарбоксилазы аминокислот — сложные ферменты, коферментом которых является пиридоксальфосфат. Например, глутаматдекарбоксилаза ускоряет реакцию декарбоксилирования глутаминовой кислоты: Продукт этой реакции γ – аминомасляная кислота (ГАМК), как и глутаминовая кислота, относится к медиаторам нервного импульса, ГАМК ингибирует, глутаминовая кислота активирует передачу нервных импульсов. Декарбоксилирование гистидина приводит к образованию гистамина, который является медиатором и содержится в нервных клетках и тучных клетках. Особенно много его выделяется в очаге воспаления. Гистамин играет важную роль в проявлении аллергических реакций. Таким образом, конечными продуктами катаболизма аминокислот являются α-кетокислоты, амины, оксид углерода (IV), аммиак. Органические соединения вовлекаются в определенные метаболические процессы, углекислый газ выводится из организма. Аммиак крайне токсичен, особенно для центральной нервной системы, для клеток мозга, поэтому в организме существуют процессы, в которых происходит обезвреживание этого токсиканта. Прежде всего аммиак превращается в нетоксичное соединение и в таком виде переносится кровью в органы, где обезвреживается (печень, почки). Во многих тканях аммиак связывается с образованием глутамина. 30 3 0 У большинства животных, обитающих в воде, например, костистых рыб, аммиак является конечным продуктом распада и выводится из организма. Такие организмы называются аммониотелические. У таких животных нейтральный, нетоксичный глутамин переносится кровью в жабры, где содержится фермент глутаминаза, катализирующая гидролиз глугамина с образованием глутаминовой кислоты и аммиака. Так как аммиак хорошо растворим в воде, он быстро разбавляется и уносится током омывающей жабры воды. У большинства наземных животных аммиак обезвреживается путем образования мочевины - это полный амид угольной кислоты; их называют уреотелическими. Мочевина образуется в печени в цикле мочевины (орнитиновый цикл) поступает в кровь и через почки выводится из организма с мочой. У птиц, ящериц и змей аммиак обезвреживается путем образования мочевой кислоты, которая выводится из организма; такие организмы называются урикотелические. Некоторое количество аминокислот поступает в толстый кишечник, где подвергается гниению— распаду под действием микроорганизмов. При этом образуются зачастую ядовитые вещества, имеющие неприятный залах. Так, при гнилостном распаде триптофана образуются индол и скатол, при распаде цистеина — различные меркаптаны, тирозина — фенол и крезол и т. д. Продукты гниения белков также всасываются и поступают в кровь. После ряда биохимических превращений они обезвреживаются (главным, образом в печени) и затем выводятся из организма. Вопросы для самоконтроля к главе 11 «Обмен белков» 1.В чем особенность функционирования пепсина? 2.Что такое пепсиноген? 3. Почему при переваривании белков в желудке образуются не отдельные аминокислоты, а фрагменты белков, пептиды? 4. Какие пептидазы действуют в тонком кишечнике? 5. Каковы пути использования аминокислот после всасывания? 6. Какие процессы происходят при гниении белков? 7. Каковы пути обезвреживания аммиака живыми организмами? ПРАКТИКУМ Лабораторные работы, представленные в практикуме, позволяют учащимся закрепить изложенный в учебном пособии теоретический материал, освоить методические приемы лабораторных методов исследования. Лабораторные работы практикума распределены согласно темам основного теоретического курса биохимии ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ РАБОТЫ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Меры предосторожности при работе в лаборатории 1. Все опыты с ядовитыми, неприятно пахнущими веществами следует проводить только в вытяжном шкафу; с легко воспламеняющимися веществами - вдали от огня. 2. При нагревании растворов в пробирке, пробирку необходимо держать в наклонном положении, а не вертикально, отверстие пробирки направлять в сторону от себя и от соседа по рабочему столу. Особенно важно соблюдать это правило, когда нагреваемой жидкостью являются концентрированные кислоты или растворы щелочей. Рекомендуется эти опыты проводить в вытяжном шкафу. 3. Нельзя наклонять лицо над нагреваемой жидкостью во избежание попадания на него брызг. 4. Не следует вдыхать пахучие вещества, в том числе и выделяющиеся газы, близко наклоняясь к сосуду с этими веществами; нужно легким движением руки направить струю воздуха от отверстия сосуда к себе и осторожно вдохнуть. 5. При разбавлении концентрированных кислот, особенно серной; вливать кислоту в воду, а не наоборот. Оказание первой помощи в лаборатории 1. При попадании на кожу (рук, лица и т.д.) концентрированных кислот (серной, азотной, соляной, уксусной и т.д.) следует немедленно промывать сильной струей воды обожженное место в течение 3-5 мин, после чего наложить повязку из ваты, смоченной 1% раствором питьевой соды, или 3 % раствором перманганата калия. 2. При ожоге кожи растворами щелочей промывать водой обоженный участок кожи до исчезновения мылкости, после чего положить повязку, смоченную 1% уксусной кислотой. 3. При попадании брызг кислоты или щелочи в глаза немедленно промыть глаза большим количеством воды комнатной температуры, затем 2 % раствором борной кислоты (для нейтрализации щелочи), либо 2 % раствором гидрокарбоната натрия (для нейтрализации кислоты). После чего сейчас же обратится к врачу. 31 3 1 4. При термическом ожоге кожи, наложить повязку с мазью от ожогов. 5. При порезах стеклом рану промывают водой, очищают от осколков стекла и смазывают спиртовым раствором йода. Для предупреждения несчастных случаев необходимо соблюдать следующие основные правила техники безопасности при работе, в лаборатории: • работать только в халатах и защитных очках; • выполнять опыты в вытяжном шкафу; • перед тем как набрать какой-либо химический реактив, внимательно прочитать подпись на этикетке. • избегать контакта с любыми неорганическими и органическими реактивами. • неиспользованные химические реактивы нельзя возвращать в ту же склянку; • в лаборатории запрещено пить воду и принимать пищу Приступая к выполнению практических занятий, следует изучить теоретический материал по учебной литературе, внимательно ознакомиться с содержанием очередного практического занятия Прежде чем приступить к выполнению опыта, учащийся должен тщательно продумать эксперимент в целом, составить краткий план последовательно проводимых операций. Все приборы, в которых проводится тот или иной опыт, должны быть собраны компактно и целесообразно. Студенту в лаборатории отводится постоянное место (рабочий стол), и он обязан поддерживать его в полной чистоте и порядке. На рабочем столе должны находиться только те предметы, которые нужны в данное время для работы. Все работы, за небольшим исключением, выполняются студентом индивидуально. Необходимые для работы реактивы выставляются на полки, находящиеся над лабораторными столами. Исключение составляют концентрированные кислоты и пахучие вещества, которые хранятся в вытяжных шкафах. Студентам не разрешается оставлять реактивы на своих рабочих местах. Сухие реактивы необходимо брать чистым шпателем или специальной ложечкой. При наливании растворов из склянок следует держать последние таким образом, чтобы этикетка была повернута вверх (во избежание ее загрязнения). Крышки и пробки от реактивных банок и склянок, которые нельзя путать, следует класть на стол поверхностью, не соприкасающейся с реактивом. Если в руководстве не указано, какое количество вещества необходимо взять для проведения в пробирке того или иного опыта, предлагается брать сухое вещество в количестве, закрывающем дно пробирки, а раствор — не более 1/6 объема пробирки. Следует отметить, что при работе с малыми количествами вещества большинство операций (нагревание, охлаждение, фильтрование, высушивание и др.) требует значительно меньше труда и времени. Неизрасходованные реактивы нельзя высыпать (выливать) обратно в склянки, их надо сдавать лаборанту. Для приготовления водных растворов и ополаскивания вымытой стеклянной посуды следует пользоваться дистиллированной водой. Студент в лаборатории должен работать в халате. Категорически запрещается без разрешения преподавателя выполнять опыты, не описанные в руководстве. Студенты должны соблюдать правила пожарной безопасности и техники безопасности при пользовании реактивами в химической лаборатории. РАБОЧИЙ ЖУРНАЛ Все наблюдения и выводы по экспериментальной работе следует заносить в рабочий журнал, отражающий всю работу студента. На обложке или первой странице журнала должны быть написаны фамилия студента, его инициалы, номер группы и название практикума. Записи в журнале производят только ручкой, лаконично, аккуратно, непосредственно после проведения опыта. Запись должна содержать: 1. Дату выполнения работы. 2. Название темы и название опыта. 3. Последовательность проведения операций опыта 4. Ход работы. 5. Рисунок или схему используемого прибора. 6. Уравнения происходящих в опытах реакций. 7. Изменение окраски веществ, выделение и характер осадка. 8. Расчеты, проводимые при выполнении работы. 9. Ответы на поставленные в занятии вопросы. 10. Выводы. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1 ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ Присутствие белка можно обнаружить рядом ц в е т н ы х р е а к ц и й. При взаимодействии белка с отдельными химическими веществами возникают окрашенные продукты реакции. Образование их обусловлено наличием в молекуле белка той или иной аминокислоты или химической группировки. Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность установить белковую природу вещества и доказать присутствие некоторых аминокислот в различных природных белках. Некоторые из цветных реакций широко используются в биохимической практике для изучения структуры и аминокислотного состава белков, их количественного определения. 32 3 2 Различают универсальные цветные реакции, которые дают все белки, независимо от их аминокислотного состава – биуретовая и нингидриновая реакция. Остальные цветные реакции идут за счет радикалов аминокислот. Техника безопасности 1. Категорически запрещается отмеривать концентрированные кислоты и щелочи обыкновенными пипетками. Для отмеривания реактивов использовать мерные пробирки, цилиндры. 2. Будьте внимательны при наливании концентрированных кислот и щелочей! 3. В процессе нагревания постоянно перемешивайте жидкость, не допускайте выброса ее из пробирки. 4. Соблюдайте правила пожарной безопасности. Для качественного определения белков в растительных продуктах вначале готовят водную вытяжку. К одной части муки, помещенной в колбу, добавляют четыре части дистиллированной воды, хорошо взбалтывают и оставляют на некоторое время (желательно на 18-20ч) в прохладном месте. Смесь перемешивают и фильтруют вначале через 4 слоя марли или через вату, а затем – через складчатый бумажный фильтр. Яичный белок представляет собой смесь нескольких белков. Примерно 70% яичного белка составляет альбумин, который легко отделяется от глобулинов. При десятикратном разведении яичного белка дистиллированной водой глобулины выпадают в осадок, а альбумин остается в растворе. Чтобы отделить белок от желтка, осторожно проделывают отверстие в скорлупе яйца с двух концов и выливают белок в стакан емкостью 500 мл, затем в стакан добавляют 250 мл дистиллированной воды и содержимое перемешивают стеклянной палочкой с резиновым наконечником. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ (ПИОТРОВСКОГО). При добавлении к щелочному раствору белка раствора сернокислой меди жидкость приобретает красно-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание. Реакция обусловлена присутствием в белке пептидных связей, которые в щелочной среде присутствуют в лактимной таутомерной форме: OH O H CN CN лактамная лактимная которая с ионами меди образует окрашенный биуретовый комплекс. В избытке щелочи ОН-группы диссоциируют, в результате чего на кислороде появляется отрицательный заряд, наблюдается электростатическое взаимодействие с ионом меди, возникает солеобразная связь. Кроме того, ион меди образует дополнительные координационные связи с атомами азота за счет использования их неподеленных электронных пар. Схематично реакция может быть представлена в следующем виде: Н Н O R2 R4 + 2NaOH CuSO4 O Н 2N — CН — С — N — CH — С — N — CH — C — N — CH — C — N — CH... R1 O Н R3 O Н R5 полипептид R2 R4 OН OН Н 2N — CН — С = N — CH — С = N — CH — C = N — CH — C = N —CH... R1 OН R3 OН R5 иминольная форма полипептида R2 C = N CH C = N R1 CH О О Cu CH R3 NH2 . . . CH N = C CH N = C R5 ОNa R4 ОNa Биуретовый медный комплекс фиолетового цвета 33 3 3 Окраска биуретового комплекса зависит от количества медной соли в растворе и от структуры вещества, с которым координирован ион меди. Продукты распада белка –пептоны и полипептиды дают биуретовую реакцию с красным оттенком. Свое название биуретовая реакция получила от производного мочевины – биурета, который дает эту реакцию. Биурет образуется при нагревании мочевины с отщеплением от нее аммиака. мочевина биурет Реактивы: CuSO4 - 1% р-р. NaOH - 10% р-р. белок куриного яйца, растительные белки Х о д р а б о т ы . В 2 пробирки наливают: в одну – 5 капель раствора белка, 5 капель 10% раствора едкого натра и 1 каплю 1% раствора сернокислой меди, в другую –вместо 10% раствора едкого натра наливаете 5 капель дистиллированной воды. Что наблюдаете? Дайте объяснение. При малой концентрации белка в растворе биуретовую реакцию производят следующим образом. В пробирку наливают 20 капель 10% раствора едкого натра, добавляют 1-2 капли 1% раствора сернокислой меди и перемешивают. Затем набирают в пипетку разбавленный раствор белка и осторожно спускают его по стенке пробирки так, чтобы он наслаивался сверху и не смешивался со щелочным раствором сернокислой меди. На границе двух слоев жидкости образуется фиолетовое кольцо. НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ НА -АМИНОКИСЛОТЫ. Раствор белка при нагревании с разбавленным раствором нингидрина окрашивается в синий цвет. Реакция обусловлена наличием в белке остатков -аминокислот. При взаимодействии с нингидрином аминокислоты окисляются и распадаются с образованием аммиака, альдегида и угольной кислоты. Нингидрин восстанавливается и конденсируется с другой частицей нингидрина и аммиаком. В результате образуется продукт синего цвета. Реакция может быть представлена в следующем виде: 34 3 4 Х о д р а б о т ы . В 3 пробирки наливают: в одну –5 капель 1% раствора яичного белка, в другую -5 капель дистиллированной воды и добавляют около 0,1 г пшеничной муки, в третью-5 капель 0,1% раствора глицина. В каждую пробирку наливают по 2-3 капли 0,1% раствора нингидрина и кипятят. Через 1-2 минуты появляется розовое, красное, а затем синее окрашивание. При стоянии интенсивность окраски увеличивается. КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ НА ЦИКЛИЧЕСКИЕ АМИНОКИСЛОТЫ При нагревании растворов большинства белков с концентрированной азотной кислотой жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет, переходящий при подщелачивании в оранжевый. Реакция обусловлена присутствием в белке циклических аминокислот-фенилаланина, тирозина (п-оксифенилаланина) и триптофана (индолилаланина), которые при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образуют нитропроизводные желтого цвета (реакция нитрования). Последние при добавлении щелочи превращаются в соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет. H O — Н N О + 2 N а О Н O — — — C H — C H — C O O H 3 H C H — C H — C O O H 2 2 -2 Н О 2 N H N H 2 2 О = N O т и р о з и н ( ж е л т а я о к р а с к а ) — C H — C O O N a N a O — — C H 2 N H 2 О = N O ( о р а н ж е в а я о к р а с к а ) Белки, в которых циклические аминокислоты отсутствуют, не дают ксантопротеиновой реакции. Помимо белков данную реакцию дают многие более простые ароматические соединения, например фенол. Аналогично протекает реакция нитрования триптофана и фенилаланина (последний нитруется труднее). Реактивы: раствор яичного белка, раствор растительного белка, раствор желатины, р-р HNO3 конц. 30% р-р NaOH Х о д р а б о т ы . В 3 пробирки наливают: в первую-5 капель 1% раствора яичного белка, во вторую-5 капель раствора растительного белка, в третью-5 капель 1% раствора желатины. Во все пробирки добавляют по 2-3 капли концентрированной азотной кислоты и нагревают. В первой и второй пробирках жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет, в третьей получается едва заметное бледно-желтое окрашивание. После охлаждения в каждую пробирку добавляют по 10 капель концентрированного раствора аммиака или 30% раствора едкого натра. Окраска жидкости переходит в оранжевую. РЕАКЦИЯ МИЛЛОНА (НА ТИРОЗИН). При нагревании растворов большинства белков с реактивом Миллона (состоящим из смеси азотнокислых и азотистокислых солей закиси ртути, растворенных в концентрированной азотной кислоте) образуется осадок белка, окрашенный в красный цвет.Реакция обусловлена присутствием в белке циклической аминокислоты тирозина, которая при взаимодействии с реактивом Миллона дает ртутную соль своего нитропроизводного, окрашенную в красный цвет. Белки, не содержащие тирозина (желатина, клупеин, сальмин и др.), не дают реакции Миллона. Если реакцию Миллона производят с раствором тирозина или с растворами полипептидов, содержащих тирозин, то осадок не образуется, но жидкость равномерно окрашивается в красный цвет. Эту реакцию широко используют для количественного определения тирозина в гидролизатах белка и для определения некоторых производных тирозина, дающих эту реакцию. Реакция может быть изображена в следующем виде: 35 3 5 Тирозин Ртутная соль нитротирозина Следует избегать прибавления избытка реактива Миллона, так как он содержит азотную кислоту, которая может дать желтое окрашивание (ксантопротеиновая реакция), которое будет маскировать реакцию Миллона. Реакция Миллона не является строго специфичной для тирозина. Ее дают фенолы, полифенолы, а также алкалоиды, имеющие фенольную группировку. Однако все эти вещества отсутствуют в молекуле белка. Реактивы: раствор яичного белка, раствор растительного белка, раствор желатины, реактив Миллона Х о д р а б о т ы . В 3 пробирки наливают: в первую-5 капель 1% раствора яичного белка, во вторую-5 капель раствора растительного белка, в третью-5 капель 1% раствора желатины. Во все пробирки прибавляют по 1-2 капли реактива Миллона и осторожно нагревают. В первых двух пробирках осадок белка приобретает красное окрашивание, в пробе с желатиной осадок растворяется и жидкость остается бесцветной. РЕАКЦИЯ НА АРГИНИН (САКАГУЧИ). При добавлении к раствору белка щелочи, гипобромита и - нафтола жидкость окрашивается в красный цвет. Реакция обусловлена присутствием в белке аминокислоты аргинина, имеющей в своем составе гуанидиновую группировку. В результате реакции образуется сложное соединение красного цвета, представляющее собой продукт конденсации окисленного аргинина с -нафтолом. Гипобромит играет роль окислителя гуанидиновой группировки данной аминокислоты. Окисленный аргинин реагирует с -нафтолом , при этом образуется продукт конденсации красного цвета. Реактивы: раствор яичного белка, раствор растительного белка NaOH - 15% р-р, - нафтол, р-р гипобромита натрия Х о д р а б о т ы . В 2 пробирки наливают: в первую-5 капель 1% раствора яичного белка, во вторую-5 капель раствора растительного белка и добавляют в каждую по 5 капель 10% раствора едкого натра, по 3 капли 0,1% спиртового раствора -нафтола и по каплям (1-3-5) 2% раствора гипобромита натрия (избыток гипобромита мешает реакции). Жидкость в обеих пробирках окрашивается в красный цвет. РЕАКЦИЯ ФОЛЯ (С УКСУСНОКИСЛЫМ СВИНЦОМ) При добавлении к раствору белка крепкой едкой щелочи, уксуснокислого свинца и последующем кипячении раствор начинает темнеть. Реакция обусловлена присутствием в белке серосодержащих аминокислот, в молекулах которых сера связана относительно слабо (это цистеин и цистин) и легко отщепляется при щелочном гидролизе в виде сероводорода, который реагирует со щелочью, образуя сульфиды натрия или калия. 36 3 6 Цистеин Серин Сульфиды реагируют с плюмбитом натрия, который образуется при взаимодействии ацетата свинца со щелочью (CH3COO)2Pb + 2 NaOH → Na2PbO2 + 2CH3COOH Сернистый натрий при взаимодействии с плюмбитом натрия образует черный осадок сернистого свинца: Na2S + Na2PbO2 + 2H2O → PbS + 4 NaOH Ход работы. К 1 мл 1%-го раствора яичного белка или кусочку шерстяной нити добавляют 1 мл 30%-й щелочи и 3-4 капли 5%-го раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость окрашивается в бурый или черный цвет. Реакцию Фоля проделывают с 1%-м раствором желатина, сравнивают полученные результаты и делают вывод. ОТКРЫТИЕ АМИНОКИСЛОТ В ПОТЕ Пот, выделяемый потовыми железами кожи, содержит кроме воды (98-99%) ряд неорганических (хлорид натрия, хлорид калия, аммиак) и органических (мочевина, мочевая кислота, креатинин, холестерин, летучие жирные кислоты, некоторые аминокислоты, белки) веществ. Химический состав пота непостоянен и изменяется в зависимости от обмена веществ в организме. В ходе интенсивных тренировок, соревнований с потом выделяются повышенные количества белков, азотистых веществ и свободных аминокислот. Реактивы: 0,1 % - ный раствор нингидрина в ацетоне. Х о д р а б о т ы : Кусочек фильтровальной бумаги размером 3х3 см сжимают большим и указательным пальцами так, чтобы на ней остались отпечатки (мыть руки перед опытом не следует, чтобы не удалить пот). Затем, взяв бумажку пинцетом, смачивают ее из пипетки 0,1 % - ным раствором нингидрина в ацетоне, слегка подкисленном уксусной кислотой (0,1 мл 80 % - ной уксусной кислоты на 10 мл раствора нингидрина). Кладут бумажку на часовое стекло (или чашку Петри) и ставят в термостат при 60 оС. Через некоторое время на месте отпечатка пальцев появляется краснофиолетовое пятно. Вопросы к лабораторной работе «Цветные реакции на белки» 1. 2. 3. Какие цветные реакции являются универсальными? На чем основана биуретовая реакция? Какими цветными реакциями можно доказать наличие в составе белка цистеина, аргинина, тирозина? ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2 РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ Растворы белков, как и все растворы высокомолекулярных соединений, обладают двойственностью: по сути являются истинными растворами, поскольку частицами в этих растворах являются отдельные молекулы белка, но проявляют свойства коллоидных растворов, так как размеры макромолекул белка составляют от 1 до 100 нм, т.е. соизмеримы с коллоидными частицами. Устойчивость данных растворов, также как и коллоидных, обусловлена двумя факторами – зарядом и гидратной оболочкой, состоящей из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. Растворы белков образуются самопроизвольно (не нужен стабилизатор, в отличие от коллоидных растворов). Возникновение заряда на молекуле белка связано с диссоциацией собственных ионогенных групп. По химическим и физическим свойствам вода, входящая в состав гидратной оболочки, отличается от чистого растворителя. В частности, температура замерзания ее составляет –40°С. В этой воде хуже растворяются сахара, соли и другие вещества. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок. В этом случае наблюдается обратимое осаждение, белки не подвергается глубоким изменениям, сохраняются их нативные (первоначальные свойства) и полученные осадки белков снова могут быть растворены в исходном растворителе. В случае необратимого осаждения белков происходят изменения в структуре молекулы – изменяется третичная и вторичная структура, при этом макромолекулы белков теряют свои нативные свойства. В этом случае осадки белков не могут быть снова растворены в исходном растворителе. Техника безопасности 1. Соблюдайте особую осторожность при работе с концентрированными серной, соляной и азотной кислотами, с растворами трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот, с 10% раствором щелочи. 37 3 7 2. Будьте внимательны при нагревании растворов. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СЕРНОКИСЛЫМ АММОНИЕМ (ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ) Реактивы: р-р яичного белка, насыщенный р-р (NH4)2SO4, порошок (NH4)2SO4 При добавлении к водным растворам белков нейтральных солей щелочных металлов (NaCl, Na2SO4, KCl), солей аммония ((NH4)2SO4, NH4Cl) белки выпадают в осадок. Поскольку свободной воды (воды, не испытывающей воздействия ионов) в растворе полиэлектролитов нет, то гидратация ионов солей идет за счет снятия гидратной оболочки с молекулы белка. Х о д р а б о т ы : В пробирку наливают 2-3 мл р-ра белка, добавляют равный объем насыщенного р-ра (NH4)2SO4 и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в р-ре. Осадок отфильтровывают через бумажный фильтр. Для осаждения альбуминов к фильтрату добавляют порошок (NH4)2SO4 до полного насыщения, т.е. до тех пор, пока порошок не будет растворяться. Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают. С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Если произошло полное осаждение белков, она должна быть отрицательной. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СПИРТОМ Органические растворители понижают устойчивость растворов белков за счет следующих процессов: они снимают гидратную оболочку с молекулы белка; уменьшают заряд на белковой молекуле, т.к. обладают низкой диэлектрической постоянной и поэтому их добавка к раствору белка снижает диэлектрическую постоянную этого раствора.. Осаждению белков спиртом способствует присутствие электролитов (например, хлористого натрия) в растворе, в этом случае осадок образуется полнее и быстрее. Ионы соли связываются молекулами белка и снимают их заряд. Осаждение белков спиртом обратимо, если воздействие реагента было кратковременным и процесс проводили без нагревания. Продолжительный контакт белка со спиртом ведет к необратимому осаждению, денатурации. Осаждение белков спиртом широко применяется для промышленного изготовления препаратов крови. При определенных концентрациях этилового спирта, температуре, ионной силе и рН создаются условия избирательного осаждения фибриногена, альбумина, α -, β -, γ - глобулинов, тромбина и других белковых фракций. Реактивы: р-р яичного белка, этиловый спирт, порошок NaCl Х о д р а б о т ы . В пробирку налить 1-2 мл р-ра яичного белка, добавить немного порошка NaCl ( на кончике шпателя) и взболтать до растворения. По каплям прилить 4-6 мл этилового спирта, сильно взболтать. Через 5-8 мин выпадает осадок белка. Сразу же после появления осадка отливают часть содержимого пробирки (с осадком) в другую, добавляют несколько мл дистиллированной воды. Концентрация спирта падает и белок растворяется. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СОЛЯМИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ. Соли тяжелых металлов (Hg, Ag, Cu, Pb и др.) вызывают необратимое осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде соединения. Поэтому белки применяют в качестве противоядия при отравлении, например, ртутными солями. Белок ограничивает всасывание тяжелого металла, образуя с ним нерастворимые комплексы. Но в случае некоторых солей (соли меди, свинца, цинка) образующиеся осадки растворяются в избытке осадителя вследствие адсорбции избытка ионов металла поверхностью комплекса измененного белка с металлом, в результате чего он переходит в раствор. Подобное явление наблюдается при добавлении достаточного количества хлористого натрия, который вызывает растворение осадка ртутного соединения белка. Реакции осаждения белков солями тяжелых металлов идут полно и ими пользуются не только для выделения белков из растворов и биологических жидкостей, но и для освобождения их от белков. Реактивы: раствора яичного белка; 7% раствор сернокислой меди; 5% раствор уксуснокислого свинца; 5% раствор азотнокислого серебра. Х о д р а б о т ы . В три пробирки наливают по 5 капель 1% раствора яичного белка и по 2-3 капли : в первую 7% раствора сернокислой меди, во вторую - 5% раствора уксуснокислого свинца, в третью - 5% раствора азотнокислого серебра. Наблюдается образование осадка во всех трех пробирках. В первую пробирку добавляют еще 5-10 капель раствора сернокислой меди, во вторую - 5-10 капель уксуснокислого свинца, в третью - 5-10 капель азотнокислого серебра. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКА МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ Осаждение белка концентрированными минеральными кислотами (кроме ортофосфорной кислоты) объясняется как явлениями дегидратации белковых частиц и нейтрализации их зарядов, так и рядом других причин (денатурацией, образованием солей). 38 3 8 В избытке серной или соляной кислот, а также при их длительном воздействии, выпавший осадок денатурированного белка растворяется, по-видимому, за счет перезарядки белка и частичного гидролиза. В избытке азотной кислоты этого растворения не происходит (возможно, сопутствующий нитрат-ион мешает перезарядке белковой молекулы). Реактивы: р-р белка; конц. растворы соляной и азотной кислот. Х о д р а б о т ы . В 2 пробирки наливают по 10-15 капель концентрированной соляной и азотной кислот. Затем, наклонив пробирки под углом 45, осторожно по стенке пробирки (чтобы жидкости не смешались) наливают равный объем раствора белка. На границе двух слоев жидкости появляется осадок белка в виде тонкой пленке. Осторожно встряхивая пробирки, обнаруживаются растворение осадка белка. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ТРИХЛОРУКСУСНОЙ КИСЛОТОЙ. Органические кислоты необратимо осаждают белок из растворов. Механизм осаждения белков органическими кислотами связан с дегидратацией молекулы белка и снятием заряда. Трихлоруксусная кислота (CCl3COOH) является очень чувствительным и специфическим реактивом на белок и широко применяется для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, сыворотки крови), поскольку осаждает только белки. Продукты распада белков не осаждаются, они остаются в растворе. Преимуществом данного метода является также то, что трихлоруксусная кислота легко устраняется из фильтрата кипячением. Х о д р а б о т ы : трихлоруксусной кислоты. Реактивы: р-р яичного белка; трихлоруксусная кислота, 10%-ный р-р. В пробирку наливают 2 мл раствора белка и добавляют 5-8 капель 10%-ного р-ра ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ПРИ НАГРЕВАНИИ. Почти все белки денатурируют при нагревании до температуры от 50 С до 55 С и выше. Механизм тепловой денатурации связан с перестройкой структуры белковой молекулы, в результате которой белок теряет свои нативные свойства и растворимость. Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в выпадении в осадок денатурированного при нагревании белка. Наиболее полное осаждение происходит в изоэлектрической точке белка, т.е. при такой величине рН, когда молекулы белка наименее устойчивы. Реактивы: раствор яичного белка; 10% раствор уксусной кислоты, насыщенный раствор хлорида натрия; 10% раствор гидроксида натрия В пять пробирок наливают по 0,5 мл 1% раствора яичного белка. Содержимое первой пробирки нагревают до появления опалесценции (помутнения раствора). К раствору белка во второй пробирке осторожно добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты, нагревают и наблюдают вначале появление опалесценции, а затем выпадение белого хлопьевидного осадка белка. Это объясняется тем, что белок теряет заряд и находится в изоэлектрическом состоянии. К раствору белка в третьей пробирке добавляют 1-2 капли 10% раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок не образуется, так как в кислой среде частицы белка перезаряжаются и приобретают положительный заряд. К раствору белка в четвертой пробирке добавляют 1-2 капли 10% раствора уксусной кислоты, 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Выпадает осадок вследствие адсорбции ионов электролита (образование двойного электрического слоя) и нейтрализации заряда на частицах белка. К раствору белка в пятой пробирке добавляют 1 каплю 10% раствора гидроксида натрия и нагревают. Осадок не образуется, так как в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка усиливается. Вопросы к лабораторной работе «Реакции осаждения белков» 1. 2. 3. 4. 5. Что такое высаливание белков? Каков механизм высаливания? Каков механизм осаждения белков при кратковременном действии спирта, при действии солей тяжелых металлов? Что понимают под денатурацией белка? Почему в сильнокислой или сильнощелочной среде при нагревании белок не осаждается? ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3 НУКЛЕОПРОТЕИДЫ 39 3 9 Нуклеопротеиды представляют собой сложные белки, содержащие в качестве небелковой части (простетической группы) нуклеиновые кислоты. Из этих белков состоит основная масса клеточного ядра, поэтому нуклеопротеиды могут быть выделены из тканей, богатых ядерным веществом (зобной железы, семенников, сперматозоидов и др.). Нуклеопротеиды играют важную биологическую роль, являясь структурными элементами клетки (ее ядра и цитоплазмы) и выполняя важнейшие специфические функции в живом организме. Деление клеток, биосинтез белков, передача наследственной информации тесно связаны с нуклеопротеидами, в частности с входящими в их состав нуклеиновыми кислотами (ДНК и РНК). Изучение состава нуклеопротеидов При проведении частичного гидролиза нуклеопротеиды распадаются на составные части: белки, преимущественно основного характера (протамины и гистоны), и нуклеиновые кислоты. Более полный гидролиз приводит к распаду белков и нуклеиновых кислот. Схема гидролиза нуклеопротеидов Исследование химического состава нуклеопротеидов проводят на примере дрожжей, которые подвергают гидролизу с последующим изучением его продуктов (полипептидов, пуриновых оснований, углеводных компонентов и фосфорной кислоты). Техника безопасности 1. Соблюдайте особую осторожность при работе с концентрированными серной, соляной, уксусной и азотной кислотами, с 10% раствором щелочи. 2. Будьте внимательны при нагревании растворов. ПРОВЕДЕНИЕ ГИДРОЛИЗА В круглодонную колбу на 100 мл помещают 1 г свежих или 0,2 г сухих пекарских дрожжей, приливают 20 мл 10 %-го раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды. Колбу закрывают пробкой с воздушным холодильником, закрепляют с небольшим наклоном и кипятят под тягой 1 час. Охлаждают, доводят объем до первоначального дистиллированной водой, отфильтровывают через складчатый фильтр. С фильтратом проводят следующие реакции. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ НА ПОЛИПЕПТИДЫ К 5 каплям гидролизата дрожжей добавляют 10 капель 10 %-го раствора NaOH и 1–2 капли 1 %-го раствора CuSO4 до появления сине-фиолетового или красно-фиолетового окрашивания. СЕРЕБРЯНАЯ ПРОБА НА ПУРИНОВЫЕ ОСНОВАНИЯ Метод основан на способности пуриновых оснований с аммиачным раствором AgNO 3 образовывать осадок серебряных солей пуриновых оснований (аденина, гуанина), окрашенных в светло-коричневый цвет: В пробирку вносят 10 капель гидролизата дрожжей, добавляют по каплям концентрированный раствор NH 4OH до щелочной реакции по универсальной индикаторной бумаге (1–10 капель) и 10 капель аммиачного раствора AgNO3, который готовят добавлением концентрированного раствора NH4OH к 2–3 %-му раствору AgNO3 до растворения осадка. Через 3–5 минут образуется рыхлый бурый осадок серебряных соединений пуриновых оснований. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ПЕНТОЗЫ Дифениламиновая проба (реакция Дише) 40 4 0 Метод основан на способности дезоксирибозы ДНК образовывать соединения синего цвета с дифениламином при нагревании в среде, содержащей смесь ледяной уксусной и концентрированной серной кислот. С рибозой РНК аналогичная реакция дает зеленое окрашивание. Х о д р а б о т ы : К 10 каплям гидролизата приливают 0,5–1 мл дифениламинового реактива. Содержимое пробирки перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 15–20 минут. Отмечают характерное окрашивание. Для приготовления дифениламинового реактива 1 г дифениланилина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты и к раствору добавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты. Проба Троммера Эта проба, как и две последующих, основана на способности рибозы и дезоксирибозы, имеющих свободный гликозидный гидроксил, восстанавливать в щелочной среде окисные формы металлов (Cu, Fe, Bi) до закисных, а закисные – до свободного состояния. Сахара же в этих условиях дают различные продукты окисления. Проба Троммера основана на реакциях: Избыток CuSO4 мешает реакции, т. к. ведет к образованию большого количества Cu(OH) 2, который при нагревании распадается с образованием черного осадка CuO: Х о д р а б о т ы К 5 каплям гидролизата добавляют 5 капель 30 %-го раствора NaOH и несколько капель 7 %го раствора CuSO4 до появления неисчезающей мути Cu(OH)2. При нагревании до кипения выпадает черный осадок CuOH или красный осадок Cu2O. Реакция Толленса Реакция Толленса является специфичной для пентоз. Она обусловлена взаимодействием флороглюцина с фурфуролом, образующимся из пентозы при нагревании с HCl. При этом образуется продукт конденсации красного цвета. Х о д р а б о т ы В пробирку вносят 5–7 капель гидролизата, 2–3 капли 0,5 %-го раствора флороглюцина в концентрированной HCl и кипятят в течение 1 минуты. Наблюдают за изменением окраски. МОЛИБДЕНОВАЯ ПРОБА НА ФОСФОРНУЮ КИСЛОТУ В пробирку вносят 5 капель гидролизата дрожжей, добавляют 10–20 капель молибденового реактива и кипятят в течение нескольких минут. При охлаждении пробирки под струей воды выпадает кристаллический осадок фосфорной соли молибдата аммония лимонно-желтого цвета: Приготовление молибденового реактива В 100 мл дистиллированной воды растворяют 7,5 г молибдата аммония и добавляют 100 мл 32 %-го раствора HNO3 плотностью 1,2 г/см3. Вопросы к лабораторной работе «Нуклеопротеиды» 1. Как определяется белковая природа нуклеопротеидов? 2. Что образуется при полном гидролизе нуклеопротеидов? 3. Что такое нуклеозиды? 4. Что такое мононуклеотиды? 5. Какие азотистые основания входят в состав нуклеиновых кислот? 41 4 1 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4 КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ОТДЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ Цель работы: ознакомиться с каталитическим действием некоторых ферментов пищеварительного тракта (амилазы слюны, пепсина и липазы) и каталазы крови. Техника безопасности 1. Соблюдайте особую осторожность при работе с раствором Люголя (йода), с раствором перекиси водорода 2. Будьте внимательны при нагревании растворов. Опыт № 1. Амилаза слюны Амилаза слюны осуществляет гидролиз крахмала или гликогена. Ход работы. В две пробирки вносят по 5 мл 0,2 %-го раствора крахмала, в одну из них добавляют 0,5 мл слюны. Содержимое перемешивают и пробы помещают в водяную баню (37оС) на 15 минут. В обе пробирки добавляют по 5 капель раствора Люголя (йода). В пробирке со слюной (амилазой) раствор не дает реакции на полисахарид, а в пробирке без слюны образуется сине-фиолетовое окрашивание. Опыт №2. Липаза поджелудочной железы Липаза гидролизует жиры на глицерин и жирные кислоты, количество которых можно определить титрованием щелочью. Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл растительного масла, 4 мл дистиллированной Н 2О, 5 мл 1%-го раствора NaHCO3. Содержимое энергично встряхивают до образования эмульсии. Затем в обе пробирки добавляют по 5 капель спиртового раствора фенолфталеина, в одну из пробирок (опыт) - 1 мл липазы, а в другую (контроль) - 1 мл Н2О. Содержимое тщательно перемешивают и ставят в термостат (37оС) на 15-20 минут. Вследствие образования жирных кислот в ходе реакции и нейтрализации ими щелочной среды раствор в пробе с липазой становится менее окрашенным или обесцвечивается, а в пробе без липазы не изменяется. Опыт №3. Пепсин Пепсин, фермент желудочного сока, гидролизует белки до пептидов и аминокислот. Ход работы. В две пробирки вносят несколько мл раствора белка (альбумина) и легким подогревом на спиртовке или электроплитке денатурируют его. Пробы охлаждают до комнатной температуры и в одну из них добавляют раствор пепсина, а в другую - 1 мл Н2О. Обе пробы помещают в термостат (37оС) на 20 минут, после чего сравнивают результаты. Опыт №4. Каталаза Каталаза инактивирует перекись водорода, разлагая ее на воду и молекулярный кислород: 2Н2О2 = 2Н2О + О2. Перекись водорода образуется в некоторых окислительно – восстановительных процессах при восстановлении молекулярного кислорода. Это вещество является сильным клеточным ядом, т.е. обладает цитотоксическим действием. К негативному биологическому действию Н2О2 относится также локальное закисление среды, сосудосуживающее действие. Из перекиси водорода образуется гидроксильный радикал - ОН - высокореакционноспособный оксидант. Таким образом, каталаза, удаляя этот ядовитый продукт, защищает биохимические системы клетки от неконтролируемых самопроизвольных окислительных процессов, т.е. является внутриклеточным ферментативным антиоксидантом. Этот фермент содержится в эритроцитах, в клетках печени и других тканей. Ход работы. В две пробирки вносят по 2 мл свежеприготовленного 5%-го раствора перекиси водорода, в одну из проб добавляют 1 каплю крови и перемешивают. В пробе с кровью (каталазой) вследствие выделения кислорода наблюдается интенсивное образование пузырьков. Вопросы к лабораторной работе «Качественные реакции на отдельные ферменты» 1. 2. 3. 4. 5. 6. К какому классу ферментов относится амилаза? Какое вещество является субстратом амилазы слюны? Скорость какой реакции ускоряет липаза? К какому классу относится каталаза? Какое вещество является субстратом каталазы? Почему каталаза является антиоксидантным ферментом? ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ Аскорбиновая кислота (витамин С) относится к водорастворимым витаминам, может функционировать как промежуточный переносчик водорода при окислении некоторых органических кислот в процессе дыхания. Содержание этого витамина в растительных тканях служит показателем его восстановительной и общей физиологической активности. Определение содержания аскорбиновой кислоты основано на ее способности восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол. 42 4 2 При титровании кислого раствора аскорбиновой кислоты индикатор переходит из окрашенной формы в бесцветную. Титруют до появления розового цвета, обусловленного избытком индикатора в среде. Техника безопасности 1. Соблюдайте особую осторожность при работе с раствором трихлоруксусной кислоты. Цель работы: Определить содержание витамина C в пищевых продуктах Реактивы: Растительный материал для анализа: картофель, лук, капуста, яблоко и другие; трихлоруксусная кислота (5%); 0,001 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (краска Тильманса). Ход работы: а) гомогенизация биоматериала и экстракция витамина С. 2 г растительного материала, растирают в фарфоровой ступке с 10 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты. Растирание продолжается 3-5 мин до получения однородной массы. Далее содержимое ступки с помощью воронки переводят в мерную колбу на 50 мл, при этом трихлоруксусной кислотой тщательно обмываются ступка и пестик, и доливают колбу до метки этой же кислотой. Мерную колбу закрывают пробкой и в течение 5 мин встряхивают. После этого содержимое колбы фильтруют в сухую колбу. 1 г продукта измельчают, в фарфоровой ступке с 2 мл дистиллированной воды, смесь количественно переносят в мерную колбу на 25 мл, и доводят объем водой до метки. Через 10 минут смесь фильтруют через бумажный фильтр в мерную пробирку. б) количественное определение витамина C в экстракте. Для определения содержания аскорбиновой кислоты берут в коническую колбочку 5 мл фильтрата и титруют из микробюретки раствором 0.001 н 2,6-дихлорфеноиндофенола до слаборозового окрашивания, сохраняющегося в течение 20 секунд. Используют только свежеприготовленный раствор 2,6дихлорфеноиндофенола, поскольку он неустойчив при хранении. Расчет содержания аскорбиновой кислоты (А) ведут по следующей формуле: Х = (0,088. А. 50 . 100) / Б. В = (мг %), где Х - содержание аскорбиновой кислоты в мг %; А - количество раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола (в мл), пошедшее на титрование; В - количество сухого вещества в г, взятое для анализа; Б - количество вытяжки в мл, взятое для титрования; 50 - общее количество вытяжки в мл; 0,088 - количество аскорбиновой кислоты в мг, эквивалентное 1 мл 0,001н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола. Вопросы к лабораторной работе «Количественное определение аскорбиновой кислоты» 1. 2. 3. 4. К какой группе витаминов относится аскорбиновая кислота? В чем заключается биохимическая функция большинства витаминов? Какова биохимическая функция витамина С? Содержание аскорбиновой кислоты в данной работе выражают в мг %. Что это означает? ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ Цель работы: Определить содержание глюкозы в растительном объекте. Принцип метода. Для определения содержания глюкозы в растительном объекте используют феррицианидный микрометод определения глюкозы по Хагедорну-Йенсену. Метод основан на реакции окисления глюкозы (и других углеводов) гексациано-(111) ферратом калия (красной кровяной солью) в слабощелочной среде. В этих условиях глюкоза окисляется до глюконовой кислоты, при этом гексациано-(111)феррат калия восстанавливается до гексациано-(11)феррата (желтой соли). 2K3 [Fe(CN)6]+C6H2O6 + 3Na2CO3 + H2O - > 2 K3Na[Fe(CN)6] + C5H4O5COONa + NaHCO3 Вследствие обратимости этой реакции гексациано-(11)феррат калия переводят в нерастворимую соль K2Zn3[Fe(CN)6]2 действием сульфата цинка, при этом протекает реакция: 2К4Fe(CN)6 + 3ZnSO4 = K2Zn3[Fe(CN)6]2 + 3K2SO4 Гексациано-(111)феррат калия берут в избытке и неиспользованный остаток его определяют иодометрически в кислой среде. 2К3Fe(CN)6 + 2KJ = 2K4Fe(CN)6 + J2↑ Выделившийся йод оттитровывают тиосульфатом натрия (гипосульфи-том): J2 + 2Na2S2O3 = 2NaJ + Na2S4O6. 43 4 3 Ход работы. 250 мг растительного материала растирают с 20 мл дистиллированной воды и фильтруют. К 1 мл фильтрата добавляют 2 мл щелочного раствора 0,005 н красной кровяной соли и помещают в кипящую водяную баню на 15 мин для протекания реакции окислительно-восстановительной реакции. Пробу охлаждают и определяют в ней остаток непрореагировавшей красной кровяной соли. Для этого добавляют 2 мл 3% СН3СООН и 3 мл тройного раствора, состоящего из NaCl и ZnSO 4 (для связывания K4Fe(CN)6) и KI (для реакции с K3Fe(CN)6. Раствор желтеет, выделяется свободный йод, который сразу связывают крахмалом (появляется синяя окраска) и оттитровывают 0,005 н Na2S2O3 из микробюретки до исчезновения окраски. Параллельно в другой пробирке проводят опыт с контрольной пробой, в которую вместо фильтрата берут 1 мл дистиллированной воды. Далее делают тоже, что с опытной пробой, кроме кипячения. Расчет. Для расчета содержания глюкозы пользуются специальной таблицей (Табл.5), составленной для р-ра гипосульфита (0,005 н.). Таблица 5. Содержание глюкозы в 0,1 мл вытяжки, в мг Гипосульфит, мл 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,385 0,355 0,331 0,310 0,290 0,270 0,251 0,232 0,213 0,195 0,177 0,159 0,141 0,124 0,106 0,088 0,070 0,052 0,034 0,382 0,352 0,329 0,308 0,288 0,268 0,249 0,230 0,211 0,193 0,175 0,157 0,139 0,122 0,104 0,086 0,068 0,050 0,032 0,379 0,350 0,327 0,306 0,286 0,266 0,247 0,228 0,209 0,191 0,173 0,155 0,138 0,120 0,102 0,084 0,066 0,048 0,031 0,376 0,348 0,325 0,304 0,284 0,264 0,245 0,226 0,208 0,190 0,172 0,154 0,136 0,119 0,101 0,083 0,065 0,047 0,029 0,373 0,345 0,323 0,302 0,282 0,262 0,243 0,224 0,206 0,188 0,170 0,152 0,134 0,117 0,099 0,081 0,063 0,043 0,027 0,370 0,343 0,321 0,300 0,280 0,260 0,241 0,222 0,204 0,186 0,168 0,150 0,132 0,115 0,097 0,079 0,061 0,042 0,025 0,367 0,341 0,318 0,298 0,278 0,259 0,240 0,221 0,202 0,184 0,164 0,148 0,131 0,113 0,095 0,077 0,059 0,041 0,024 0,364 0,338 0,316 0,296 0,276 0,257 0,238 0,219 0,200 0,182 0,164 0,146 0,129 0,111 0,093 0,075 0,057 0,039 0,022 0,361 0,336 0,314 0,294 0,274 0,255 0,236 0,217 0,199 0,181 0,163 0,145 0,127 0,110 0,092 0,074 0,056 0,038 0,020 0,358 0,333 0,312 0,292 0,272 0,253 0,234 0,215 0,197 0,179 0,161 0,143 0,125 0,108 0,090 0,072 0,054 0,036 0,019 1,9 0,017 0,015 0,014 0,012 0,010 0,008 0,007 0,005 0,003 0,002 Например, на титрование опытной пробы израсходовано 1,29 мл гипосульфита, на титрование контрольной пробы 1,92 мл. По таблице: 1,29 мл соответствует 0,125 мг глюкозы, а 1,92 мл - 0,014 мг. Содержание глюкозы в 1 мл оттитрованной вытяжки = 0,125-0,014=0,111 мг. Далее рассчитывают содержание глюкозы в 1 г растительного материала. Вопросы к лабораторной работе «Количественное определение углеводов» 1. К каким углеводам относится глюкоза? 2. Приведите пример кетогексозы. 3. Обладает ли глюкоза восстанавливающими свойствами? 4. Какой вид таутомерных превращений характерен для углеводов? 5. Какая таутомерная форма является более устойчивой? 6. Каков принцип феррицианидного микрометода определения глюкозы по Хагедорну-Йенсену? ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №7 ЖИРОВЫЕ КОНСТАНТЫ Определение йодного числа жира Йодное число является одной из количественных характеристик непредельности жира. Йодным числом называется количество грамм иода, которое связывается 100 г жира, так как присоединяется по месту двойных связей. Избыток иода, оттитровывается раствором тиосульфата. Техника безопасности 1. Соблюдайте особую осторожность при работе с раствором йода. Реактивы. Растительное масло. Хлороформ. 0,1 н. спиртовый раствор иода. 0,1 н. раствор тиосульфата. Крахмал, 1%-ный раствор. 44 4 4 Ход работы. В коническую колбу емкостью 400 мл помещают навеску жира около 0,2—0,3 г и растворяют в 20—30 мл хлороформа. Затем в колбу приливают 25 мл 0,2 н. спиртового раствора иода, смешивают, приливают 200мл воды, хорошо встряхивают и настаивают 5 минут. Затем титруют 0,1 н. раствором тиосульфата, вначале до слабожелтой окраски, а затем добавляют 1 мл раствора крахмала и титруют до исчезновения синей окраски. Объем раствора тиосульфата, пошедшего на титрование, отвечает избыточному иоду. Теперь 25 мл 0,2 н. спиртового раствора иода оттитровывают 0,1 н. раствором тиосульфата и вычитают из полученного объема раствора тиосульфата объем, найденный ранее. По разности находят объем раствора тиосульфата, соответствующий связанному жиром иоду. Переводя этот объем по известному титру в граммы иода, и относя результат к 100 г жира, находят йодное число. Р а с ч е т. 1 мл 0,1 н. раствора тиосульфата эквивалентен1 мл 0,1 н. раствора иода (0,01270 г иода). Зная, сколько миллилитров раствора иода (а) налито в колбу и сколько миллилитров 0,1 н. раствора тиосульфата (b) пошло на титрование остатка иода (обратное титрование), определяют количество миллилитров 0,1 н. раствора иода (а — b), связанных жиром. Умножая разность на 0,0127, получают количество иода в граммах, связанного навеской (с) жира. Отсюда йодное число: X= (а — b) • 0,0127” 100 с Определение кислотного числа жира Кислотным числом жира называется количество миллиграмм едкого калия, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира. Кислотное число напрямую характеризует качество жира, при прогоркании жира этот показатель увеличивается. Количество свободных жирных кислот определяют при помощи титрования щелочью. Техника безопасности 1. Соблюдайте особую осторожность при работе с с раствором КОН Реактивы. Смесь эфира и спирта (1 : 1). Раствор фенолфталеина. Едкий кали , 0,1 н. спиртовой раствор. . Ход работы. 1 мл масла растворяют в 10 мл смеси эфира и спирта и в присутствии фенолфталеина (2-3 капли) титруют 0,1 н. спиртовым раствором КОН до слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 0,5 мин. На 1 мл масла идет некоторое количество щелочи, что указывает на существование в нем свободных жирных кислот. Такую же реакцию проводят с прогорклым маслом. Кислотное число (к.ч.) находят по формуле: а •К • 5,6 к.ч. = ---------------b где a – кол-во 0,1 н. спиртовой раствора КОН, пошедшее на титрование 1 мл масла; К – поправка к титру КОН; b - взятый объем масла; 5,6- коэффициент для пересчета (1 мл 0,1 н. раствора содержит 5,6 мг КОН). Вопросы к лабораторной работе «Жировые константы» 1. 2. 3. 4. 5. 6. Какие жировые константы Вам известны? Что понимают под прогорканием жира? Что такое йодное число? Что характеризует йодное число? Что такое кислотное число жира? Что характеризует кислотное число? Используемая литература 1. 2. 3. 4. А.Ленинджер Основы биохимии. В 3-х томах. Пер. с англ. Москва «Мир», 1985.-974 с. Э.Ф. Костылев, А.П. Рябошапко. Биохимия сырья водного происхождения – М.:Легкая и пищевая пром-сть, 1982. – 144 с. Биохимия молоди пресноводных рыб. Отв.редактор В.С. Сидоров – Петрозаводск: Карельский филиал АН СССР, 1985. – 144 с. И.М. Анисимова, Лавровский В.В. Ихтиология: Учебник для вузов. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.:Агропромиздат, 1991. -– 288 с. 45 4 5
