лабораторная диагностика инфекций, передающихся

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАЮЩИХСЯ ИКСОДОВЫМИ
КЛЕЩАМИ, НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
Колясникова Н.М.1,2, Карань Л.С.2, Топоркова М.Г.3, Махнева М.А.3, Надеждина М.В.3,
Есаулкова А.Ю.4, Романенко В.В.4, Сбитнева Н.Н.5,Оленькова О.М.5, Платонов А.Е.2
ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П. Чумакова РАМН;
Московская обл., Россия;
2
ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора , Москва, Россия;
3
Городская клиническая больница №33, г. Екатеринбург, Россия;
4
Центр гигиены и эпидемиологии в Свердловской области, г. Екатеринбург, Россия;
5
Клинико-диагностический центр, г. Екатеринбург, Россия.
1
Введение: В условиях существования сочетанных очагов клещевых инфекций и роста
числа людей, пострадавших от укусов клещей, большое значение приобретает
дифференциальная лабораторная диагностика. Иксодовые клещи являются переносчиками
различных патогенных для человека микроорганизмов: вируса клещевого энцефалита
(ВКЭ), боррелий, возбудителей гранулоцитарного анаплазмоза человека, моноцитарного
эрлихиоза человека, риккетсий, бабезиоза, бартонеллеза и других. Клиническая
дифференциальная диагностика этих заболеваний крайне затруднена, в то время как
терапия вирусных и бактериальных заболеваний принципиально различна. Поэтому
своевременный выбор адекватной терапии в современных условиях должен основываться
на комплексе лабораторных методов, позволяющих обеспечить дифференциальную
экспресс-диагностику при поступлении больного в стационар.
Цель: Разработка комплекса тест-систем ПЦР для экспресс-диагностики патогенных
микроорганизмов, переносимых клещами, в клиническом материале и объектах
окружающей среды.
Материалы и методы: В 2009-2010 годах исследованы кровь и ликвор от 426 пациентов,
госпитализированных в ГКБ № 33 г. Екатеринбурга с заболеваниями, развившимися после
присасывания клеща или посещения природных зон в эпидемический сезон. Для детекции
возбудителей клещевых инфекций: ВКЭ, боррелий комплекса B.burgdorferi sensu lato,
A.phagocytophillum, E.muris/E.chaffeensis и B.miyamotoi использовали коммерческую тестсистему
«Amplisens
TBEV,
B.burgdorferi
sensu
lato,
A.phagocytophillum,
E.muris/E.chaffeensis-Fl» (ЦНИИ Эпидемиологии, Москва), для диагностики B.miyamotoi разработанную нами тест-систему на основе РРВ-ПЦР. Для изоляции нуклеиновых кислот
из суспензий клещей, лейкоцитарной фракции крови, спинномозговой жидкости (СМЖ),
тканей мозга применяли набор «Рибо-преп» (Амплисенс, Москва), позволяющий
одинаково эффективно экстрагировать из биоматериала РНК и ДНК. Реакцию обратной
транскрипции проводили с использованием набора «Reverta-L» (Амплисенс, Москва). Для
проведения РВ-ПЦР использовали амплификаторы RotorGene 6000 (Corbette Researche,
Австралия) и iQ5 (BioRad, США).
Основные результаты: Эффективность комплекса методик оценена путем
исследования проб крови больных иксодовым клещевым боррелиозом, клещевым
энцефалитом и микст-инфекцией – клещевой энцефалит/боррелиоз - из Свердловской
области. Показано, что при ПЦР исследовании проб крови, взятых при поступлении
больного, возможно установление этиологии заболевания у 39% больных, в то время как
на основании серологических данных диагноз, как правило, ставится не ранее второй
недели лечения. Ложноположительные результаты ПЦР диагностики отсутствовали.
Заболевания, вызванные анаплазмой или эрлихиями, методом ПЦР не выявлены.
Показано, что более 50% случаев клещевого боррелиоза в безэритемной форме были
вызваны B.miyamotoi, среди возбудителей боррелиоза в эритемной форме выявлена
B.garinii. Диагностическая чувствительность созданной ПЦР методики определялась
относительно данных серологического анализа или присутствия патогномоничного
признака боррелиоза – эритемы, и для детекции ВКЭ составила 29%, для боррелий
комплекса B.burgdorferi sensu lato - 20%, данные результаты исследования позволяют
использовать этот метод только в качестве метода экспресс-диагностики клещевого
энцефалита и иксодового боррелиоза в первые дни госпитализации, который обязательно
должен быть дополнен серологическим исследованием парных проб сыворотки крови в
динамике.
Новым явлением, обнаруженным в ходе данной работы, является присутствие рРНК
B.miyamotoi в 53% проб от больных ИКБ в безэритемной форме в Свердловской области.
Клинически
инфекция
B.miyamotoi
характеризовалась
лихорадкой
и
общеинтоксикационным синдромом, что во многих чертах совпадало с клинической
картиной клещевого энцефалита в лихорадочной форме и препятствовало своевременному
началу антибиотикотерапии. Открытие нового варианта иксодовых клещевых
боррелиозов требует немедленного создания и внедрения серологических и ПЦР методик
для дифференциальной диагностики данного заболевания и выяснения степени его
распространенности в Евразии, а также детального исследования клинической картины и
разработки предпочтительных способов терапии.
Заключение: Одновременная детекция четырех патогенов, передаваемых одним видом
переносчика, существенно сокращает время дифференциальной диагностики и является
удобным форматом исследования для врача-лаборанта. Включение в комплекс методик
тест-системы для выявления B.miyamotoi представляет уникальную на настоящий день
возможность для диагностики этой «новой», ранее неизвестной инфекции.