Лекция 5.
advertisement
Лекция 5. Общий путь катаболизма как источник субстратов тканевого дыхания – окислительное декарбоксилирование пирувата, цикл трикарбоновых кислот. Подведение итога: образование АТФ методом субстратного и окислительного фосфорилирования АДФ Общий путь катаболизма включает: 1) окислительное декарбоксилирование пирувата до ацетил-КоА; 2) окисление ацетильной группы ацетил-КоА (2 и 3 углеродные атомы пирувата) в цикле трикарбоновых кислот; 3) выделение и аккумулирование энергии при дегидрировании метаболитов общего пути катаболизма в митохондриальных цепях переноса электронов. Пируват образуется из углеводов (глюкоза), глицерола, гликогенных аминокислот и лактата. Ацетил-КоА занимает центральное место в общем пути катаболизма и образуется в митохондриях: 1) при окислительном декарбоксилировании пирувата; 2) при β-окислении жирных кислот; 3) из кетогенных аминокислот. 1. Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты Пировиноградная кислота связывает гликолиз с циклом трикарбоновых кислот. Пируват переносится из цитозоля в матрикс митохондрий с помощью переносчика по механизму симпорта с протоном. В матриксе митохондрий пируват превращается в ацетил-КоА. Этот процесс называется окислительное декарбоксилирование пирувата и катализируется пируватдегидрогеназным комплексом (пируватдегидрогеназной системой). Высокая концентрация пируватдегидрогеназного комплекса обнаружена в сердечной мышце и почках. Пируватдегидрогеназный комплекс является классическим мультиферментным комплексом, в котором промежуточные продукты остаются связанными на поверхности молекулы фермента до образования конечного продукта. В состав пируватдегидрогеназного комплекса входит 3 фермента и 5 кофакторов. I-й фермент – пируватдегидрогеназа содержит кофактор тиаминпирофосфат (производное витамина В1); II-й фермент – дигидролипоилтрансацетилаза содержит кофакторы липоевую кислоту (ЛК, 6,8дитиооктановая кислота) и кофермент А (НS-КоА), причем остаток липоевой кислоты присоединен к апоферменту путем образования амидной связи между карбоксильной группой ЛК и ε-аминогруппой лизина белка (образуется длинная «рука», состоящая из 13 атомов углерода); III-й фермент - дигидролипоилдегидрогеназа содержит кофакторы ФАД и НАД+. 1 NH 2 N H 3C ÑÍ O O 2 Î Ð Î Ð Î S Î- ÎТиаминпирофосфат (ТПФ) N 2 N C C CH3 C ÑÍ 2 ÑÍ - Ï àí òî òåí î âàÿ êèñëî òà äèãèäðî êñè, äèì åòèëì àñëÿí àÿ êèñëî òà O CH2 O P OO O P OO CH2 O 3' O PO32- àëàí èí CH3 O O C CHOH C NH CH2 CH2 C NH CH2 CH2 SH CH3 Òèî ýòàí î ëàì èí NH 2 N N N N OH 3'-ô î ñô î àäåí î çèí äèô î ñô àò S Í 2Ñ ÑÍ Êî ô åðì åí ò À S 2 ÑÍ ÑÍ 2 ÑÍ 2 ÑÍ 2 ÑÍ 2 ÑÎÎ - S ËÊ S Ëèï î åâàÿ êèñëî òà (ËÊ) 2. Механизм окислительного декарбоксилирования пирувата I этап. Пируват взаимодействует с кофактором пируватдегидрогеназы тиаминпирофосфатом. Основную роль играет второй углеродный атом тиазольного кольца ТПФ, который легко теряет протон, превращаясь в карбанион. Карбанион атакует частично положительно заряженный α-углеродный атом пирувата с возникновением связи С−С. Сильно электрофильный атом азота в карбоксиэтил-ТПФ способствует его декарбоксилированию с образованием гидроксиэтил-ТПФ. 2 ÑÍ 3 R1 N C CH3 C C R2 S H+ Ñ O - ÑÎÎ Пируват ТПФ CH3 R2 ~ ÑÍ 3 + Ñ O SÊî À ÀöåòèëÊî À ËÊ + ÔÀÄ ÔÀÄÍ S ËÊ + Äèãèäðî ëèï î èëò ðàí ñàöåò èëàçà + Í ÀÄ+ + HSKoA Àöåòèë-ëèï î åâàÿ êèñëî òà HS ËÊ HS Äèãèäðî ëèï î åâàÿ êèñëî òà S ËÊ + ÔÀÄÍ S 2 ÑÍ 3 Ñ O S ËÊ HS ÒÏ Ô Ëèï î åâàÿ êèñëî òà Äèãèäðî ëèï î èëäåãèäðî ãåí àçà HS СО2 Карбоксиэтилтиаминпирофосфат S Гидроксиэтилтиаминпирофосфат HS R1 N C CH3 C C R2 HO S C H3C COO- ~ R1 N C C C НО S С Н Н3С Пируватдегидрогеназа ÔÀÄ + Í ÀÄÍ +Í 2 + Í ÀÄ+ + Í 2Î + 2,5 ÀÒÔ II этап. В следующей реакции, катализируемой дигидролипоилтрансацетилазой, гидроксиэтил-ТПФ взаимодействует с липоевой кислотой. Происходит перенос гидроксиэтильной группы на один из атомов серы ЛК. При этом гидроксиэтильная группа окисляется в ацетильную. В процессе окисления гидроксиэтильной группы и восстановления SH-группы ЛК возникает макроэргическая связь. Затем ацетильный остаток переносится на второй кофермент дигидролипоилтрансацетилазы – HS-KoA, а ЛК полностью восстанавливается. Образованный ацетил-КоА отделяется от полиферментного комплекса. III этап. Восстановленная форма ЛК окисляется дигидролипоилдегидрогеназой. 3. Регуляция пируватдегидрогеназного комплекса. Превращение пирувата в ацетил-КоА – процесс необратимый. Поэтому синтез глюкозы из ацетил-КоА невозможен. Обычно ацетил-КоА далее превращается 2-мя путями: 1) ацетильная 3 группа ацетил-КоА окисляется до СО2 и Н2О через ЦТК и сопряженные цепи переноса электронов с выделением и запасанием энергии в виде АТФ; 2) используется для синтеза кетоновых тел, холестерола и жирных кислот. Пируватдегидрогеназный комплекс регулируется методом фосфорилированиядефосфорилирования. Повышение величин отношений НАДН/НАД+, ацетил-КоА/КоА или АТФ/АДФ способствует фосфорилированию фермента протеинкиназой и дезактивации комплекса. Следовательно, пируватдегидрогеназный комплекс инактивируется, если клетка богата энергией и биосинтетическими предшественниками. Пируват и АДФ, наоборот, активируют пируватдегидрогеназный комплекс посредством ингибирования протеинкиназы. Вазопрессин активирует пируватдегидрогеназный комплекс путем повышения концентрации ионов кальция в митохондриях, которые активируют протеинфосфатазу (дефосфорилирование фермента). Инсулин также усиливает превращение пирувата в ацетил-КоА через дефосфорилирование пируватдегидрогеназного комплекса. 4. Цикл трикарбоновых кислот Вторым компонентом общего пути катаболизма является ЦТК. Этот цикл был открыт в 1937 г. Кребсом и Джонсоном. В 1948 г. Кеннеди и Ленинджер доказали, что ферменты ЦТК локализованы в матриксе митохондрий. 4.1. Химизм цикла трикарбоновых кислот. Свободную уксусную кислоту невозможно окислить путем дегидрирования. Поэтому она в активной форме (ацетилКоА) предварительно связывается с оксалоацетатом (ЩУК, щавелевоуксусной кислотой), в результате чего образуется цитрат. 1. Ацетил-КоА соединяется с оксалоацетатом в реакции альдольной конденсации, катализируемой цитратсинтазой. Образуется цитрил-КоА. Цитрил-КоА при участии воды гидролизуется до цитрата и НS-КоА. 2. Аконитат-гидратаза (аконитаза) катализирует превращение цитрата в изоцитрат через стадию цис-аконитовой кислоты. Аконитаза по механизму действия одновременно гидратаза и изомераза. 3. Изоцитратдегидрогеназа катализирует дегидрирование изолимонной кислоты в оксалосукцинат (щавелевоянтарную кислоту), которая затем декарбоксилируется в 2-оксоглутарат (α-кетоглутарат). Коферментом является НАД+ (в митохондриях) и НАДФ+ (в цитозоле и митохондриях). 4. 2-Оксоглутаратдегидрогеназный комплекс (α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс) катализирует окислительное декарбоксилирование 2-оксоглутарата в сукцинил-КоА. Мультиферментный 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс похож на пируватдегидрогеназный комплекс и процесс протекает аналогично окислительному декарбоксилированию пирувата. 5. Сукцинилтиокиназа катализирует расщепление сукцинил-КоА на янтарную кислоту и кофермент А. Энергия расщепления сукцинил-КоА накапливается в виде гуанозинтрифосфата (ГТФ). В сопряженной реакции перефосфорилирования АДФ фосфорилируется в АТФ, а освобождающиеся молекулы ГДФ могут вновь фосфорилироваться (субстратное фосфорилирование). У растений фермент специфичен к АДФ и АТФ. 6. Сукцинатдегидрогеназа катализирует превращение сукцината в фумаровую кислоту. Фермент стереоспецифичен, является интегральным белком, так как вмонтирован во внутреннюю мембрану митохондрий и в качестве простетических групп содержит ФАД и железосерные белки. ФАДН2 не отделяется от фермента, а два электрона далее передаются на кофермент Q цепи переноса электронов внутренней 4 мембраны митохондрий. 7. Фумарат-гидратаза (фумараза) катализирует превращение фумаровой кислоты в яблочную (малат) с участием воды. Фермент стереоспецифичен, образует только L-малат. 8. Малатдегидрогеназа катализирует окисление яблочной кислоты в оксалоацетат. Кофермент малатдегидрогеназы - НАД+. Далее оксалоацетат вновь конденсируется с ацетил-КоА и цикл повторяется. 5 + Î êñàëî àöåòàò ÑÎÎ ÑÍ 2 Ñ ÑÎÎ ÑÍ ÑÎÎ - ÑÍ 3 Ñ O SÊî À Öèò ðàò ñèí ò àçà +H2O ~ ÑÎÎ Ñ O ÑÍ 2 ÑÎÎ - ÑÎÎ ÑÍ 2 Í Ñ ÑÎÎ ÑÍ ÎÍ ÑÎÎ - Àêî í èò àçà +Í 2Î - HS-KoA Àöåòèë-Êî À Öèñ-àêî í èòàò - ÑÎÎ ÑÍ 2 ÍÎ Ñ ÑÎÎ ÑÍ 2 ÑÎÎ Öèòðàò - È çî öèò ðàò äåãèäðî ãåí àçà (äåêàðáî êñèëèðóþ ù àÿ) Mg2+ Í ÀÄ+ Í ÀÄÍ +Í È çî öèòðàò Àêî í èò àçà -Í 2Î + ÑÎÎ ÑÍ 2 Í Ñ ÑÎÎ Ñ O ÑÎÎ - Í ÀÄ++Í 2Î +2,5 ÀÒÔ - Î êñàëî ñóêöèí àò ~ ÑÎÎ ÑÎÎ - Ñóêöèí èëò èî êèí àçà ÑÍ 2 2-î êñî ãëóò àðàò äåãèäðî ãåí àçà ÑÍ 2 Mg2+ ÑÍ 2 ÑÍ 2 Ñ O - ÑÎ 2 Ñ ÑÎÎ - ÑÎ 2 Í ÀÄ+ Í ÀÄÍ +Í + O SÊî À HS-KoA ÃÄÔ ÃÒÔ+ÀÄÔ Ðí 2-î êñî ãëóòàðàò Ñóêöèí èë-Êî À Í óêëåî çèääèô î ñô àò êèí àçà Í ÀÄ++Í 2Î +2,5 ÀÒÔ ÑÎÎ ÑÍ 2 ÑÍ 2 ÑÎÎ - Ñóêöèí àò äåãèäðî ãåí àçà - ÔÀÄ ÔÀÄÍ Ñóêöèí àò 2 ÑÎÎ ÍÑ ÑÍ ÑÎÎ - - Ôóì àðàò ÔÀÄ+Í 2Î +1,5 ÀÒÔ Ôóì àðàçà +Í 2Î ÃÄÔ + ÀÒÔ ÍÎ ÑÎÎ Ñ Í ÑÍ 2 ÑÎÎ - Ì àëàò äåãèäðî ãåí àçà - Í ÀÄ+ Í ÀÄÍ +Í + Ì àëàò Í ÀÄ++Í 2Î +2,5 ÀÒÔ ÑÎÎ Ñ O ÑÍ 2 ÑÎÎ Î êñàëî àöåòàò 4.2. Биологическое значение и регуляция цикла трикарбоновых кислот. Цикл трикарбоновых кислот – компонент общего пути катаболизма, в котором происходит окисление топливных молекул углеводов, жирных кислот и аминокислот. Большинство топливных молекул поступают в ЦТК в виде ацетил-КоА (рис. 1). Все 6 реакции ЦТК протекают согласованно в одном направлении. Суммарная величина G0 = -40 кДж/моль. В среде врачей давно бытует крылатая фраза «Жиры горят в пламени углеводов». Ее надо понимать как окисление ацетил-КоА, основным источником которого является β-окисление жирных кислот, после конденсации с оксалоацетатом, образуемой, главным образом, из углеводов (при карбоксилировании пирувата). При нарушениях обмена углеводов или голодании создается дефицит оксалоацетата, ведущий к уменьшению окисления ацетил-КоА в ЦТК. Рис.1. Роль ЦТК в клеточном дыхании. 1 стадия (ЦТК) извлечение из молекулы ацетил-КоА 8 электронов; 2 стадия (цепи переноса электронов) восстановление двух молекул кислорода и формирование протонного градиента (~36 Н+); 3 стадия (АТФсинтаза) использование энергии протонного градиента для образования АТФ (~9 АТФ) (Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. Biochemistry. N-Y: W.H.Freeman and Company, 2002). Основная метаболическая роль ЦТК может быть представлена в виде двух процессов: 1) серия окислительно-восстановительных реакций, в результате которых ацетильная группа окисляется до двух молекул СО2; 2) четырехкратное дегидрирование, ведущее к образованию 3 молекул НАДН+Н+ и 1 молекулы ФАДН2. Кислород необходим для функционирования ЦТК опосредованно как акцептор электронов в конце цепей переноса электронов и для регенерации НАД+ и ФАД. Основное значение для регуляции ЦТК имеет синтез и гидролиз АТФ. 1. Изоцитратдегидрогеназа аллостерически активируется АДФ путем повышения сродства фермента к субстрату. НАДН ингибирует этот фермент, замещая НАД+. АТФ также ингибирует изоцитратдегидрогеназу. Важно, что превращения метаболитов в ЦТК требуют на нескольких стадиях НАД+ и ФАД, количество которых достаточно только в условиях низкого энергетического заряда. 2. Активность 2-оксоглутаратдегидрогеназного (αкетоглутаратдегидрогеназного) комплекса регулируется аналогично регуляции пируватдегидрогеназного комплекса. Этот комплекс ингибируется сукцинил-КоА и НАДН (конечными продуктами превращений, катализируемых 2оксоглутаратдегидрогеназным комплексом). Кроме того, 2оксоглуттаратдегидрогеназный комплекс ингибируется высоким энергетическим зарядом клетки. Итак, скорость превращений в ЦТК уменьшается при достаточной обеспеченности клетки АТФ (рис. 11.2). У ряда бактерий цитратсинтаза аллостерически ингибируется АТФ посредством повышения Км для ацетил-КоА. Схема регуляции общего пути катаболизма представлена на рисунке 2. 7 Рис. 2. Регуляция общего пути катаболизма. Основными молекулами, регулирующими функционирование ЦТК являются АТФ и НАДН. Основными пунктами регуляции являются изоцитратдегидрогеназа и 2оксоглутаратдегидрогеназный комплекс. 4.3. Энергетическая роль общего пути катаболизма В общем пути катаболизма из 1 молекулы пировиноградной кислоты образуется 3 молекулы СО2 в следующих реакциях: при окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты, при декарбоксилировании изолимонной кислоты и при декарбоксилировании 2-оксоглутаровой кислоты. Всего при окислении 1 молекулы пировиноградной кислоты отнимается пять пар атомов водорода, из них одна пара – от сукцината и поступает на ФАД с образованием ФАДН2, а четыре пары – на 4 молекулы НАД+ с образованием 4 молекул НАДН+Н+ при окислительном декарбоксилировании пировиноградной, 2-оксоглутаровой кислот, дегидрировании изоцитрата и малата. В конечном итоге атомы водорода переносятся на кислород с образованием 5 молекул Н2О, а выделившаяся энергия аккумулируется в реакциях окислительного фосфорилирования в виде молекул АТФ. Общий итог: 1. Окислительное декарбоксилирование пирувата ~ 2,5 АТФ. 2. В ЦТК и сопряженных дыхательных цепях ~ 9 АТФ. 3. В реакции субстратного фосфорилирования ЦТК ~ 1 АТФ. В ЦТК и сопряженных реакциях окислительного фосфорилирования образуется примерно10 АТФ при окислении ацетильной группы одной молекулы ацетил-КоА Итого в общем пути катаболизма в результате превращений 1 молекулы пировиноградной кислоты выделяется примерно 12,5 молекул АТФ. 5 Амфиболическая функция цикла трикарбоновых кислот включает катаболические и анаболические реакции. Катаболические реакции – это окисление ацетил-КоА с выделением и запасанием энергии. Анаболические реакции (рис. 3): 1. Ацетил-КоА является исходным соединением для синтеза жирных кислот и, 8 следовательно, жиров, изопреноидов (включая стероиды), кетоновых тел. Ацетил-КоА служит донором ацетильной группы в синтезе различных эфиров (ацетилхолин, ацетилглюкозамин и др.). 2. Соединения, участвующие в ЦТК, образуют фонд промежуточных веществ, дающих начало ряду биосинтетических процессов. Например: 2-оксоглутарат является важнейшим акцептором аминогрупп в реакциях трансаминирования: превращается в глутаминовую кислоту, которая затем превращается в глутамин, пролин, орнитин, цитруллин, аргинин и другие метаболиты. Оксалоацетат является ключевым соединением для глюконеогенеза (синтеза углеводов). Путем трансаминирования из оксалоацетата образуются аспарагиновая кислота, аспарагин. Аспарагиновая кислота необходима для получения пиримидиновых нуклеотидов и некоторых аминокислот. Сукцинил-КоА может образовывать с глицином аминолевулиновую кислоту, которая конденсируется в порфобилиноген; последний далее используется в синтезе гема, цитохромов. Фумарат является одним из продуктов разложения ароматических аминокислот, он также образуется из аспарагиновой кислоты в цикле мочевины. Рис. 11.3. Биосинтетическая роль цикла трикарбоновых кислот. Подписи по стрелкам: Пируват; Ацетил-КоА; Цитрат; Жирные кислоты, стероиды; α-Кетоглутарат; Глутамат; Другие аминокислоты; Пурины; СукцинилКоА; Порфирины, гем; Оксалоацетат; Аспартат; Пиримидины, пурины, аминокислоты Главной задачей ЦТК является бесперебойное обеспечение субстратами процесса продукции энергии в митохондриях. Поэтому особое значение имеет так называемая анаплеротическая реакция, заключающаяся в синтезе оксалоацетата из пирувата, сопряженном с гидролизом АТФ: Пируват + АТФ + НСО3- → оксалоацетат + АДФ + Рн + Н+ Эту реакцию катализирует пируваткарбоксилаза, кофактором которой является биотин. Итак, общий путь катаболизма обеспечивает: 1) продукцию энергии в дыхательных цепях, поставляя в нее протоны и электроны; 2) ряд биосинтетических процессов, начинающихся от ацетил-КоА и метаболитов ЦТК. 6. Роль витаминов в регуляции общего пути катаболизма Семь витаминов выполняют функции кофакторов ферментов общего пути катаболизма. 9 1) Пируват- и 2-оксоглутаратдегидрогеназные комплексы: В1 - необходим для синтеза ТПФ; липоевая кислота (витаминоподобное вещество); пантотеновая кислота необходима для синтеза HS-КоА; В2 - необходим для синтеза ФАД; РР - необходим для синтеза НАД. 2) Биотин катализирует реакцию карбоксилирования пирувата с образованием оксалоацетата. 3) В6 необходим для синтеза пиридоксальфосфата, являющегося кофактором аспартат- и аланинаминотрансфераз, катализирующих превращение аспарата в оксалоацетат и аланина в пируват, соответственно. Перечисленные выше витамины должны составлять основу сбалансированных поливитаминных препаратов. 7. Глиоксилатный цикл. В клетках высших растений, плесневых грибов, ряда бактерий обнаружен глиоксилатный цикл (Г.Кребс, 1957), который служит механизмом пополнения промежуточных продуктов ЦТК. Глиоксилатный цикл – это видоизмененный ЦТК, в котором изоцитратдегидрогеназа и 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс заменены изоцитрат-лиазой, которая расщепляет изолимонную кислоту до янтарной и глиоксиловой кислот. Другой ключевой фермент цикла – малат-синтаза, которая катализирует реакцию конденсации ацетил-КоА с глиоксиловой кислотой с образованием L-малата и HS-КоА. Итак, в глиоксилатном цикле идут следующие превращения: Оксалоацетат + ацетил-КоА → лимонная кислота → цис-аконитовая кислота → изолимонная кислота (выделяется сукцинат) → глиоксиловая кислота + ацетил-КоА→ яблочная кислота (выделяются 2Н) → оксалоацетат. Таким образом, при каждом обороте цикла в него включаются две молекулы ацетил-КоА и выделяется одна молекула янтарной кислоты. На последнем этапе цикла в малатдегидрогеназной реакции выделяются 2 атома водорода, которые в цепях переноса электронов дадут ~2,5 молекулы АТФ. Глиоксилатный цикл найден у микроорганизмов и дрожжей, использующих в качестве энергетического и пластического материала двухуглеродные соединения, например глицин или гликолевая кислота. Если уксусная кислота и этанол включаются в ЦТК в виде ацетил-КоА, то глицин и гликолевая кислота окисляются до глиоксиловой кислоты. В тканях растений с помощью глиоксилатного цикла протекает превращение жиров в углеводы. Особенно активно этот процесс реализуется в прорастающих семенах масличных растений. Резервные триацилглицеролы расщепляются до жирных кислот, окисление последних ведет к образованию ацетилКоА, который в реакциях глиоксилатного цикла дает янтарную кислоту. Последняя превращается в углеводы через реакции ЦТК и глюконеогенеза. Глиоксилатный цикл локализуется в микротельцах растений, называемых глиоксисомами. Глиоксилатный цикл найден у беспозвоночных нематод и трематод (Fasciola hepatica). Появляются отдельные сообщения о выявлении ключевых ферментов глиоксилатного цикла в тканях позвоночных на стадии эмбриогенеза и в печени голодавших крыс. 10
