Полный текст работы
реклама
Специализированный учебно-научный центр МГУ им. М.В Ломоносова — Школа им. А.Н. Колмогорова Тем а: Оцен ка ДНК повр ежда юще й спос обно сти неко торы х бакт ерио стат ических антибиотиков в условиях in vitro. Подготовил: Миронов Иннокентий Дмитриевич, 10 “Н” класс. Научный руководитель: Синюшин А.А., к.б.н., Биологический факультет МГУ им.М.В.Ломоносова Москва, 2012 Введение ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота — полимер, выполняющий функцию хранения и передачи наследственной информации в живых системах. Впервые предположение о существовании наследственных факторов было высказано Гриффитом на основании опытов с R и S штаммами пневмококков (Streptococcus pneumoniae), концепция была развита Маклеодом и Маккартни [1], Уотсоном и Криком было сформироно представление о химической структуре молекулы ДНК, как о двойной спирали, построенной по принципу комплементарности [2]. Повреждение ДНК, денатурация, изменение химической структуры может привести к негативным последствиям для живых организмов, в крайнем случае — быть следствием гибели. Необходимо отметить, что повреждение может оказать воздействие как на онтогенез конкретной особи, так и на развитие последующих генераций. Так, «талидомидовая трагедия» 60-х годов прошлого столетия привела к рождению большого количества детей с дефектами конечностей (фокомелия), а также повреждениями во многих внутренних системах органов [3]. Данное тератогенное воздействие обусловлено наличием у талидомида двух оптических изомеров: R-энантиомер оказывает лекарственное действие, S-энантиомер встраивается в ДНК на участке, богатом парами G-C, вызывая нарушения транскрипции. Повреждение ДНК может быть вызвано различными факторами: радиационное и УФоблучение, термическое воздействие, ошибки при репликации и сборке нуклеотидов, деятельность вирусов (Retroviridae и др.).Среди экзогенных химических веществ также можно выделить ряд соединений, обладающих ДНК-повреждающей способностью. В настоящее время данный список пополняется за счет синтеза новых веществ. Нередко полученные соединения используются как лекарственные средства (антибиотики и др.), что обусловливает высокую вероятность воздействия на ДНК клеток человека. Кроме того, целенаправленное получение подобных соединений является перспективным направлением разработки противоопухолевых препаратов. Естественные модифицированные нуклеотиды широко используются в живых системах. Таким образом, изучение ДНК-повреждающей и ДНК-модифицирующей способности физико-химико-биологических факторов представляется весьма актуальным. В настоящей работе рассмотрены аспекты, касающиеся ДНК-повреждающей способности химических агентов, применяемых в современной медицине в качестве лекарственных средств. Цель: оценить степень эффективности некоторых бактериостатических антибиотиков как ДНК-повреждающих агентов в условиях in vitro. Задачи 1.Для получения полинуклеотидных фрагментов провести полимеразно-цепную реакцию с геномной ДНК Pisum sativum L. в качестве субстрата. 2.После инкубации повреждающих агентов с полученными фрагментами провести электрофорез экспериментальных и контрольного образцов. 3.На основании длины пробега полидезоксирибонуклеотидных фрагментов оценить степень деградации ДНК и эффективность действия исследуемых веществ. Теоретический обзор Итак, предложенная в 1953г. модель трехмерной структуры ДНК заключается в следующем. Молекула ДНК представляет собой двойную спираль и состоит из полинуклеотидных цепей, закрученных в противоположные стороны вокруг общей оси. Пуриновые и пиримидиновые основания (аденин и гуанин, тимин и цитозин соответственно) расположены внутри спирали, а остатки фофсфата и дезоксирибозы – снаружи. Диаметр спирали 20 А, расстояние между соседними основаниями вдоль оси спирали 3,4 А, они повернуты относительно жруг друга на 36 градусов. Таким образом, на полный виток спирали приходится 10 нуклеотидов. Две спирали удерживаются вместе водородными связями между парами оснований, причем тимин образует связи только с аденином, гуанин – только с цитозином (принцип комплементарности). Пара А-Т образует две водородные связи, пара G-C – три. Таким образом, общее число пуриновых остатков равно общему количеству пиримидиновых (правило Чаргаффа). [4] При рассомотрении повреждений ДНК в первую очередь необходимо остановиться на воздействии радиационного излучения. Выделяются прямой и косвенный механизмы воздействия. Прямой механизм связан с непосредственным поглощением энергии молекулами ДНК. Это вызывает скручивание молекул, раскрытие двойных связей и др. При косвенном воздействии молекулы ДНК изменяются Рис.1. Продукты радиолиза воды под действием продуктов радиолиза воды – распада воды под действием радиоактивного излучения (рис.1), а также других форм радикалов и перекисей. Установлено, что при косвенном действии независимо от разведения раствора абсолютное число поврежденных молекул остается постоянным, а доля их от общего числа изменяется обратно пропорционально их концентрации. В отличие от косвенного, при прямом действии число инактивированных молекул при заданной дозе увеличивается пропорционально концентрации раствора, а доля от общего числа молекул остается постоянной. Данная звкономерность получила название “эффекта разведения” (рис.2), [5]. УФ - облучение вызывает образование тиминовых димеров, ультрафиолет разрушает связи в гетероциклических молекулах пиримидиновых азотистых оснований. Если при этом в последовательности ДНК два пиримидиновых нуклеотида находятся рядом, возможно образование Рис.2.Эффект разведения. 1 – прямое, 2 – косвенное воздействие [5] ковалентных связей между их азотистыми основаниями. [6] В результате этого появляется пиримидиновый димер циклобутанового типа, который нарушает третичную структуру молекулы ДНК. Порог термической денатурации ДНК определяется температурой плавления - 80-90 градусов. Происходит разрушение водородных связей и разъединение двойной цепи. Данное свойство получило применение в молекулярной биологии. Так, полимеразно-цепная реакция (ПЦР) начинается с процесса денатурации ДНК. Биогенные, или естественные, повреждения ДНК, обуславливающие наследственную мутационную изменчивость, определяются следующими основными процессами: 1.Ошибки спаривания при репликации. Основания в матричной цепи ДНК могут переходить в другую таутомерную форму, которая способна присоединить неканоническое основание в комплементарной цепи. Для азотитстых оснований характерна кето-енольная и амино-иминная таутомеризация. Данные таутомерные переходы подчиняются закономерности, сформулированной Ингольдом [7]: “Если в гетероциклических молекулах протоны, связанные с атомами азота, способны переходить на другие свободные атомы азота либо на атомы кислорода кетогруппы, то в растворе эти молекулы будут присутствовать в виде двух таутомерных форм, переходящих одна в другую». В енольной форме G становится подобен A, а U(T) – C; в иминоформе A эквивалентно U(T) или G, а C – U(T). В природных условиях преобладают кето- и аминоформы, их доля в растворах составляет >99,99% [8]. 2.Спонтанное отщепление основания от цепи ДНК. Как правило, происходит депуринизация - разрыв N-гликозидной связи между пурином и дезоксирибозой (рис.3). Тогда в молекуле ДНК на месте этих оснований образуется участок, лишённый азотистых оснований, названный АP-сайтом (апуриновый сайт). Рис.3. Депуринизация [9] 3.Дезаминирование цитозина. Дезаминирование цитозина приводит к его превращению в урацил (рис.4) Соответственно, при дезаминировании аденина образуется гипоксантин, гуанина — ксантин. Рис.4. Дезаминирование цитозина [9] Действие внешних факторов химической природы Алкилирующие агенты — вещества, способные ковалентно присоединять алкильные радикалы к активным группам нуклеотидов ДНК: Такой способностью обладают сернистый и азотистый иприты, многие промышленные токсиканты, лекарственные (противоопухолевые) препараты (производные дихлорэтиламина: циклофосфамид, мелфалан; производные нитрозомочевины: кармустин, ломустин; алкилсульфонаты: бисульфан; цисплатин (рис.5). К числу способных к алкилированию активных групп пуриновых и пиримидиновых оснований относятся: Азот в 1, 3, 7 положениях молекулы аденина; Азот в 3,7 положениях и кислород в 6 положении молекулы гуанина; Азот в 3 и кислород во 2 положении молекулы цитозина; Рис. 5. некоторые алкильные агенты Азот в 3 и кислород во 2 и 4 положении молекулы тимина. Так, алкилирование аминогрупп галогенсодержащими соединениями протекает по механизму нуклеофильного замещения галогена: на первой стадии образуется аммониевый хлорид, нуклеофильным агентом служит амин за счет неподеленной электронной пары. На второй стадии аммониевая соль разрушается под действием другой молекулы исходного амина (другой аминогруппы нуклеотида), выступающей в роли основания. Алкилирование аденина используется в живых системах, его продукты носят название цитокининов и являются важнейшими растительными гормонами [8]. Ионы металлов обладают способностью связываться с ДНК, причем в случае связывания некоторых ионов (Cu2+) с основаниями наблюдается значительная дестабилизация двуцепочечной структуры. Наиболее реактоспособными являются катионы (2+) магния, кобальта, никеля. В медицине используются противоопухолевые платиновые антибиотики, подавляющие активность ДНК как матрицы (приводят к образованию «синего платинового» - комплексов платины с тимином) [8]. В современной медицине используются также готовые модифицированные нуклеотиды, которые встраиваются вирусом или опухолевой клеткой в свою полинуклеотидную цепь и вызывают летальные нарушения репликации и транскрипции. Модификации может подвергаться как азотистое основание, так и сахарный остаток. Так, альфа-нуклеотиды, обладающие антиметаболическим действием, являются энантиомерами обычных нуклеотидов, ассметрическим центром служит углерод дезоксирибозы при N-гликозидной связи. Альфа-нуклеозидный компонент также входит в состав Vit.B12 [8]. Методы и материалы Для получения экспериментального материала в виде полидезоксирибонуклеотидных фрагментов была осуществлена полимеразно-цепная реакция (PCR). Использовалась ДНК растительной клетки, экстрагированная из гороха посевного Pisum sativum L. Геномная ДНК данного вида была разбавлена деионизированной водой в соотношении 1:500. Рис.6. Механизм PCR Использовались праймеры, фланкирующие внутренние транскрибируемые спейсеры (ITS — некодирующие участки генов рибосомальной ДНК) ITS1 – 5.8S-ITS2: PrL(прямой) 5'- TCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3' и Pr4(обратный) 5'-TCCTCCGCTTATTATTGATATGC-3' [12, цит. по: [10], [11]]. Реакция была проведена в 21 микропробирке (V=500 μl). Состав реакционной смеси для каждой емкости: 2,5 ммоль MgCl2, 0,25ммоль каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP), 1,2μl р-ра, содержащего Taq-полимеразу и крезоловый красный (рис.7), 0,13μl прямого праймера (PrL) и 0,16μl обратного (Pr4) праймера, 5,3μl ДНК. Общий объем смеси для одной пробирки V=25μl. Перемешивание компонентов проводилось при помощи микроцентрифуги. В каждую пробирку добавлено небольшое количество минерального масла для обеспечения эффективной амплификации на данном приборе (MC2+ thermal cycler). Амплификация проводилась при следующих заданных параметрах: 94°C на 2 мин для начальной денатурации; 5 циклов по 30с при 94°C; 30с при 60°C; 2 мин 70,5°C для процесса элонгации; 30 циклов по 20с при 93°C; 30с при 58°C; 1мин при 71,5°C -элонгация; дефинитивная элонгация в течение 5 мин при 72°C (для данного прибора — программа FK58). Общий принцип механизма PCR отображен на рис.6. После амплификации для выделения ДНК из смеси (Vобщ=0,525мл) было добавлено 131,25μl (Vобщ/4) 5М NaCl и 1,05мл (2Vобщ) 96%C2H5OH ( вся смесь собрана в две микропробирки V=1,5 ml каждая), после чего ДНК осаждалась при T=-20°C в течение 2-24ч. Данные реагенты вызывают выпадение ДНК в осадок и изменение окраски раствора, вследствие изменения его кислотности (индикаторные свойства крезолового красного, изначально добавленного вместе с Taqполимеразами).После центрифугирования образовавшегося осадка жидкая фаза сливалась, добавлялось 0,4ml 96% этанола и вновь производилось центрифугирование (t=10мин). Данная операция (промывка спиртом) повторяется два-три раза. Оставшаяся чистая ДНК высушена в термостате, к ней добавлено 100μl деионизированной воды. В качестве модельных объектов для изучения воздействия бактериостатических антибиотиков на геномную ДНК были выбраны следующие вещества: ципрофлоксацин (рис.10), хлорамфеникол (левомицетин) (рис.11) и бисептол (рис.12), взятые в составе соответствующих лекарственных препаратов. Приготовлены 10% растворы Произведена инкубация модельных растворов с ДНК Pisum sativum: в пять микропробирок помещено по 5μl исследуемого вещества (в контрольных емкостях использовалась деионизированная вода) и 5μl ДНК (всего – 20 емкостей, три экспериментальных и одна контрольная серия). Полученные смеси выдерживались в термостате в течение 50 минут при температуре T=38°C. Агарозный гель для электрофореза был приготовлен следующим образом: на 3л дистиллированной воды взято: Рис.7. Taq-polymerase Termus aquaticus тригидроксиметиламинометана: 22,4 г; EDTA: 2,22г; борной кислоты: 16,5г. После перемешивания обозначенных компонентов образуется буферный раствор (3BE — буфер). На 150ml 3BE взято 3г агарозы, произведено плавление в СВЧ-печи. Перед застыванием в гель добавлено 15μl бромистого этидия — избирательно связывающегося с нуклеиновыми кислотами красителя, флюоресцирующего красным цветом в УФ-излучении. Застывший гель (загустение при комнатной температуре в специальной емкости с набором пластиковых «гребенок», образующих лунки (углубления) в геле) был помещен в ванну для электрофореза. В каждую из 20 опытных пробирок добавлено по капле раствора глицерина, содержащего красный краситель(для обозначения общего фронта при форезе). Перед запуском электрофореза исследуемые растворы помещены в лунки (V — несколько μl) агарозного геля (рис.8). В отдельную лунку помещен маркер молекулярной массы – раствор, содержащий нуклеотидные фрагменты известной длины, на основании длины пробега которых возможно оценить длину исследуемых фрагментов с длиной пробега X. Время разгона t=30мин. Результаты визуализировались путем просмотра пластинки с агарозным гелем в проходящем УФ-излучении (флюоресцентные свойства бромистого этидия). Длина пробега определялась с фотографии, при помощи компьютерной программы «Measure» (при известной длине лунки в геле (l=4мм) эта величина измерялась в пикселях (3 повторности приводились к среднему значению), и при расчете длины пробега производился обратный перевод). На основании длины пробега полинуклеотидных фрагментов оценивалась длина амплифицированного в ходе PCR участка генома Pisum sativum L. и степень деградации исходного материала при воздействии модельных химических веществ. Результаты и их обсуждение Результаты электрофореза трех экспериментальных и одного контрольного образцов представлены на рис.9. Расчет длины пробега ДНК-фрагментов из маркера молекулярной массы приведен в табл.1. Может быть справедлив тезис о наличии обратной квадратичной зависимости y=1/x2 между данными величинами. Рис.10. Электрофорез контрольных образцов При сравнении длины пробега маркеров и ДНК пяти контрольных образцов (рис.10) выявлено, что длина пробега амплифицированного в ходе PCR фрагмента составляет Lср=19,92мм, что соответствует длине цепи ок. 400 нуклеотидных пар (0,4 кб). Наибольшая длина пробега — 32мм, что соответствует длине в 200 п.н. Таблица 1. Длины пробегов модельных полинуклеотидных фрагментов Длина фрагмента, Длина пробега, мм килобаз (тыс.п.н.) 2 3,33 1,5 6,57 1 9,44 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 10,55 11,39 12,72 14,11 15,59 При воздействии бисептола и ципрофлоксацина на ДНК (рис.11) наблюдается высокая степень деградации исследуемого биополимера, вследствие отсутствия длинных нуклеотидных фрагментов (Lmin=18,5мм — минимальная длина, на которой различима флюоресценция бромистого этидия. Визуально различимая Lmax=33,9мм превышает таковую у контрольных образцов, что подтверждает высокую рестриктивную активность данных химических агентов. Средняя длина фрагментов Lmed — ок. 30mm, что в существенной мере отличется от контрольного показателя. При электрофорезе ципрофлоксацина было отмечено наличие в растворах лунок положительно заряженного вещества, мигрирующего к катоду и интенсивно флюоресцирующего синим цветом в УФ-излучении (см. рис.9). Рис.11. Форез ц-на и б-ла Этот факт объясняется тем, что изучаемые бактериостатические антибиотики были взяты не в чистом в виде, а в составе соответствующих лекарственных препаратов (см. материал и методы). Таким образом, в состав «цетролета» (препарата, содержащего ципрофлоксацин) входит вещество, обладающее описанными свойствами, что делает препарат ценным модельным объектом, который может быть использован в ряде биохимических, молекулярно-биологических и медицинских иследований. Рис.12 Форез левомицетина При изучении степени деградации ДНК при воздействии левомицетина (рис.12) не выявлено видимых отличий по сравнению с контролем (Lmax=32,26mm; Lmed=19,7mm), что позволяет сделать вывод об отсутствии вляния даного фактора на скорость деградации полидезоксирибонуклеотиднх фрагментов в условиях in vitro. Данные о трех рассмотренных параметрах у разных образцов сведены в табл.2. Таблица2. Основные характеристики результатов электрофореза экспериментальных образцов Длина пробега,мм/Длина фрагмента, кб Lmin Lmed Lmax Контроль 0/>2 19,92/0,4 32/0,2 Бисептол 18,5/0,45 30/0,2 33,9/0,2 Ципрофлоксацин 30/0,2 33,6/0,2 Левомицетин 0/>2 19,7/0,4 32,6/0,2 Следует отметить, что в контрольной серии и серии с левомицетином также наблюдается некоторый уровень рестрикции исходного материала, связанный с действием таких мутагеных факторов, как свет, вода, температура и пр. Таким образом, два из рассмотренных веществ обладают рестриктивной активностью. На основании результатов настоящей работы можно сделать предположение о том, что хлорамфеникол является более безопасным средством, в рамках рассмотренного аспекта. Выводы 1.Для получения идентичных полинуклеотидных фрагментов была осуществлена полимеразно-цепная реакция (PCR) с геномной ДНК Pisum sativum в виде субстрата. 2.Выявлена рестриктивная активность бисептола и ципрофлоксацина, средняя длина нуклеотидного фрагмента уменьшена вдвое, по сравнению с контролем. 3. Зафиксировано отсутствие влияния левомицетина на длину полидезоксирибонуклеотидных фрагментов в условиях in vitro. 4.В составе препарата «Цетролет» отмечено наличие положительно заряженного вещества, интенсивно флюоресцирующего в УФ-излучении. Заключение Таким образом, в данной работе произведен экспериметальный анализ степени опасности некоторых бактериостатических антибиотиков как мутагенных факторов, показана возможность использования одного из препаратов в качестве модельного объекта, что в перспективе может явиться почвой для создания методики. В настоящее время существует большое количество других ДНК-повреждающих агентов, обладающих разнообразными мишенями и механизмами воздействия. Синтезируются новые химические факторы, обладающие ДНК-повреждающей активностью. Повышается уровень УФО, вследствие уменьшения толщины озонового экрана. С одной стороны, данная тенденция является негативной вследствие повышения вероятности различных заболеваний, в т.ч. наследственных. С другой, получение данных химических соединений определяет перспективу развития медицины в области лечения опухолевых, вирусных и бактериальных заболеваний. Использованная литература 1.Avery, MacLeod, and McCarty. «Studies on the Chemical Nature of the Substance Inducing Transformation of Pneumococcal Types: Induction of Transformation by a Desoxyribonucleic Acid Fraction Isolated from Pneumococcus Type III». Journal of Experimental Medicine 79 (1): 137–58, 1944. 2. Watson J.D., Crick F.H.C. The structure of DNA. - Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1953, v.18, p.123-131. 3.Castilla et all. Thalidomide, The current of teratogen in South America. - Teratology 54: 273-277, 1996. 4. Кузьменко Н.Е., Еремин В.В., Попков В.А. Начала химии. Современный курс для поступающих в вузы: учебник. - М.: Экзакмен, 2010. 831с. 5.Бак З., Александер П. Кислородный эффект при действии ионизирующих излучений, М., 1959; Основы радиобиологии, пер. с англ., М., 1963. 6. Patrick M. H., Rahn R.O. , Photochemistry of DNA and polynucleotides: photoproducts, in S. Y. Wang ted.), Photochemishy and photobiology of nucleic acids, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976, pp. 35-95. 7.Ingold C.K. Structure and Mechanism in Organic Chemistry, Cornell Univ. Press, New York, 1953. 8.Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. Перевод с английского. - М.: «Мир», 1987. 584с. 9.Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003. 779 с. 10.White, T. J., Bruns, T., Lee, S. & Taylor, J. W. 1990: Amplification and direct sequencingof fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. — In: Innis, M. A., Gelfand, D. H.,Sninsky, J. J. & White, T. J. (eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods andApplications: 315–322. Academic Press, New York. 11.Hsiao, C., Chatterton, N. J., Asay, K. H. & Jensen, K. B. 1994: Phylogenetic relationshipsof 10 grass species: an assessment of phylogenetic utility of the internal transcribedspacer region in nuclear ribosomal DNA in monocots. — Genome 37: 112–120. 12. BobrovA. A., Sinjushin A. A. Morphological and molecular confirmation of the hybrid Potamogeton × salicifolius (P. lucens × P. perfoliatus,Potamogetonaceae) in Upper Volga region (Russia), Saint-Petersburg — Moscow, KOMAROVIA, 2008. с1–9.
