http://www.biolabmix.ru Выделение нуклеиновых кислот Наименование Реагент для выделения РНК из клеток и тканей «ЛИРА» Описание Предназначен для проведения лизиса биологических материалов для последующей фенол-хлороформной экстракции нуклеиновых кислот Кат. № Количество, мл LR-0100 100 LR-0200 200 Меры предосторожности: Осторожно! Реагент для лизиса клеток тканей содержит агенты, оказывающие раздражающее и токсичное действие. При работе с реагентом необходимо соблюдать правила общей и личной техники безопасности. Токсичен при попадании на кожу и внутрь. Вызывает ожоги. Работайте под тягой! При попадании на кожу промойте немедленно большим количеством воды и моющего средства (детергента). При необходимости покажитесь врачу. Описание продукта: Реагент используют для выделения РНК из клеток и препаратов тканей животных и растений. Протокол применения: Для выделения РНК из клеток и тканей необходимо провести полный лизис биологического образца с использование реагента «ЛИРА». Для этого к образцу добавьте реагент в количестве достаточном для получения однородного прозрачного лизата. Ориентировочные количества необходимого реагента: для клеток млекопитающих, собранных из монослоя или суспензии центрифугированием – 900 мкл на 2-5 млн клеток; при лизисе в культуральной посуде – 900 мкл на 10 см2 (реагент должен равномерно покрыть всю площадь); для образцов тканей – 900 мкл на 40-80 мг ткани (на качество препарата РНК, в первую очередь, влияют условия хранения образца ткани; гомогенизацию ткани необходимо проводить непосредственно в реагенте). Проведите лизис образца при комнатной температуре в течение 3-10 мин. Соберите лизат в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл (при необходимости можно использовать стандартные пробирки большего объема). К лизату добавьте хлороформ в количестве 1/5 от объема литического реагента, энергично перемешайте в течение 15 секунд и разделите фазы смеси центрифугированием при 12000 g при 4 ºС в течение 10 минут. Отберите аккуратно водную фазу (!!! не захватывая интерфазы) и перенесите в чистую пробирку. К водной фазе добавьте равный объем изопропилового спирта, тщательно перемешайте и выдержите в течение 10 минут при комнатной температуре (для повышения выхода РНК можно выдерживать при пониженных температурах до -20 ºС и использовать холодный изопропиловый спирт), затем проведите центрифугирование при 16000 g при 4 ºС в течение 15 минут. Супернатант удалите, осадок промойте 80% этанолом (используя этиловый спирт объемом не менее половины объема исходного лизата), для формирования осадка на дне пробирки проведите центрифугирование при 12000 g при 4 ºС в течение 5 минут. Полученные осадки подсушите на воздухе в течение 15-30 мин и растворите в деионизованной воде (!!! специально подготовленной без РНКаз) для дальнейшего использования и хранения. После выделения РНК определите оптическую плотность растворов при длинах волн 260 и 280 нм. Соотношение 260/280 для растворов РНК должно соответствовать диапазону 1,60 – 1,95. Примечания: при работе с РНК всегда необходимо использовать перчатки и специально подготовленные посуду и растворы без РНКаз для предотвращения деградации РНК; для повышения выхода РНК на стадии осаждения можно использовать ацетат натрия (до 0,3 М) и соосадители (например, гликоген в концентрации 5-10 мг/мл).