токсоплазмоз - Дагестанская государственная медицинская
реклама
Министерство здравоохранения и социального развития РФ Дагестанская Государственная медицинская академия ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ТОКСОПЛАЗМОЗА Учебное пособие для студентов, слушателей ФПО, врачей - лаборантов Махачкала – 2006 Составители: доценты кафедры микробиологии Саидов М.С., Царуева Т.В., – ассистент, к.м.н. Саидова Б.М., ст.преподаватель кафедры ОМЗ и ОЗД ДГПУ Рабаданова П.М. Рецензент: зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии профессор Меджидов М.М. Рекомендовано центральным координационным методическим советом ДГМА для печати и использования в учебном процессе (протокол №7 от 13.04.2006. 2 ТОКСОПЛАЗМОЗ Среди инфекционных причин перинатальной патологии токсоплазмоз занимает одно из важных мест. На каждую тысячу новорожденных в разных странах приходится от 1 до 8 детей с врожденным токсоплазмозом, в Дагестане - 5-6 на 1000 новорожденных. Возбудитель токсоплазмоза Toxoplasma gondii относится к типу простейших, к классу споровиков. Пролиферативная форма паразита (трофозоит) имеет форму полумесяца. По методу Романовского-Гимза протоплазма окрашивается в голубой цвет, а ядро - в рубиново-красный. Токсоплазма - внутриклеточный паразит. При острой стадии заболевания размножается внутри клеток путем продольного деления и эндодиогении (внутреннего почкования), образуя в клетках мозга, лимфатических узлов и других паренхиматозных органов так называемые псевдоцисты. Скопления токсоплазм в тканях при хроническом токсоплазмозе отличаются от псевдоцист наличием твердой оболочки. Эти скопления содержат до 1000 и более паразитов и называются истинными цистами. Истинные цисты локализуются в тканях головного мозга, глаз, матки, сердца и других органов. Половой цикл развития возбудитель проходит в эпителии кишечника домашней кошки и приводит к образованию ооцист, которые выделяются с фекалиями во внешнюю среду и через 3-4 дня, необходимых для их созревания, становятся инвазионными. Ооцисты обладают высокой устойчивостью к различным неблагоприятным факторам внешней среды. Токсоплазмоз является широко распространенной паразитарной инфекцией. В разных странах мира от 6 до 80% населения заражено токсоплазмозом. Инфицированность токсоплазмозом женщин детородного возраста в нашей республике колеблется от 15 до 50% и более. Основным источником заболевания для человека являются сельскохозяйственные и домашние животные, птицы: крупный рогатый скот, овцы, козы, свиньи, кошки.собаки, куры.утки и др. Среди этих источников инфекции надо выделить домашних кошек и представителей семейства кошачьих, являющихся дефинитивными хозяевами, в организме которых происходит половой цикл развития токсоплазм. Заражение человека может происходить несколькими 3 путями. Основной и наиболее распространенный - это алиментарный путь передачи. Заражение цистами токсоплазм происходит при употреблении термически плохо обработанных продуктов животного происхождения, в первую очередь, мяса. Возможно заражение при употреблении в пищу сырых яиц, молока. Заражение происходит через грязные руки, пищевые продукты, овощи, зелень, загрязненные ооцистами токсоплазм. Контаминационный путь передачи - через поврежденную кожу и слизистые на практике не имеет решающей роли. Тем не менее, этим путем возможно заражение животноводов, работников мясокомбинатов, домашних хозяек, а также медицинских работников - хирургов, акушеров-гинекологов, клинических лаборантов, медсестёр и т.д. Гемотрансфузионный путь передачи возможен при переливании крови, пересадке костного мозга. Несомненна роль человека - беременной женщины - как источника инфекции при внутриутробном заражении токсоплазмозом плода. Как уже указывалось, заражение плода происходит от беременной с острой токсоплазмозной инфекцией, приобретенной во время данной беременности. Передача возбудителя инфекции плоду происходит независимо от того, как протекала первичная токсоплазмозная инфекция у беременной: с явными клиническими признаками или бессимптомно. Результаты наших проспективных исследований, проведенных в республике, показывают, что частота первичной инфекции у беременных составляет 13 на 1000. Внутриутробное заражение плода происходит, как правило, начиная с 3-го месяца беременности и частота передачи токсоплазм плоду нарастает к 3-му триместру. В среднем у женщин, заразившихся токсоплазмозом во время беременности, передача инфекции плоду происходит в 40-50% случаев. Старая (хроническая) инфекция беременной в плод не передается и риска для заражения плода нет. Различают приобретённый и врожденный токсоплазмоз. Приобретенный токсоплазмоз в зависимости от продолжительности болезни делится на острый и хронический. Во многих случаях острый токсоплазмоз у беременных, как и у большинства взрослых людей, происходит с малой, стертой симптоматикой (лимфадениты, чаще заднешейные, затылочные, подчелюстные, мало или вовсе безболезненные, субфебрильная температура, легкий, скоропроходящий энтерит) или полностью бессимптомно. Число бессимптомных форм от числа пер4 вично заразившихся во время беременности составляет 80-90%. Хронический токсоплазмоз начинается постепенно, с явлениями общей интоксикации, характеризующейся общей слабостью, утомляемостью, адинамией, снижением аппетита, головными болями, иногда очень упорными, болями в мышцах и суставах. Очень часто у больных с хроническим токсоплазмозом отмечается субфебрильная температура (37,2-37,9оС), которая держится довольно долго. На этом фоне выявляется локальная симптоматика со стороны лимфатических узлов, ЦНС, глаз, миокарда, у женщин с хроническим приобретенным токсоплазмозом возможно равитие специфических воспалительных заболеваний гениталий в виде эндометрита, сальшшгооофорита. Результаты проспективных исследований беременных, проведенных в г.Махачкале показали,что у женщин с хронической токсоплазмозной инфекцией достоверно чаще, чем у женщин, свободных от токсоплазмоза, наблюдалась угроза прерывания беременности (41,3% против 19,6%, p<0,01), а в исходах чаще отмечались самопроизвольные выкидыши и преждевременные роды. Врожденный токсоплазмоз является результатом внутриутробного (трансплацентарного) заражения плода токсоплазмами. В зависимости от времени внутриутробного заражения плода Тальхаммер (1957) различает три клинические формы врожденного токсоплазмоза: острую, подострую и хроническую, частота которых распределяется в соотношении 1:10:100. Острая генерализованная форма врожденного токсоплазмоза - результат заражения плода в поздние сроки беременности. Общее состояние новорожденных тяжелое, температура чаще низкая или субфебрильная, редко высокая. Как правило, отмечаются желтуха различной интенсивности, увеличение печени и селезенки. Одновременно поражаются и другие внутренние органы (миокард, легкие), дети плохо прибавляют в весе. Кожные покровы у них цианотичны, могут быть отеки, макуло-папулезная сыпь, иногда петехии. Подострая форма врожденного токсоплазмоза в виде выраженного энцефалита или менингоэнцефалита может наблюдаться у новорожденных детей в тех случаях, когда острая стадия прошла внутриутробно, или же явления энцефалита или менингоэнцефалита могут присоединиться у них к картине генерализованного токсоплазмоза. Наиболее часто встречается хроническая форма врож5 денного токсоплазмоза, когда у новорожденных отмечаются тяжелые, нередко необратимые изменения со стороны ЦНС - выраженная гидроцефалия, поражение сетчатки (хориоретинит) или пороки развития глаз - мик-рофтальм, анофтальм как последствия воспалительного процесса, внутримозговые кальцификаты. Гидроцефалия, хориоретинит и внут-римозговые кальцификаты описаны как "классическая триада" симптомов врожденного токсоплазмоза. Следует отметить, что только 1/2-1/3 заразившихся внутриутробно детей имеют клинически выраженные проявления токсоплазмоза. В остальных случаях - это бессимптомные врожденные токсоплазмозные инфекции, но тем не менее у таких детей возможны более поздние проявления заболевания, чаще со стороны ЦНС и глаз. Для установления диагноза приобретенного токсоплазмоза необходимо исключить все другие заболевания со сходной клинической картиной. Дифференциальную диагностику врожденного токсоплазмоза необходимо проводить с такими заболеваниями, как гемолитическая болезнь новорожденных, врожденная атрезия желчных путей, с родовой внутричерепной травмой, опухолями мозга, с врожденными инфекциями, как листериоз, цитомегалия, сифилис. Ведущую роль в диагностике токсоплазмоза играют микробиологические методы исследования. Микробиологическая диагностика токсоплазмоза Микробиологическая диагностика токсоплазмоза состоит из паразитологического, серологического и аллергического методов диагностики. а) материалом для исследования при паразитологических исследованиях являются: спинномозговая жидкость, кровь, соскобы из полости матки, плацента, органы абортированного плода и мертворожденных, биоптаты мозга, лимфоузлов, других органов и тканей. Для антенатальной паразитологической диагностики исследуется также амниотическая жидкость и кровь, взятые путем амнио- и кордоцентеза. Взятие материала производится с соблюдением мер асептики. Материал помещают в стерильную посуду: чашки Петри, флаконы, пробирки и доставляется в лабораторию в кратчайшие сроки (в течение 1-2 часов); б) материалом для серологических исследований является кровь, взятая в сухую стерильную пробирку с соблюдением мер 6 асептики, в количестве 3-5 мл. Взятие крови лучше производить натощак. Для диагностики врожденного токсоплазмоза используется также пуповинная кровь или кровь плода, полученная путем кордоцентеза. После отделения сыворотки ее помещают в стерильную пробирку. Допускается хранение сыворотки в течение нескольких дней (до 3-5) при температуре 2-40С. Определение антител производят не только в сыворотке крови, но и в других биологических жидкостях – ликворе, слюне и т.д. Для диагностики врожденного токсоплазмоза с поражением ЦНС важно исследовать ликвор с целью обнаружения антител к токсоплазмам; в) в качестве материала для исследования при ПЦР используют кровь, сыворотку, ликвор, амниотическую жидкость, биоптаты органов и тканей. Для исключения контаминации проб, забор материала производят только одноразовым инструментарием (шприцы, зонды и пр.). Взятый материал помещают в одноразовые пробирки или тщательно вымытые хромовой смесью стеклянные флаконы. Каждый образец, для исключения взаимной контаминации, хранят и транспортируют в отдельном полиэтиленовом пакете. До транспортировки в ПЦР-лабораторию отобранный биоматериал хранят при температуре 2-40С не более 48 часов. Для более длительного хранения (до 1 месяца) используют максимально низкую температуру. Выявление антигенов Toxoplasma gondii в амниотической жидкости с использованием ПЦР для антенатальной диагностики достаточно широко применяется в странах Западной Европы и США (Лобзин Ю.В. с соавт. 2001; Hengst et. al., 1990). Неправильный забор образцов, некачественное хранение и транспортировка могут привести как к ложноположительным, так и ложноотрицательным результатам, несмотря на безупречно проведенную процедуру анализа (42). 1. Среди существующих методов лабораторной диагностики паразитологический метод является наиболее убедительным, подтверждающим диагноз. Для обнаружения токсоплазм при паразитологических исследованиях применяются: а) прямая микроскопия мазков-отпечатков, биопсированных лимфоузлов, центрифугата ликвора и т. д.; б) гистологическое исследование органов или биопсированного материала; 7 в) прямой иммунофлюоресцентный метод; г) метод биопроб. а) Прямая микроскопия. Из исследуемого материала готовят мазки-отпечатки. В крови находки паразита редки. В биоптате лимфатических узлов идентификация токсоплазм затрудняется обилием других клеток. Легче обнаружить трофозоиты и цисты в мозговой ткани, осадке ликвора. Биоптат мозга может быть взят иглой (пункционная биопсия) или при открытой биопсии. Ликвор центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут и из осадка готовят мазки. Мазки фиксируют метанолом или смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимза. Препараты смотрят с помощью иммерсионного объектива. В зависимости от стадии процесса в таких препаратах обнаруживаются трофозоиты или цисты токсоплазм. б) Для приготовления гистологических препаратов кусочки ткани фиксируют в формалине, срезы окрашивают гематоксилин-эозином. В срезах органов паразиты обычно меньше размером и имеют вид округлых или овальных телец, что затрудняет идентификацию токсоплазм. Псевдоцисты и истинные цисты, имеющие характерный вид, можно определить в гистологических препаратах с большой достоверностью. При исследовании мозговой ткани находят разрушенные нейронные и глиальные структуры и скопления цист паразитов. Идентификация токсоплазм облегчается при применении прямой РИФ. в) Метод прямой люминесцентной микроскопии заключается в обработке мазков-отпечатков и гистологических срезов мечеными сыворотками против токсоплазм. Специфическое свечение паразитов позволяет их идентифицировать. Метод нуждается в усовершенствовании, что значительно улучшит паразитологическую диагностику токсоплазмоза. Нередко в биоптате или в осадочной жидкости паразитов так мало, что их невозможно обнаружить путем микроскопии. Тогда прибегают к методу биопроб. Разрабатываются методы индикации возбудителя с помощью ПЦР (15,153). г) Метод биопроб заключается в заражении экспериментальных животных, чаще белых мышей. Отсутствие у белых мышей спонтанной токсоплазмозной инфекции при достаточно высокой их восприимчивости к токсоплазмам – причина того, что биопроба на белых мышах остается наиболее достоверным методом выявления токсоплазм в паразитологических лабораториях. 8 В методике биологической пробы можно выделить два варианта. Первый основан на выявлении трофозоитов в перитонеальном экссудате или в мазках-отпечатках органов белых мышей в результате многократного (до 7–10 раз) пассирования через каждые 7–10 дней. Этим методом выделено много, как правило, вирулентных штаммов (14). Второй вариант имеет в основе одно- или двукратное пассирование. Мышей забивают через 3-6 недель, исследуют кровь в РСК или РИФ и при выявлении специфических антител микроскопируют отпечатки мозга на наличие цист токсоплазм. При первом заражении (пассаже) даже при тщательном исследовании токсоплазмы в перитонеальном экссудате можно не обнаружить. Тогда необходим второй пассаж на мышах: перитонеальную жидкость от мышей первого пассажа вводят таким же образом интактным мышам. При положительном результате через 6 недель после заражения в препаратах мозга мышей обнаруживают цисты паразита. При подозрении на врожденный токсоплазмоз паразитологическому исследованию подвергается ликвор, кровь (при генерализованной форме), а также плацента. Изоляция возбудителя из плаценты трудоемка, но положительная инокуляция еще не означает, что ребенок инфицирован, хотя в большинстве случаев это так. Выделение возбудителя из крови чаще дает положительные результаты при генерализованных формах врожденного токсоплазмоза, а из ликвора – при картине менингоэнцефалита. В настоящее время с целью пренатальной диагностики применяется исследование крови (после кордоцентеза) или амниотической жидкости, полученной с помощью амниоцентеза на наличие токсоплазм методом биопроб на белых мышах. Чаще всего цисты токсоплазм можно спутать со скоплением спор Encephalitozoon – паразита, которыми могут быть заражены лабораторные животные. Немалые трудности возникают и при дифференцировке от саркоцист, могущих находиться в тканях человека (Грачева Л.И. с соавт. 1980; Лысенко А.Я. с соавт. 1986 и др.). При просмотре нативных препаратов и окрашенных мазков достоверность находки токсоплазм должна быть подтверждена только при обнаружении нескольких типичных паразитов. 9 Паразитологические исследования применяются в некоторых специальных лабораториях, но не вошли еще в широкую практику обследования больных на токсоплазмоз. 2. Для практических целей, а также при массовых обследованиях чаще применяются серологические методы исследования. К серологическим реакциям, применяемым для диагностики токсоплазмоза, относятся: а) реакция с красителем; б) реакция связывания комплемента; в) реакция иммунофлюоресценции; г) реакция агглютинации; д) реакция пассивной гемагглютинации; е) реакция энзиммеченых антител и др. а) Реакция с красителем, или реакция Сэбина-Фельдмана (РСФ), предложенная этими авторами в 1948 году, представляет собой оригинальный метод, который заключается в том, что токсоплазмы под действием антител утрачивают характерную для них способность прижизненно окрашиваться метиленовой синькой. РСФ специфична и высоко чувствительна, однако ряд технических трудностей и, в первую очередь, необходимость работать с живой вирулентной культурой токсоплазм ограничивает ее применение (Грачева Л.И. с соавт., 1980). В лаборатории живых вирулентных токсоплазм сохраняют при помощи регулярных пассажей на белых мышах. Для постановки РСФ токсоплазмы из перитонеального экссудата мышей необходимо использовать в течение часа. Другой сложностью этой реакции является необходимость присутствия специального активатора, содержащегося в свежей, нормальной сыворотке. Тем не менее, из всех серологических методов РСФ является наиболее чувствительным и эталонным, по которому проверяют все другие тесты, внедряемые для определения антител к токсоплазмам (Грачева Л.И., 1980; Reiter – Owonaj et al., 1999 и др.). Антитела в РСФ появляются через несколько дней после заражения. За несколько недель титры антител достигают максимальной величины, остаются на высоких цифрах несколько месяцев, затем в последующие годы титры снижаются до 1:64 или 1:16. На таких цифрах титры антител держатся многие годы, вернее, пожизненно. б) Реакция связывания комплемента (РСК) введена в диагностику токсоплазмоза Уорреном и Сэбином в 1942 году. Эта 10 реакция широко применяется в диагностике токсоплазмоза. Специфичность ее проверена параллельным исследованием сывороток при многих инфекционных заболеваниях. Эта реакция относительно проста, может быть поставлена в любой серологической лаборатории. Недостатком РСК является ее меньшая (по сравнению с РСФ) чувствительность. Исследования по повышению чувствительности РСК направлены: на повышение качества антигена, а также на совершенствование методики реакции. Антиген, применяемый для РСК, готовят из токсоплазм, полученных путем заражения лабораторных животных (белых мышей), куриного эмбриона, культуры тканей. Frenkel (1948) использовал для приготовления антигена экссудат белых мышей, зараженных токсоплазмами. В последующем были предложены многочисленные модификации получения антигена, которые различались между собой по способу получения экссудата (Грачева Л.И. и др.,1980; Дедкова Л.М. и др., 2000 и др.). Культура тканей дает возможность получить токсоплазмы в чистом виде, что обеспечивает большую чувствительность антигена, но чаще для приготовления антигена используют перитонеальный экссудат зараженных белых мышей. Нами использовался антиген, полученный в лаборатории токсоплазмоза ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Если использовать полный паразитарный антиген, содержащий все антигенные компоненты токсоплазм и чувствительную технику постановки РСК, можно значительно повысить чувствительность реакции (Грачева Л.И. и др.,1980; Jacobs, 1976 и др.). В частности, было показано, что увеличение концентраций гемолизина и уменьшение концентраций эритроцитов в гемолитической системе, приводя к уменьшению необходимой для реакции дозы комплемента, повышают чувствительность реакции в целом. Связывание комплемента должно происходить в условиях холодильника при температуре +4С в течение 16-18 часов. Постановка РСК в условиях термостата, хотя и сокращает время до 30-45 минут, но резко снижает чувствительность реакции. Использование различных антигенов и различных методик постановки РСК в лабораториях затрудняет оценку полученных данных и мешает унификации реакции. До последних лет в лабораториях нашей страны РСК применялась очень широко. При использовании РСК в основном определяются иммуноглобулины G. В нашей лаборатории РСК было рекомендовано для определения IgM, используя в качестве ингибитора IgM риванол. РСК ставили параллельно с сыворот11 ками, обработанными и необработанными риванолом. Снижение титров антител в сыворотке, обработанной риванолом, свидетельствует о наличии IgM (Шевкунова Е.А., Саидов М.С., 1976). Антитела, определяемые в РСК, появляются через 2 недели (иногда позже) после заражения и сохраняются до 4-5 лет и больше, т.е. антитела в РСК появляются позже и исчезают позже, чем антитела, определяемые в РСФ. в) Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) предложена для диагностики токсоплазмоза J. Kramar в 1961г. Эта реакция получает все большее применение в диагностике токсоплазмоза. Она специфична и по чувствительности приближается к РСФ. Для определения антител применяется непрямой метод РИФ, который заключается в нанесении исследуемой сыворотки на мазок токсоплазм (антиген). При наличии в сыворотке специфических антител последние адсорбируются на поверхности токсоплазм. Чтобы выявить антитела, препарат обрабатывают меченной флюоресцирующей сывороткой, содержащей антитела к гамма-глобулинам человека. Эти меченные антитела адсорбируются на антителах исследуемой сыворотки, связанной с антигеном. Просмотр препарата под люминесцентным микроскопом выявляет вокруг тел токсоплазм яркие, светящиеся желтозеленоватым светом ободки (положительная реакция). Если специфические антитела отсутствуют в исследуемой сыворотке, свечения вокруг тел токсоплазм нет, они имеют тусклую сероватую окраску (отрицательная реакция). Основным преимуществом РИФ перед реакцией с красителем является применение убитого антигена, а перед РСК – более высокая чувствительность. РИФ выявляет антитела так же рано, как и РСФ и почти в таких же титрах Remington (1967) предложил тест для определения IgM в РИФ. Тест Ремингтона применяется для диагностики как острого, так, особенно, и врожденного токсоплазмоза. г) Реакция агглютинации (РА) для диагностики токсоплазмоза предложена в 1959 году. Исследователями была показана специфичность и высокая чувствительность РА. Но в практических лабораториях эта реакция не нашла широкого применения из-за трудности получения антигена. РА широко применяется в ряде европейских стран, в частности, во Франции (Marс et al., 1974). Desmonts рекомендует применять РА с сыворотками, обработанными 2-меркаптоэтанолом. В этом случае РА выявляет IgМ и служит дополнительным тестом для их выявления. 12 РА технически проста, т.к. для постановки требуется только антиген и сыворотка больного, не требуется оборудование и аппаратура. д) Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) впервые предложена для диагностики токсоплазмоза Джекобс и Лунде в 1957 году. Реакция основана на том, что под влиянием специфических антител происходит агглютинация (склеивание) эритроцитов, нагруженных специфическим антигеном. Основная сложность заключается в приготовлении токсоплазмозного эритроцитарного диагностикума. Чувствительность реакции довольно высока и зависит от качества диагностикума и техники постановки реакции. В лаборатории токсоплазмоза для постановки реакции РПГА применяли формалинизированные, таннизированные эритроциты барана, сенсибилизированные токсоплазменным антигеном. Анализ полученных данных показал, что титры сывороток в РПГА гораздо выше, чем в РСК, и в среднем на 2-3 разведения выше, чем в РИФ, что свидетельствует о высокой чувствительности РПГА. РПГА становится положительной позже, чем другие серологические реакции, в частности, РСФ, РСК, РИФ. В случае лабораторного заражения человека РПГА стала положительной в титре 1:10 лишь на 18-й день, РСФ – через неделю, РСК – через 10 дней в титре 1:40. Исследователи описывают случаи врожденного токсоплазмоза, где РПГА оказалась отрицательной при положительных результатах РСФ в высоких титрах (Грачева Л.И. и др.,1980). Для массового обследования женщин на токсоплазмоз рекомендуют использовать сочетание двух методов: РПГА и прямую агглютинацию (РА). Эти авторы рекомендуют РА для обнаружения свежей инфекции у беременных; РПГА является лучшей для выявления инфицированности у небеременных женщин. Обработка сывороток 2-Меркаптоэтанолом, цистеином позволяет точнее определить стадии развития инфекции. Простота, экономичность и высокая специфичность позволяют рекомендовать РПГА для выявления антител при токсоплазмозе. е) В последние годы для серологической диагностики широко применяют реакцию энзиммеченных антител или иммуноферментный метод (ИФМ). Сущность реакции заключается в следующем: в сенсибилизированные полистироловые пластины, на которых адсорбиро13 ван антиген, добавляют различные разведения сывороток и после инкубации сыворотку удаляют путем повторных промываний. Затем в пластины добавляют энзиммеченый антииммуноглобулин. Фермент, остающийся на пластинке после промывания, служит мерой количества специфических антител в сыворотке и определяется спектрофотометрически. Для метки используют ферменты: щелочную фосфатазу и пероксидазу хрена. Учет реакции проводится в единицах оптической плотности (ОП), иммуноферментных (EIU) или международных (МЕ) единицах и в титрах антител. Результаты считаются положительными, если показатели соответственно ОП>1,5; EUI>60; ME>125, титры антител 1:1600 (Мороз Б.В. и др.,1990). 3. Метод ДНК-диагностики – полимеразноцепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР в последние годы получил широкое распространение в диагностике многих инфекционных заболеваний и в т.ч. токсоплазмоза (15,42). ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификация) вирус-специфической последовательности ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и двух специфических затравок – праймеров. Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25-35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для его определения, как правило, с помощью электрофореза в агаровом геле. Метод высокоспецифичен и очень чувствителен, позволяет обнаружить несколько копий ДНК в исследуемом материале. В связи с высокой чувствительностью метода существует опасность получения ложноположительных результатов в силу контаминации продуктами амплификации т.к. в процессе ПЦРдиагностики ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся с аэрозолями и через приборы. Наибольшее диагностическое значение этот тест имеет у больных с иммуносупрессией, онкологических больных, ВИЧ инфицированных, когда серологические методы, аллергическая проба и т.д. мало информативны. 14 Получены данные успешной пренатальной диагностики врожденного токсоплазмоза с помощью ПЦР при исследовании амниотической жидкости (15,127,122). 4. Аллергодиагностика токсоплазмоза Внутрикожная аллергическая проба (ВП) предложена Frenkel в 1948 году и нашла широкое применение в медицинской практике. Аллергеном служит токсоплазмин – экссудат из брюшной полости зараженных белых мышей, подвергнутый специальной обработке. Было показано, что ВП становится положительной через 4-6 недель после заражения, но ряд исследователей наблюдали более поздние появления реакции: через полгода и даже год. Внутрикожная проба с токсоплазмином достаточно специфична, это подтверждают и результаты многочисленных исследований лиц с различными заболеваниями, такими, как туберкулез, сифилис, малярия, трихомониаз и пр. Как показали эти исследования, положительная ВП встречается среди них с такой же частотой, как и среди практически здорового населения. ВП широко применяется в эпидемиологических исследованиях. По данным различных исследователей, частота положительных реакций колеблется в странах СНГ от 7 до 50%. Частота ВП среди жителей республики Дагестан колеблется от 10 до 50% (Султанов Г.В., Саидов М.С., 1996 и др.). ВП дает хорошую корреляцию с результатами серологических реакций. При РСФ отмечается наибольшее совпадение результатов – от 90 до 96%. В наших исследованиях при положительной ВП РСК положительна в 45% случаев, РИФ – в 85%. В клинических исследованиях ВП имеет вспомогательное значение, т.к. не дает врачу информации о стадии токсоплазмозной инфекции. ВП не рекомендуется ставить детям первых 2-3 лет жизни, а также лицам старше 60 лет, т.к. из-за возрастной реактивности могут быть недостоверные результаты. После перенесенной инфекции ВП остается положительной многие годы, практически пожизненно. Положительная ВП в сочетании с положительными серологическими реакциями в низких титрах свидетельствует о перенесенной инфекции. Отрицательная проба свидетельствует о полном отсутствии инфекции или начальной ее стадии (до 4-х недель). У больных СПИДом, даже инфицированных токсоплазмами, ВП практически отрицательна из-за полной анергии клеточного иммунитета. 15 Аллерген готовят из перитонеального экссудата белых мышей, где кроме токсоплазм могут содержаться и другие клетки из организма мышей. 0,1 мл аллергена содержит продукты распада 150-200 тыс. токсоплазм. Сотрудниками лаборатории токсоплазмоза ИЭМ им. Гамалеи был разработан принципиально новый метод получения аллергена, который готовят не из тел токсоплазм, а из продуктов их метаболизма. Этот аллерген является более чувствительным. Трудности, связанные со стандартизацией препарата, привели к тому, что аллерген не выпускается в некоторых странах – США, Франции. На введение антигена кроме местной реакции в виде покраснения или инфильтрата может быть и общая реакция. Больные отмечают слабость, головные боли, недомогание, ухудшение сна, повышение температуры до субфебрильных цифр. Важное диагностическое значение имеют так называемые «очаговые» реакции после введения токсоплазмина. Так, например, в ответ на внутрикожное введение токсоплазмина наблюдается активизация процесса на глазном дне (Шпак Н.И., 1976; Казанцев А.П., 1985). Введение токсоплазмина при токсоплазмозных миозитах усиливает боли в пораженных участках, болезненность мышц при пальпации. Титрационная проба с различными разведениями токсоплазмина может быть использована для дифференциации латентного и активного хронического токсоплазмоза. По данным Казанцева А.П. (1985), при латентном токсоплазмозе, даже при выраженной ВП на введение цельного токсоплазмина, разведения препаратов 1:10 и 1:100 уже могут не дать реакции, в то время как у больных с активным хроническим токсоплазмозом нередко наблюдаются реакции и на разведения 1:10000 и 1:100000. Но такие корреляции автор отмечает не во всех случаях, что еще раз подтверждает вспомогательное значение реакции. Для выявления сенсибилизации организма при токсоплазмозе применяются и так называемые цитотоксические тесты, такие, как метод специфического повреждения нейтрофилов (ППН), специфического лейкоцитолиза, специфического повреждения лимфоцитов, лейкергии и др. В частности ППН, предложенный Фрадкиным В.А. (1965) для аллергодиагностики туберкулеза, использовали ряд исследователей для диагностики токсоплазмоза (Саидов М.С., Хома А.И., 1982; Пьянова Р.Е., 1989 и др.) 16 Указанный метод прост технически, может быть применен в любой серологической лаборатории. Преимуществом метода является и то, что он не связан с введением в организм соответствующих аллергенов. В нашей лаборатории метод специфического повреждения нейтрофилов применяется для аллергодиагностики токсоплазмоза, а также для дифференциальной диагностики токсоплазмоза, листериоза, бруцеллеза с использованием соответствующих аллергенов. Выраженные колебания значений ППН у больных с хроническим приобретенным токсоплазмозом, полученные различными исследователями (Саидов М.С. с соавт., 1982; Пьянова Р.Е., 1989 и др.), свидетельствуют о наличии «субъективного фактора» при учете результатов реакции. Объективным, менее трудоемким является реакция специфического лейкоцитолиза (РЛ), которая была применена нами для аллергодиагностики токсоплазмоза. РЛ заключается в следующем: в стерильную пробирку наливают 0,1 мл 5% лимоннокислого натрия и 0,3 мл крови, взятой в микропипетку из пальца обследуемого (следует отметить, что количество лимоннокислого натрия и крови зависит от числа аллергенов, к которым необходимо определить сенсибилизацию). Кровь осторожно смешивают и разливают по 0,1 мл в 3 пробирки (или в 3 лунки планшета для титрования). В первую пробирку (лунку) добавляют по 0,05 токсоплазмина, во вторую – 0,05 бруцеллина, в третью (контрольную) – 0,05 мл физиологического раствора. Из каждой пробирки в смеситель для лейкоцитов набирают кровь до метки 0,5 и насасывают 3% раствор уксусной кислоты до метки 11 (для подсчета числа лейкоцитов в камере Горяева), а пробирки помещают в термостат на 60 минут при 37С. После инкубации вновь подсчитывают число лейкоцитов. Степень сенсибилизации (повреждения лейкоцитов в процессе инкубации) можно рассчитать в двух вариантах: а) по проценту уменьшения количества клеток в процессе инкубации; б) по величине индекса сенсибилизирования по формуле: H H2 R 1 100 где Н1 – количество клеток до инкубации, Н2 – количество клеток после инкубации. 17 На основании значительного количества контрольных исследований за нормальные величины были приняты – индекс лейкоцитолиза до 0,3, а процент убыли клеток после инкубации – 10,0. Параллельно с ППН, этим методом было обследовано 106 больных, из них 72 – с хроническим токсоплазмозом и 34 – с хроническим бруцеллезом, свободных от токсоплазмозной инфекции. ( Кишов М.Г., Саидов М.С., 1992). Полученные результаты показали, что инкубация крови больных токсоплазмозом с токсоплазмином приводит к достоверному снижению числа лейкоцитов в пробах: до инкубации – 5, 0 0,03x109/л, после инкубации 3,8 ± 0,03×109 /л, (R=12; р<0,001). Количество лейкоцитов у этих больных после инкубации с бруцеллином существенно не изменялось – до инкубации 4,85 ± 0,13× 10 9/л, после инкубации 4,7 ± 0,12×10 9/л (R=1,5). В контроле (физиологический раствор) – соответственно 4,75 ± 0,05×10 9/л и 4,6 ± 0,05×10 9/л (R=1,5). Разница статистически достоверна. У 34 больных с хроническим бруцеллезом (свободных от токсоплазмозной инфекции) количество лейкоцитов до инкубации с токсоплазмином составило 4,9±0,01×10 9/л, после инкубации - 4,6±0,06×10 9/л (R=3,0), с физиологическим раствором соответственно 4,8 ± 0,02×10 9/л и 4,6 ± 0,4×10 9/л (R=2,0), а с бруцеллином соответственно 5,3±0,04×10 9/л и 3,9±0,01×10 9/л ( R=14,0; р<0,01). Таким образом, полученные результаты и их сравнение с данными ППН свидетельствуют о возможности выявления специфической сенсибилизации лейкоцитов при токсоплазмозе и бруцеллезе и возможности использования данного теста для аллергодиагностики токсоплазмоза и бруцеллеза, отличающегося своей простотой и быстротой выполнения, а также высокой информативностью. Интерпретация результатов лабораторных исследований Как уже указывалось, врожденный токсоплазмоз является результатом передачи токсоплазм от матери, заразившейся во время беременности. Целью серологического обследования беременных является выявление у них первичной, свежей инфекции. При заражении токсоплазмами первые антитела, возникающие в ответ на антигенный раздражитель, представлены IgM, 18 титр которых достигает максимума на 2-4 неделе, затем их синтез сменяется синтезом IgG. В 70% случаев IgM исчезают в течение 3-4 месяцев (35,133 и др.). IgG достигают максимума через 1,5-2 (до 5-6) месяца, титры держатся на относительно высоких цифрах, в последующем титры антител снижаются, но остаются на низком уровне длительное время. Возможны отклонения от такой закономерности динамики антител. В некоторых случаях образование IgM происходит быстро, так же быстро происходит их смена иммуноглобулинами G, в других антителах IgM образуются в течение нескольких месяцев и так же медленно происходит образование IgG. Возможно также длительное, годами существование низких титров IgM и IgG (Грачева Л.И. и др, 1980; Desmonts, Convreur, 1985 и др.). Для выявления свежего заражения беременных необходимы повторные – 2-3 раза в течение беременности серологические обследования. Если первое обследование проведено в ранние сроки (до 1012 недель), то это облегчает определение срока инфицирования. Большинство исследователей считают, что высокие титры антител в серологических реакциях при первом обследовании указывают на свежее заражение. Но ряд ученых (Desmonts,1975; Remington 1974 и др.) описывают случаи обнаружения высоких титров антител в течение нескольких лет. Более достоверно о свежем заражении свидетельствуют положительные серологические реакции, нарастающие при повторных обследованиях, при отрицательной ВП. Повторное серологическое обследование не рекомендуется ранее 23 недель, т.к. нарастание антител при токсоплазмозе более медленное, чем при бактериальных инфекциях. Достоверно о нарастании титров антител можно говорить лишь в том случае, если они в двух последовательно исследуемых пробах сывороток различаются на 3-4 и более разведения. Рост или падение титров антител на одно разведение может быть следствием технической погрешности, поэтому и не учитывается. Более убедительно в пользу острой свежеприобретенной инфекции свидетельствует положительная сероконверсия, т. е. когда ранее отрицательные серологические реакции становятся положительными. Как уже указывалось, нами для выявления свежих случаев заражения применялось обследование беременных с помощью ВП, РСК и РИФ (54,86). Все три теста применялись при первом 19 обследовании, которое проводилось при взятии на учет по беременности (в основном до 12 недель), второе обследование проводилось при сроке беременности 20-24 недель и третье – при сроке 32-36 недель с помощью только серологических реакций. Вне этих сроков повторное серологическое обследование проводилось в тех случаях, когда нужно дифференцировать свежее заражение. Это повторное обследование проводили через 2-3 недели. Результаты сероаллергического обследования оценивались следующим образом. Если кожная проба и серологические реакции при первом обследовании отрицательные, то женщина не заражена токсоплазмозом. Однако такая беременная должна быть инструктирована о мерах личной профилактики токсоплазмоза; она подлежит повторному серологическому обследованию на токсоплазмоз. При положительной ВП в одной или двух серологических реакциях в низких или средних титрах (до 1:80) инфекция оценивается как хроническая. В этих случаях риск заражения плода отсутствует. Положительные серологические реакции (РСК, РСК, ИФМ) в высоких титрах при отрицательной кожной пробе дают основание подозревать первичное заражение в 1-м триместре беременности. Обнаружение специфических IgM в крови беременной или 3–4-кратное нарастание титров в РСК и РИФ подтверждает первичное заражение токсоплазмозом. Содержание IgM выше 200% в ИФА или нарастание их количества свидетельствует в пользу «свежего» заражения (Лобзин Ю.В. с соавт., 2001). Отрицательная кожная проба и положительные серологические реакции в средних и высоких титрах могут быть и у больных с хроническим токсоплазмозом на фоне СПИДа. Гуморальный иммунитет у больных СПИДом, как правило, не угнетен, поэтому серологические реакции, выявляющие противотоксоплазменные антитела, могут быть полезными для диагностики (Israelski O.M., Remington J.S., 1992; Lingappa et al.,1994). Второе обследование на токсоплазмоз проводится тем женщинам, у которых при первом обследовании кожная проба и серологические реакции были отрицательными. Если результаты серологических реакций отрицательные, то женщина попрежнему свободна от токсоплазмозной инфекции. Положительные серологические реакции, обычно, в высоких титрах (по20 ложительная сероконверсия) свидетельствуют о том, что первичное заражение токсоплазмозом произошло в период между вторым и третьим обследованием. Женщины, заразившиеся токсоплазмозом во время данной беременности, как с первично бессимптомной инфекцией, так и с клинически выраженной, подлежат срочному этиотропному лечению. Интерпретация результатов иммуннологического обследования ребенка и матери на токсоплазмоз Результаты обследования ребенка Результаты обследования матери Заключение Серологические реакции а) ВП отрицательна, серологиотрицательны ческие реакции отрицательны; б) ВП положительна, РСК и РИФ отрицательны Серологические реакции ВП положительна, серологичеположительны в низких ские реакции (РСК, РИФ, ИФМ и средних титрах. Тесты и др.) положительны в низких и на IgM отрицательны средних титрах. Ребенок свободен от токсоплазмозной инфекции Серологические реакции положительны в относительно высоких титрах, тесты на IgM положительны: а) клинических признаков нет; б) имеются клинические признаки врожденного токсоплазмоза а) диспансерное наблюдение, профилактическое лечение; б) лечение свежеприобретенный, инаппартный или мани-фестный токсоплазмоз: а) положительная сероконверсия во время беременности; б) отрицательная ВП. Высокие титры серологических реакций, наличие IgM при первом обследовании У ребенка пассивно переданные материнские антитела. В лечении не нуждается. Отрицательные серологические реакции ребенка и матери свидетельствуют о том, что ребенок свободен от токсоплазмозной инфекции. Положительные серологические реакции в низких титрах с обнаружением IgG при исследовании сывороток новорожденных и грудных детей первых 3-х месяцев жизни могут быть результатом пассивной передачи антител от матери. При повторных серологических исследованиях титры антител не нарастают, а у 21 некоторых детей даже снижаются. Пассивно переданные материнские антитела сохраняются у детей, как правило, не более 6 месяцев. Высокие титры антител в серологических реакциях, при положительных тестах на IgM у ребенка, родившегося от женщины с первичной токсоплазмозной инфекцией во время беременности и при наличии клинических признаков, характерных для внутриутробной инфекции, диагноз врожденного токосплазмоза не вызывает сомнения. IgM, обладая крупной молекулой, через плаценту не проходят и обнаружение их в пуповинной сыворотке новорожденных указывает на внутриутробное заражение плода. Поэтому для диагностики врожденного токосплазмоза важное значение имеет определение специфических IgM в пуповинной крови с использованием РИФ, ИФМ и др. При интерпретации результатов серологических реакций у детей, инфицированных внутриутробно, необходимо учесть и состояние иммунной системы, так как низкие уровни антител, отсутствие IgM могут быть признаком незрелости иммунной защиты. Отрицательные результаты серологических реакций у ребенка при наличии первичной, свежей инфекции у матери не исключает его внутриутробного инфицирования. В этих случаях необходимо дальнейшее наблюдение за клиническим состоянием ребенка и динамикой серологических реакций. Описаны случаи, когда у недоношенных детей с явными признаками внутриутробного инфицирования – гидроцефалия, хориоретинит, кальцификаты – серологические методы (ИФМ) дали отрицательные результаты и токсоплазмоз был подтвержден при патологоанатомическом исследовании (Чебуркин А.В., Мороз Б.В.,2000). Особенности лабораторной диагностики токсоплазмоза у больных с иммунодефицитом Гуморальный иммунитет у больных СПИДом не угнетен и определение антитоксоплазменных антител может иметь диагностическое значение. Но у больных СПИДом наиболее частыми проявлениями токсоплазмоза являются энцефалит, хориоретинит, при которых серологические методы мало информативны (Aspök H., 1980; Israelski O.M., Remington J.S., 1992 и др.). 22 Специфические иммуноглобулины-М, свидетельствующие о свежей инфекции и имеющие более весомое значение для диагностики, у этих больных обнаруживаются примерно в 20% случаев. Иммуноглобулины-G обнаруживаются у больных с токсоплазмозным энцефалитом и хориоретинитом в низких и средних титрах, но в таких же титрах антитела могут быть и у инфицированных лиц без токсоплазмозного энцефалита. С диагностической точки зрения, более важное значение имеет определение противотоксоплазменных антител у больных СПИДом в ликворе (98). Достоверно диагноз подтвердить может биопсия пораженных участков мозга. Биоптат для исследования может быть взят иглой (при пункции) или при открытой биопсии (Lingappa J.R., 1994). При гистологическом исследовании в биоптате находят трофозоиты и цисты токсоплазм, паразиты иногда обнаруживаются в осадке ликвора. При отрицательных результатах прямой микроскопии выделение возбудителя проводят путем пассажей на белых мышах. При положительном результате, через 6 недель после заражения, в гистологических препаратах мозга белых мышей обнаруживаются цисты токсоплазм. В последние годы разработан метод выделения возбудителя в культуре клеток, однако, в широкую практику он еще не внедрен. Важную помощь в диагностике токсоплазмозных энцефалитов оказывает компьютерная томография. Практически у всех больных отчетливо виден отек мозга, в 80-95% случаев отмечается наличие контрастного усиления некротических поражений. В тех случаях, когда вспомогательные и лабораторные методы невозможны или не дают достаточной информации для постановки диагноза, проводят терапию ex juvantibus специфическими препаратами. Положительный эффект лечения через 1-2 недели является основанием для подтверждения диагноза. 23 Рекомендуемая литература: 1. Васильев В.В., Тимченко В.Н., Васильева Н.С. Современная диагностика токсоплазмоза у детей. // Детские инфекции.- 2004. - №1.- с.63-66. 2. Грачева Л.И., Савина М.А., Чумак Л.Г. Лабораторная диагностика токсоплазмоза. // Проблема токсоплазмоза.- М; Медицина, 1980.-с.153-198. 3. Грачева Л.И., Гончаров Д.Б. Современные методы иммунологической диагностики токсоплазмоза. // Клин. лаб. диагностика.-1999.-№11.-с.12. 4. Пьянова Р.Е. Патогенетические основы диагностики и прогнозирования развития паразитарной инвазии (на примере токсоплазмоза). Автореф.:д.м.н.- М.,1989. 5. Саидов М.С., Хома А.М. Некоторые показатели аллергии при хронической токсоплазмозной инфекции. // Современные проблемы протозоологии. Матер. III съезда ВОПР.- Вильнюс, 1982.-380с. 6. Саидов М.С., Омаров С.М.-А., Шевкунова Е.А. Клиника, диагностика, лечение и профилактика токсоплазмоза у беременных. Методические рекомендации. Махачкала, 1990, 19 с. 7. Саидов М.С., Меджидов М.М. Врожденный токсоплазмоз. Махачкала, 2002.-108 стр. 8. Чебуркин А.В., Мороз Б.В. Оценка серологических тестов на токсоплазмоз у детей и их матерей. //Педиатрия.- 2000.№6.-с.46-49 9. Шпак Н.И. Токсоплазмоз глаза.- М.: Медицина, 1976.176 с. 10. Dubey J. P. Toxoplasma gondii // BMJ. – 2000.- v.322P.142-147. 11. Lopez A. et.al. // Preventing congenital toxoplasmosis. MMmr.-2000.-v.49.- p.142-147. ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Формат 60х84 1/16. Гарнитура Таймс. Тир. 300 экз. Размножено ПБОЮЛ «Зулумханова». Махачкала, Гаджиева, 34. 24
