Непрямой SpermMar тест (только для SpermMar IgG)

SpermMar Test IgG
Набор для определения антиспермальных антител класса IgG
Документ FP09 I02 R01B.3 Дата издания 24/03/2011
Консервант: азид натрия 0,09%
Хранение от 2 до 8ºС. Не замораживать!
Качественный латексный тест для определения спермальных антител (АСАТ).
Диагностический набор in vitro, только для профессионального использования.
Набор состоит
1 флакон - суспензия латексных частиц SpermMar IgG – 0,7 мл
1 флакон - антисыворотка SpermMar IgG – 0,7 мл
Общая информация и пояснение
Наличие спермальных антител (АСАТ), взаимодействующих с антигенами на
сперматозоидах считается типичным и специфическим для иммунологического
бесплодия. АСАТ принадлежат к двум иммунологическим классам: IgA и IgG.
Существует мнение, что АСАT класса IgA клинически более важны в патогенезе
инфертильности, связанной с иммунологическими факторами, чем АСАТ класса IgG.
Тем не менее, спермальные антитела класса IgA редко существуют без антител класса
IgG. Поэтому тестирование спермальных антител класса IgG является рутинным
скрининговым методом.
Прямой SpermMar тест проводится путём смешивания свежего необработанного
образца семени с латексными частицами, покрытыми человеческими IgG. К этой
смеси добавляется моноспецифическая античеловеческая антисыворотка. Образование
агглютинации между частицами и подвижными сперматозоидами указывает на
наличие АСАТ IgG на сперматозоидах. В непрямом SpermMar тесте промытые
подвижные донорские сперматозоиды инкубируются с разбавленной сывороткой
пациента (мужчины или женщины). Если сыворотка содержит АСАТ IgG , они
покроют сперматозоиды и дадут позитивную реакцию на SpermMar тест.
Реагенты
Два реагента поставляются для производства SpermMar теста :
1. SpermMar латексные частицы - суспензия полистериновых латексных шариков,
размером около 2 мкн в диаметре, покрытых человеческим IgG. Перед
использованием хорошо перемешать! Объём 0,7 мл.
2. SpermMar антисыворотка -иммуноспецифическая антисыворотка, направленная
на Fc – фрагмент человеческого иммуноглобулина. Объём 0,7 мл.
Оба реагента консервированы в 0,09% растворе азида натрия .
Подготовка реагентов.
SpermMar латексные частицы готовы к использованию, тем не менее, они должны
быть тщательно перемешаны перед использованием. SpermMar антисыворотка готова
к использованию.
Хранение.
Реагенты SpermMar должны храниться при температуре 2-8ºС. При правильном
хранении реагенты стабильны в течение 18 месяцев от даты производства. Не
замораживать!
Сбор образцов и подготовка.
Сбор семени производится предпочтительно мастурбацией. При отсутствии условий
для мастурбации используются специальные пластиковые кондомы Мэйл фактор пак.
Обычные презервативы не могут использоваться для этих целей. В идеале, семя
должно использоваться в течение 1 часа после сбора. Сыворотку получают венозной
пункцией.
Предупреждение.
Все человеческие органические материалы должны рассматриваться как потенциально
опасные. Работайте со всеми компонентами так, как если бы они были опасны на ВИЧ
или гепатит. Все манипуляции проводите с осторожностью. Используйте защитную
одежду и перчатки.
Суспензия SpermMar латексных частиц содержит 0,1% бычьего альбумина,
произведённого в США. SpermMar латексные частицы покрыты человеческим
иммуноглобулином IgG, все используемые материалы показали отрицательный
результат при тестировании на гепатит В,С и ВИЧ.
Процедура
Материалы, включённые в набор (только для полного набора):
- суспензия латексных частиц SpermMar
- антисыворотка SpermMar
- слайды размером 76 х 26 мм
- покровные стёкла размером 24 х 40 мм
- микрокапилляры, калиброванные на 10 мкл
- микрогруша
Необходимое дополнительное оборудование:
- световой микроскоп (400-600 кратное увеличение)
- раствор Эрла (только для непрямого SpermMar теста)
Инструкция по использованию
Прямой SpermMar тест для определения АСАT (антиспермальных антител)
на человеческих сперматозоидах
1. Реагенты и образцы должны принять комнатную температуру.
2. На слайд поместите:
10 микролитров свежей спермы
10 микролитров латексных частиц SpermMar
10 микролитров антисыворотки SpermMar
Для этого используйте 10 микролитровые капиллярные пипетки, входящие
в полный набор.
Памятка: При использовании микрокапиллярной пипетки, вставьте прозрачный конец пипетки в
резиновую микро-грушу, жирной черной отметкой внутрь, приблизительно на 5 мм. Наполните пипетку
до чёрной отметки (10 микролитров). Не выливайте жидкость в грушу. Медленно, сдавливая пальцами
верх груши, выведите жидкость из пипетки на слайд.
3. Смешайте образец и латексный реагент 5 раз краем покровного стекла.
4. Смешайте антисыворотку с латексным реагентом и образцом.
5. Накройте покровным стеклом и поместите под микроскоп с 400-600 кратным
увеличением. Использование фазы контрастного или темного поля позволит лучше
прочесть результат.
6. Прочтите результат через 2-3 минуты. Изучите латексные частицы, соединившиеся
с подвижными сперматозоидами. Сосчитайте 100 сперматозоидов для определения
процента активности спермы. Если слипание частиц не наблюдается, прочтите
результат через 10 минут.
Обратите внимание: следует хранить подготовленный слайд в тёмном месте во влажной среде.
Непрямой SpermMar тест
1. Реагенты и образцы должны принять комнатную температуру.
2. Инактивируйте образец сыворотки, нагрев её до температуры 56С в течение
30 минут, если используются стеклянные пробирки,
или в течение 45 минут, если используются пластиковые пробирки.
3. Доведите средой Эрла уровень PH до 7.4 –7.5
4. Промойте подвижные донорские сперматозоиды, позволив им всплыть в среде с
уровнем pH 7.4 – 7.5. Промывка должна проводиться в 5 мл стеклянной или
стерильной пластиковой пробирке с круглым дном при температуре 37С в течение
45 минут. Доведите концентрацию спермы до 2х107 сперматозоидов на мл в среде
с pH 7.4 – 7.5.
5. Последовательно разбавьте инактивированный образец сыворотки в пропорции
1/16 в титровальной плашке средой (pH 7.4 – 7.5).
6. Смешайте 50 мкл разбавленной инактивированной сыворотки (п.5) с 50 мкл
раствора промытой донорской спермы (п.4) в свободной лунке в титровальной
плашке. Оставьте инкубироваться в инкубатор при температуре 37С в течение 60
минут.
7. Поместить на покровное стекло
10 мкл смеси сыворотки спермы
10 мкл латексных частиц SpermMar
10 мкл антисыворотки SpermMar
8. Смешать образец и латексный реагент 5 раз краешком покровного стекла.
9. Также перемешайте антисыворотку с латексным реагентом и раствором образца.
10. Накройте покровным стеклом и поместите раствор под микроскоп с 400-600
кратным
увеличением, фазовый контраст или тёмное поле также может
использоваться для чтения результата.
11. Прочтите результат через 2-3 минуты. Изучите латексные частицы, соединившиеся
с подвижными сперматозоидами. Сосчитайте 100 сперматозоидов для определения
процента агглютинированных сперматозоидов. Если не наблюдается слипания
латексных частиц со сперматозоидами – прочтите снова через 10 минут.
Обратите внимание: следует хранить подготовленный слайд в тёмном месте во влажной среде.
Если используется инкубационная среда для ооцитов, убедитесь, что она не содержит
сыворотку или альбумин. Рекомендуемая среда - Эрла.
Используйте среду без HCO3. Если среда с низкой концентрацией HCO3,
инкубирование возможно при 5% СО2 или после добавления Хепес-буфера (9 мл
Хепес на 500 мл среды). Во избежание испарения во время инкубирования всегда
покрывайте парафином.
Интерпретация результата.
Если тест сделан правильно, отсутствие АСАТ будет показано свободно
двигающимися сперматозоидами, не соединившимися с латексными частицами.
Латексные частицы сами формируют агглютинацию, что подтверждает действие
реагента. При наличии спермальных антител сперматозоиды будут частично
покрываться латексными шариками. В некоторых случаях сперматозоиды могут даже
быть обездвижены большим количеством латексных частиц. В прямом SpermMarтесте диагноз иммунологического бесплодия предполагается, когда 10-30%
подвижных сперматозоидов покрыты латексными частицами. Если покрыто 40% или
более сперматозоидов, иммунологическое бесплодие возможно в высокой степени.
Дополнительные исследования должны подтвердить диагноз. Даже если достигнут
позитивный результат, рекомендуется провести тест исследование на наличие АСАТ
класса IgA. В непрямом SpermMar-тесте присутствие 40% или более реакций между
покрытыми латексными частицами и подвижными сперматозоидами – означает
низкий лимит активности.
Ограничение
Прямой тест может проводиться, если подвижные сперматозоиды имеются в образце
семени. Образцы с недостаточной подвижностью сперматозоидов могут явиться
причиной негативного результата.
Характеристики тестов
Прямой SpermMar-тест
Несколько сотен образцов семени были исследованы на прямой Мар-тест (смешанная
антиглобулиновая реакция, основанная на красных кровяных клетках) и SpermMarтест. Результаты были идентичны в 97%. В 3% случаев Мар-тест, основанный на
красных кровяных клетках, был отрицательным, в то время как SpermMar-тест,
определил антитела, покрывшие сперматозоиды, хотя и в небольшом количестве
(меньше 40%), что доказывает более высокую чувствительность SpermMar-теста.
Непрямой тест SpermMar-тест
Используя значение 40% реакций между подвижными сперматозоидами и латексными
частицами как нижний предел активности, непрямой SpermMar-тест считается
позитивным по отношению к негативными результатами Tray Agglutination Test или
других вспомогательных тестов
Было доказано,
что SpermMar-тест
более прост в использовании и более
чувствителен. Негативный результат непрямого SpermMar-теста в сравнении с Tray
Agglutination Test получается в случаях, наличия IgM в сыворотке, клиническое
значение которых сомнительно. Рекомендуется достичь положительного результата
непрямого SpermMar-теста путём дополнительных тестов на определение активности
агглютинации (ТАТ) и цитотоксической активности (АТP цитотоксический тест).
Последние тесты также
устанавливают тип иммунологического эффекта,
вызываемого антиспермальными антителами.