2. Лабораторная работа № 3 Измерение увеличения
реклама
1.Исследование морфологии микроорганизмов 1.1. Форма клеток 1.1.1. Бактерии Под общим понятием «бактерии» описано свыше 1600 видовмикроорганизмов-прокариот, не имеющих настоящего сложноорганизованного ядра. Большинство представителей бактерий – одноклеточные организмы, различающиеся размерами и физиологическими свойствами. По форме все бактерии можно разделить на шаровидные (или кокки), палочковидные, извитые и нитчатые. Из почвы выделены также бактерии, имеющие довольно своеобразную форму. С основными формами бактерий можно познакомиться на примере следующих представителей (рис. 1). Шаровидные бактерии – кокки (от греч. kokkos – зерно, шарик). Они делятся на следующие группы. 1. Микрококки (от лат. micro – маленький). В природе встречаются в виде одиночных шаровидных клеток. Примером могут служить клетки Micrococcus agilis (от лат. agilis – подвижный). 2. Диплококки (от греч. diploos – двойной) – шаровидные бактерии, соединенные по двое. К ним относится Azotobachter choococcum. Родовое название этих бактерий отражает их способность фиксировать азот атмосферы, видовое – продуцировать коричневый пигмент (от лат. chroo – коричневеющий). 3. Стрептококки (от лат. streptos – цепь) – шаровидные бактерии, образующие в результате деления клеток в одной плоскости разнообразной длины цепочки. К роду стрептококков относятся в основном патогенные бактерии. Но стрептококковую форму имеют многие молочнокислые бактерии рода лактококкус. Поэтому с этой формой бактерий знакомятся при изучении молочнокислого брожения на примере Lactococcus lactis. Родовое и 1 видовое названия этих бактерий, образующих короткие цепочки, отражают их причастность к молочнокислому брожению (от лат. lactis – молочный). Рис. 1. Форма бактерий: шаровидная: а – микрококки, б – диплококки, в – тетракокки, сарцины, г – стрептококки; палочковидная: д – не образующие спор, е, ж, з – спорообразующие: е – бациллярный, ж – клостридиальный, з – плектридиальный типа спорообразования; извитая: и – виброны, к – сарцина (ув. ×12000) 4. Сарцины (от лат. sarceo – соединяю) – шаровидные бактерии, группирующиеся по 8 клеток. Располагаются в виде куба, с каждой стороны которого по 4 клетки. Такая форма возникает в результате деления клетки в 2 трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Некоторые виды сарцин формируют большие сарциноподобные кубообразные пакеты, в которых с каждой стороны находится уже не по 4 клетки (субъединицы сарцины), а по 4 сарцины. Удобна для просмотра Sarcina flava (сарцина желтая) – наиболее распространенный представитель микрофлоры воздуха. Все шаровидные формы бактерий, за исключением Lactococcus просматривают lactis, на фиксированных и окрашенных фуксином препаратах. Палочковидные бактерии. К ним относятся формы, образующие споры (роды Pseudomonas Bacillus, Clostridium и др.) и не образующие их (роды Pseudomonas, Achomobachter, Lactobacillus и др.). Цитоплазма клеток Pseudomonas stutzeri прокрашивается равномерно, поскольку это неспорообразующая палочка, и под микроскопом клетки выглядят как тонкие, четко очерченные, равномерно окрашенные палочки. С представителями палочковидных бактерий, образующих споры, можно познакомиться на примере Bacillus mycoides или Bacillus mesentericus. В названии первого вида отражена его способность развиваться на питательных средах в виде ложно-грибового налета (от лат. mycoides – грибовидный), напоминающий мицелий грибов. Поскольку Bacillus mycoides – спорообразующаяпалочка, цитоплазма клетки, приступившей к спорообразованию, прокрашивается красителем, а спорогенная зона – нет. Поэтому под микроскопом бацилла выглядит неравномерно окрашенной. Спорогенная зона, как более плотная и непрокрашенная, иначе преломляет свет, чем цитоплазма клетки. Клетки Bacillus mycoides относятся к стрептобациллам, так как обычно располагаются цепочками. Для просмотра лучше брать двух-трехсуточную культуру ( в более позднем возрасте клетки переходят в стадию спорообразования). Bacillus mesentericus (картофельная палочка) также относится к стрептобациллам. 3 Палочковидные бактерии просматривают на фиксированных и окрашенных фуксином препаратах. Нитчатые формы. Представляют собой цепочки цилиндрических клеток, часто окруженные общим влагалищем, или чехлом. Нитчатые бактерии распостранены в илах, почве и водоемах, особенно с высоким содержанием железа. В водоемах эти бактерии часто образуют охристые осадки. Для знакомства с нитчатыми бактериями рекомендуется брать пробу воды с охристыми отложениями из естественных водоемов. Препарат готовят в раздавленной капле и просматривают с иммерсионной системой. Наиболее часто на нем встречаются железобактерии рода Leptoohrix, окисляющие закисные формы железа в окисные. Гидрат окиси железа откладывается во влагалищах, отчего они имеют желтовато-бурую (охристую) окраску. Размножается Leptoohrix делением концевой (молодой) клетки, обращенной внутрь влагалища. При этом старые клетки оттесняются (выталкиваются) молодыми; нить и влагалище в результате размножения и роста клеток удлиняются. Нередко старые клетки отчленяются от общей нити. На препарате часто обнаруживаются остатки ожелезненных чехлов (в виде тонких трубок) и другие ожелезненные структуры. Для выявления вегетативных клеток железобактерий пробу берут непосредственно из охристых осадков, препарат фиксируют 96%-ным спиртом, обрабатывают 1%-ным раствором HCl (для обесцвечивания влагалищ) и окрашивают в течение суток эритрозином. Влагалища клеток на таком препарате бесцветны, а вегетативные клетки и гонидии красные. Гонидии – образования овальной или округлой формы, в некоторых случаях имеющие жгутики. Гонидии формируются у тех нитчатых бактериях, которым свойственна дифференциация нити. Извитые формы. Среди бактерий данной группы выделяют следующие формы. 4 1. Вибрионы (от лат. vibrare – извиваться, дрожать) – слегка изогнутые клетки: изгиб их меньше половины окружности. 2. Спириллы (от лат. spiro – штопор). В отличие от вибрионов их клетки более длинные, толстые и извитые: извитость или равна, или больше половины окружности. Спириллы могут иметь один завиток в виде русской буквы С, два завитка в виде латинской буквы S или несколько – в виде спирали. 3. Спирохеты – длинные и тонкие клетки с большим количеством мелких, но крутых завитков; длина клеток превышает их толщину в 5–200 раз. Вибрионы и спириллы удобно просматривать на фиксированном и окрашенном фуксином препарате, приготовленном из навозной жижи, предварительно инкубированной в течение нескольких суток в термостате. На таком препарате много клеток разных видов микроорганизмов, среди них часто встречаются извитые формы. Для ознакомления со спирохетами следует приготовить фиксированный крашеный препарат зубного налета. Особенно удачны препараты соскоба из кариесного (гнилого) зуба. Зубные спирохеты чрезвычайно тонкие, почти волосовидные, короткие (всего 2–3 завитка). Миксобактерии, или скользящие бактерии. Это группа бактерий, стоящих на более высокой ступени эволюционного развития, чем описанные выше. У отдельных представителей миксобактерий (Sorangium, Polyangium) даже в световой микроскоп четко видно дифференцированное ядро. Вегетативные клетки имеют палочковидную форму с заостренными или округлыми концами. По мере старения они укорачиваются и переходят в миксоспоры, соединяющиеся впоследствии слизью и образующие первичные и вторичные цисты. Из последних в дальнейшем формируются плодовые тела. 5 Для наблюдений за формой миксобактерий берут колонии, развившиеся вокруг комочков почвы на гелевых пластинах, на которых единственным источником углерода служит целлюлоза. 1.1.2. Актиномицеты Актиномицеты (от греч. aktis – луч, mykёs – гриб) – лучистые грибы (рис. 2, а). это группа микроорганизмов занимает промежуточное положение между бактериями и грибами, поэтому ее представителей называют грибобактериями. Они одноклеточные, как бактерии, но образуют мицелий, как грибы; диаметр нитей у них очень мал, как у бактерий (не более 0,5–0,8 мкм), но гифы мицелия длинные и ветвистые, как у грибов. У актиномицетов длина ветвящихся нитей достигает нескольких миллиметров, мицелий грибов в длину – нескольких сантиметров. С грибами актиномицетов объединяет также способность размножаться спорами. Рис. 2. Актиномицеты (а); нокардии (б); микобактерии (в) На питательных средах актиномицеты образуют пушистые, бархатистые, мучнистые, преимущественно плотные кожистые колонии, срастающиеся с субстратом, иногда имеющие характерный землистый запах. 6 Мицелий актиномицетов на питательных средах дифференцирован: одна часть его погружена в субстрат (субстратный мицелий), другая находится над субстратом (воздушный мицелий). Многие представители актиномицетов продуцируют пигменты, поэтому их воздушный мицелий и особенно колонии окрашены в голубой, синий, фиолетовый, розовый, бурый, коричневый или черный цвета. Чтобы выявить характерные морфологические признаки колоний актиномицета, сначала следует рассмотреть их при малом увеличении непосредственно на питательной среде на чашках Петри или по краю колонии в пробирке. При этом можно видеть, что гифы мицелия частично внедряются в субстрат, частично стелются по поверхности и приподнимаются над ней. На концах нитей воздушного мицелия хорошо просматриваются спороносцы со спорами. Спороносцы по строению бывают прямыми, волнистыми, спиральными и мутовчатыми. Затем готовят фиксированный, окрашенный фуксином, препарат. Для этого на предметное стекло наносят кусочек колонии актиномицета вместе со средой, чтобы захватить не только воздушный, но и субстратный мицелий. Вторым предметным стеклом плотно прижимают этот кусочек к стеклу, раздавливают и размазывают по стеклу. Далее препарат сушат, фиксируют, красят. На фиксированном окрашенном препарате дифференциации мицелия не видно, как правило, не видны и споры, однако четко просматриваются мицелиальные одноклеточные нити. Много общего с актиномицетами имеют нокардии, или проактиномицеты. 1.1.3. Нокардии Это наименее дифференцированные формы актиномицетов. Воздушные мицелий у них отсутствует или развит слабо. На питательных средах развиваются колонии тестообразной (мягкой) консистенции с характерным мицелиальным ободком. Окраска их так же разнообразна, как и у нокардиеформных актиномицетов. В молодом возрасте проактиномицеты 7 образуют мицелий, который вскоре начинает септироваться (в нитях образуются перегородки) и расчленяться на палочковидные фрагменты, в дальнейшем переходящие в укороченные палочки, но чаще – в кокки. Для знакомства проактиномицетами можно воспользоваться чистой культурой Nocardia rubra, образующей красные (от лат. rubber – красный) колонии (рис. 2, б). 1.1.4. Микобактерии Это палочковидные, иногда ветвящиеся, образующие подобие мицелия бактерии (рис. 2, в). Настоящего мицелия микобактерии не имеют. Колонии тестообразной консистенции, продуцируют пигмент. В молодой культуре формируются палочки искривленной формы с неровным контуром – звездообразные, иногда довольно длинные, с боковыми отростками. В старых культурах ветвистые палочки часто распадаются сначала на более короткие палочки, затем – на кокки. 1.1.5. Грибы Объектами микробиологии служат многие виды микроскопических грибов. С некоторыми их представителями знакомятся на практических занятиях. Грибов относят эукариотам. Тело гриба состоит из мицелия, или грибницы, – сплетения тонких ветвящихся нитей – гиф. Зигомицеты. Низшие грибы, имеют хорошо развитый ветвистый одноклеточный мицелий. Размножаются как половым путем, так и бесполым, т. е. при помощи спор. Представитель класса – мукор (Mucor mucendo) развивается в виде войлочного белого или серого налета на продуктах растительного происхождения и навозе травоядных животных. Мицелий мукоровх грибов пронизывает субстрат и частично стелется по его поверхности. Вверх от грибницы отходят особые воздушные гифы – 8 спорангиеносцы, вздувающиеся на концах. Вздутия предсатвляют собой спорангии, в дальнейшем они отделяются от спорангиеносцев перегородкой. В спорангиях бесполым путем образуются многочисленные спорангиоспоры – эндоспоры (от греч. endon – внутри). Перегородка, спорангиеносца, отделяющая арсположена спорангий куполообразно, от спорангий поэтомуверхняя от часть спорангиеносца оказывается внутри спорангия. Этот участок спорангиеносца называется колонкой и у разных видов мукоровых грибов имеет различную форму (грушевидную, шаровидную, цилиндрическую). Для просмотра мукоровых грибов следует осторожно взять препаровальной иглой снять его на сухое предметное стекло. Препарат сначала рассматривают без покровного стекла при малом увеличении микроскопа. Видны спорангиеносцы и круглые темные шарики на их концах – спорангии. Обычно они покрыты тонкими шипами из кристаллов оксалата кальция. Затем на поверхность препарата наносят каплю воды, накрывают его покровным стеклом. Оболочка спорангия при этом разрушается, и споры выпадают. Препарат рассматривают последовательно при малом и больших увеличениях (без иммерсии). Рис. 3. Грибы микроскопические: 9 а – Mucor, б – Aspergillus, в – Penicilium, г – Fusarium, конидиеносец с конидиями: 1 – макроконидии, 2 – микроконидии; д – Trichoderma (конидиеносцы с головками конидий; е – Altrnaria, конидиеносцы с цепочками конидий. Представитель рода Mucor (рис. 3, а) могут быть выделены из почвы при посеве пылевидных ее частиц на поверхность сусло-агара в чашках Петри или из свежего конского навоза, помещенного на 3–4 дня под стеклянный колпак на тарелку с влажной фильтровальной бумагой или сырым песком. Аскомицеты, или сумчатые грибы. Высшие грибы с многоклеточ– ным или членистым мицелием, образующие споры в сумках – асках. Они включают представителей эуаскомицетов (истинных аскомицетов), у которых сумки со спорами формируются в результате полового процесса на поверхности или внутри плодовых тел, образуемых сплетением гиф мицелия (возможно бесполое размножение экзогенно возникающими спорами – конидиями), и гемиаскомицетов, у которых плодовые тела отсутствуют. К гемиаскомицетам относят большинство дрожжей, рассматриваемых отдельно. Эуаскомицеты включают два важнейших рода почвенных грибов – Penicillium и Aspergillus, которых нередко называют также плесневыми грибами. К группе плесневых относят и некоторых представителей зигомицетов и несовершенных грибов. Пенициллы и аспергиллы имеют хорошо развитый многоклеточный мицелий. Размножаются преимущественно конидиальным спороношением. Наблюдаются в виде налета голубого, зеленого, сизого, реже других цветов на продуктах растительного происхождения (варенье, томатной пасте, лимонах и апельсинах), отсыревших изделиях из кожи, обоях. Распространены в верхних горизонтах почвы. 10 Грибы рода Penicillium (рис. 3, в) называют кистевиками, так как они образуют конидии на концах мутовчаторазветвленных конидиеносцев, напоминающих кисть руки. Иногда отдельный пучок конидиеносцев, выходящих из одной точки и отчленяющих конидии, напоминает рисовальные кисти. Для рассмотрения строения конидиеносцев Penicillium glaucum препаровальной иглой вырезают кусочек мицелия (приблизительно 0,5 мм2) на границе между его зеленым и белым участками (Гриб к занятию выращивают в чашке Петри; старые грибы с полностью зеленым мицелием не годятся для просмотра). Осторожно с помощью двух препаровальных игл кусочек мицелия снимают со среды и помещают в каплю воды на предметное стекло. Поскольку мицелиальная пленка гриба довольно толстая, может получиться так, что под покровным стеклом вода не будет целиком окружать исследуемый мицелий. В этом случае надо из капельницы добавлять воду под покровное стекло до тех пор, пока кусочек мицелия не будет со всех сторон окружен водой. Затем слегка надавливают на покровное стекло в центре стеклянной палочкой (или препаровальной иглой). Избыток воды можно удалить фильтровальной бумагой. Препарат сначала просматривают при малом увеличении, уделяя основное внимание его краям, так как на них обычно хорошо видны кисти конидиеносцев. Когда подходящий участок найден, переходят с объектива 8× на объектив 40× и детально рассматривают кисточки. Во время просмотра при малом увеличении конденсор опускают, при переводе на объектив 40 снова регулируют освещенность поднятием конденсора. Aspergillus, или леечная плесень (рис. 3, б), имеет обычно одноклеточные конидиеносцы шаровидно, булавовидно или грушевидно вздутые. На них располагаются параллельно друг другу короткие кеглеобразные стеригмы, каждая из которых отшнуровывает радиально цепочки конидий. Некоторые виды аспергиллов имеют два ряда стеригм. Вся головка конидиеносца с радиально расходящимися цепочками конидий напоминает наконечник лейки со струйками воды. 11 Для ознакомления со строением конидиеносцев аспергилла на примере Aspergillus niger препаровальной иглой берут небольшое количество мицелия на границе между черным и коричнево – бурым участками колонии и вносят в каплю воды на предметном стекле. Далее поступают так же, как и при просмотре пеницилла. В начальной стадии спорообразования Aspergillus похож на Mucor (бесцветные головки), затем с возрастом головки покрываются стеригмами, на которых развиваются споры. В результате получаются так называемые кудрявые головки. От мукора аспергилл всегда можно отличить наличием таких головок. У мукора головки гладкие – «лысые», так как споры его эндогенного происхождения (внутренние), а у аспергилла и пеницилла – экзогенные споры (внешние). Дейтеромицеты, или несовершенные грибы. Имеют многоклеточ– ный мицелий, но у них нет полового процесса и совершенной стадии спороношения. Размножаются бесполым путем при помощи конидий или вегетативно участками гифов. В природе широко распространены представители родов Fusarium, Trichoderma, Alternaria, которых формально относят к дейтеромицетам. Встречаются они на растительных остатках, плодах, семенах и в почве. Среди грибов рода Fusarium (рис. 3, г) есть сапротрофы, живущие в почве и на растительных остатках, и паразиты, вызывающие заболевания многих видов растений (увядание, гнили корней, стеблей, плодов, полегание сеянцев древесных кустарниковых пород, болезни семян, различные пигментации органов растений). Колонии отдельных видов фузариума на питательных средах (на сусло-агаре) разнообразны по структуре: они могут быть рыхлыми, ватообразными, пушистыми, паутинистыми или плотными пленчатыми. Колонии бывают белые или различных тонов розового или желтого цветов. Нередко питательная среда также окрашивается в разные цвета и оттенки от розового до коричневого. 12 Фузариумы характеризуются большим разнообразием ферментов, благодаря которым могут использовать в качестве источников питания различные вещества, некоторые виды также способны усваивать клетчатку. Приготовив в капле воды препарат обычным способом и рассматривая его под микроскопом, можно увидеть более или менее разветвленные конидиеносцы и очень характерные для фузариума конидии, так называемые макроконидии. Они заострены на концах, продолговатые, согнутые, неродко серповидные, с несколькими перегородками (напоминают бананы). У многих видо фузариума образуются, кроме того, овальные мелкие бесцветные, чаще одноклеточные, микроконидии. Грибы рода Trichoderma нередко можно обнаружить на коре, древесине, засохших листьях и стеблях, а также на семенах различных трав, кустарников и деревьев; их легко выделить из почвы на подкисленном суслоагаре. Через 2-3 дня инкубации при 23-250С на поверхности среды появляется сначала белый, затем с оттенками зеленовато- желтого цвета рыхлоклочковатый или войлочный налет, образованный мицелием и скоплением конидиеносцев. С возрастом он становится темно- зеленым. При большом увеличении супротивно микроскопа разветвленные видны конидиеносцы, прямостоячие, многократно приподнимающиеся над мицелием. На вершине конидиеносцев расположены шаровидные головки, каждая из которых состоит 10-20 бесцветных одноклеточных конидий. Представители этого рода энергично разрушают белковые соединения и разнообразные углеводы. Обладая антибиотическими свойствами в отношении других грибов, в том числе паразитических, триходерма выполняет оздоровляющую функцию в почве. Разные виды рода Alternaria можно выделить с листьев пораженных этим грибом растений картофеля или томата, с семян капусты и других растений, из почвы. Они характеризуются своеобразным (обратнобулаловидным) строением многоклеточных грушевидных конидий, соединенных цепочками. У каждой – 3-9 поперечных и одна или несколько продольных перегородок. Конидиеносцы, являясь боковыми ответвлениями 13 мицелия, имеют вид простых или слаборазветвленных одноклеточных, иногда многоклеточных веточек. Колонии на сусло-агаре сначала светлые, пушистые, затем зеленовато – серые или оливково – черные, бархатистые или ворсистые, нередко с ясно выраженной концентрической зональностью; и колонии с самого начала сажисто – черные, уплощенные, во многих случаях темный пигмент диффундирует в среду. Дрожжи. По современным представлениям, дрожжи – это сборная группа одноклеточных микроскопических организмов, относящихся к разным классам грибов, преимущественно – к классу аскомицетов. Диаметр клеток дрожжей колеблется от 8 до 15 мкм. Форма их разнообразна: эллипсовидная, грушевидная, округлая, цилиндрическая. Размножаются вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения – почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимся дрожжам (рис. 4, а) относятся представители «культурных» дрожжей рода Saccharomyces (сахаромицеты), к делящимся – виды рода Schizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. В каждой сумке образуется от 2 до 8, иногда 12 спор. Среди дрожжей есть аспорогенные, ложные дрожжи, не способные к половому процессу и спорообразованию. Они относят к классу несовершенных грибов. С делящимися дрожжами (рис. 4, б) можно познакомиться на примере Schizosaccharomyces pombe (schizo – рваться, делиться, saccharomyces – сахарный гриб, pombe – название африканского напитка, из которого этот организм выделен). Дрожжам размножение делением несвойственно, поэтому данный род дрожжей является отклонением от нормы. Шизосахаромицеты размножаются и половым путем, связанным со спорообразованием, что характерно для сумчатых грибов. Schizosaccharomyces pombe рассматривают на фиксированных, окрашенных 14 фуксином препаратах. Это цилиндрической формы крупные клетки с округлыми концами. Размножение делением свойственно также дрожжам рода Endomyces. Из почкующихся дрожжей наиболее «одомашнены» дрожжи пекарские – Saccharomyces Рис. 4. Дрожжи cerevisiae. Форма их разнообразна. Размножаются а – почкующиеся; они почкованием (вегетативный способ размножения) б – делящиеся и аскоспорами. При почковании на материнской клетке возникает маленькая выпуклость – почка – дочерняя клетка, в которую переходит одно ядро. Клетка увеличивается в размерах и отделяется. Если условия для такого размножения благоприятны (достаточное количество сахара, соответствующая температура, аэрация), процесс идет быстро. У некоторых представителей рода клетки после почкообразования не успевают разъединяться, и возникает псевдомицелий (ложный мицелий). Для лабораторных занятий могут быть использованы пекарские дрожжи. Небольшой кусочек дрожжевой массы за несколько часов до занятий помещают в теплую подсахаренную воду и ставят в теплую место. Образуется мутная беловатая жидкость. Каплю этой жидкости наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, сверху наносят каплю кедрового масла и просматривают препарат с иммерсионной системой. Клетки хорошо видны и при меньших увеличениях. В пекарских дрожжах обычно присутствуют две расы: одна представлена округло – эллипсовидными клетками быстро разъединяющимися при почковании; другая – удлиненно - цилиндрическими, образующими при почковании ветвистые кустики (псевдомицелий). На многих клетках видны почки. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей хорошо заметны крупные прозрачные вакуоли, занимающие иногда центральное положение. С представителями аспорогенных дрожжей, размножающихся только почкованием и не образующих спор, можно познакомиться на примере Candida kefiri. Их клетки мелкие, диаметром около 5 мкм. 15 Размножение у дрожжеподобных организмов может происходить также в результате распада гиф на отдельные клетки – оидии, или артроспоры, как у Geotrichum candidum (Oidium lactis). 1.2. Цитохимические методы исследования микроорганизмов Микробная клетка – сложная живая система, характеризующаяся высокой степенью упорядоченности составляющих ее структур. Каждая такая структура имеет определенную функцию, а взаимодействие отдельных структур между собой обеспечивает существование клетки, ее целостность. Для изучения внутреннего строения клеток применяют специальные способы окраски – цитохимические методы исследования. Многие из этих методов преследуют диагностические цели. По форме клетки микроорганизмов не слишком разнообразны, и в ряде случаев, чтобы установить принадлежность к тому или иному роду и виду, необходимо специальное окрашивание клетки или вещества, находящегося в ней. 1.2.1. Окраска клеток микроорганизмов по Граму Вводные пояснения. Этот метод дифференциации микробных клеток основан на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних микроорганизмов образуется нерастворимое соединение иода с основным красителем, а у других видов это соединение появляется временно и Микроорганизмов первой после обработки спиртом растворяется. группы называют – грамположительными, второй – грамотрицательными. Техника окраски по Граму. На хорошо обезжиренное предметное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов (два из них – контрольные, с заведомо известным отношением к окраске по Граму). 16 Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1 мин феноловым раствором генциана фиолетового ( или кристаллического фиолетового), держа стекло в слегка наклонном положении. Затем краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на него на 1 мин. раствор Люголя (до полного почернения мазка). Стекло и в этом случае лучше держать в наклонном положении. Препарат, не промывая водой, обрабатывают, непрерывно покачивая, 96%-ным спиртом в течение 15-20 с. Очень важно четко придерживаться времени обесцвечивания, так как при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки. Промыв водой, препарат окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1 мин. После этой обработки грамположительные микроорганизмы приобретают темно – фиолетовый цвет, а грамотрицательные окрашиваются лишь в цвет дополнительной окраски (фуксина). Результаты окраски по Граму зависят от возраста культуры: в старых культурах мертвые клетки всегда окрашиваются грамотрицательно. Поэтому лучше использовать молодые односуточные культуры. Некоторые бактерии (протей) окрашиваются грамвариабельно, т.е. часть клеток – как грамположительные, а часть – как грамотрицательные. Хорошими объектами для окраски клеток микроорганизмов по Грамму служат дрожжи, Bacillus грамположительные) и mesentericus или кишечная палочка Bacillus subtilis Escherichia ( coli (грамотрицательная). Метод Грамма в модификации Синева. На фиксированный мазок накладывают предварительно полоску фильтровальной пропитанную 1 бумаги %-ным шириной спиртовым 3 см, раствором кристаллического фиолетового и высушенную. На бумагу наносят 2-3 капли воды и оставляют ее на препарате 2 мин. Далее окраску проводят по вышеописанной методике. Модификацию Синева широко применяют на практике. 17 Метод Грамма в модификации Калина. На предметное стекло наносят небольшую каплю дистиллированной воды, помещают в нее минимальное количество клеток микроорганизмов и петлей добавляют 0,5%ный спиртовой раствор кристаллического фиолетового. Суспензию равномерно распределяют на площади 1 см2, подсушивают и фиксируют однократным проведением над пламенем горелки. После этого препарат в течение 1 мин обрабатывают реактивом, содержащим 10 мл 5%-ного раствора фуксина Пфейфера, 10 мл 10%-ного раствора иода, 10 мл ацетона и 70 мл 0,5%-ного раствора иодита калия. Затем препарат опускают на мгновение в 96%-ный этиловый спирт и быстро высушивают фильтровальной бумагой. Красители и реактивы для окраски по Грамму. 1.Феноловый раствор генциана фиолетового. Генциан фиолетовый – 1 г, спирт 96%-ный – 10 мл, фенол кристаллический – 2 г, вода дистиллированная – 100 мл. В некоторых случаях применяют спиртовой раствор генциана фиолетового: генциан фиолетовый (или кристаллический фиолетовый) – 1г, спирт 96%-ный (ректификат) – 100 мл, глицерин – 5 мл. Бутыль со смесью ставят в термостат на 24 ч (можно и дольше), затем фильтруют. 2.Раствор Люголя (иодит калия – 2 г, иод кристаллический – 1г, вода дистиллированная – 300 мл). Вначале готовят концентрированный раствор иодита калия в 5 мл воды, в нем ратворяют иод, потом добавляют воду до 300 мл. 3. Спирт 96%-ный. 4.Фуксин Пфейфера (водный раствор карболового фуксина Циля): 1 мл карболового фуксина Циля (см. 3.2.2) и 9 мл дистиллированной воды. 18 1.2.2. Выявление кислотоустойчивости бактерий методом Циля – Нильсена Кислотоустойчивость - свойство, наиболее характерное для микобактерий и некоторых актиномицетов. Оно связано с особенностями химического состава клеточных стенок, главным образом – с наличием в них миколовых кислот. Кислотоустойчивость проявляется в том, что клетки с трудом воспринимают красители, а при окрашивании – прочно их удерживают. До фиксации мазка бактерий на пламени препарат готовят обычным способом. Далее на фиксированный в пламени и остывший препарат помещают полоску фильтровальной бумаги, обильно смачивают ее карболовым фуксином Циля и нагревают препарат над пламенем 5 мин. Нельзя допускать высыхания препарата: в случае необходимости следует добавить 1-2 капли воды. Нельзя также доводить краситель до кипения: как только появятся пары, препарат отводят в сторону. По окончании окрашивания и охлаждения препарата бумагу удаляют, а мазок промывают слабой струей водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке. Затем препарат промокают фильтровальной бумагой и погружают на 3-5 с в 5%-ный раствор H2SO4 или 3%-ный раствор HCL. Еще раз промывают препарат водой, промокают и окрашивают в течение 3-5 мин метиленовым синим Леффлера. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, некислотоустойчивые – в синий. Красители и реактивы для окраски кислотоустойчивых бактерий. 1. Карболовый фуксин Циля: фуксин основной – 1 г, карболовая кислота кристаллическая (фенол) – 5 г, спирт 96%-ный – 10 мл, глицерин – несколько капель, вода дистиллированная – 100 мл. Основной фуксин растворяют в этаноле и затем добавляют растворенный в воде фенол. Раствор тщательно перемешивают и оставляют на несколько дней. Перед использованием его фильтруют. 19 2. Метиленовый синий Леффлера: 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешивают со 100 мл 0,01%-ного раствора KOH. Насыщенный спиртовой раствор метиленового синего готовят следующим образом: 1,6 г метиленового синего растворяют в 100 мл 95%-ного этилового спирта. 3. Серная кислота – 5%-ный раствор или соляная кислота – 3%-ный раствор. 2. Лабораторная работа № 3 Измерение увеличения зрительной трубы и микроскопа Цель работы: ознакомиться с некоторыми методами определения увеличения микроскопа и зрительной трубы. Теоретическая часть Зрительная трy6а и микроскоп представляют собой оптические системы, состоящие из объектива и окуляра. Зрительная труба предназначена для рассмотрения удаленных предметов. Действительное перевернутое изображение, полученное с помощью объектива зрительной трубы располагается практически в фокальной плоскости объектива. При рассмотрении с помощью микроскопа предмет располагается вблизи фокуса объектива на расстоянии, несколько большем фокусного расстояния. Поэтому объектив дает действительное увеличенное перевернутoe изображение. Окуляр и в зрительной трубе, и в микроскопе дает прямое мнимое увеличенное изображение. В результате совместного действия объектива и окуляра в обоих случаях глазом наблюдается перевернутое изображение. Видимым увеличением Г называется отношение тангенса угла, под которым глаз наблюдателя видит изображение, образованное оптической системой (рис.1), к тангенсу утла, под которым предмет виден невооруженным глазом: tg . tg (1) Тангенс угла , под которым виден предмет невооруженным глазом, определяется размерами предмета и расстоянием от предмета до глаза. Следует различать случаи 20 наблюдения удаленных и близлежащих предметов. В первом случае расстояние от предмета до глаза гораздо больше фокусного расстояния и размеров оптической системы. Поэтому в случае рассмотрения удаленных предметов можно пользоваться приближенной формулой tg l tg . s (2) Рис. 1. Наблюдение предмета не вооруженным глазом и с помощью оптической системы Вo втором случае предмет можно рассматривать непосредственно глазом с расстояния наилучшего зрения d0, которое является неодинаковым для разных глаз и в среднем считается равным 25 см. В этом случае tg l . d0 (3) Если оптическая система образует прямое изображение ( и одного знака), то Г положительно. Обратное изображение оптической системы характеризуется различными по знаку углами и и, следовательно, величина видимого увеличения будет отрицательной. Однако на практике пренебрегают знаком видимого увеличения, оно всегда считается положительным, а вид изображения (прямое или обратное) оговаривается особо. Пусть предмет величиной l (рис. 1) рассматривается из точки В с помощью оптической системы, характеризуемой главными точками H и H’ и фокусами F и F' с координатами f и f’, соответственно. Тангенс угла , под которым видно изображение l ' 21 (на рисунке все величины положительны), определяется размерами изображения и расстоянием d от изображения до глаза: Из подобия треугольников, изображенных на рис. 1, имеем l l ; x f l l . f x (5) Отсюда и получаем формулу Ньютона l f x , l x f xx ff . (6) (7) Здесь - линейное увеличение оптической системы. Если коэффициенты преломления вещества справа и слева от оптической системы одинаковы, то, как следует из теории, f f . Так как обычно наблюдение производится в воздухе, это равенство остается в силе в большинстве случаев. Нетрудно доказать, что если f f , углы и также равны друг другу. При этом, как видно из рис.1, имеет место следующее соотношение: tg l l l . S S f x (8) Рассмотрим несколько частных случаев. 1. Пусть система используется в качестве объектива зрительной трубы. В этом случае расстояние от предмета до первого фокуса x f и обратное уменьшенное изображение располагается практически во второй или задней фокальной плоскости (см. формулу (7)). В этом случае, как видно из формулы (8), tg l . f (9) Если глаз расположить на расстоянии наилучшего зрения от изображения, то изображение будет видно под углом , величина которого определяется формулой tg l . d0 (10) Отсюда видимое увеличение объектива зрительной трубы (см. также формулу (2)) f . d0 (11) Как видно из этой формулы, чтобы получить увеличение больше единицы, необходимо, чтобы фокусное расстояние было больше расстояния наилучшего зрения. 2. Если оптическая система используется в качестве объектива микроскопа, то предмет располагается вблизи первого фокуса на расстоянии, несколько большем фокусного расстояния (-x>0) от первой главной плоскости. Чтобы рассмотреть изображение, глаз 22 можно расположить на расстоянии f x d 0 от второй главной плоскости (рис.1), причем, как следует из формулы (7), x ff f 2 . x x (12) В этом случае угол , под которым видно изображение, определяется из формулы tg l . d0 (13) Видимое увеличение объектива микроскопа, как видно из формул (3) и (13), оказывается равным линейному увеличению (см. также формулу (7)): f x . x f (14) Отсюда следует, что 1 , если x f . При заданном фокусном расстоянии увеличение тем больше, чем меньше расстояние (-x) от предмета до первого фокуса. Вместе с тем предмет нельзя помещать слишком близко от фокуса, так как при этом расстояние до глаза f’+x’+d0, как следует из формулы (12), будет слишком большим. Используя формулы (12) и (14), для этого расстояния получим: f x d 0 f (1 ) d 0 . (15) Из этой формулы следует, что при фиксированном фокусном расстоянии объектива микроскоп с большим увеличением должен иметь большие размеры. Микроскоп небольших размеров и с большим увеличением должен иметь объектив с малым фокусным расстоянием. На практике действительное перевернутое изображение, полученное с помощью объектива, в зрительной трубе и в микроскопе рассматривается с помощью собирающей системы, используемой в качестве окуляра. 3. Для того чтобы собирающая система выполняла функции окуляра, предмет располагается между ее передним фокусом и первой главной плоскостью (x>0). С изменением расстояния x от переднего фокуса окуляра до предмета будет изменяться координата изображения x’ относительно второго фокуса окуляра и, следовательно, расстояние от глаза до изображения. Если x=0, то мнимое прямое увеличенное изображение располагается на бесконечно большом удалении и глаз необходимо аккомодировать на бесконечность. Чтобы определить расстояние x, при котором мнимое изображение находится на произвольном расстоянии d от глаза, введем координату глаза x1 относительно заднего фокуса окуляра и воспользуемся формулой (7). Полагая в этой формуле ( x x1 ) d , найдем (рис. 2) 23 x f 2 . d x1 (16) Рис.2. Наблюдение мнимого изображения призмы в системе окуляр-глаз В этом случае линейное увеличение окуляра, как следует из формулы (7), будет равно d x1 , f (17) а линейный размер мнимого изображения l l . Угол , под которым видно изображение, определяется из формулы tg l (d x1 ) . f d (18) Следовательно, видимое увеличение окуляра в общем случае оказывается равным (см- также формулу (3)): d x 0 1 1 . f d (19) Из формулы (19) следует, что видимое увеличение окуляра зависит от фокусного расстояния, положения глаза и от расстояния до мнимого изображения, на которое аккомодируется глаз. Увеличение окуляра обратно пропорционально фокусному расстоянию, поэтому для окуляра с большим увеличением фокусное расстояние выбирается намного меньше расстояния наилучшего зрения, f ' d0 . 24 Расстояние d, на которое аккомодируется глаз при рассмотрении предметов с помощью окуляра или лупы, специфично для каждого глаза и может быть измерено экспериментально. Для дальнозоркого глаза это расстояние может быть бесконечно большим. Для близорукого глаза d < d0, т.е. меньше расстояния наилучшего зрения для среднего глаза. В связи с этим окуляры выполнены таким образом, чтобы можно было плавно изменять их положение относительно действительного изображения, даваемого объективом. Тем самым осуществляется изменение расстояния от глаза до мнимого изображения и, следовательно, настройка на четкое изображение для данного глаза. В результате совместного действия объектива и окуляра видимое увеличение зрительной трубы и микроскопа оказывается равным произведению увеличения объектива (см. формулы (11) и (14), соответственно) на увеличение окуляра (см. формулу (19)). Отсюда для видимого увеличения зрительной трубы имеем f x об 1 1 , f ок d (20) а для микроскопа, соответственно, получим d 0 f об f ок x1 1 . d (21) Здесь - расстояние от второго фокуса объектива в микроскопе до действительного изображения, даваемого объективом. Практически это расстояние совпадает с расстоянием между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра. Расстояние называют длиной тубуса микроскопа. Общим сечением для всех пучков лучей, приходящих под разными углами в зрительную трубу или микроскоп, является сечение объектива. Это сечение является зрачком входа. В каждую точку зрачка входа приходит сходящийся пучок лучей из разных точек рассматриваемого объекта. Каждый такой пучок преобразуется окуляром в сходящийся пучок лучей в плоскости, положение которой определяется расстоянием от объектива до окуляра и фокусным расстоянием окуляра. Входной зрачок отображается в этой плоскости в виде круглого светлого пятна, являющегося общим сечением для всех выходящих пучков лучей. Это сечение называется выходным зрачком. Как видно из формул (20) к (21), увеличение зрительной трубы и микроскопа тем больше, чем больше расстояние от объектива до окуляра в сравнении с фокусным расстоянием окуляра. Поэтому в системах с большим увеличением выходкой зрачок находится практически в задней фокальной плоскости окуляра. Если помещать глаз в сечении выходного зрачка, что удобно с точки зрения выигрыша в светосиле, то формулы для увеличения зрительной трубы и микроскопа yпpocтятся, так как x1 0 . В этом случае для видимого увеличения зрительной трубы получим известную формулу 25 f об , f ок (22) а видимое увеличение микроскопа запишется в виде d 0 . f об f ок (23) Заметим, что эти же результаты получаются из более общих формул (20) и (21), соответственно, в предположения d = . Поэтому при расчете увеличения зрительной трубы и микроскопа можно полагать, что действительное изображение, полученное с помощью объектива в этих системах, совмещено с передней фокальной плоскостью окуляра. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Измерение расстояния наилучшего зрения П р и н а д л е ж н о с т и : окуляр (лупа) с объектом для настройки по глазу; фотообъектив с перемещающимся относительно него экраном; источник света; оптическая скамья, рулетка. При рассмотрении предметов с помощью окуляра или лупы важное значение имеют оптические свойства самого глаза, так как видимая картина является результатом совместного действия окуляра (лупы) и оптической системой глаза, с учетом субъективных зрительных навыков и патологии глаза наблюдателя. Одним из свойств глаза, который является очень сложным и совершенным оптическим инструментом, является аккомодация. Аккомодацией называется способность глаза приспосабливаться к четкому наблюдению разноудаленных предметов. Это достигается изменением формы хрусталика. Различают ближнюю и дальнюю точки ясного зрения. Расстояние между этими точками в метрах определяет область или длину аккомодации, а выраженное в диоптриях - силу аккомодации. Расстояние, на котором глаз отчетливо различает наибольшее число деталей предмета, называется расстоянием наилучшего зрения. Это расстояние является специфичным для каждого глаза, причем в общем случае расстояние d0 наилучшего зрения при непосредcтвенном наблюдении предметов может отличаться от расстояния d , на которое аккомодируется глаз при рассмотрении с помощью окуляра или лупы. В частности, для дальнозоркого глаза расстояние d0 может оказаться порядка 3040 см, а расстояние d, на которое аккомодируется глаз при наблюдении с помощью окуляра, может быть бесконечно большим. 26 В рамках настоящего упражнения предлагается измерить расстояние d наилучшего зрения при рассмотрении предмета с помощью окуляра. Схема оптической системы для выполнения упражнения приведена на рис.3. Перестраиваемый окуляр (лупа) настраивается таким образом, чтобы наблюдаемое через него изображение объекта было видно наиболее отчетливо. Далее окуляр 3 вместе с объектом 2 устанавливается на оптическую скамью вблизи источника света 1, с одной стороны, и фотообъектива 4 - с другой. Перемещая экран 5, необходимо добиться чёткого изображения объекта 2 на экране. Рис. 3. Схема оптической системы для определения расстояния наилучшего зрения Затем окуляр вместе с объектом снимается и, не меняя относительного расположения объектива и экрана, относительным перемещением источника и фотообъектива находится расстояние d, при котором на экране получается четкое изображение источника. Следует иметь в виду, что расстояние d измеряется от источника света до первой главной плоскости объектива, положение которой отмечено на креплении объектива. Поэтому переднюю главную плоскость объектива при настройке с окуляром (лупой) следует располагать в непосредственной близости от лупы. При этом несоответствие в расположении глаза и передней главной плоскости Н (рис.3) относительно окуляра (лупы) повлечет за собой ошибку в измерении расстояния d. Измерения необходимо повторить 45 раз, найти среднее значение и определить среднеквадратическую ошибку измерений. Определение увеличения зрительной трубы П р и н а д л е ж н о с т и : зрительная труба, стенной масштаб, рулетка. 27 Оптические системы, предназначенные для наблюдения удаленных предметов, называются телескопическими. Вследствие достаточной удаленности предметов лучи из каждой точки предмета поступают в телескоп или зрительную трубу в виде почти параллельного пучка. Поэтому можно считать, что изображение предметов получается в задней фокальной плоскости объектива. В первом приближении также можно считать, что это действительное обратное изображение располагается в передней фокальной плоскости окуляра, поэтому выходящие из телескопической системы пучки лучей можно в первом приближении считать параллельными. Ход лучей в телескопической системе показан на рис. 4. Рис. 4. Ход лучей света в телескопической системе Как видно из рис.4, отношение диаметров зрачка входа D и зрачка выхода D' равно отношению фокусных расстояний объектива и окуляра. С другой стороны, как следует из формулы (22), это отношение определяет видимое увеличение зрительной трубы. Таким образом, видимое увеличение зрительной трубы может быть определено с помощью формулы D . D (24) Формула (24) положена в основу первого метода измерения видимого увеличения зрительной трубы. В рамках этого метода зрительная труба настраивается на четкое изображение достаточно удаленных предметов. Производятся измерения входного зрачка (внутреннего диаметра оправы объектива) и выходного зрачка. Для этого за окуляром зрительной трубы устанавливается экран с делениями таким образом, чтобы на экране отчетливо 28 наблюдалось световое пятно, образованное выходящими из зрительной трубы пучками света. Видимое увеличение подсчитывается по формуле (24). Видимое увеличение зрительной трубы может быть измерено вторым методом. В рамках этого метода угловые размеры изображения целого числа делений стенного масштаба, видимых одним глазом в зрительной трубе, измеряются целым числом N делений, видимых вторым (невооруженным) глазом. Для этого необходимо, одновременно наблюдая двумя глазами, один из которых вооружен зрительной трубой, увидеть линейку (стенной масштаб). При этом в поле зрения зрительной трубы видно какое-то число увеличенных делений. Необходимо выбрать такое целое число n этих делений, которое видно под тем же углом, под которым невооруженным глазом видно другое целое число N делений (рис.5). В результате деления N на n получим число делений, видимых невооруженным глазом под тем углом, под которым видно изображение одного деления в зрительной трубе, т.е. видимое увеличение: N n (25) Рис.5. Изображения линейки, одновременно наблюдаемые невооруженным глазом и вооруженным зрительной трубой глазом Измерение поля зрения зрительной трубы Полем зрения называется та часть пространства, которая видна или изображается с помощью данной оптической системы. Очевидно, поле зрения ограничено вследствие конечных размеров линз. Для систем, предназначенных для рассмотрения значительно удаленных предметов (например, для зрительной трубы) поле зрения принято характеризовать в угловой мере. Для систем, предназначенных для рассмотрения 29 близлежащих предметов, например для микроскопа, поле зрения определяется в линейной мере. Для измерения поля зрения зрительной трубы необходимо настроить ее на стенную линейку и определить длину l-той части линейки, которая видна в поле зрения зрительной трубы. Затем с помощью рулетки необходимо измерить расстояние L от линейки до объектива зрительной трубы. Поле зрения определится по формуле l , L а в градусной мере- 180 l l 57, 3 . L L (26) Измерение увеличения микроскопа и скорости роста кристаллов П р и н а д л е ж н о с т и : микроскоп с двумя объективами и двумя окулярами, объектный микрометр, наклонное зеркальце на цилиндрической подставке, шкала с миллиметровыми делениями на вертикальном штативе, винтовой окулярный микрометр, пробирки с водными растворами медного купороса, гипосульфита и хромпика, секундомер. Как следует из формулы (21), видимое увеличение микроскопа зависит от фокусных расстояний объектива и окуляра, положения предмета относительно объектива и, следовательно, от положения окуляра относительно объектива, а также от расположения глаза и способа его аккомодации. Однако в первом приближении можно считать, что действительное изображение, полученное с помощью объектива, находится в передней фокальной плоскости окуляра (рис.6). Выходной зрачок, как видно из рисунка, расположен за вторым фокусом окуляра, причем, так как на практике фокусное расстояние окуляра намного меньше расстояния от объектива до окуляра, в первом приближении можно считать, что выходной зрачок совмещен со второй фокальной плоскостью окуляра. Если глаз наблюдателя совмещен с выходным зрачком (см. теоретическую часть), видимое увеличение в этом случае может подсчитываться по формуле (23). 30 Рис. 6. Ход лучей света в микроскопе Чтобы получить качественное изображение, объектив и окуляр (рис.7 и рис.8) выполняются из нескольких линз с тем, чтобы изображение не искажалось вследствие сферической и хроматической аберраций. Объектив (рис.7) - важнейшая часть микроскопа представляет собой систему линз, собранную в единой оправе. Передняя, так называемая фронтальная линза - единственная, производящая увеличение, остальные же служат для исправления искажений фронтальной линзы и поэтому называются коррегирующими. Объективы нумеруются в порядке возрастания даваемого ими увеличения. Рис.7. Объектив микроскопа Рис.8. Окуляр Окуляр (рис.8) представляет собой сложную лупу, состоящую обычно из двух линз: верхней глазной и нижней собирательной, отстоящих друг от друга на расстоянии, 31 равном половине суммы их фокусных расстояний. Окуляры также нумеруются в порядке возрастания увеличения. Микроскоп (рис.9) состоит из штатива, в который входят основание 2, тубусодержатель 4 и предметный столик 8, тубуса 6 и приспособления 10 для крепления зеркала 11, необходимого для освещения прозрачного объекта. Штатив микроскопа имеет массивное основание, придающее ему необходимую устойчивость. Предметный столик служит для крепления объекта наблюдения. Непосредственно под столиком или на конденсоре 9 укреплена переменная диафрагма, служащая для регулировки освещенности рассматриваемого объекта. Тубус микроскопа связан с колонкой и может передвигаться при вращении кремальерных винтов 1, 3. Нижнее отверстие тубуса имеет нарезку для привертывания объектива или держателя 7, несущего на себе несколько объективов и позволяющего быстро менять их путем поворота вокруг оси. В верхней части тубуса устанавливаются съемные окуляры 5. Для измерений видимого увеличения микроскопа на предметный столик кладется объектный микрометр - стеклянная пластинка с нанесенной на ней шкалой с делениями через 0,1 мм. С помощью кремальерных винтов 1, 3 и окуляра 5 производится настройка микроскопа на четкое изображение. Сбоку на расстояния наилучшего зрения устанавливается вертикальная шкала с миллиметровыми делениями. На окуляр микроскопа устанавливается наклонное зеркальце (полупрозрачное или имеющее продольный вырез) таким образом, чтобы можно было одновременно видеть отчетливое изображение объектного микрометра в микроскопе и вертикальную шкалу. При этом для выравнивания освещенности рекомендуется пользоваться диафрагмой конденсора или изменением наклона зеркала. 32 Рис.9. Внешний вид микроскопа и его составные части Подсчитывается число делений шкалы N, видимых под тем же самым углом, под которым видно n делений изображения микрометра. Так как линейные размеры делений вертикальной шкалы в 10 раз больше соответствующих делений микрометра, видимое увеличение подсчитывается по формуле 10 N . n (27) Измерения повторяются для второго окуляра, а затем для второгo объектива. Для измерений скорости роста кристаллов необходимо в верхнее отверстие тубуса, установить винтовой окулярный микрометр и определить линейный размер предмета, видимого под углом, соответствующим одному делению окулярного микрометра. Если смещению на m делений окулярного микрометра соответствует n делений объектного микрометра, то, очевидно, одному делению окулярного микрометра соответствует линейное смещение в плоскости объекта, равное n 0,1 мм . m (28) Заметим, что величина будет разной для различных объективов. 33 После того, как величина измерена, необходимо снять объектный микрометр, установить на предметный столик стеклянную пластинку, на которой предварительно необходимо размазать каплю водного раствора CuSO4, K2Cr2O7 или другой соли. При испарении воды из раствора выпадают кристаллы. Настройку на четкое изображение необходимо осуществлять с помощью кремальерного винта. Установив перекрестие окулярного микрометра на одну из граней кристалла, необходимо включить секундомер и одновременно снять показания барабана микрометра. Через некоторое время перемещается перекрестие микрометра вслед за растущей гранью кристалла и останавливается секундомер. Определив линейное перемещение грани кристалла и время, вычисляется скорость роста кристаллов. Измерения в процессе роста кристалла необходимо повторить три-пять раз, найти среднее значение скорости и определить среднеквадратическую ошибку. Контрольные вопросы и задания 1. С помощью каких формул можно вычислить увеличение объективов зрительной трубы и микроскопа, а также увеличение окуляра? 2. Где располагается выходной зрачок в зрительной трубе и в микроскопе? 3. 0т каких параметров зависит увеличение зрительной трубы и микроскопа? 4. Как может быть измерено расстояние наилучшего зрения? 5. Какими методами измеряется увеличение зрительной трубы и микроскопа? 6. Как измеряется поле зрения зрительной трубы? 7. Постройте ход лучей в зрительной трубе и микроскопе? Литература 1. Ландсберг Г.С. Оптика.- M.: Наука, 1976. 2. Фриш С.Э., Тиморева А.В. Курс общей физики. Т.3.- М.: Физматгиз, 1962. 3. Бегунов Б.Н. Геометрическая оптика.- M.: Изд-во МГУ, I961. 4. Федин Л.А. Микроскопы, принадлежности к ним и лупы.- M.: Оборонгиз, 1961. 5. Шишловский А.А. Прикладная физическая оптика.- М.: Физматгиз, 1961. 6. Физический практикум. Электричество и оптика / Под ред. В.И.Ивероновой.- M.: Физматгиз, 1968. 34 35
