Б.Б. Костишко (студент), А.Ф. Садритдинова (студент), А.В. Снежкина (студент)
advertisement
Б.Б. Костишко (студент), А.Ф. Садритдинова (студент), А.В. Снежкина (студент) ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ г. Ульяновск, Центр нанотехнологий и материалов (ЦНТИМ), Ульяновский Государственный Университет ВВЕДЕНИЕ За последние превратилась 10 из ограниченному лет экзотической числу распространенный сканирующая и зондовая методики, исследовательских успешно микроскопия доступной групп, применяемый в лишь широко инструмент для исследования свойств поверхности [21]. Атомно-силовой микроскоп (АСМ) производит сканирование поверхности нанометровом на основе расстоянии принципа от поддержания объекта алмазной на постоянном иглы, которая притягивается к поверхности за счет межмолекулярных сил. АСМ позволяет исследовать биологические объекты и измерять параметры клеток. В ближайшее распространенным в время этот биологических метод будет исследованиях. наиболее Привлекает возможность исследования объектов не только на нанометровом расстоянии, но и возможность прижизненного исследования клеток [5]. Данная работа посвящена исследованию клеток крови лейкоцитов и эритроцитов – методом атомно-силовой микроскопии. 1 Несмотря на огромное разнообразие методов диагностики клеток крови, атомно-силовая современный микроскопия инструмент для представляет проведения собой исследований. самый АСМ позволяет измерять не только профиль поверхности, но и локальные силы трения, величину адгезии, упругие и вязкие свойства поверхности с субнанометровым пространственным разрешением. Приготовление препаратов для исследований с помощью атомно-силовой микроскопии позволяет избежать жесткой фиксации образцов и методов обработки солями тяжелых металлов, которые традиционно применяются в световой и электронной микроскопии. Подобные процедуры зачастую не соответствуют природным условиям, в которых макромолекулы проявляют свою биологическую активность. Высокое разрешение порядка нескольких нанометров, относительно небольшое время – минуты, которое требуется для сканирования, отсутствие необходимости вводить метки и фиксировать образец делают АСМ одним из удобных инструментов исследований в биологии. Задачей настоящего исследования явилось выявление наиболее адекватного способа приготовления клеток крови человека для АСМанализа структурно-функциональных и вязко-упругих свойств поверхностной мембраны эритроцитов и лейкоцитов. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Периферическую кровь из локтевой вены (v. mediana cubiti) 1:1 разбавляли раствором Хенкса. В специальные центрифужные пробирки пипеткой наслаивали градиентный раствор фиколл-верографина, затем осторожно наслаивали кровь. После 45 минут центрифугирования, в пробирке образуется четыре фракции: первая (нижняя) – осадок эритроцитов и мертвых клеток, вторая – раствор фиколл-верографина, третья – кольцо лейкоцитов, четвертая – плазма крови. Кольцо, содержащее лейкоциты, осторожно снимали, переносили в чистую 2 пробирку, отмывали в растворе Хенкса. Суспензию лейкоцитов пипетировали и раскапывали (размер капли 20 мкл) на чистые обезжиренные предметные стекла (размер стекол 1х2,5 см) и проводили адгезию при температуре 37 градусов в течение 60 минут. Суспензию эритроцитов наносили на стекло методом мазка и высушивали на воздухе [7]. В качестве фиксаторов использовали следующие вещества: пары формалина (45 минут), метанол (1-10 минут), 2,5% глютаровый альдегид (1-10 минут). Препараты окрашивали по Романовскому-Гимза для оценки локализации клеток на препарате. Для исследования сканирующий зондовый поверхности микроскоп Solver клеток Smena использовали A (ЦНТИМ). Сканирование поверхности фиксированных препаратов проводили в полуконтактном режиме на воздухе. Использовались неконтактные кремниевые зонды серии NSG10 (NT-MDT) с жесткостью 5,5 Н/м, резонансной частотой приблизительно 150 кГц, радиусом закругления 10 нм, высота зонда 10-20 мкм. Было проведено сканирование в воздушной фазе более чем 30 образцов. Обработку полученных изображений проводили с помощью программного обеспечения Nova [2,3]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведенного исследования фиксации клеток крови эритроцитов и лейкоцитов такими фиксаторами, как метанол, 2,5% глютаровый альдегид было получено: На препаратах лейкоцитов без адгезии, высушенных на воздухе клетки оказываются вздутыми, что свидетельствует о нарушении целостности плазматической мембраны. Данный факт не позволяет определять морфологию и измерять параметры мембраны, возможен 3 лишь подсчёт плотности и количества клеток на препарате (рис. 1). При фиксации лейкоцитов метиловым спиртом необходимо соблюдать определённое время фиксации. При фиксации в течение 10 мин – клетки разрушаются, происходит плазмолиз. При фиксации в течение 15 мин - морфология клетки сохраняется. При фиксации лейкоцитов 2,5% глютаровым альдегидом в течение 10 мин – клетки разрушаются, в течение 1-5 мин при соблюдении адгезии и предварительной фиксации в парах формалина клетки сохраняют воду и их АСМизображение идентично изображению нативного лимфоцита, в котором четко определены границы клетки. Таким образом, последний способ фиксации лейкоцитов является наиболее оптимальным и дает возможность определения морфологических параметров (рис. 2) [1]. Рис.1. Лейкоциты, высушенные на воздухе. На мембране лейкоцитов возникают вздутия, происходит искажения клеточной поверхности. 4 Рис.2 Изображение лейкоцита, фиксированного 2,5% глютаровым альдегидом (1-5 мин), при соблюдении адгезии и предварительной фиксации в парах формалина. Проводилось измерение линейных параметров лимфоцита. Справа – силовая кривая, вершина графика соответствует максимальной высоте клетки (высота ядра, т.к. клетка распластана). По силовой кривой можно рассчитать вязко-упругие свойства мембраны изучаемой клетки. Препараты эритроцитов, высушенных на воздухе, дают адекватную картину распределения клеток в мазке. Скан эритроцитов соответствует их нативному изображению. Такие клетки наиболее удобны для изучения морфологии и параметров мембраны (рис. 3). Эритроциты, фиксированные метанолом в течение 1-10 мин, имеют искаженную форму. Они слипаются, образуя «столбики». При данном методе фиксации возможен лишь подсчет количества эритроцитов и определение плотности клеток на препарате (рис. 4) [1]. 5 Рис.3 Эритроциты, высушенные на воздухе. Искажение формы клетки не происходит. Рис.4 Эритроциты при фиксации метанолом. Форма клеток искажена. В ходе данного исследования были выявлены также артефакты сканирования, которые необходимо учитывать при изучении экспериментального материала. Все наблюдаемые артефакты можно разделить на две основные группы: 1. Особенности, связанные с приготовлением биологического материала: А) нарушение целостности мембраны (изменение pH, несоблюдение времени фиксации клеток, нарушение температурного режима, механики опыта и др.); 6 Б) обезвоживание клеток – выход воды из клетки, эритроциты имеют вид теней (высокая концентрация фиксирующего раствора, несоблюдение времени фиксации) (рис. 5); Рис.5 Обезвоженные клетки. На АСМ-скане видны «тени» клеток вследствие выхода из них воды. В) неправильная форма клеток в отсутствии у них адгезии; 2. Особенности, связанные с взаимодействием зонда и мембраны клетки: А) возбуждение зонда на поверхности клеток при резких перепадах высот; Б) разрыхление мембраны и появление на ней участков, взаимодействующих с зондом (к которым зонд липнет) (рис. 6). Рис.6 Взаимодействие зонда с мембраной эритроцита, приводящее к разрыхлению мембраны. 7 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нами проведена оценка морфологических особенностей клеток крови человека с помощью метода атомно-силовой микроскопии. При проведении исследований биологических объектов – клеток, методами АСМ возникает ряд проблем, связанных с процедурой приготовления препаратов. Поэтому, прежде чем проводить измерения исследуемых клеток крови необходимо стандартизировать методику получения и приготовления лейкоцитов и эритроцитов. Для получения устойчивых изображений необходимо правильно иммобилизировать клетки [5]. При исследовании, например, лейкоцитов возникают сложности с их относительно большими вертикальными размерами. В связи с этим, при подготовке препарата важным методическим аспектом является правильный выбор времени инкубации клеток. Чем продолжительнее срок инкубации, тем более распластанными на подложке оказываются клетки и тем удобнее их исследовать. Кроме этого важно правильно выбрать фиксатор и время фиксации клеток, так как лейкоциты неустойчивы, поэтому при передержке в фиксаторе, при высокой его концентрации мембрана клетки и сами лейкоциты разрушаются [6]. Таким образом наиболее оптимальным вариантом подготовки лейкоцитов для изучения на АСМ является: выделение верографина, адгезия фракций лейкоцитов лейкоцитов на с помощью стеклянной фиколл- подложке при температуре 37 градусов в течение 60 мин, фиксации в 2,5% глютаровом альдегиде в течение 1-4 мин, при предварительной фиксации в парах формалина в течение 45 мин. При изучении эритроцитов наилучшим способом оказалось приготовление препарата методом мазка, при высушивании его на воздухе. Такой способ дает более адекватную картину размещения 8 клеток на препарате. При большем приближении зонда и использовании фильтра «карта латеральных сил» возможна оценка цитоскелета эритроцита, в 3D изображении – оценка особенностей мембраны клетки. При проведении сканирования изучаемых клеток также необходимо учитывать особенности сканирования. Это в дальнейшем позволит получать более достоверные данные при подсчетах и оценках параметров клеток. В результате проведенного нами исследования разработан наиболее адекватный способ приготовления клеток крови эритроцитов и лейкоцитов для дальнейшего исследования структурно- функциональных и вязко-упругих свойств поверхностной мембраны клеток крови в норме и при патологии. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Атлас клеток крови и костного мозга. (Под редакцией профессора Г.И.Козинца). М.: Триада-Х, 1998. 160с. 2. Интернет-сайт компании "НТ-МДТ": http://www.ntmdt.ru/ 3. Интернет-сайт учебно-научного центра "Бионаноскопия": http://www.nanoscopy.org/Саватеев, M.Н., Н.В., Kозловская, Mойсенович, AIP Conference. – М.: M.M. et al, 2003. – 428 с. 4. Российское общество сканирующей зондовой микроскопии и нанотехнологий: http://www.nanoworld.org 5. Пермяков Н. К., Ананян М. А., Сороковой В. И., Лускинович Н. Н. Сканирующая зондовая микроскопия и медико-биологическая нанотехнология: история и перспективы // Передовые статьи. - 1998. № 5. – С. 9-13. 6. Плескова Использование С. метода Н., Звонкова сканирующей 9 М. Б., зондовой Гущина Ю. Ю. микроскопии для исследования морфологических параметров нейтрофильных гранулоцитов // Морфология. – 2005. – Т. 122. - № 1. – С. 60-62. 7. Подосинников И.В., Нилова Лабораторное дело. - 1981.- №8. - С. 68 . 10 Л.Г., Бабиченко И.В. //
