Б.Б. Костишко (студент), А.Ф. Садритдинова (студент), А.В. Снежкина (студент)

реклама
Б.Б. Костишко (студент), А.Ф. Садритдинова (студент),
А.В. Снежкина (студент)
ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ
АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
г. Ульяновск, Центр нанотехнологий и материалов (ЦНТИМ),
Ульяновский Государственный Университет
ВВЕДЕНИЕ
За
последние
превратилась
10
из
ограниченному
лет
экзотической
числу
распространенный
сканирующая
и
зондовая
методики,
исследовательских
успешно
микроскопия
доступной
групп,
применяемый
в
лишь
широко
инструмент
для
исследования свойств поверхности [21].
Атомно-силовой микроскоп (АСМ) производит сканирование
поверхности
нанометровом
на
основе
расстоянии
принципа
от
поддержания
объекта
алмазной
на
постоянном
иглы,
которая
притягивается к поверхности за счет межмолекулярных сил. АСМ
позволяет исследовать биологические объекты и измерять параметры
клеток.
В
ближайшее
распространенным
в
время
этот
биологических
метод
будет
исследованиях.
наиболее
Привлекает
возможность исследования объектов не только на нанометровом
расстоянии, но и возможность прижизненного исследования клеток [5].
Данная работа посвящена исследованию клеток крови
лейкоцитов и эритроцитов
–
методом атомно-силовой микроскопии.
1
Несмотря на огромное разнообразие методов диагностики клеток
крови,
атомно-силовая
современный
микроскопия
инструмент
для
представляет
проведения
собой
исследований.
самый
АСМ
позволяет измерять не только профиль поверхности, но и локальные
силы трения, величину адгезии, упругие и вязкие свойства поверхности
с субнанометровым пространственным разрешением. Приготовление
препаратов для исследований с помощью атомно-силовой микроскопии
позволяет избежать жесткой фиксации образцов и методов обработки
солями тяжелых металлов, которые традиционно применяются в
световой и электронной микроскопии. Подобные процедуры зачастую
не соответствуют природным условиям, в которых макромолекулы
проявляют свою биологическую активность. Высокое разрешение
порядка нескольких нанометров, относительно небольшое время –
минуты,
которое
требуется
для
сканирования,
отсутствие
необходимости вводить метки и фиксировать образец делают АСМ
одним из удобных инструментов исследований в биологии.
Задачей настоящего исследования явилось выявление наиболее
адекватного способа приготовления клеток крови человека для АСМанализа
структурно-функциональных
и
вязко-упругих
свойств
поверхностной мембраны эритроцитов и лейкоцитов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Периферическую кровь из локтевой вены (v. mediana cubiti) 1:1
разбавляли раствором Хенкса. В специальные центрифужные пробирки
пипеткой наслаивали градиентный раствор фиколл-верографина, затем
осторожно наслаивали кровь. После 45 минут центрифугирования, в
пробирке образуется четыре фракции: первая (нижняя) – осадок
эритроцитов и мертвых клеток, вторая – раствор фиколл-верографина,
третья – кольцо лейкоцитов, четвертая – плазма крови. Кольцо,
содержащее лейкоциты, осторожно снимали, переносили в чистую
2
пробирку, отмывали в растворе Хенкса.
Суспензию
лейкоцитов
пипетировали и раскапывали (размер капли 20 мкл) на чистые
обезжиренные предметные стекла (размер стекол 1х2,5 см) и проводили
адгезию при температуре 37 градусов в течение 60 минут. Суспензию
эритроцитов наносили на стекло методом мазка и высушивали на
воздухе [7].
В качестве фиксаторов использовали следующие вещества: пары
формалина (45 минут), метанол (1-10 минут), 2,5% глютаровый
альдегид (1-10 минут).
Препараты окрашивали по Романовскому-Гимза для оценки
локализации клеток на препарате.
Для
исследования
сканирующий
зондовый
поверхности
микроскоп
Solver
клеток
Smena
использовали
A (ЦНТИМ).
Сканирование поверхности фиксированных препаратов проводили в
полуконтактном режиме на воздухе. Использовались неконтактные
кремниевые зонды серии NSG10 (NT-MDT)
с жесткостью 5,5 Н/м,
резонансной частотой приблизительно 150 кГц, радиусом закругления
10 нм, высота зонда 10-20 мкм. Было проведено сканирование в
воздушной фазе более чем 30 образцов. Обработку полученных
изображений
проводили
с
помощью
программного
обеспечения
Nova [2,3].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного исследования фиксации клеток крови
эритроцитов и лейкоцитов такими фиксаторами, как метанол, 2,5%
глютаровый альдегид было получено:
На препаратах лейкоцитов без адгезии, высушенных на воздухе
клетки оказываются вздутыми, что свидетельствует о нарушении
целостности плазматической мембраны. Данный факт не позволяет
определять морфологию и измерять параметры мембраны, возможен
3
лишь подсчёт плотности и количества клеток на препарате (рис. 1). При
фиксации лейкоцитов метиловым спиртом необходимо соблюдать
определённое время фиксации. При фиксации в течение 10 мин –
клетки разрушаются, происходит плазмолиз. При фиксации в течение 15 мин - морфология клетки сохраняется. При фиксации лейкоцитов
2,5% глютаровым альдегидом в течение 10 мин – клетки разрушаются,
в течение 1-5 мин при соблюдении адгезии и предварительной
фиксации в парах формалина клетки сохраняют воду и их АСМизображение идентично изображению нативного лимфоцита, в котором
четко определены границы клетки. Таким образом, последний способ
фиксации
лейкоцитов
является
наиболее
оптимальным
и
дает
возможность определения морфологических параметров (рис. 2) [1].
Рис.1. Лейкоциты, высушенные на воздухе. На мембране
лейкоцитов возникают вздутия, происходит искажения клеточной
поверхности.
4
Рис.2 Изображение лейкоцита, фиксированного 2,5% глютаровым
альдегидом (1-5 мин), при соблюдении адгезии и предварительной
фиксации в парах формалина. Проводилось измерение линейных
параметров лимфоцита. Справа – силовая кривая, вершина графика
соответствует максимальной высоте клетки (высота ядра, т.к. клетка
распластана). По силовой кривой можно рассчитать вязко-упругие
свойства мембраны изучаемой клетки.
Препараты
эритроцитов,
высушенных
на
воздухе,
дают
адекватную картину распределения клеток в мазке. Скан эритроцитов
соответствует их нативному изображению. Такие клетки наиболее
удобны для изучения морфологии и параметров мембраны (рис. 3).
Эритроциты, фиксированные метанолом в течение 1-10 мин,
имеют искаженную форму. Они слипаются, образуя «столбики». При
данном
методе
фиксации
возможен
лишь
подсчет
количества
эритроцитов и определение плотности клеток на препарате (рис. 4) [1].
5
Рис.3 Эритроциты, высушенные на воздухе. Искажение формы
клетки не происходит.
Рис.4 Эритроциты при фиксации метанолом. Форма клеток
искажена.
В ходе данного исследования были выявлены также артефакты
сканирования,
которые
необходимо
учитывать
при
изучении
экспериментального материала. Все наблюдаемые артефакты можно
разделить на две основные группы:
1.
Особенности, связанные с приготовлением биологического
материала:
А)
нарушение
целостности
мембраны
(изменение
pH,
несоблюдение времени фиксации клеток, нарушение температурного
режима, механики опыта и др.);
6
Б) обезвоживание клеток – выход воды из клетки, эритроциты
имеют вид теней (высокая концентрация фиксирующего раствора,
несоблюдение времени фиксации) (рис. 5);
Рис.5 Обезвоженные клетки. На АСМ-скане видны «тени» клеток
вследствие выхода из них воды.
В) неправильная форма клеток в отсутствии у них адгезии;
2. Особенности, связанные с взаимодействием зонда и мембраны
клетки:
А) возбуждение
зонда на поверхности клеток при резких
перепадах высот;
Б) разрыхление мембраны и появление на ней
участков,
взаимодействующих с зондом (к которым зонд липнет) (рис. 6).
Рис.6 Взаимодействие зонда с мембраной эритроцита,
приводящее к разрыхлению мембраны.
7
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Нами проведена оценка морфологических особенностей клеток
крови человека с помощью метода атомно-силовой микроскопии.
При проведении исследований биологических объектов – клеток,
методами АСМ возникает ряд проблем, связанных с процедурой
приготовления препаратов. Поэтому, прежде чем проводить измерения
исследуемых клеток крови необходимо стандартизировать методику
получения и приготовления лейкоцитов и эритроцитов.
Для получения устойчивых изображений необходимо правильно
иммобилизировать
клетки
[5].
При
исследовании,
например,
лейкоцитов возникают сложности с их относительно большими
вертикальными размерами. В связи с этим, при подготовке препарата
важным методическим аспектом является правильный выбор времени
инкубации клеток. Чем продолжительнее срок инкубации, тем более
распластанными на подложке оказываются клетки и тем удобнее их
исследовать. Кроме этого важно правильно выбрать фиксатор и время
фиксации клеток, так как лейкоциты неустойчивы, поэтому при
передержке в
фиксаторе, при высокой его концентрации мембрана
клетки и сами лейкоциты разрушаются [6]. Таким образом наиболее
оптимальным вариантом подготовки лейкоцитов для изучения на АСМ
является:
выделение
верографина,
адгезия
фракций
лейкоцитов
лейкоцитов
на
с
помощью
стеклянной
фиколл-
подложке
при
температуре 37 градусов в течение 60 мин, фиксации в 2,5%
глютаровом альдегиде в течение 1-4 мин, при предварительной
фиксации в парах формалина в течение 45 мин.
При изучении эритроцитов наилучшим способом оказалось
приготовление препарата методом мазка, при высушивании его на
воздухе. Такой способ дает более адекватную картину размещения
8
клеток
на
препарате.
При
большем
приближении
зонда
и
использовании фильтра «карта латеральных сил» возможна оценка
цитоскелета эритроцита, в 3D изображении – оценка особенностей
мембраны клетки.
При
проведении
сканирования
изучаемых
клеток
также
необходимо учитывать особенности сканирования. Это в дальнейшем
позволит получать более достоверные данные при подсчетах и оценках
параметров клеток.
В
результате
проведенного
нами
исследования
разработан
наиболее адекватный способ приготовления клеток крови эритроцитов
и
лейкоцитов
для
дальнейшего
исследования
структурно-
функциональных и вязко-упругих свойств поверхностной мембраны
клеток крови в норме и при патологии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Атлас клеток крови и костного мозга. (Под редакцией
профессора Г.И.Козинца). М.: Триада-Х, 1998. 160с.
2.
Интернет-сайт компании "НТ-МДТ": http://www.ntmdt.ru/
3.
Интернет-сайт учебно-научного центра "Бионаноскопия":
http://www.nanoscopy.org/Саватеев,
M.Н.,
Н.В.,
Kозловская,
Mойсенович, AIP Conference. – М.: M.M. et al, 2003. – 428 с.
4.
Российское общество сканирующей зондовой микроскопии
и нанотехнологий: http://www.nanoworld.org
5.
Пермяков Н. К., Ананян М. А., Сороковой В. И., Лускинович
Н. Н. Сканирующая зондовая микроскопия и медико-биологическая
нанотехнология: история и перспективы // Передовые статьи. - 1998. № 5. – С. 9-13.
6.
Плескова
Использование
С.
метода
Н.,
Звонкова
сканирующей
9
М.
Б.,
зондовой
Гущина
Ю.
Ю.
микроскопии
для
исследования
морфологических
параметров
нейтрофильных
гранулоцитов // Морфология. – 2005. – Т. 122. - № 1. – С. 60-62.
7.
Подосинников
И.В.,
Нилова
Лабораторное дело. - 1981.- №8. - С. 68 .
10
Л.Г.,
Бабиченко
И.В.
//
Скачать