методы исследования в вирусологии - Кабардино
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Х.М.БЕРБЕКОВА ____________________________________________________________________ МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ, ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201.65 – Биология Нальчик - 2010 1 УДК 576.858(075.8) ББК 52.63я73 Б-69 Рецензент: кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры микробиологии, гигиены и санитарии Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии М.Х. Пежева Составитель: Блиева Лариса Заурбековна Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов: Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология». - Нальчик: Каб.-Балк. ун-т, 2010.- 48 с. В методических рекомендациях представлены современные методы исследования вирусов. Описываются особенности работы с вирусами, методы их культивирования, индикации и идентификации. Издание рассчитано на самостоятельную работу при подготовке к лабораторным занятиям студентов, обучающихся на 3 курсе по специальности «Биология». Рекомендовано РИС университета УДК 576.858(075.8) ББК 52.63я73 Б-69 Кабардино-Балкарский государственный университет, 2010 2 ВВЕДЕНИЕ В методических рекомендациях по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» предлагаются методики самостоятельного изучения студентами основ культивирования, индикации и идентификации вирусов. Согласно учебному плану по специальности 020201.65 студентам 3 курса Биологического факультета в течение одного семестра преподаётся дисциплина «Микробиология, вирусология». Вирусология – медико-биологическая наука, изучающая вирусы: их строение, биохимию, систематику, генетику, а также значение в жизни человека. В результате изучения вирусологии студенты должны знать особенности вирусов, овладеть практическими навыками и умениями в заборе материала для вирусологических исследований, проведении лабораторных методов диагностики заболеваний и в оценке их результатов. При изучении вирусологии используются знания, полученные студентами при прохождении общей биологии, гистологии, биохимии, генетики, физиологии. Общий объём дисциплины «Микробиология, вирусология» составляет 210 часов, из которых 68 часов аудиторных и 142 часа на самостоятельную работу. Согласно учебно-тематическому плану на освоение вирусологии отводится 38 часов, из которых 10 часов аудиторных и 28 часов на самостоятельную работу. Существующие учебники и практические руководства не отражают всех вопросов, затрагиваемых в этом курсе. Настоящие методические рекомендации разработаны по темам соответствующим лабораторным занятиям и содержат методы не представленные в лабораторном практикуме. Основное внимание уделено современным методам применяемым в вирусологии, вместе с тем студенты знакомятся с фундаментальными принципами и нюансами вирусологических методов исследования. 3 В данное издание включены разделы: 1 – культивирование вирусов; 2 – индикация и идентификация материала для вирусов. Собраны: вирусологических вируссодержащего материала, описание подготовки исследований, выделение и методы обработки культивирование вирусов различными способами, методы индикации и идентификации вирусов и молекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусных инфекций. тематика К каждому разделу даётся перечень контрольных вопросов, докладов о результатах самостоятельной работы и список рекомендуемой литературы. Раздел 1. Культивирование вирусов 1.1. Подготовка материала для вирусологических исследований 1.1.1. Правила работы в вирусологической лаборатории В вирусологической лаборатории проводят работу по выделению штаммов вирусов, их идентификации и культивированию, выполняются различные научные исследования. При работе с вирусами необходимо прежде всего: 1. Не допустить загрязнения штаммов вирусов посторонней микрофлорой; 2. Обеспечить безопасность работающего персонала от возможного заражения вирусами; 3. Обеспечить безопасность окружающего населения от заражения вирусными инфекциями через сточные воды, трупы экспериментальных животных и т.п. Методы значительной исследования, сложностью, применяемые что связано в вирусологии прежде всего с отличаются абсолютным внутриклеточным паразитизмом вирусов и их малыми размерами. 4 При исследовании материалов, полученных от больных вирусными инфекциями, с целью лабораторной диагностики этих заболеваний применяются различные методы: Методы электронной и в меньшей степени световой микроскопии; Методы выделения и культивирования вирусов в культурах клеток; Методы выделения и культивирования вирусов в развивающихся куриных эмбрионах и в организме чувствительных экспериментальных животных; Выявление вирусов по их гемагглютинирующей способности; Различные серологические методы исследования: традиционные и экспресс-методы; Молекулярно-генетические методы исследования – молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция. 1.1.2. Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях При взятии инфекционного материала от людей и животных необходимо учитывать тропизм вирусов к определённым тканям и органам, пути выделения вируса во внешнюю среду и особенности патогенеза той или иной вирусной инфекции. Различают пневмотропные, энтеротропные, гепатотропные, лимфотропные, нейротропные и дермотропные вирусы. В зависимости от тропизма исследованию подвергают различные материалы. Например, исследуют слизь из зева, мокроту и т.п., если виру пневмотропный; испражнения – при энтеротропных вирусах; жидкость из визикул или пустул, корочки – если вирус обладает дермотропностью и т.д. 1.1.3. Обработка вируссодержащего материала Инфекционные материалы, взятые с учётом тропизма вирусов и с соблюдением асептики, помещают в стерильную посуду, тщательно закупоривают её и направляют в лабораторию, поместив в термос со льдом. 5 Материал рекомендуется исследовать в кратчайший срок, так как вирусы быстро инактивируются. Сохранению вируса способствует помещение исследуемого материала (в 50%-ном растворе глицерина) в холодильник при температуре не выше 5оС. Но самый надёжный способ – это хранение в замороженном состоянии при температуре -45оС и ниже; в таких условиях вирус может оставаться жизнеспособным длительное время. Обработка плотного материала, содержащего вирусы, начинается с растирания его в ступке или измельчения в специальных аппаратах – гомогенизаторах. Затем готовится 10%-ная взвесь в солевом растворе, которую центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 15-30 минут для осаждения крупных частиц. Вирусы остаются в надосадочной жидкости, которую и подвергают дальнейшему исследованию. Жидкий вируссодержащий материал непосредственно центрифугируют и также получают надосадочную жидкость. Если есть сомнения в бактериологической стерильности исследуемой вируссодержащей надосадочной жидкости, к ней добавляют антибиотики, чтобы уничтожить посторонние микроорганизмы. Антибиотики не влияют на вирусы, и они сохраняют свою жизнеспособность. 1.1.4. Микроскопические методы исследования в вирусологии - Электронная микроскопия Электронноскопические препараты готовят из очищенных и концентрированных вируссодержащих взвесей или ультратонких срезов тканей, заражённых вирусами. Вирусные объекты наносят на специальные плёнки-подложки, помещённые на опорные сеточки. Плёнки-подложки должны быть очень тонкими (не более 30 нм толщины), прозрачными и достаточно прочными, например, коллоидийно-угольные. Плёнки наносят на поддерживающие сеточки из меди (диаметром 2-3 мм) с многочисленными отверстиями. Далее препараты обрабатывают различными способами. 6 Методы напыления металлами применяют для получения контрастных препаратов. Пары тяжёлых металлов (золота, платины, урана и др.), образующиеся в специальном приборе в условиях вакуума и высокой температуры, направляют под острым углом на вируссодержащий препарат. Вирусы оказываются покрытыми тонким слоем металла. Метод негативного контрастирования основан на том, что при обработке препарата некоторыми солями тяжёлых металлов, например, 12%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, создаётся более плотный слой, не пропускающий электроны, а котором хорошо видны более электроннопрозрачные исследуемые объекты. Метод ультратонких срезов в сочетании с негативным контрастированием является наилучшим для изучения тонкого строения вирионов и изучения этапов взаимодействия вирусов с клеткой, но в то же время он наиболее сложен. Исследуемые кусочки инфицированной ткани или другого вируссодержащего материала фиксируют в специальном фиксаторе (например, осмиевом). Обезвоживают путём последовательного помещения в спирты возрастающей крепости. Заливают образцы специальной пластмассой, после полимеризации которой образуются твёрдые прозрачные блоки. Из блоков готовят ультратонкие срезы толщиной 10-20 нм на специальном микротоме, Полученные срезы контрастируют, помещая в раствор фосфорновольфрамовой кислоты. Приготовленные вышеописанными способами препараты изучают в просвечивающем электронном микроскопе, разрешающая способность которого достигает 0,2-0,3 нм. Изображение препарата наблюдают на флюаресцирующем экране электронного микроскопа и фотографируют специальные фотопластинки, с которых получают отпечатки. Получаемые увеличения: ×100000-×400000. 7 Сканирующая электронная микроскопия осуществляется с помощью сканирующего электронного микроскопа, в котором тонкий пучок электронов быстро перемещается по исследуемому объекту, то есть сканирует его поверхность. В результате возникает излучение вторичных электронов, которое, проходя через катодно-лучевую трубку, преобразуется в объёмное изображение объекта на флюоресцирующем экране. Сканирующая микроскопия позволяет получать трёхмерное изображение вирионов (предварительно препарат напыляют металлами), различать детали строения их поверхности, но не выявляет их внутреннюю структуру. Разрешающая способность сканирующего микроскопа равна 7-20 нм. - Световая микроскопия В световом микроскопе можно увидеть крупные вирусы, размеры которых находятся в пределах разрешающей способности микроскопа не менее 0,2 мкм. А также внутриклеточные включения в поражённых вирусом тканях. Крупные вирусы, например, поксвирусы, и включения обнаруживают с помощью специальных методов окраски, в фазовом контрасте, в тёмном поле зрения; применяют и люминесцентную микроскопию. Крупные вирусы выявляют путём окраски по Морозову (серебрением). Для выявления внутриклеточных включений приготавливают гистологические срезы из поражённых тканей, препараты-мазки или отпечатки. Обычно препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе, иногда другими методами. Наибольшее практическое значение имеет обнаружение включений Бабеша-Негри в нервных клетках головного мозга при бешенстве. Для этого препараты окрашивают по Манну. Люминесцентная микроскопия. Препараты, приготовленные из материалов, содержащих крупные вирусы, внутриклеточные включения, 8 скопления вирусных антигенов, окрашивают растворами флюорохромных красителей. При люминесцентной микроскопии в УФсвете окрашенные акридин-оранжевым скопления РНК-геномных вирусов и образуемые ими включения видны как светящиеся красные гранулы на фоне бледно-зелёной цитоплазмы клеток; ДНК-геномные вирусы дают изумрудно-зелёное свечение. Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении вирусов, внутриклеточных включений, специфическими скоплений противовирусными флюорохромными красителями. вирусных антигенов антителами, Образовавшиеся со меченными комплексы дают свечение при люминесцентной микроскопии. 1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы их получения Культура клеток – клетки какой-либо ткани животных или человека, способные расти и размножаться в искусственных условиях. Культуры клеток широко применяются при диагностике вирусных инфекций, в производстве вакцин, незаменимы при проведении научных исследований в области вирусологии. Для успешного получения клеточных культур и последующего размножения в них вирусов культивируемые клетки должны постоянно находиться в сбалансированной физиологической среде, содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения. Питательные потребности клеток обеспечиваются наличием незаменимых аминокислот (таких, как глутамат, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, аргинин, гистидин, метионин, треонин, цистин, тирозин), витаминов (особенно комплекса В), глюкозы и сыворотки крови. Изотоничность и буферность среды поддерживается с помощью неорганических солей. Оптимальным является рН 7,2-7,4, при длительном культивировании клеток значение рН должно оставаться в пределах 6,8-7,8. 9 Постоянство рН в течение нескольких дней обеспечивается присутствием карбонатного и фосфатного буферов. Стабилизации значения рН способствует выращивание культур в пробирках и флаконах, закрытых резиновыми пробками, вследствие чего не улетучивается СО2 (в противном случае это привело бы к сдвигу рН в щелочную сторону). Контроль за реакцией среды осуществляется путём добавления индикатора фенолрот: при рН 6,8-7,2 среда имеет жёлтый цвет, при рН 7,2-7,4 – оранжеворозовый, при рН 7,4-7,6 – красный, при рН 7,7-7,8 – красно-фиолетовый. Во время приготовления клеточных культур к солевым растворам и питательным средам нередко добавляют антибиотики, чтобы избежать бактериального и грибкового загрязнения. Применяют пенициллин и стрептомицин (по 60 000 ЕД/мл), тетрациклины, доксициклин, другие антибиотики широкого спектра действия в концентрации 0,1-0,01 мг/л; противогрибковые антибиотики – нистатин (20 ЕД/мл) и фунгизон. Для приготовления питательной среды требуется вода высокой степени очистки, так как культура клеток очень чувствительна к ионам тяжёлых металлов. Рекомендуется применять бидистиллированную воду, перегнанную в стеклянных аппаратах или очищенную в ионообменных колонках. Работу с культурами клеток проводят в тщательно обработанной «вирусологической» посуде из специальных сортов стекла или пластиковой посуде из полистерола для одноразового использования. Рис. 1. Лабораторная посуда для выращивания культур клеток 10 Приготовленную культуру клеток инкубируют в термостате при температуре 36,0-38,50С. 1.2.1. Питательные среды Питательные среды для клеточных культур в большинстве случаев готовят на основе солевых растворов, которые имеют состав солей, качественно и количественно приближающийся к составу жидкостей животного организма. Таблица 1 Состав основных солевых растворов (в г на л) Вещества Раствор Хенкса Раствор Эрла NaCl 8,0 6,8 KCl 0,4 0,4 CaCl2 0,14 0,2 MgSO4×7H2O 0,1 0,1 MgSO4×6H2O 0,1 - NaH2PO4×H2O - 0,125 NaH2PO4×2H2O 0,06 - KH2PO4 0,06 - Глюкоза 1,0 1,0 Фенолрот (не всегда) 0,02 0,05 NaHCO3 0,35 2,2 Различают: 1. Естественные питательные среды (применяются редко). Естественные питательные среды готовят на основе солевых растворов Хенкса и Эрла, к которым добавляют сыворотку, амниотическую жидкость, эмбриональный экстракт. Эти биологические жидкости являются источниками белкового питания, витаминов и других веществ, способствующих росту и размножению клеток. Например, среда для культивирования клеток HeLa: сыворотка человека – 50%, куриный эмбриональный экстракт – 2%, раствор Хенкса – 48%. 11 2. Ферментативные гидролизаты белковых веществ. В среды добавляют ферментативные гидролизаты: лактальбумина, казеина, белков крови крупного рогатого скота. 3. Синтетические питательные среды, которые отличаются сложным составом: Среда 199 (Паркера) содержит 20 аминокислот,17 витаминов, пурины и пиримидины, глюкозу, 9 минеральных солей и ряд других веществ. Эту среду готовят на солевом растворе Хенкса, стерилизуют фильтрованием через бактериальные фильтры. Среда Игла содержит 13 аминокислот, 4 катиона, 3 аниона, 6 витаминов, холин, инозит и углеводы. 1.2.2. Типы клеточных культур Для приготовления культур клеток используют различные ткани животных, человека и птиц как эмбриональные, так и зрелые. Кроме нормальных используют и злокачественные перерождённые ткани, получаемые из опухолей. Источником эмбриональной ткани часто служит куриный зародыш, а также эмбрионы человека, мышей, свиней, кроликов и др. Эмбриональная и опухолевая ткани отличаются лучшей выживаемостью и более активным ростом, чем ткани взрослого организма. Из зрелых тканей чаще всего употребляется почечная ткань (обезьян, морских свинок, хомячков и др.), амниотическая оболочка человека. Ткани берут в асептических условиях, промывают в солевом растворе Хенкса и затем подвергают измельчению. В вирусологии используют только культуры растущих тканей, которые подразделяют на: 1. Культуры фиксированных кусочков тканей. 2. Однослойные культуры клеток: а) первичные культуры клеток; б) перевиваемые (стабильные) культуры клеток; в) культуры диплоидных клеток. 12 3. Культуры суспензированных клеток. В практической вирусологии чаще используют однослойные культуры, клетки которых растут и размножаются будучи прикреплёнными к твёрдому субстрату (стеклу, пластику), образуя слой толщиной в одну клетку (монослой). Метод обработки однослойных культур клеток основан на обработке исходной ткани ферментами (обычно трипсином), разрушающими межклеточные связи; ткань диспергируется, и образуется взвесь изолированных клеток. При культивировании клетки прикрепляются к стеклу сосуда и растут в виде сплошного монослоя, благодаря чему удобно воздействовать на клетки, заражая их вирусами, и визуально наблюдать возникающие изменения в динамике. а) Первичные культуры клеток способны размножаться только в первой генерации Методика получения первичных культур фибробластов куриного эмбриона 1. Яйца, инкубированные 7-11 дней, овоскопируют. Убедившись в жизнеспособности эмбриона, очерчивают границу воздушного мешка. 2. Скорлупу на тупом конце яйца протирают спиртом, йодом, снова спиртом, а затем срезают на уровне воздушного мешка. 3. Извлекают эмбрион и помещают его в стерильную чашку, удаляют голову. Тело эмбриона омывают 3-5 мл раствора Хенкса, который затем отсасывают. 4. Тело эмбриона тщательно измельчают ножницами, полученные кусочки (размером около 1 мм3) пипеткой переносят в пробирку. 5. Проводят 2-3-кратное отмывание измельчённой ткани от крови. Каждый раз наливают в пробирку с тканью по 2-3 мл раствора, дают ткани осесть, после чего жидкость отсасывают. 6. К отмытой ткани добавляют 3 мл 0,25% раствора трипсина и тщательно перемешивают содержимое пробирки с помощью «пипетирования» (многократного насасывания и выдувания жидкости пипеткой) или 13 энергичного встряхивания. Под действием трипсина клетки ткани разъединяются и образуют суспензию, поэтому после оседания более крупных тканевых частиц на дно пробирки жидкость над осадком должна остаться мутной. 7. Верхний помутневший слой жидкости, содержащий взвесь изолированных клеток, переносят в центрифужную пробирку, куда заранее наливается 2,5 мл питательной среды гидролизата лактальбумина. Проводят центрифугирование при 1 000 об/мин в течение 10-15 минут. 8. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку клеток добавляют 2-3 мл гидролизата лактальбумина и тщательно перемешивают, чтобы клетки вновь оказались во взвешенном состоянии. Для отделения конгломератов клеток, которые могут попасть во взвесь, рекомендуется последующее фильтрование через сетку из нержавеющей стали или марлю. 9. Производится подсчёт клеток в камере Горяева под малым увеличением микроскопа. Определив концентрацию клеток во взвеси, её разводят гидролизатом лактальбумина до 400 000 клеток в 1 мл. 10. Взвесь разливают в пробирки по 1 мл, закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат при 370С в наклонном положении под углом 50. Через 3-4 суток от начала культивирования, просматривая пробирки при малом увеличении микроскопа, можно видеть вытянутые, отростчатые клетки – фибробласты, которые растут на стенке пробирки, образу монослой. б) Перевиваемые культуры клеток (линии клеток) Это стабильные культуры клеток, которые способны бесконечно долго размножаться вне организма, если их культивировать в соответствующих условиях. Например, перевиваемые культуры из амниона человека (FL, А-8), почки обезьян (VERO - от зелёной мартышки, LLCMK 2 – от макаки-резус), 14 эмбриона мыши (ЗТЗ), из опухолевых клеток человека (HeLa - из рака шейки матки, Нер–2 – из рака гортани) и многие другие. Перевиваемые культуры клеток обладают целым рядом преимуществ по сравнению большим первичными. Работа с ними менее трудоёмка, они отличаются диапазоном чувствительности ко многим вирусам. Однако перевиваемые культуры не пригодны для производства вирусных вакцин, так как существуют опасения по поводу их возможной злокачественности. Перевиваемые культуры клеток без пересева на свежую среду довольно быстро дегенерируют. Поэтому исходную культуру клеток выращивают в матрацах с питательной средой, еженедельно пересевая культуру в новые сосуды. При работе с пробирочными культурами также рекомендуется пересевать их через 7-8 дней, или же раз в 3-4 дня заменять питательную среду свежей, тогда клеточные культуры сохраняют свою жизнеспособность 2-3 недели. Для культивирования перевиваемых культур клеток применяют среду 199 (часто с добавлением 10% бычьей сыворотки), среду Игла с добавлением 20% сыворотки, 0,5% гидролизат лактальбумина, содержащий 5% телячьй сыворотки. в) Культуры диплоидных клеток Их называют полуперевиваемыми культурами, так как ини обладают способностью к пересевам в течение длительного времени – выдерживают до 40-50 пассажей, проводимых на протяжении 8-10 месяцев. Затем культура клеток дегенерирует и гибнет. Диплоидными их называют , потому что они стойко сохраняют диплоидный кариотип, присущий исходным нормальным клеткам организма – родоначальницам диплоидной линии. Культуры диплоидных клеток получают из различных тканей эмбриона человека, из первичных культур. Так, например, пользуется известностью штамм ДКЛЧ (диплоидные клетки лёгких человека), штаммы WJT-38, JMR-90, MRC-5 из лёгких ткани эмбриона человека. 15 Диплоидные культуры применяют для выделения и культивирования вирусов. Они чувствительны ко многим штаммам вирусов, онкогенно безопасны, пригодны для культивирования в промышленных масштабах и получения массового количества вирусных вакцин. Рис. 2. Культуры клеток Культуры суспензированных клеток Суспензированная культура – это культура, в которой отдельные клетки или их конгломераты постоянно находятся во взвешенном состоянии в жидкой среде. Культуры клеток в суспензии удаётся получить, если проводить их культивирование при постоянном интенсивном перемешивании среды путём вращения пробирок в барабане, с помощью магнитной мешалки и т.п. В последнее время используют специальные аппараты – хемостаты, в которых обеспечивается автоматическое обновление среды. Суспензированные клетки обладают большей активностью роста, накапливаются в большом количестве, при регулярной замене среды длительное время остаются жизнеспособными. 1.3. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах Многие вирусы, поражающие человека и животных, могут в большей или меньшей степени размножаться в курином эмбрионе. Наличие плотной скорлупы защищает эмбрион от попадания микроорганизмов из внешней среды. Метод культивирования вирусов в куриных эмбрионах используют при лабораторной диагностике вирусных инфекций, а также для изготовления вирусных вакцин и диагностических препаратов. Но этот метод имеет 16 недостатки: 1) невозможно наблюдать в динамике за патологическими изменениями, происходящими в эмбрионе после заражения его вирусом; 2) при вскрытии эмбриона, зараженного вирусом, часто не обнаруживается видимых изменений и приходится выявлять наличие вируса в тканях, в жидкостях эмбриона, пользуясь другими вирусологическими методами (например, реакцией гемагглютинации); 3) метод культивирования в куриных эмбрионах пригоден не для всех вирусов. Несмотря на имеющиеся недостатки метод сравнительно прост, удобен и дешев и широко используется в вирусологических исследованиях. Наибольшее значение он имеет при работе с ортомиксовирусами, герпесвирусами, поксвирусами. 1.3.1. Строение куриного эмбриона Куриный эмбрион покрыт известковой оболочкой – скорлупой, к которой изнутри примыкает скорлупная оболочка. В тупом конце яйца она раздваивается и заключает в себе воздушное пространство. Под скорлупной оболочкой находится хорионаллантоисная оболочка, в тупом конце яйца она проходит по внутренней стороне скорлупной оболочки, замыкающей воздушное пространство, эта оболочка богата кровеносными сосудами и служит эмбриону органом дыхания. Изнутри к ней прилегает аллантоисная полость, которая является органом выделения и защищает зародыш от высыхания и травм. Аллантоисная полость окружает зародыш, находящийся в полости амниона, которая наполнена околоплодной жидкостью. Через желточный канатик зародыш соединён с желточным мешком – основным источником питательных веществ. Для успешного культивирования вирусов в организме развивающихся куриных эмбрионов требуется определённый температурный режим (360-380), влажность (50-70%), а также достаточная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы определённого возраста, инкубированные от 6 до 13 дней в зависимости от вида вирусов и метода заражения. Необходимо подготовить: подставку для яйца, пузырьки со спиртом и йодом, пробирку со стерильным 17 парафином, покровные стёкла, пакетики стерильной ваты и марли, завёрнутую в бумагу стерильную посуду, стерильные шприцы, иглы, пинцеты, препаровальные иглы. Инструменты помещают в стаканчик со спиртом, где они находятся в течение всей работы, перед каждой манипуляцией их дополнительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки. Руки перед работой тщательно моют, рекомендуется надеть маску из марли. Для работы отбирают жизнеспособные эмбрионы, просвечивая инкубированные яйца в овоскопе. Жизнеспособный эмбрион подвижен, кровеносные сосуды оболочки заполнены кровью. Отобранные яйца тщательно дезинфицируют на тупом конце (или на боковой стороне яйца): скорлупу протирают спиртом, смазывают йодом, повторно обрабатывают спиртом и обжигают. 1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку Для заражения используют куриные эмбрионы 10-12-дневного возраста. Основные этапы заражения: 1. Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху, проводят стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца. 2. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы. 3. в образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и вырезают окно в скорлупе около 1,5 см в диаметре. 4. Через отверстие осторожно надрывают иглой внутренний листок скорлупной оболочки и отслаивают на небольшом участке (0,5-1 см2). 5. Производят заражение хорионаллантоисной оболочки путём нанесения на неё 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала с помощью пастеровской пипетки или шприца. 18 6. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной плёнкой или стерильным покровным стеклом и прикрепляют расплавленным парафином. Заражённые эмбрионы помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют в течение 2-3 суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам: 1. Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное пространство было наверху, проводится стерилизация места вскрытия. 2. Стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного пространства. 3. Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку по границе. Обнажённую хорионаллантоисную оболочку подрезают вдоль края скорлупы. Через образовавшееся отверстие выливают всё содержимое яйца в чашку или лоток. 4. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь её расправляют и изучают изменения, поместив чашку на тёмный фон. Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, её нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 минут и надосадочная жидкость используется в качестве вируссодержащего материала. Рис. 3. Заражение куриных эмбрионов 19 1.3.3. Заражение в аллантоиную полость Для заражения берут эмбрионы 10-11-дневного возраста. Основные этапы заражения: 1. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством. 2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы. 3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение вируса. Иглу продвигают в вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного мешка и затем вводят 0,1-0,2 мл материала. 4. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью расплавленного стерильного парафина. Заражённые эмбрионы выдерживают в термостате обычно в течение 2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 4 0С. Вскрытие производится в следующем порядке: 1. Яйцо устанавливается на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют. 2. С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше границы воздушного пространства. 3. Осторожно удаляют пинцетом скорлупную оболочку, после чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную жидкость. 4. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на бактериологическую стерильность. 1.3.4. Заражение в полость амниона Для заражения используют эмбрионы 7-12-дневного возраста. Заражение в амниотическую полость проводят открытым или закрытым методом. Техника открытого метода заражения: 20 1. Яйцо помещают на подставку и проводят стерилизацию скорлупы в области тупого конца. 2. Над центром воздушного пространства в скорлупе ножницами вырезают окошко величиной 2 см в поперечнике. 3. Осторожно снимают внутренний листок скорлупной оболочки с помощью пинцета, обнажая подлежащую хорионаллантоисую оболочку. 4. Прорезают ножницами небольшое отверстие в хорионаллантоисной оболочке в том месте, где нет кровеносных сосудов, и вводят в прорез глазной пинцет. Пинцетом захватывают оболочку амниона и вытягивают амниотический мешок над поверхностью хорионаллантоисной оболочки. 5. Удерживая амниотическую оболочку в этом положении, производят заражение в полость амниона, вводя шприцем 0,1-0,2 мл разведения вируса. 6. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, пользуясь для фиксации и герметизации яйца расплавленным парафином. Заражённые эмбрионы инкубируют в течение 2 суток, выбраковывая погибшие в течение первых суток. Затем эмбрионы выдерживают в течение ночи в холодильнике при 40С. Техника вскрытия эмбриона при заражении в амниотическую полость: 1. Простерилизовав место предстоящего вскрытия, срезают скорлупу немного выше края воздушного мешка. 2. Прокалывают хорионаллантоисную оболочку пастеровской пипеткой и удаляют аллантоисную жидкость. 3. Захватив пинцетом амниотический мешок, прокалывают его оболочку иглой шприца или пастеровской пипеткой и насасывают амниотическую жидкость (от 0,5 до 1,5 мл). У заражённого эмбриона жидкость должна быть мутной, между тем как у нормального эмбриона она прозрачна. 4. Взятую жидкость переносят в стерильную пробирку. 0,1-0,3 мл засевают в бульон для контроля на бактериологическую стерильность. 21 1.4. Культивирование вирусов путём заражения лабораторных животных Восприимчивые к изучаемым вирусам животные называются экспериментальной моделью. Взятые в опыт животные должны быть одного вида, определённого возраста и содержаться в одинаковых условиях. Таблица 2 Экспериментальные модели для некоторых вирусов Наименование вируса Экспериментальная модель Вирус бешенства Мыши, кролики Вирус Коксаки Мыши-сосунки Вирус полиомиелита Обезьяны, крысы Вирус гриппа Мыши, хорьки Вирус клещевого энцефалита Мыши Для вирусологической работы чаще всего используют так называемые «чистые линии» экспериментальных животных. Они обладают однотипной наследственностью, имеют минимальное число латентных инфекций, обладают высокой восприимчивостью к вирусам. Особенно чувствительны к вирусам животные-гнотобионты. Работу животными рекомендуется проводить в настольном боксе или в специальной операционной вивария. Все отходы и трупы погибших животных автоклавируют и сжигают. Рис. 4. Лабораторное животное При вирусологических исследованиях применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение лабораторных животных. 22 1.4.1. Интраназальное заражение Метод используют для выделения пневмотропных вирусов. Заражение мышей проводится под эфирным наркозом. Животных помещают в закрытую стеклянную банку, в которую положен кусок ваты, пропитанный эфиром. С помощью шприца или пастеровской пипетки в ноздри животного вводят 0,030,1 мл заражающего материала. За животными устанавливается наблюдение, при проявлении признаков заболевания мышей забивают при помощи эфирного наркоза, а затем вскрывают. Этапы вскрытия животных: 1. Увлажнённый 5%-ным раствором лизола или фенола труп мыши фиксируют брюшком кверху на поверхности кюветы со смесью воска и парафина. 2. Обрабатывают кожные покровы спиртом, йодом и вновь спиртом; опаливают пламенем. 3. Ножницами делают продольный разрез кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы к лапкам, отсепаровывают её. 4. Вскрывают грудную полость, вырезав грудину ножницами по рёберным хрящам. 5. Осматривают внешний вид органов грудной полости, обращая внимание на наличие экссудата. Извлекают лёгкие при строгом соблюдении асептики и сохраняют их при минусовой температуре в морозильнике до получения ответа на бактериологический контроль-результат посева кусочка легочной ткани в мясо-пептонный бульон (после выдерживания его в термостате при 370С в течение суток). 6. При отрицательном контроле на бактериальную загрязнённость готовят 10%-ную суспензию легочной ткани путём растирания ткани в фарфоровой ступке, с постепенным добавлением физиологического раствора. 23 7. Суспензию центрифугируют для осаждения крупных частиц при 1500 об/мин, надосадочную жидкость собирают и используют для последующего вирусологического исследования. 1.4.2. Интрацеребральное заражение Метод предназначен для выделения нейротропных вирусов. При заражении мыши в мозг её плотно прижимают левой рукой к столу, большим и указательным пальцами оттягивают кожу головы к затылку, мизинцем и безымянным фиксируют хвост. Лобный участок головы предварительно обрабатывают 3%-ной йодной настойкой. Заражающий материал (кровь) в объёме 0,02-0,03 мл вводят в мозг туберкулиновым шприцем с тонкой иглой путём прокола лобной кости на глубину 1,5-2 мм. Этапы вскрытия животных: 1. Труп увлажняют раствором лизола или фенола. 2. Обрабатывают кожные покровы головы последовательно спиртом, йодом и вновь спиртом, опаливают пламенем. 3. Вскрывают и отделяют кожу головы. Отрезают голову, помещают её в стерильную чашку Петри, проведя предварительно через пламя горелки. 4. Вскрывают ножницами черепную коробку, извлекают мозг и сохраняют его в замороженном состоянии до получения результата бактериологического контроля. 5. В случае отрицательного бактериологического контроля из мозговой ткани приготавливают 10%-ную суспензию в физиологическом растворе. Освобождают её от крупных тканевых частиц центрифугированием, надосадочную жидкость используют для вирусологической работы. На лабораторных животных проводят титрование вирусов, ставят реакцию нейтрализации; животных используют для получения вирусных вакцин, диагностикумов, противовирусных сывороток. 24 Контрольные вопросы 1. Назовите и охарактеризуйте методы электронной микроскопии, применяемые при изучении вирусов. 2. Применение светового микроскопа для обнаружения вирусов. Примеры. 3. Объясните, что понимают под тканевым (оранным) тропизмом вирусов. 4. Солевые растворы и питательные среды, используемые для культивирования культур клеток. Их состав. Примеры. 5. Назовите и охарактеризуйте основные типы культур клеток. 6. Первичные культуры клеток. Принципы приготовления этих культур. 7. Перевиваемые культуры клеток. Их характеристика. 8. Диплоидные культуры клеток. Их характеристика. 9. Применение культур клеток в вирусологии, их преимущества и недостатки. 10. Строение развивающегося куриного эмбриона (КЭ) и подготовка инкубированных КЭ к заражению. Способы заражения КЭ. 11. Преимущества и недостатки культивирования вирусов в КЭ. 12. Культивирование вирусов в организме восприимчивого животного. Способы заражения. 13. Применение экспериментальных животных в вирусологии, преимущества и недостатки. Тематика докладов 1. Преимущества выращивания вирусов в культуре клеток. 2. Особенности культивирования вирусов гриппа. 3. Основные методики изготовления вакцин против гриппа. 4. Трудности в создании вакцин против вируса иммунодефицита человека. ЛИТЕРАТУРА 1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. 3-е изд. – М.: Медицина, 1982. 2. Букринская А.Г. Вирусология. – М.: Медицина, 1986. 25 3. Голубев Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. – Л., 1986. Электронный учебник. 4. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. – 4-е изд. – М.: Издательский центр «Академия», 2003. Электронный учебник. 5. Общая медицинская вирусология / Н.С. Горячкина и др.; под ред. Н.С. Горячкиной, Л.И. Кафарской. – Ростов н/Д: Феникс, 2007. 6. Общая микробиология: Лабораторный практикум. – Изд. 2-е, перераб., доп. – Нальчик: Каб.-Балк. ун-т, 2005. 7. www.medmaster.net 8. http://dronel.genebee.msu.su/journals/ microb-r.html Раздел 2. Индикация и идентификация вирусов 2.1. Методы индикации и идентификации вирусов в клеточных культурах При заражении вирусами клеточных культур можно получать различные видимые проявления действия вируса: Цитопатическое действие вируса на культуру клеток (ЦПД) – возникновение в ней видимых морфологических дегенеративных изменений (литическая инфекция); Приобретение заражённой культурой клеток способности к гемадсорбции – к адсорбции эритроцитов на поверхности клеточного слоя; Образование в заражённой клеточной культуре под плотным слоем специального агарового покрытия характерных бляшек, являющихся «негативными колониями» вирусов; Подавление процессов метаболизма в заражённой вирусом культуре клеток, выявляемое с помощью так называемой цветной пробы. 26 Окончательная идентификация выделенного вируса проводится с помощью реакции нейтрализации с диагностическими вируснейтрализующими сыворотками. Определяют их родовую и видовую принадлежность. 2.1.1. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток Основной причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки. Прекращается синтез РНК клетки-хозяина, что ведёт к подавлению синтеза белков, приводит к нарушению структуры клеточных мембран, лизосом, митохондрий. Освобождаются и активируются клеточные ферменты (лизосомальные), которые вызывают деструкцию клеточных компонентов, т.е. развитие ЦПД. При резкой дегенерации клеточный монослой гибнет. При острой вирусной инфекции может наблюдаться образование гигантских многоядерных клеток – симпластов (или синцитиев). Симпластообразование вызывают более 20 различных вирусов, имеющих ферменты: лецитиназу, нейраминидазу, и богатых липидами (напр., парамиксовирусы). Рис. 5. Проявление ЦПД в культуре клеток К проявлению ЦПД вирусов относится образование внутриклеточных включений. Они образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. Образование включений может быть единственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса. С целью обнаружения вируса в материалах от больных проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур клеток. Для заражения отбирают пробирки со сплошным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Перед заражением из пробирок отсасывают 27 культуральную жидкость, затем вносят по 0,1 мл исследуемого материала и добавляют питательную среду до 1 мл. Каждую пробу материала вносят в 4 пробирки. Для контроля несколько пробирок оставляют незаражёнными, но также сменяют в них питательную среду. Пробирки выдерживают в термостате, обычно при 370С, и ежедневно микроскопируют с целью обнаружения ЦПД (в течение недели и более). ЦПД различных вирусов на клеточные культуры обладает определённой специфичностью. Родственные вирусы дают цитопатическую реакцию сходного типа, эффект действия отдалённых по свойствам вирусов часто различен, поэтому по типу ЦПД можно судить о семействе или роде, к которым относится исследуемый вирус: - энтеровирусы (вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО) вызывают однородную мелкозернистую деструкцию клеток; - аденовирусы превращают клеточный слой в скопления мелких, округлых клеток, расположенных в виде гроздьев винограда; - парагриппозные вирусы, респираторно-синцитиальный, вирусы кори и паротита образуют симпласты. Количественное определение вирусов в исследуемом материале проводится с помощью титрования. Для этой цели готовят 10-кратные последовательные разведения вируса, которыми заражают клеточные культуры. Титром вируса называют его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине заражённых культур. Титр вируса выражают в цитопатических дозах (ЦПД 50) в 1 мл. За одну ЦПД50 принимают 0,1 мл вируссодержащего материала, разведённого до титра. Для идентификации выделенного вируса по нейтрализации ЦПД культуральную жидкость смешивают с равным объёмом диагностической иммунной сыворотки (разведение сыворотки 1:5 или 1:10). После 1-2-часового контакта при комнатной температуре этой смесью (по 0,2 мл) заражают 4 пробирки с культурой клеток, из которой предварительно была удалена 28 питательная среда; после добавления смеси в пробирки вносят по 0,8 мл свежей среды. Опыт сопровождается несколькими контролями: 1 – контроль незаражённой культуры; 2 – контроль дозы вируса – клеточные культуры заражают той же дозой вируса, что и в опыте; 3 – контроль культуры, заражённой смесью культуральной жидкости с нормально сывороткой. Опыт учитывают через 5-7 дней и более, просматривая пробирки под малым увеличением микроскопа. В первом контроле ЦПД должно отсутствовать, во втором и третьем – обязательное проявление ЦПД. Отсутствие цитопатического эффекта в опытных пробирках указывает, что в данной пробе произошла нейтрализация вируса иммунной сывороткой, сыворотка соответствует типу выделенного вируса. 2.1.2. Реакция гемадсорбции Гемадсорбирующие свойства имеют многие вирусы: орто- и парамиксовирусы, флавивирусы, поксвирусы. Эти же вирусы обладают спосодностью вызывать гемагглютинацию – склеивание эритроцитов. Приобретение способности к гемадсорбции связано со встраиванием в мембрану заражённых вирусом клеток вирусспецифических белков – гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности заражённых клеток. В реакции применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека 0 (I) группы. По наличию явления гемадсорбции обнаруживают присутствие вирусов в культурах клеток при латентной инфекции, когда цитопатический эффект оказывается слабо выраженным или отсутствует совершенно. Рис. 6. Реакция гемадсорбции 29 Техника постановки реакции гемадсорбции Предварительно клеточные культуры заражают исследуемым материалом. Реакцию гемадсорбции ставят каждые два дня до появления положительной реакции (в течение 8-10 дней). Для этого в пробирку с заражённой культурой вносят по 0,2 мл взвеси эритроцитов (0,4-1%) и выдерживают пробирки в наклонном положении, чтобы эритроциты соприкасались с клеточным слоем. Температура, при которой ставят опыт, и экспозиция зависит от вида вируса. Пробирки встряхивают и оставляют на некоторое время в вертикальном положении для оседания неадсорбировавшихся эритроцитов. При микроскопии под малом увеличением в опытной пробирке регистрируют положительную реакцию гемадсорбции, выражающуюся в том, что эритроциты адсорбируются на клетках культуры, прилипая к клеточному слою; в контрольной пробирке клеточный слой свободен от эритроцитов. При добавлении специфической иммунной сыворотки в пробирку с клеточной культурой, предварительно заражённой соответствующим вирусом, заражённые клетки теряют способность адсорбировать эритроциты, т.е. происходит явление задержки гемадсорбции. Вследствие специфичности этого явления реакция задержки гемадсорбции может быть использована для идентификации выделенных вирусов, а также с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующих антител в сыворотках больных. 2.1.3. Метод бляшек Для получения бляшек клеточный монослой заражают небольшой концентрацией вируса и фиксируют адсорбировавшиеся на клетках вирионы с помощью агарового покрытия, в которое добавлен витальный краситель – нейтральный красный. ЦПД вирусов имеет очаговый характер, погибшие клетки дегенерируют, теряют способность удерживать нейтральный красный и обесцвечиваются. В результате на непрозрачном равномерно розовом фоне клеточного монослоя появляются бляшки в виде более прозрачных неокрашенных округлых пятен. 30 Рис. 7. Метод бляшек Агаровое покрытие готовят из высококачественного агара в концентрации 1-1,5% и других компонентов – солевых буферных растворов, дополнительных питательных веществ, антибиотиков. Раствор нейтрального красного входит в состав среды или его добавляют во флакон или чашку незадолго до учёта опыта. Часто вместо агара используют гель бентионита (5-6%) – это алюмосиликат природного происхождения, который биологически инертен и не токсичен для культур клеток. Обнаружение и титрование вирусов методом бляшек Для получения бляшек вирусов во флаконы или чашки наливают взвесь клеток в питательной среде (№ 199 или среда с гидролизатом лактальбумина). Флаконы закрывают резиновыми пробками, чашки заклеивают лейкопластырем и помещают в термостат на 5-6 дней для получения монослоя клеток, который должен быть сплошным, без признаков дегенерации. Перед заражением среду из флаконов или чашек удаляют и однослойную культуру клеток осторожно отмывают раствором Хенкса, который затем тщательно отсасывают. Заражение производят путём внесения разведённого исследуемого материала в объёме 0,10,25 мл и равномерного распределения этого материала по поверхности клеточного слоя с помощью покачивания. Через 30-60 минут заражённую культуру клеток заливают покровной средой. Флаконы или чашеи с застывшей средой помещают в термостат (клеточным слоем кверху) и выдерживают до образования бляшек (2-5 суток), после чего производят их подсчёт и изучение. Разные вирусы образуют бляшки, отличающиеся по величине, форме, характеру краёв, по срокам появления и другим свойствам, что может быть использовано для предварительной идентификации вируса. 31 Для титрования вирусов готовят серийные разведения вируссодержащего материала и каждое из разведений вносят во флакон или чашку со слоем культуры клеток. Подсчитав образовавшиеся бляшки (с учётом разведения вируса), вычисляют титр вируса – количество вирионов в 1,0 мл исходного материала. Титр вируса, определяемый методом бляшек, принято выражать числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл. Метод бляшек даёт возможность провести точную идентификацию вируса с помощью диагностических специфических сывороток. При соответствии между сывороткой и вирусом происходит нейтрализация вируса и при заражении монослоя клеток такой смесью бляшки не образуются или их количество значительно снижается. 2.1.4. Цветная проба Цветная проба (или цветная реакция) основана на разнице в цвете среды индикатором фенолрот, в которой растёт нормальная, жизнеспособная культура клеток, и среды, где находится культура, заражённая вирусом. В процессе развития нормальной культуры клеток происходит постепенное накопление кислых продуктов обмена веществ, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону. Такое изменение реакции среды говорит о наличии роста и размножения клеток. Среда с индикатором фенолрот, первоначально имевшая красный цвет (рН 7,4 – 7,6), вследствие снижения рН до 7,0 – 6,8 приобретает жёлтый цвет. Заражение культуры клеток вирусом приводит к развитию в ней дегенеративных процессов: происходит подавление процессов метаболизма, значительно понижается гликолиз, в результате чего кислых продуктов накапливается мало, рН среды остаётся на исходном уровне и среда с индикатором фенолрот остаётся красного цвета. С помощью цветной реакции можно определить соответствие вируса и вируснейтрализующей сыворотки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка 32 нейтрализует вирус и он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры. Цветную пробу ставят с различными типами клеточных культур. Чаще берут первичную культуру клеток почки обезьяны или перевиваемые культуры клеток. При постановке цветной реакции необходимо учитывать, что каждая культура клеток, на которой ставят реакцию, имеет определённый уровень метаболизма. Устанавливают дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, которое должно быть взято в каждую пробирку. При работе с культурой почечных клеток обезьяны готовят взвесь клеток густотой 100-200 тыс. в 1 мл. Из неё делают ряд возрастающих разведений в объёме 0,25 мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из красного в жёлтый н 5-6-й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза – 25 тыс. клеток в объёме 0,25 мл. Титрование вируса методом цветной пробы Цветную пробу ставят в пробирках, которые иногда закрывают резиновыми пробками, но чаще разобщение от атмосферного воздуха достигается наслаиванием стерильного вазелинового масла (0,6-0,8 мл) или применение алюминиевой фольги. Однотипную опытную смесь наливают в четыре пробирки. При оценке результатов реакции учитывают два тона: жёлтый и красный (табл. 3). При титровании вируса по цветной пробе готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала. Эти разведения вируса, взятые в объёме 0,25 мл, смешивают с 1 дозой клеток, содержащейся в таком же объёме, добавляют питательную среду по 0,25 мл и наслаивают вазелиновое масло по 0,6-0,8 мл. В реакции ставят контроли клеточной взвеси: берут 1,1/2 и ¼ дозы клеток. 33 Пробирки помещают на 5-6 дней в термостат при 370С после чего по изменению цвета учитывают реакцию. Титром вируса по цветной пробе называется то наибольшее разведение вируса, которое вызывает подавление метаболической активности клеток в 50% случаев. В данном примере (табл. 3) титр вируса равен 10-4 (две пробирки красные, две – жёлтые). Количество вируса, содержащееся в объёме 0,25 мл в разведении, равном титру, называется цитопатической дозой (ЦПД50) вируса. Таблица 3 Схема титрования вируса методом цветной пробы № пробирок Ингредиенты 1 опыта (в мл) 2 3 Разведения 4 5 6 вируссодержащего 7 8 9 Контроль клеток материала 10-1 Вируссодержащий 0,25 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 1 ½ ¼ доза доза доза 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 - - - 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 Питательная среда 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 0,5 Вазелиновое 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 материал Взвесь клеток (1 доза) 0,6 масло Возможные результаты Цвет среды в пробирках (красный К-3 К-4 или К-4 К-2 К-1 титр Ж-1 Ж-2 Ж-2 Ж-4 Ж-3 Ж-4 К-4 К-2 жёлтый) Обозначения: К-4 – красного цвета 4 пробирки; Ж-3 – жёлтого цвета 3 пробирки 34 2.2. Применение реакции гемагглютинации (РГА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и биологических моделей для индикации и идентификации вирусов Гемагглютинация, вызываемая вирусами, не является иммунологической реакцией, так как здесь нет системы антиген – антитело. С помощью этой реакции легко выявить присутствие гемагглютинирующего вируса, но невозможно его идентифицировать. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами, имеют на поверхности гемагглютинины, с помощью которых происходит склеивание эритроцитов. По своей химической природе гемагглютинины являются глико- или липопротеидами. В процессе взаимодействия вирусов с эритроцитами различают стадии адсорбции, агглютинации и элюции. Адсорбция вирусов на эритроцитах начинается как неспецифическая, а затем переходит в специфическую вследствие сродства гемагглютининов к рецепторам эритроцитов. На одном эритроците адсорбируется множество вирусов, они образуют мостики между эритроцитами, изменяется электростатический заряд эритроцитов и в результате наступает следующая стадия взаимодействия – гемагглютинация, на которой процесс может остановиться. Некоторые вирусы способны к элюции – освобождению с поверхности эритроцитов. Элюция происходит под действием вирусных ферментов (например, нейраминидазы) на рецепторы эритроцитов. Элюированные вирусы при этом не повреждаются, эритроциты же не способны повторно адсорбировать вирус вследствие разрушения рецепторов. При постановке РГА используют те эритроциты (птиц, животных, человека), с которыми гемагглютинирующие свойства данного вируса проявляются лучше (например, эритроциты кур). Задерживающее действие на РГА могут оказывать ингибиторы, содержащиеся в тканях, где размножался вирус, и других биологических субстратах. Для снятия ингибиторного действия 35 вируссодержащие материалы прогревают, обрабатывают трипсином, ацетоном и др. 2.2.1. Техника постановки РГА На плексигласовой доске готовят двукратные возрастающие разведения в объёме 0,5 мл исследуемого вируссодержащего материала , начиная с 1:10 и до 1:1280. в луночки с разведениями добавляют равные объёмы 1% взвеси эритроцитов кур. Доску осторожно встряхивают и оставляют на 30-45 мин при комнатной температуре. Учёт результатов проводят по трёхкрестовой системе в зависимости от внешнего вида осадка эритроцитов. При гемагглютинации на «+++» осадок имеет форму зонтика и занимает всё дно лунки. При отсутствии агглютинации эритроциты оседают в центре лунки в виде компактного диска. Титром вируса называется то наибольшее его разведение, при котором ещё наблюдается выраженная гемагглютинация («+++» или «++»). В нашем примере титр вируса 1:320 (табл. 4). Количественное содержание вируса в разведении, равном титру, называется гемагглютинирующей единицей (содержится в 0,5 мл разведения 1:320). Определение этой величины необходимо для постановки РТГА, в которой в качестве рабочей дозы вируса берут 4 гемагглютинирующие единицы. Таблица 4 Схема постановки реакции гемагглютинации при диагностике гриппа Ингредиенты РГА (в мл) Номера лунок разведения вируссодержащего материала 1 2 3 4 1:10 1:20 1:40 1:80 0,1 0,5 0,9 0,5 5 6 7 8 1:160 1:320 1:640 1:1280 9 К Вируссодержащий 0,5 вылить материал Физиологический 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 раствор 36 1% взвесь 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 +++ +++ +++ +++ +++ ++ + - - эритроцитов Возможный результат титр Если предварительно соединить вирус со специфической иммунной вируснейтрализующей сывороткой и потом добавить эритроциты, то такой инактивированный вирус теряет способность вызывать гемагглютинацию. Эта реакция получила название реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и может быть использована для окончательной идентификации неизвестного гемагглютинирующего вируса – по специфической диагностической сыворотке, а также для выявления титра неизвестных антител в сыворотке больного – по известным вирусным антигенам-диагностикумам. Затрудняет применение РТГА наличие в сыворотках крови человека и животных неспецифических вирусных ингибиторов, которые могут вызвать неспецифическое торможение гемагглютинации. Выпускают противовирусные диагностические сыворотки, освобожденные от ингибиторов. РТГА ставят обычно на досках с лунками по методике, сходной с РГА. 2.2.2. Техника постановки РТГА РТГА с целью идентификации вируса гриппа рода А. На плексигласовой доске готовят три ряда двукратных возрастающих разведений (в объёме 0,25 мл) диагностических противогриппозных сывороток А(Н1N1), А(Н2N2) и А(Н3N2) от 1:10 до 1:320 (до титра сывороток). Во все лунки, кроме контрольной, добавляют по 0,25 мл рабочей дозы вируса (разведение 1:40), в котором содержится 4 гемагглютинирующие единицы (табл. 5). После выдерживания реакции в течение 1 часа при комнатной температуре во все лунки добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов кур. Учёт результатов проводят через 30-40 минут. В примере торможение произошло сывороткой 37 А(Н3N2), следовательно выделен вирус гриппа, принадлежащий к подтипу А(Н3N2). Таблица 5 Схема постановки РТГА для определения типовой принадлежности вируса гриппа А Ингредиенты Номера лунок, разведения иммунной сыворотки РТГА 1 2 3 4 5 в мл 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 0,25 0,25 0,25 6 7 1:320 Контр. Диагностические противогриппозные 0,25 сыворотки в вылить разведении 1:5 Физиологический 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 - раствор Вируссодержащая аллантоисная 0,25 жидкость в разведении 1:40 Взвесь эритроцитов Выдерживание 1 час при комнатной температуре кур 1% 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Диагности- А(Н1N1) +++ +++ +++ +++ +++ ++ - ческие +++ +++ +++ +++ +++ - - - - - ++ - Возможный результат А(Н2N2) +++ сыворотки А(Н3N2) - (нейтрализация) РТГА ставят и для определения наличия и титра антител в сыворотке больного. Для этого готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в объёме 0,25 мл и соединяют их с 0,25 мл известного антигена (содержащего 4 гемагглютинирующие единицы), чтобы произошла 38 нейтрализация вируса. Затем в пробирки вносят по 0,5 мл взвеси эритроцитов. За титр сыворотки принимают то наибольшее её разведение, в котором ещё наблюдается торможение гемагглютинации (1:160). 2.2.3. Реакция нейтрализации вирусов in vivo Основными составляющими компонентами этой реакции являются: иммунная вируснейтрализующая (опытная) и нормальная (контрольная) сыворотки одного и того же вида животного или человека; содержащий живые вирусы материал, являющийся антигеном; биологические объекты (мыши, куриные эмбрионы), на которых обнаруживают вируснейтрализующее действие иммунной сыворотки. Применяют два варианта постановки реакции нейтрализации. При одном из них берут постоянную дозу сыворотки и различные разведения вируса, при втором – постоянное разведение вируса и различные разведения сыворотки. Во всех случаях последовательность проведения реакции следующая: 1) предварительный контакт вируссодержащего соответствующей иммунной сывороткой материала (один из с этих компонентов заведомо известен, наличие другого определяется); 2) введение этой смеси в чувствительную биологическую систему (белым мышам или куриным эмбрионам); 3) Сыворотки учёт наличия или отсутствия нейтрализации. получают диагностические либо сыворотки от от больных людей, иммунизированных либо применяют животных. Перед постановкой реакции сыворотки инактивируют, прогревая при температуре 56600С. Антигены (вируссодержащие взвеси) получают из материала от больных вирусными инфекциями, готовят из органов и тканей заражённых вирусом животных, куриных эмбрионов, а также из инфицированных клеточных культур и подвергают очистке. Перед употреблением антиген титруют для определения его активности. 39 Биологические объекты выбирают с учётом свойств вируса, чувствительности самого объекта к действию вируса, а также задач и условий исследования. Постановка реакции нейтрализации (I вариант) Ставят для идентификации выделенного вируса. Для постановки реакции берут два ряда пробирок, из которых первый ряд является опытным, а второй – контрольным. В первый ряд пробирок наливают определённое количество неразведённой диагностической иммунной сыворотки, во второй – контрольный – такое же количество неразведённой нормальной сыворотки того же вида животного. Отдельно в пробирках готовят несколько разведений вируса, чтобы при добавлении их в пробирки опытного, контрольного ряда получились последовательные 10-кратные разведения вируса (например, 10-1, 10-2, 10-3 и т.д.). Сыворотки и добавляемые разведения вируса должны быть в одинаковых объёмах, например по 0,2 мл. Пробирки с приготовленной смесью ставят в термостат при температуре 370С обычно на 1-2 часа. После этого опытные и контрольные смеси вводят мышам или в куриные эмбрионы. Каждым разведением для достоверности опыта заражают не менее 4 мышей или куриных эмбрионов. За заражёнными животными (опытными и контрольными) устанавливают наблюдение в течение 2-х недель, регистрируют заболевших и погибших мышей. Учёт реакции проводят путём сопоставления количества погибших опытных и контрольных мышей от соответствующего разведения вируса. Определяют 50%-ную смертельную дозу – LD50, проводя подсчёт по Риду и Менчу. Высчитывают индеек нейтрализации (ИН) по формуле, определяющей количество доз, нейтрализуемых сывороткой: Титр вируса в опыте с нормальной сывороткой ИН = -------------------------------------------------------------------Титр вируса в опыте с иммунной сывороткой ИН менее 10 – отрицательный; 40 ИН – 11-49 – сомнительный; ИН равный 50 и выше – положительный. Заражённые эмбрионы инкубируют при температуре 35-370С от 48 до 72 ч. Затем яйца вскрывают, аллантоисную или амниотическую жидкость отсасывают и в ней определяют наличие вируса при помощи реакции гемагглютинации. Если гемагглютинация наступила в контроле (смесь нормальной сыворотки с разведениями вируса) и отсутствует в опыте (смесь иммунной сыворотки с разведениями вируса), то сыворотка обладает нейтрализующим действием, Конечный титр вируса в контроле и в опыте определяют путём статистической обработки. Постановка реакции нейтрализации (II вариант) Реакцию ставят с различными разведениями исследуемой сыворотки и постоянной дозой известного живого вируса. Для этого к двукратным возрастающим разведениям сыворотки добавляют равные объёмы определённого разведения вируса (рекомендуется брать 100 или 1000 LD50 вируса). Далее поступают как и в I варианте, то есть выдерживают опытные и контрольные смеси 1-2 часа в термостате, после чего вводят их мышам или куриным эмбрионам. При постановке реакции нейтрализации на мышах за титр изучаемой сыворотки принимают разведение, дающее защитный эффект у 50% мышей. В реакции на куриных эмбрионах титром сыворотки считается то наибольшее её разведение, которое ещё способно задержать гемагглютинирующее действие вирусов у 50% заражённых куриных эмбрионов. 2.3. Молекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусных инфекций К таким методам относятся молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция, которые позволяют обнаружить присутствие в исследуемом материале даже единичных копий генов определяемых вирусов (ДНК или РНК 41 с определённой нуклеотидной последовательностью), и тем самым доказать наличие соответствующей инфекции. 2.3.1. Молекулярная гибридизация (метод молекулярных зондов) Метод основан на способности двухспиральной ДНК к денатурации и ренатурации. Денатурация – это расхождение цепей при нагревании ДНК до 801000С или обработке её щёлочью. Ренатурация – воссоединение цепей с помощью водородных связей при снижении температуры до 40-600С (отжиг) и приобретение ДНК первоначальной двухспиральной структуры. Разъединённые цепи ДНК способны к гибридизации с фрагментами других односпиральных ДНК, имеющих комплементарные участки расположения нуклеотидов. К гибридизации комплементарных нитей способна также РНК, образуя комплексы ДНК – РНК или РНК – ДНК. Необходимые для молекулярной гибридизации фрагменты ДНК или РНК, с помощью которых выявляют наличие в исследуемом материале комплементарных нитей нуклеиновой кислоты, называются молекулярными зондами. Молекулярные зонды готовят из нуклеиновых кислот, выделенных из различных вирусов, иногда используют вирусную и-РНК, но чаще зондом служит клонированная рекомбинантная ДНК. Имеются наборы молекулярных зондов для определения многих вирусов. При постановке реакции молекулярной гибридизации зонды метят радиоактивной (Р32), флюоресцентной или биотиновой меткой, соединяют с исследуемым материалом, содержащим определяемую нуклеиновую кислоту, подвергающуюся денатурации. Если зонд комплементарен цепи определяемой нуклеиновой кислоты, происходит гибридизация в комплементарном участке. После отжига зонд оказывается включённым в ренатурированную нуклеиновую кислоту и может быть обнаружен по имеющейся метке. Выявление наступившей молекулярной гибридизации позволяет установить природу определяемого вируса. Чувствительность этого метода составляет 10 14 г/мл. 42 2.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или локальная амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК) ПЦР, как и молекулярная гибридизация, основана на способности ДНК к денатурации и ренатурации и на комплементарности цепей ДНК. Важным принципом реакции является использование термостабильной ДНК- полимеразы, при участии которой происходит амплификация – умножение определяемых генов или фрагментов с определённой нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате реакции исследуемый генетический материал накапливается в значительном количестве и может быть легко выявлен и идентифицирован. Чувствительность этой реакции составляет 10 -18 г/мл. В реакции участвуют следующие ингредиенты: определяемая ДНК вирусов в испытуемом биологическом материале, который предварительно концентрируется; праймеры 2-х типов (олигонуклеотиды) – короткие цепочки ДНК с нуклеотидной последовательностью комплементарной 3,-концам каждой из двух цепей определяемой ДНК. Праймеры получают из нуклеиновых кислот различных вирусов, их нуклеотидную последовательность определяют методом секвенирования; свободные нуклеитиды (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты 4-х типов с различными азотистыми основаниями) – необходимый материал для осуществления амплификации; фермент термостабильная ДНК-полимераза – производит достройку комплементарных цепей ДНК из пула свободных нуклеотидов. Фермент выделяют из бактерий Thermus aquaticus или получают генно-инженерным методом. Сущность ПЦР состоит в том, что определяемая ДНК, находящаяся в тестируемом биологическом материале, подвергается денатурации. Затем праймеры 2-х типов в условиях отжига присоединяются, вследствие их 43 комплементарности, к 3,-концам каждой из антипараллельных цепей, восстанавливая на этом участке двухспиральную структуру ДНК. Праймеры служат «затравками» для последующей достройки цепей ДНК, осуществляемой термостабильной ДНК-полимеразой, которая использует для этой цели свободные нуклеотиды. В результате одного цикла ПЦР количество молекул определяемой ДНК удваивается, то есть происходит амплификация ДНК. Обычно проводят 25-40 повторных циклов амплификации и в итоге за 2-3 часа получают миллионы копий специфического фрагмента ДНК вирусов. ПЦР проводят в 0,5-1,5 мл микроцентрифужных пробирках в амплификаторах, которые автоматически регулируют смену температуры. Каждому из 3-х этапов цикла амплификации – денатурации ДНК, отжига и достройки – необходима инкубация образцов при различном температурном режиме. 1. Денатурация – разъединение определяемой двухспиральной ДНК на две изолированные цепи при нагревании до 90-950С в течение 0,5-1,0 мин. 2. Отжиг – восстановление двухцепочечной структуры определяемой ДНК в области присоединения комплементарного праймера – проводится при температуре 40-600С 0,5 мин. 3. Удлинение (элонгация) – достройка каждой цепи определяемой ДНК доисходного двухцепочечного состояния с помощью термостабильной ДНК-полимеразы – проводится при температуре 70-750С в течение 2-5 мин. Наличие ДНК после повторных циклов амплификации определяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, авторадиографией или другими методами. С помощью ПЦР возможно определение не только нуклеотидной последовательности ДНК, но также РНК и, следовательно, выявление РНК- 44 вирусов (для этого в реакцию вводят обратную транскриптазу). ПЦР особенно ценен для диагностики латентных вирусных инфекций и ВИЧ-инфекции. Рис. 8. Схема полимеразной цепной реакции Контрольные вопросы 1. Индикация вируса по его цитопатическим действиям (ЦПД) и определение титра вируса. Идентификация вируса по нейтрализации ЦПД. 2. Метод гемадсорбции, его практическое применение, идентификация вируса в реакции задержки гемадсорбции. 3. Метод бляшек. Идентификация вирусов методом бляшек, титрование антител. 4. Метод цветной пробы, методика постановки, практическое применение. 5. Реакция нейтрализации по цветной пробе, её сущность, применение. 6. Реакция гемагглютинации (РГА), вызываемая вирусами. Практическое применение РГА. Методика постановки. 7. Сущность реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Методика постановки. Практическое применение. 8. Реакция нейтрализации вирусов in vivo, способы постановки. Практическое применение. 45 9. Молекулярно-генетические методы исследования, их сущность. Принцип метода молекулярной гибридизации. 10.Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Ингредиенты реакции, их характеристика, значение амплификации. Сущность ПЦР. 11.Техника постановки ПЦР, практическое применение и оценка, как экспресс-метода диагностики вирусных инфекций. Тематика докладов 1. Современные методы диагностики распространённых вирусных инфекций. 2. Индикация и идентификация вирусов гриппа. 3. Молекулярно-генетические методы анализа полиморфизма генов. 4. Молекулярно-генетические методы анализа экспрессии генов. ЛИТЕРАТУРА 1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. 3-е изд. – М.: Медицина, 1982. 2. Большой словарь медицинских терминов / Сост. Федотов В.Д. – М.: ЗАО Центрполиграф, 2007. 3. Вирусология. Методы / Под ред. Б. Мейхи. – М.: Мир, 1988. 4. Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П. Медицинская и санитарная микробиология. – М.: АСАDEMA, 2003. 5. Голубев Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. – Л., 1986. Электронный учебник. 6. ПЦР «в реальном времени» / Под ред. Д.В. Ребрикова; 2-е изд., испр. И доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. 7. Филдс Б., Найп Д. Вирусология. Т. 1-3. – М.: «Мир», 1989. 8. www. infections.ru/rus/all/mvb journals.shtml 9. www.blackwellmedstudent.com 10.www.medmaster.net 46 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………….... 3 Раздел 1. Культивирование вирусов ……………………………………………4 1.1. Подготовка материала для вирусологических исследований…………….4 1.1.1. Правила работы в вирусологической лаборатории…………………....4 1.1.2. Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях…………….........5 1.1.3. Обработка вируссодержащего материала………………………………5 1.1.4. Микроскопические методы исследования в вирусологии…………….6 1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы их получения………………..9 1.2.1. Питательные среды…………………………………………………….11 1.2.2. Типы клеточных культур………………………………………………12 1.3. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах……...16 1.3.1. Строение куриного эмбриона………………………………………….17 1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку....18 1.3.3. Заражение в аллантоисную полость……………………………...........20 1.3.4. Заражение в полость амниона………………………………………….20 1.4. Культивирование вирусов путём заражения лабораторных животных…22 1.4.1. Интраназальное заражение………………….……………………….....23 1.4.2. Интрацеребральное заражение…………………………………............24 Контрольные вопросы………………………………………………………..….25 Тематика докладов……………………………………………………………….25 Литература………………………………………………………………………..25 Раздел 2. Индикация и идентификация вирусов………………………………26 2.1. Методы индикации и идентификации вирусов в клеточных культурах..26 2.1.1. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток…….......27 2.1.2. Реакция гемадсорбции…………………………………………………29 2.1.3. Метод бляшек…………………………………………………………..30 2.1.4. Цветная проба…………………………………………………………..32 47 2.2. Применение реакции гемагглютинации (РГА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и биологических моделей для индикации и идентификации вирусов……………………...35 2.2.1. Техника постановки РГА………………………………………………36 2.2.2. Техника постановки РТГА……………………………………………..37 2.2.3. Реакция нейтрализации вирусов in vivo………………………………39 2.3. Молекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусных инфекций……………………………………..41 2.3.1. Молекулярная гибридизация (метод молекулярных зондов)………42 2.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или локальная амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК)……………………...........43 Контрольные вопросы ………………………………………………………...45 Тематика докладов……………………………………………………………...46 Литература ……………………………………………………………………..46 48
