И.С. САВИЦКАЯ, М.Х. ШИГАЕВА, А.Ж. НАУРЗБАЕВ

И.С. САВИЦКАЯ, М.Х. ШИГАЕВА, А.Ж. НАУРЗБАЕВ
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КУЛЬТУР С АНТИМУТАГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ ДЛЯ
ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИФИДОБАКТЕРИНА
(Казахский университет имени аль-Фараби)
В тесте Эймса на штамме Salmonella typhimurium TA 100 показано, что культуральная жидкость
Bifidobacterium longum инактивирует нитрозометилмочевину (НММ) путем прямого химического
взаимодействия (максимальная антимутагенная активность приходится на логарифмическую фазу
роста культуры) и, кроме того, снижает выход мутаций в условиях предобработки клеток тестштамма НММ. Таким образом, культуральная жидкость В. longum проявляет как дес- так и
биоантимутагенные свойства
Нормальная микрофлора кишечника человека выполняет ряд важных для организма-хозяина
функций: подавляет (в известных пределах) размножение микроорганизмов-пришельцев, в том
числе, что особенно важно, патогенных, участвует в превращениях питательных веществ в
кишечнике, поддержании нормального газового состава и интракишечного уровня рН,
обеспечивает макроорганизм рядом витаминов, выступает в роли стимулятора иммунной системы
/1-3/.
Нормальная кишечная микрофлора принимает также участие в инактивации поступающих извне
или образующихся эндогенно токсических веществ /4/. Среди последних могут быть и соединения,
обладающие мутагенной активностью /5/ и представляющие серьезную угрозу здоровью человека,
в частности индуцирующие возникновение опухолей /6/.
Поэтому необходимым является повышение устойчивости организма к неблагоприятным
воздействиям окружающей среды с помощью естественных защитных факторов. В случае
мутагенных воздействий речь идет об антимутагенах - веществах, снижающих уровень спонтанной
и индуцированной мутабильности.
Ингибиторами мутагенеза могут быть культуральные жидкости бактерий /7, 8/. В связи с этим
важное значение имеет исследование нормальной микрофлоры кишечника человека для
выделения бактерий, способных продуцировать антимутагены.
Бифидобактерии - одна из доминирующих групп нормальной кишечной микрофлоры. Кроме того,
препараты на основе бифидобактерий широко используются для коррекции дисфункций и
улучшения работы пищеварительного тракта.
С целью разработки более эффективных препаратов пробиотиков на основе бифидобактерий в
данной работе были исследованы антимутагенные свойства культуры Bifidobacterium longum.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы. В качестве мутагена использована нитрозометилмочевина (НММ) фирмы "Serva",
поскольку нитрозосоединения могут образовываться в кишечнике из некоторых естественных
компонентов пищи, пищевых добавок и лекарственных веществ /5/.
В качестве потенциальных продуцентов антимутагенных веществ были использованы бактерии
вида Bifidobacterium longum. Культура получена из Института питания МЗ РК.
Для выявления антимутагенной активности использован штамм Salmonella typhimurium TA 100 (his
G 46 - ауксотрофность по гистидину, rfa - дефект липополисахарида наружной мембраны, uvrB недостаточность эксцизионной репарации, pKM 101 - плазмида устойчивости к ампицилину).
Штамм получен из Института общей генетики РАН.
Получение культуральных жидкостей. Суспензию клеток бактерий в количестве 2 мл засевали в
100 мл жидкой питательной среды (обезжиренное разбавленное дистиллированной водой (1:1)
молоко, лактоза - 1,0%, пептон - 2%, NaCl - 0,35%, цистеин - 0,015%, pH 7,2-7,4) и выращивали в
термостате при 370С. Из колбы с выращиваемой культурой отбирали пробы через 4, 8, 24, 30 ч и
48 ч роста. Измеряли оптическую плотность проб на спектрофотометре для установления связи
между фазой роста культуры и максимальной продукцией антимутагенных веществ.
Культуральную жидкость получали, отделяя клетки центрифугированием (15 мин, 5000 об/мин) и
пропуская супернатант через мембранный фильтр. Фильтрат использовали для выявления
антимутагенной активности.
Определение антимутагенной активности. Антимутагенную активность культуральных жидкостей
бактерий изучали в тесте Эймса /9/. Метод основан на способности мутагенов вызывать реверсии
к прототрофности у ауксотрофных по гистидину тестерных штаммов Salmonella typhimurium.
Ревертировавшие под действием мутагена клетки при высеве суспензии тест-штамма на
селективную (не содержащую гистидина) среду образуют колонии. По числу колоний судят о силе
мутагена. Антимутагены при добавлении к инокуляту соответственно снижают частоту
индуцированных реверсий к прототрофности, что регистрируется по уменьшению числа колоний
ревертантов на селективной среде по сравнению с вариантом, где использован только мутаген.
Опыт проводили в двух вариантах. Первый включал 2-х часовую инкубацию мутагена с
фильтратом культуральной жидкости, взятой в разные сроки от начала культивирования. Смесь
добавляли к суспензии клеток тест-штамма высеваемых на селективную среду.
Во втором варианте суспензию клеток тестерного штамма смешивали с раствором НММ и
инкубировали в течение 40 мин. Затем клетки отмывали от мутагена двукратным
центрифугированием, ресуспендировали и высевали на селективную среду, добавляя
культуральную жидкость в разных количествах.
Чашки выдерживали 48 ч при 370С, затем производили подсчет колоний.
В чистом контроле вместо культуральной жидкости использовали стерильные исходные
питательные среды, которые выдерживали в течение 48 ч при 370С (пробы брали соответственно
через 4, 8, 24, 30 и 48 ч), в позитивном - аликвоту фосфатного буфера. Для определения
спонтанного уровня мутирования раствор НММ заменяли аликвотой растворителя, культуральную
жидкость или исходную питательную среду не добавляли.
Поскольку уменьшение числа колоний ревертантов в опытном варианте может быть обусловлено
неизбирательной гибелью клеток под действием модулятора (антимутагена), а не антимутагенным
эффектом, отдельно определяли бактерицидность тестируемых культуральных жидкостей в
отношении S. typhimurium согласно /9/.
Эффективность антимутагенного действия рассчитывали по формуле, приведенной в работе О.Б.
Иванченко с соавторами /10/
A = 1 - (S - N / P - N) (1)
где А - антимутагенная активность
S - число колоний ревертантов в опыте (или чистом контроле)
N - число колоний спонтанных ревертантов
P - число колоний ревертантов в позитивном контроле.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Один и тот же антимутаген может действовать как десмутаген и как биоантимутаген. В первом
случае имеет место химическое взаимодействие между антимутагеном и генотоксикантом,
приводящее к инактивации последнего, во втором - антимутаген вмешивается в метаболизм
мутагена внутри клетки, ингибирует инициируемые им цепные свободнорадикальные реакции,
влияет на репарацию ДНК или экранирует сайты мутагенной атаки в ДНК /5/. Поэтому выяснение
вопроса о том, обладает ли культуральная жидкость B. longum десмутагенным действием в
отношении НММ и на какой стадии роста культуры это действие, если оно имеет место,
максимально, было задачей первого этапа данного исследования. Для этого раствор НММ
выдерживали с определенным количеством культуральной жидкости, затем определяли
мутагенную активность смеси в сравнении с мутагенностью НММ (контроль).
Данные эксперимента представлены в таблице 1.
Таблица 1. Влияние культуральной жидкости B. longum на НММ-индуцированный мутагенез
штамма S. typhimurium TA 100.
Время
культивирования, ч
4
8
24
30
Среднее число колоний
ревертантов на чашку
778 +/- 23
753 +/- 17
661 +/- 19
436 +/- 15
А х 100 %
14
17
28
55
48
503 +/- 17
47
Примечание. Спонтанный фон: 62 +/- 3 ревертанта. Мутаген (позитивный контроль) - 100
мкг/чашку: 894 +/- 14 ревертантов. Стерильная питательная среда: 769 +/- 16 (15%) ревертантов.
Величина антимутагенной активности в тексте и таблицах дана в пересчете на проценты (А х
100%). Полное подавление мутагенеза (среднее число ревертантов в опыте не отличается от
спонтанного уровня) означает 100% антимутагенной активности (А = 1), отсутствие последней - 0%
(А = 0).
Видно, что антимутагенная активность культуральной жидкости изменяется определеным
образом. В первые 8 часов она относительно невысока и достигает 17% (14% на 4-м часу). Через
30 ч от начала культивирования антимутагенная активность наиболее высокая - число
ревертантов в опыте на 55% меньше, чем в позитивном контроле. Далее защитное действие
культуральной жидкости снижается до 47% при росте в течение 48 ч.
Через 30ч от начала культивирования культура B.longum достигает логарифмической фазы. На
этот период приходится также пик антимутагенной активности культуральной жидкости (рис. 1).
Таким образом, максимальное накопление антимутагенных веществ в данном случае имеет место
в период экспоненциального роста.
Необходимо отметить, что исходная питательная среда для бифидобактерий также обладает
заметной антимутагенной активностью (на уровне 15%) и защитное действие культуральной
жидкости по крайней мере в первые 8 часов культивирования обусловлена, очевидно,
антимутагенными соединениями, содержащимися в питательной среде. Растущая культура
B.longum образует дополнительные антимутагенные вещества помимо имеющихся в
определенном количестве в исходной среде.
Рис. 1.
Таким образом, культура B.longum образует в процессе роста соединения, инактивирующие НММ
путем непосредственного (прямого) взаимодействия, т.е. действующие как десмутагены.
Максимальное накопление этих веществ имеет место в логарифмической фазе роста культуры.
Подобные результаты получены и Л.И. Воробъевой с соавторами /7, 8/. Ими показано, что
культуральные жидкости ряда бактерий проявляют антимутагенную активность в тесте Эймса. При
этом для Streptococcus faecalis и Propionibacterium schermanii найдено, что наибольшим защитным
эффектом культуральная жидкость обладает также в период экспоненциального роста.
Поскольку в опыте культивирование S.typhimurium проводилось в присутствии смеси НММ с
культуральной жидкостью, было возможным влияние последней на мутагенез внутри клетки
(биоантимутагенез). С целью выяснения этого вопроса схема была изменена: клетки
S.typhimurium, предварительно обработанные НММ, выращивали в присутствии 0,1, 0,2 или 0,3 мл
культуральной жидкости B. longum, взятой после 30 ч роста культуры.
Оказалось, что в этом случае культуральная жидкость B.longum снижает выход индуцированных
ревертантов пропорционально количеству взятой жидкости (табл. 2, рис. 2). Исходная питательная
среда на выход мутаций не влияла.
Таблица 2. Влияние культуральной жидкости B.longum на выход мутаций у штамма S. typhimurium
TA 100 в условиях предобработки НММ.
Количество антимутагена, мл
0,1
0,2
0,3
Средне число колоний
ревертантов на чашку
764 +/- 18
698 +/- 11
584 +/- 11
А х 100 %
15
23
37
Примечание. Спонатнный фон: 67 +/- 2 ревертанта. Мутаген (позитивный контроль, 40 мин
предобработка): 887 +/- 16 ревертантов. Стерильная питательная среда: 915 +/- 15 (0%)
ревертантов.
Можно предполагать, что антимутагенная активность культуральной жидкости B.longum в данном
случае связана с ее влиянием на процессы восстановления индуцированных мутагеном
повреждений ДНК клеток тестерного штамма, хотя для разрешения данного вопроса необходимо
обратиться к изучению ее (культуральной жидкости) биоантимутагенного действия на штаммах
S.typhimurium, различающихся по активности систем репарации.
Рисунок 2
Культуральная жидкость B.longum не обладала бактерицидностью в отношении S.typhimurium.
Отсюда следует, что наблюдаемое снижение количества НММ-индуцированных ревертантов в
опыте по сравнению с позитивным контролем при проведении эксперимента как по первой, так и
по второй схемам обусловлено именно антимутагенным эффектом, а не гибелью клеток тестштамма.
ЛИТЕРАТУРА
1. Rowland J. Gut microflora metabolism: what can microbes do? // Microb. Ecol. Health and Disease.
1999. V.11. № 2. P. 105.
2. Pulverer G., Lioe H., Beuth J. Microflora associated defence stimulating factors. // Scand. J.
Gastroenterol. 1997. V.32. Suppl. n.22. P.107.
3. Cummings J. H., Macfarlane G. T. Role of intestinal bacteria in nutrient metabolism. // Clin. Nutr. 1997.
V.16. № 1. P.3.
4. Шендеров Б. А. Нормальная микрофлора и некоторые вопросы микроэкологической
токсикологии. // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. Т. 32. № 3. С.5.
5. Порошенко Г. Г., Абилев С. К. Антропогенные мутагены и природные антимутагены. // Итоги
науки и техники. Серия общая генетика. М.: ВИНИТИ. 1988. Т. 12. 206 с.
6. Дубинин Н. П. Мутагены среды и наследственность человека. // Генетические последствия
загрязнения окружающей среды. М.: Наука. 1977. С. 5-13.
7. Воробьева Л. И., Чердынцева Т. А., Абилев С. К. Антимутагенное действие бактерий против
мутагенеза, индуцируемого 4-нитрохинолиноксидом у Salmonella typhimurium. // Микробиология.
1995. Т. 64. № 2. С. 228-233.
8. Воробьева Л.И., Чердынцева Т.А., Абилев С.К. Биоантимутагенное действие культуральной
жидкости Streptococcus faecalis против мутагенеза, индуцированного 2-нитрофлуореном у
Salmonella typhimurium TA 1538 и TA 98. // Там же. 1996. Т. 65. № 1. С. 79-83.
9. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической
активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. Методические указания.
М.: Наука. 1985. 34с.
10. Иванченко О.Б., Ильинская О.Н., Карамова Н.С. Антимутагенная активность ферментного
препарата "Биназа" в микробных тест-системах. // Микробиология. 1995. Т.64. № 2. С. 234-238.
SUMMARY
Using Ames test of Salmonella typhimurium TA 100 it was shown that culture liquid of Bifidobacterium
longum reduced NMU mutagenicity by means of direct chemical interaction (desmutagenesis).
Antimutagenic activity was maximum on logarithmic phase of culture growth. Besides, the culture liquid
was found to reduce the mutability of the testing strain preliminary treated with NMU
(bioantimutagenesis).