Автореферат Сиуновой Т.В.

На правах рукописи
СИУНОВА ТАТЬЯНА ВЯЧЕСЛАВОВНА
ПЛАЗМИДОСОДЕРЖАЩИЕ РИЗОСФЕРНЫЕ БАКТЕРИИ
РОДА PSEUDOMONAS, УСТОЙЧИВЫЕ К КОБАЛЬТУ/НИКЕЛЮ
И СТИМУЛИРУЮЩИЕ РОСТ РАСТЕНИЙ
Специальность 03.01.06 − Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
ПУЩИНО − 2011
Работа выполнена в лаборатории биологии плазмид Учреждения Российской
академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
Научный руководитель:
кандидат биологических наук,
Владимир Васильевич Кочетков
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
Валентина Николаевна Хмеленина
кандидат биологических наук,
Наталья Сергеевна Захарченко
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии
наук Институт физико-химических и
биологических проблем почвоведения,
Пущино
Защита диссертации состоится « 1 » декабря 2011 г. в 10 часов 00 мин.
на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Учреждении Российской
академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.
Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, проспект
Науки, 5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения
Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed.gov.ru и http://www.ibpm.ru
Автореферат разослан « » октября 2011 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
доктор биологических наук
Кулаковская Т.В.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы
Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами является одной из
наиболее актуальных экологических проблем, поскольку затрагивает не только
техногенные, но и природные ландшафты. По данным ВОЗ, никель и близкий
по свойствам кобальт признаны веществами 2 класса опасности и
канцерогенами. Территории, где осуществляется добыча или обработка
металлов являются зонами чрезвычайной экологической ситуации, для которых
характерно образование «биогеохимических провинций» с высоким
содержанием никеля в воздухе, воде, почве и местных продуктах питания. По
данным агрохимической службы Российской Федерации уровень загрязнения
сельскохозяйственных почв никелем является умеренным, однако почвы,
загрязненные никелем, по занимаемой площади превосходят почвы,
загрязненные свинцом, кадмием, цинком и другими высокотоксичными
металлами (Аристархов, Харитонова, 2002). Основными источниками
загрязнения сельскохозяйственных почв никелем является неконтролируемое
применение минеральных удобрений, а также осадков промышленных сточных
вод, используемых в качестве мелиорантов (Аристархов, Харитонова, 2002).
В последнее десятилетие у производителей сельскохозяйственной
продукции возрос интерес к применению биопрепаратов, разрабатываемых на
основе ризосферных бактерий группы PGPR (Plant Growth Promoting
Rhizobacteria) для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенов.
Имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют о том, что
инокуляция растений ризосферными бактериями увеличивает риск
аккумуляции металлов в растениях, выращиваемых на загрязненных почвах
(Kamnev and van der Lelie, 2000; Zaidi et al., 2006; Белимов, 2008; Khan et al.,
2009; Белимов, Тихонович, 2011). Устойчивые к тяжелым металлам
ризосферные бактерии являются основой для разработки нового поколения
биопрепаратов, предназначенных для стимуляции роста и защиты растений, а
также для биоремедиации загрязненных почв. В связи с этим представляется
целесообразным
исследовать
ризосферные
бактерии,
обладающие
разнообразными механизмами устойчивости к тяжелым металлам, поскольку
бактерии способны оказывать различное влияние на аккумуляцию металлов в
растениях. Одним из эффективных механизмов, обеспечивающих высокий
уровень устойчивости к никелю/кобальту у бактерий, является активный
экспорт токсичных катионов из клетки в окружающую среду. Роль данного
механизма устойчивости исследовалась только в штаммах эндофитных
бактерий в фиторемедиационных экспериментах с субстратами, загрязненными
никелем (Lodewyckx et al., 2001) или в комплексе с хлорированными
ксенобиотиками (Weyens et al., 2010; 2011). Однако исследованные эндофитные
штаммы не обладали свойствами, характерными для бактерий группы PGPR. К
настоящему времени ремедиационный потенциал аналогичных генетических
систем устойчивости в ризосферных бактериях не изучен. В связи с этим
актуальным является поиск природных или создание рекомбинантных штаммов
3
ризосферных бактерий, обладающих системами экспорта никеля и других
металлов. При этом следует учитывать способность бактерий к биосорбции и
иммобилизации металлов, что является важным фактором, регулирующим
поступление тяжелых металлов в растения. Исследование ризосферных
бактерий, обладающих различными механизмами устойчивости к тяжелым
металлам, позволит понять принципы их взаимодействия с растениями и более
эффективно реализовать генетический потенциал бактерий при разработке
новых биотехнологий защиты растений и фиторемедиации почв, загрязненных
как тяжелыми металлами, так и в комплексе с органическими токсикантами.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось получение устойчивых к
никелю/кобальту штаммов PGPR Pseudomonas и исследование их
взаимодействия с растениями в условиях загрязнения тяжелыми металлами.
В соответствии с данной целью решались следующие задачи:
1. Из различных экологических ниш выделить и идентифицировать бактерии,
содержащие плазмиды устойчивости к никелю (кобальту, цинку, кадмию), и
определить соответствующие детерминанты устойчивости.
2. Получить на основе различных видов PGPR Pseudomonas и выделенных
плазмид новые штаммы, устойчивые к кобальту/никелю. Исследовать
физиолого-биохимические особенности трансконьюгантов.
3. Исследовать у полученных ризосферных штаммов
аккумуляции металлов из среды культивирования.
особенности
4. Исследовать влияние устойчивых к кобальту/никелю ризосферных штаммов
на аккумуляцию никеля в растениях и на параметры роста растений в
вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем.
5. Сконструировать
штаммы
ризосферных
бактерий,
содержащие
совместимые плазмиды – устойчивости к кобальту/никелю и биодеградации
полиароматических углеводородов (ПАУ). Исследовать у полученных
штаммов эффективность биодеградации нафталина в присутствии никеля в
среде культивирования и способность стимулировать рост растений в
условиях, моделирующих смешанное загрязнение ПАУ (включая нафталин
и фенантрен) и никелем.
Научная новизна работы
Впервые у бактерий рода Comamonas обнаружена плазмида устойчивости
к тяжелым металлам. Установлено, что плазмида pBS501 содержит
детерминанту устойчивости к кобальту/никелю, гомологичную cnr оперону
плазмиды pMOL28 из Cupriavidus metallidurans CH34 . Впервые показано, что
экспрессия системы устойчивости cnr-типа из Comamonas testosteroni в
штаммах PGPR Pseudomonas обеспечивает их выживаемость при высоких
концентрациях никеля при сохранении комплекса свойств, обеспечивающих
стимуляцию роста растений. Сконструированы штаммы PGPR Pseudomonas,
4
содержащие природные плазмиды биодеградации полиароматических
углеводородов (ПАУ) и устойчивости к кобальту/никелю. Показана
способность штаммов к полной утилизации модельного ПАУ в присутствии
100 мкМ никеля при периодическом культивировании.
Научно-практическая значимость работы
Получен устойчивый к кобальту/никелю штамм Pseudomonas aureofaciens
BS1393(pBS501), аккумулирующий из среды до 17% кобальта, который может
быть использован в биотехнологиях очистки промышленных сточных вод от
солей кобальта/никеля. Штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393(pBS501),
стимулирующий рост ячменя и препятствующий аккумуляции никеля в
растительной биомассе, можно использовать при разработке биопрепарата для
защиты растений, выращиваемых на почвах с загрязнением никелем до 5 ПДК.
Полученные устойчивые к никелю/кобальту ризосферные штаммыдеструкторы ПАУ могут использоваться при разработке технологий очистки
промышленных сточных вод, а также в качестве нового поколения
биопрепаратов для защиты/стимуляции роста растений или биоремедиации
почв со смешанным загрязнением нефтепродуктами, ПАУ и солями
никеля/кобальта. Штамм P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) депонирован
во Всероссийской коллекции микроорганизмов и подтвержден патентом РФ на
изобретение №2396339.
Апробация материалов работы
Основные результаты диссертации были представлены на 9 конференциях:
«Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды»,
2001, Пущино; «Сельскохозяйственная микробиология в ХIХ−ХХI веках»,
Всероссийская конференция, 14−19 июня 2001, Санкт-Петербург;
Всероссийская научно-практическая конференция «Биотехнология 2003»,
22−26 сентября 2003 г., Сочи; 1-я Международная геоэкологическая
конференция. Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды
тяжелыми металлами, 30−31 октября 2003 г., Тула; «Биотехнология-2005», 8-й
международный семинар-презентация инновационных научно-технических
проектов, научно-практическая конференция, 18−19 ноября 2005, Наукоград
Пущино; 4th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver,
Colorado; 11 International symposium on Microbial Ecology – ISME-11, Vienna,
Austria, August 20−25, 2006; 2nd International Conference «Rhizosphere», August
25−31, 2007, Montpellier, France; 4th International Phytoremediation Conference,
September, 2007, Denver, Colorado; International Symposium on Applied Molecular
Microbiology in Oil Systems (ISMOS), September 16−18, 2007, Colchester,
England.
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 6 статей,
2 главы в книгах, 9 тезисов, 1 патент РФ.
5
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы»,
«Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов»,
«Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на
157 страницах машинописного текста, включает 29 таблиц и 22 рисунка.
Библиография насчитывает 231 наименование, из них 47 отечественных и
184 зарубежные работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы
Устойчивые к тяжелым металлам бактерии выделяли из ризосферы
растений, образцов почвы и промышленных сточных вод. В работе также
использовали
штаммы
Comamonas
из
Всероссийской
коллекции
микроорганизмов ИБФМ РАН (Пущино), ризосферные штаммы Pseudomonas и
фитопатогенные грибы коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН
(Пущино).
Культивирование бактерий проводили при 28°С на среде LB (Маниатис
и др., 1984) и трис-минеральной среде (ТМС) (Мergeay et al., 1985). В качестве
источника углерода и энергии добавляли глюкозу, глютамат натрия или
нафталин. Соли металлов: CoCl2  6H2O, NiCl2  6H2O, CdSO4  8H2O, ZnSО4 
7H2O, K2CrO4 добавляли в среду до конечных концентраций 0.005−10 мМ.
Конъюгационный перенос плазмид осуществляли согласно (Dunn and
Gunsalus, 1973). Трансконъюгантные штаммы Pseudomonas отбирали на ТМС,
содержащей 0.5 мМ кобальта или 1−2 мМ никеля.
Выделение плазмидной ДНК осуществляли методом щелочного лизиса
(Birnboim and Doly, 1979).
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе фирмы
«Hybide» (Великобритания) в 20−50 мкл смеси по протоколу фирмыпроизводителя «Fermentas» (Литва). В ПЦР использовали разработанные нами
праймеры, фланкирующие структурные гены оперона устойчивости к
кобальту/никелю cnr плазмиды pMOL28 из C. metallidurans CH34: cnrCB Pf2350
(5'tgaaacaggtgatctcctcgttcc3') и Pr4850 (5' tcggcacagattctgtcaggcgt3'), cnrA Pf4800
(5'gtggactcgcaaactcatgcttcc3') и Pr8050 (5'ccgctgagaatgctctcgatcat3'). Использовали
протоколы проведения ПЦР: для амплификации генов с плазмиды pMOL28
(контроль) : 1 цикл − 96С 1 мин; 25 циклов − 95С 30 с, 55С 40 с, 72С 2 мин
40 с; 1 цикл − 72С 3 мин; для амплификации генов с плазмиды pBS501: 1 цикл
− 96С 1 мин; 2 цикла − 96С 40 с, 42С 40 с, 72С 2 мин 40 с; 25 циклов − 95С
30 с, 55С 40 с, 72С 2 мин 40 с; 1 цикл − 72С 3 мин.
Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции EcoRI, HindIII, BamHI,
PstI,
SmaI
проводили
согласно
протоколу,
рекомендованному
фирмой-производителем («Fermentas», Литва).
Включение радиоактивной метки в рестрикционные фрагменты ДНК
осуществляли с помощью DecalabelTM DNA labeling kit («Fermentas», Литва) по
6
протоколу фирмы-изготовителя. В качестве зондов использовали [32P]-меченые
фрагменты клонированных оперонов устойчивости czcCBAD, cnrXYHCBA,
nccCB (плазмиды любезно предоставлены доктором Д. Нисом (D.H. Nies,
Institute of Microbiology, Halle, Germany). Мечение ампликонов осуществляли
во время ПЦР, добавляя в реакционную смесь [αP32]dATP. ДНК-ДНК
гибридизацию проводили по методике, описанной (Sambrook et al., 2001).
Для амплификации и секвенирования фрагментов гена 16S рРНК
использовали универсальные праймеры (Lane, (1991). ПЦР-фрагменты
секвенировали на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter,
USA), используя набор реагентов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit
(Beckman Coulter, USA). Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК
анализировали с помощью пакетов программ BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov) и
CLUSTAL
W
(http://www.genebee.msu.su/clustal).
Построение
филогенетического дерева производили методом neighbor-joining (NEIGHBOR),
реализованным в пакете программ TREECON (Van de Peer et al., 1994).
Солюбилизацию поверхностных белков проводили 5 М хлоридом
лития согласно методу (Lortal et al., 1992) с модификациями. Электрофорез
белков проводили согласно (Laemmli, 1970).
Концентрацию кобальта в бактериальных клетках, выращенных в
присутствии 0.25−2 мМ хлорида кобальта, определяли с помощью пламенной
атомно-адсорбционной спектрофотометрии на приборе AAS-5100/Zeeman
(Perkin-Elmer).
Ультратонкие срезы клеток бактерий готовили согласно методике
(Reynolds, 1963) и просматривали в электронном микроскопе JEM 100B
(«JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ, а негативно
контрастированные клетки – при 60 кВ.
Удельные активности ферментов нафталиндиоксигеназы (Dua and
Meera, 1981), салицилатгидроксилазы (Shamsuzzaman and Barnsley, 1974),
катехол-2,3-оксигеназы (Hegeman, 1966), катехол-1,2-оксигеназы (Feist and
Hegeman, 1969) определяли в бесклеточных экстрактах клеток, выращенных в
ТМС на нафталине (1 г/л) в присутствии 100 мкМ никеля и без металла, на
UV-160А спектрофотометре (Shimadzu, Япония). Концентрацию белка
определяли спектрофотометрически (Kalb and Bernlohr, 1977).
Концентрацию нафталина в среде определяли с помощью ВЭЖХ на
колонке с обращенной фазой Spherisorb ODS-2 C18, Supelco (США). Разделение
проводилось в градиенте: 1% уксусная кислота: (0−100%) метанол в течение
10 мин. Процент деградации нафталина определяли, учитывая его естественное
испарение в контроле – среда с нафталином (1 г/л) без бактерий.
Вегетационные эксперименты, моделирующие загрязнение никелем,
проводили в течение 4 недель на станции искусственного климата «Биотрон»
(ФИБХ). Семена ярового ячменя сорта «Зазерский 85» инокулировали
суспензией (108 клеток/мл) штаммов P. aureofaciens BS1393 и P. aureofaciens
7
BS1393(pBS501) и выращивали в сосудах, содержащих 400 г субстрата (торф :
песок, 3 : 1 (pH 6.2)). Хлорид никеля вносили в концентрациях 235, 470 и
940 мг/кг. Через 2 недели определяли титр бактерий в ризосфере (КОЕ/см
корня), в конце эксперимента массу растений и концентрацию никеля в корнях
и надземной части растения. Эксперименты проводили в 8-кратной
повторности.
Концентрацию никеля в растительных образцах определяли
спектрофотометрически (СФ-26, =470 нм) с диметилглиоксимом в
присутствии окислителя йодида калия согласно методике (Алимарин и Иванов,
1987). Концентрацию никеля рассчитывали в мг/кг сухой массы растений.
Вегетационные
эксперименты,
моделирующие
смешанное
загрязнение ПАУ и никелем проводили в течение 4 недель с естественным
световым и температурным режимами. Семена сорго сорта «пищевое» и ячменя
сорта «Зазерский 85» инокулировали суспензией (108 клеток/мл) штаммовдеструкторов ПАУ P. aureofaciens BS1393(pBS216) и P. aureofaciens
BS1393(pBS216,pBS501) и выращивали в сосудах, содержащих 400 г серой
лесной почвы (рН 7.05). В качестве загрязнителей в почву вносили нафталин
(1 г/кг) в варианте с сорго или смесь ПАУ (нафталин (1 г/кг) и фенантрен
(0.2 г/кг)) в варианте с ячменем. Почву увлажняли раствором сульфата никеля
(конечная концентрация 400 мг/кг). Через 4 недели определяли титр
ризосферных бактерий и массу растений. Эксперименты проводились в
3- кратной повторности.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выделение и характеристика бактерий, устойчивых к никелю, кобальту,
цинку, кадмию
На первом этапе работы проводили поиск бактерий, устойчивых к
никелю, кобальту, цинку и кадмию, в ризосфере (1) дикорастущих растений
заповедника (г. Владивосток), (2) культурных злаков, выращиваемых на
сельскохозяйственной почве (г. Краснодар) и (3) диких злаков, собранных на
заводской территории автозавода «СеАЗ» (г. Серпухов). Оказалось, что у
ризосферных псевдомонад уровень устойчивости к никелю и цинку не
превышал 2−3 мМ, кобальту − 0.5 мМ, кадмию − 0.2 мМ (кроме бактерий из
3 группы, которые были устойчивы к 2 мМ кадмия). Поэтому поиск
высокорезистентных бактерий был продолжен в техногенно-загрязненных
источниках: в почвах с территории нефтеперерабатывающего завода
(г. Нижнекамск) и пробах промышленных сточных вод «Горьковского
металлургического завода» (г. Нижний Новгород). Только в последних пробах
были обнаружены бактерии, устойчивые к высоким концентрациям
никеля/кобальта (3−8 мМ), цинка (3−5 мМ) и кадмия (2−3 мМ) (табл. 1).
Последующая задача состояла в обнаружении в этих бактериях плазмид,
содержащих функциональные детерминанты устойчивости к тяжелым
металлам, для переноса в известные штаммы PGPR Pseudomonas. Одним из
эффективных механизмов, обеспечивающих высокий уровень устойчивости у
8
бактерий, является быстрый экспорт тяжелых металлов с помощью мембранной
помпы. Известны три типа оперонов, которые детерминируют этот механизм
устойчивости: cnrXYHCBAT (Cor/Nir), czcCBADRSNI (Cor/Znr/Cdr) (Mergeay et
al., 1985) и nccCBAYXHN (Nir/Cor/Cdr) (Schmidt and Schlegel, 1994). Фрагменты
этих оперонов были использованы в качестве зондов для поиска гомологичных
систем среди отобранных 42 штаммов со средним уровнем устойчивости к
нескольким металлам. В табл. 1 представлены результаты положительной
гибридизации, выявленные у 13 штаммов.
Таблица 1. Результаты гибридизации ДНК колоний выделенных устойчивых
штаммов с зондами czcCBAD, cnrXYHCBAT и ncсСB
Штамм
Фенотип
устойчивости 4
Гибридизация с зондами
czc
Ризосфера диких злаков («СеАЗ»)
1
Pseudomonas sp. R1
Ni(1) Zn(3) Cd(2)
+
Pseudomonas sp. R2
Ni(1) Zn (3) Cd(1)
+
Почва
Pseudomonas sp. S11
Ni(2) Zn(5) Cd(2)
±
Pseudomonas sp. S13
Ni(3) Zn(3) Cd(2)
±
Pseudomonas sp. S16
Zn(5) Cd(2)
±
Сточные воды
2
н.о. W27 (пл. 90 т.п.н.) Co(8) Ni(8) Zn(1.5)
−
3
W28 (пл. 65 т.п.н.)
−
Co(8) Ni(8) Zn(2)
н.о. W29 (пл.10 т.п.н.) Co(3) Ni(5) Zn(2)
−
н.о. W31
Co(5) Zn(3) Cd(3)
+
н.о. W32
Co(3) Zn(3) Cd(3)
+
н.о. W33
Co(3) Zn(5) Cd(3)
+
н.о. W37 (пл. 5 т.п.н.)
−
Co(5) Ni(5) Cd(2)
н.о. W38 (пл. 5 т.п.н.)
Co(5) Ni(3) Cd(2)
−
Контроли
E. coli EC246 (cnrXYHCBA:pSUP202)
−
E. coli EC115 (czcCBAD:pT7-5)
+
E. coli EC767 (nccCB:pVDZ'2)
−
cnr
ncс
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
+
+
+
−
−
−
−
−
±
±
±
−
−
−
+
+
+
−
−
−
−
+
Примечания: 1 На основании морфо-физиологических признаков изолят отнесен
к Pseudomonas sp.; 2 н.о. – не определен до рода; 3 изолят W28 (лабораторный
номер BS501(pBS501)) в дальнейшем идентифицирован как Comamonas
testosteroni. Штаммы, выделенные из ризосферы (R), почвы (S), воды (W).
4
В скобках указана максимальная концентрация металла (мМ) в среде LB, при
которой наблюдается рост штамма. (−) Отсутствие сигнала, (+) сильный,
(±) слабый сигналы гибридизации.
Как видно из табл. 1, у пяти ризосферных и почвенных псевдомонад
выявлена гомология с зондом czcCBAD, однако эти штаммы были
9
чувствительны к никелю и не содержали плазмид. У восьми штаммов,
выделенных из сточной воды, выявлены сигналы гибридизации с зондами
czcCBAD (3 штамма), ncсСB (2 штамма) и одновременно с двумя зондами
cnrXYHCBAT/ncсСB (3 штамма). Только в этой группе бактерий обнаружены
5 плазмидосодержащих штаммов.
2. Характеристика детерминанты устойчивости к кобальту/никелю в
штамме Comamonas testosteroni BS501(pBS501)
2.1 Плазмидная локализация. Наибольший интерес для дальнейших
исследований представлял выделенный из пробы сточной воды штамм W28,
(лабораторный номер BS501(pBS501)) устойчивый к 5 мМ кобальта, 5 мМ
никеля и 2 мМ цинка. В штамме обнаружена плазмида pBS501 размером около
65 т.п.н. (рис. 1, дорожка 1), которая передавалась при конъюгации в
чувствительные штаммы P. putida BS394 и W340 с частотой 10–6 и
обеспечивала устойчивость только к 2 мМ кобальта и никеля. Из данных
Таблицы 1 видно, что при гибридизации ДНК колоний штамма BS501(pBS501)
были выявлены 2 сигнала – сильный с зондом cnr и слабый с зондом ncc.
Однако, гибридизация EcoRI-, HindIII- и SalI-фрагментов рестрикции ДНК
pBS501 с этими зондами выявила только один положительный сигнал с
опероном cnrXYHCBA, локализованным на плазмиде pMOL28.
1
2
3
4
5
Рис. 1. Электрофорез плазмидных ДНК из
штаммов: (1) W28 (BS501(pBS501))
(65 т.п.н.), (2) W29 (90 т.п.н.); маркерные
плазмиды: (3) pMG18 (102 т.п.н.), (4)
pBS216 (85 т.п.н.), (5) pULB113 (68 т.п.н.).
2.2 Идентификация штамма BS501(pBS501). До настоящего времени
обнаружены только три плазмиды, содержащие функциональные детерминанты
устойчивости: pMOL28 (cnr) и pMOL30 (czc) в Cupriavidus metallidurans CH34
(Mergeay et al., 1985) и pTOM9 (ncc) в C. metallidurans 31a (Schmidt and Schlegel,
1994). Плазмида pBS501 (65 т.п.н.) в отличие от pMOL28 (180 т.п.н.),
значительно меньшего размера и не детерминирует устойчивость к хромату и
ртути.
Поэтому
несомненный
интерес
представляло
выяснение
таксономического положения штамма BS501(pBS501). По совокупности
морфологических, физиолого-биохимических признаков и по результатам
сравнительного анализа последовательности гена 16S рибосомальной РНК
штамм BS501(pBS501) отнесен к роду Comamonas (класс Betaproteobacteria,
порядок Burkholderiales, семейство Comamonadaceae), и идентифицирован как
Comamonas testosteroni (рис. 2). В бактериях рода Comamonas описаны
плазмиды, несущие гены биодеградации толуолсульфоната, сульфобензоата,
хлоро- и нитробензенов, фталатов и других токсичных ксенобиотиков (Tralau et
al., 2001; Wu, et al., 2006). Хотя в геномах бактерий порядка Burkholderiales
выявлены последовательности, гомологичные cnr и ncc (Stoppel and Schlegel,
1995), их исследование не проводилось, и плазмиды, контролирующие
10
устойчивость к двухвалентным катионам, в Comamonas до настоящего времени
не были обнаружены.
1000
993
1000
289
Burkholderia cepacia "ATCC25416" (AF097530)
Pandoraea apista "LMG 16407" (AF139173)
Ralstonia pickettii "ATCC 27512" (X67042)
1000
Ralstonia solanacearum "ATCC 11696"(X67036)
997
Ralstonia mannitolilytica "LMG6866" (AJ270258)
Cupriavidus campinensis "WS2" (AF312020)
1000
Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha) "DS185" (Y10825)
Cupriavidus gilardii (AF076645)
810
1000
451
Cupriavidus pauculus "LMG 3413" (AF085226)
912
"Cupriavidus metallidurans CH34" (Y10824)
994
Cupriavidus oxalaticus "DSM 1105" (AF155567)
502
Cupriavidus necator ATCC 17697 (M32021)
340
Cupriavidus basilensis "ER121" (AF312021)
1000
Cupriavidus basilensis "RK1" (AJ002302)
852
Cupriavidus basilensis "DSM 11853T"(AF312022)
Comamonas acidovorans "IAM 12409T"(AB021417)
1000
"Delftia tsuruhatensis" "T7" (AB075017)
"Comamonas koreensis" "KCTC 12005" (AF275377)
1000
"Comamonas sp." "12022" (AF078773)
"Comamonas nitrativorans" "23310" (AJ251577)
850
"Comamonas aquatica" LMG 2370T" (AJ430344)
569
"Comamonas terrigena" "IMI 359870" (AF078772)
482
"Comamonas kerstersii" LMG 3475T (AJ430347)
"Comamonas testosteroni" "SMCC B329"AF336312
1000
Comamonas testosteroni SMCC B0589 (AF501880)
"Comamonas testosteroni" "WDL7" (AF538933)
997
"Comamonas testosteroni" "SB4" (AJ606336)
999
"Comamonas testosteroni" (AY653219)
Comamonas testosterone "NCIMB 10643" (AY247415)
685
"Comamonas testosteroni" "SB3" (AJ606335)
"Comamonas testosteroni"MBIC3841" (AB007997)
545
"Comamonas testosteroni" BS501(pBS501) (EF409944)
"Comamonas testosteroni" "Q10" (AF519533)
Comamonas testosteroni ATCC 11996 (M11224)
655
504 "Comamonas testosteroni" "MBIC3840" (AB007996)
526
"Comamonas testosteroni" "AT3" (AF532871)
568
"Comamonas testosteroni" "KF704" (AB109750)
601
670 "Comamonas testosteroni" "NCIMB 9872" (AF172067)
0.01
"Comamonas testosteroni" "KF712" (AB109751)
Рис. 2. Положение штамма Comamonas testosteroni BS501(pBS501) на
филогенетическом дереве порядка Burkholderiales (класс Betaproteobacteria) на
основании последовательности гена 16S рРНК. Масштаб (0.01) соответствует
1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов. Статистическую
достоверность ветвления оценивали с помощью «bootstrap-анализа» 1000
альтернативных деревьев, используя соответствующую функцию программы
TREECON.
11
Праймеры, фланкирующие структурные гены cnrCB и cnrA оперона cnr
плазмиды pMOL28, были использованы в ПЦР с плазмидной ДНК pBS501.
Различия, обнаруженные в спектре и размерах ампликонов, свидетельствуют о
том, что исследуемая детерминанта отличается от оперона cnr (рис. 3а,
дорожки 4, 5). В то же время, положительная гибридизация с зондами cnrCB
(рис. 3б, дорожка 4) и cnrA (рис. 3в, дорожка 5) указывает на их значительную
гомологию.
(а)
2 3 4 5
1
тпн
1
2
(б)
3 4
5
1
(в)
2 3 4 5
23
4.3
2.3
2.0
0.5
Рис. 3. Выявление гомологии детерминанты устойчивости к кобальту/никелю
плазмиды pBS501 с 32Р-меченными ампликонами cnrCB (б) и cnrА (в).
(а) Электрофореграмма: 1 − HindIII; 2 и 3 − ампликоны cnrCB и cnrА,
соответственно, с плазмиды cnrXYHCBA:pSUP202 («+» контроли); 4 и 5 −
ампликоны «cnrCB» и «cnrА», соответственно, с плазмиды pBS501.
2.3 Индукция устойчивости к кобальту/никелю. Экспрессия оперона
cnr в C. metallidurans CH34 индуцируется катионами кобальта и никеля
(Schmidt and Schlegel, 1994). Предварительное выращивание инокулята штамма
C. testosteroni BS501(pBS501) при 10−200 мкМ никеля или кобальта с первых
часов обеспечивало быстрый рост культуры в среде, содержащей 2 мМ
кобальта или никеля (рис. 4, кривые 1, 2), тогда как в вариантах без индукции
наблюдалась продолжительная лаг-фаза (4−6 ч) (рис. 4, кривая 3). Из рисунка
видно, что катионы цинка и кадмия не являются индукторами устойчивости
(рис. 4, кривые 4 и 5).
0,30
ОП
1
2
0,25
Рис. 4. Влияние индукции системы
устойчивости катионами тяжелых
металлов на рост C. testosteroni
BS501(pBS501)
в
присутствии
2 мМ никеля. Инокулят выращивали
при: (1) 20 мкМ Ni, (2) 50 мкМ Со,
(4) 200 мкМ Zn, (5) 50 мкМ Cd,
(3) без индукции.
0,20
3−5
0,15
0,10
0,05
часы
0,00
0
1
2
3
4
5
6
12
2.4 Устойчивость цитоплазматической мембраны клеток исходного
штамма C. testosteroni BS501(pBS501) и трансконъюганта P. putida
BS394(pBS501) к воздействию кобальта
С помощью метода электроориентационной спектроскопии (ЭОС)
(Мирошников и др., 1986) показано, что цитоплазматическая мембрана (ЦМ)
клеток C. testosteroni
BS501(pBS501) и трансконъюганта
P. putida
BS394(pBS501), инкубированных в присутствии 50−200 мкМ кобальта,
подвергается лишь незначительному повреждению. Так, при 100 мкМ кобальта
для клеток C. testosteroni BS501(pBS501) и P. putida BS394(pBS501) величина
/к, характеризующая степень повреждения ЦМ, составила −0.130.05 и
−0.150.05, соответственно, тогда как для чувствительного штамма P. putida
BS394 /к = −0.480.2. После мягкой обработки клеток штамма C. testosteroni
BS501(pBS501) трипсином степень повреждения его ЦМ при воздействии 100
мкМ кобальта увеличивалась до −0.540.1, что может указывать на наличие
защитных белков на поверхности клеток C. testosteroni BS501(pBS501). С
поверхности клеток штаммов C. testosteroni BS501(pBS501) и P. putida
BS394(pBS501) 5 М хлоридом лития солюбилизировались белки массой около
49, 40 и 32 кДа, которые отсутствовали у чувствительного штамма P. putida
BS394 (рис. 5). Обнаруженные белки оказались близки по массе белкам,
кодируемым сnr-опероном из C. metallidurans CH34: CnrC (44 кДа), CnrB
(40 кДа) и CnrT (37 кДа) (Liesegang et al., 1993).
1
2
3
4
67
45
25
49
40
32
Рис 5. Электрофореграмма белков,
солюбилизированных 5 М хлоридом
лития с поверхности клеток устойчивых
штаммов, в 9% ПААГ-ДСН: (1) белковые
маркеры (кДа), (2) P. putida BS394,
(3) C. testosteroni
BS501(pBS501),
(4)
P. putida BS394(pBS501).
18
Измерения ЭОС клеток проводились при 20С через 15 мин после
внесения в бактериальную суспензию кобальта. Поэтому обнаруженные
поверхностные белки могли участвовать в процессах экспорта катионов
тяжелых металлов из клеток исследуемых устойчивых бактерий, однако не
исключено также их участие в биосорбции и иммобилизации металлов.
3. Характеристика штаммов PGPR Pseudomonas, содержащих плазмиду
pBS501
3.1 Получение устойчивых вариантов PGPR. Плазмида pBS501 с
помощью конъюгации была перенесена в ризосферные штаммы P. aureofaciens
BS1393, P. fluorescens 38a и P. chlororaphis PCL1391. С частотой 10−4−10−5
получены трансконъюганты, в которых плазмида стабильно сохраняется в
13
неселективных условиях, как минимум, в течение 10 пассажей и обеспечивает
повышение устойчивости к кобальту (0.5−2.0 мМ) от 5 до 20 раз, и никелю
(1.0−2.5 мМ) от 2 до 10 раз (табл. 2).
Таблица 2. Уровни устойчивости к тяжелым металлам штаммов Pseudomonas и
Comamonas в трис-минеральной среде с глютаматом натрия или глюкозой
Максимальный уровень устойчивости (мМ)
Штаммы
P. aureofaciens BS1393
P. aureofaciens BS1393(pBS501)
P. chlororaphis PCL1391
P. chlororaphis PCL1391(pBS501)
P. fluorescens 38a
P. fluorescens 38a(pBS501)
C. testosteroni B-1241
C. testosteroni B-1241(pBS501)
C. acidovorans B-1251
C. acidovorans B-1251(pBS501)
C. testosteroni BS501(pBS501)
Co
0.1
2.0
0.05
0.5
0.05
0.5
0.5
5.0
1.0
5.0
5.0
Ni
1.0
2.0
0.15
2.0
0.1
1.0
1.0
5.0
2.0
5.0
5.0
Zn
1.5
1.5
2.5
2.5
2.0
2.0
1.0
1.0
1.0
1.5
1.0
Cd
0.2
0.2
0.2
0.2
0.1
0.1
0.1
0.1
0.2
0.2
0.1
3.2 Супрессия фитопатогенов и продукция индольных соединений
ризосферными штаммами в присутствии кобальта/никеля. Исходные
ризосферные штаммы являются продуцентами фитогормона индолил-3уксусной кислоты (ИУК) и противогрибных антибиотиков – феназинов
(P. aureofaciens
BS1393),
пиолютеорина
(P.
fluorescens
38a)
и
феназинкарбоксамида (P. chlororaphis PCL1391). Известно о положительном
влиянии микромолярных концентраций тяжелых металлов на синтез ИУК
(Belimov et al., 2000, Белимов, 2008) и некоторых антибиотиков (Slininger and
Jackson, 1992; Chin-A-Woeng et al., 1998 Duffy and Defago, 1999). В настоящей
работе показано, что в культуральной среде устойчивых штаммов
P. aureofaciens BS1393(pBS501) и P. chlororaphis PCL1391(pBS501),
выращенных в присутствии 2 мМ никеля или кобальта, концентрация
индольных соединений (1.6−2.0 мкг/мг биомассы) в 1.5−2 раза выше по
сравнению с чувствительными вариантами.
В ходе работы выявлено, что большинство видов фитопатогенных грибов
родов Fusarium, Rhizoctonia или Geumanomyces обладает более высоким
уровнем устойчивости к кобальту и никелю, чем исследуемые ризосферные
бактерии. Однако ризосферные штаммы, содержащие плазмиду pBS501, при
совместном
выращивании
с
различными
видами
перечисленных
фитопатогенов, подавляли рост грибов в присутствии 2 мМ кобальта или
никеля, в отличие от исходных штаммов. На рис. 6 показан пример супрессии
Fusarium oxysporum устойчивыми штаммами P. aureofaciens BS1393(pBS501),
P. fluorescens 38a(pBS501) и P. chlororaphis PCL1391(pBS501) (1−3) при
совместном выращивании в присутствии 2 мМ никеля. В то же время
14
чувствительные варианты BS1393 (4) и 38a (5) слабее подавляли рост гриба, а
штамм PCL1391 (6) зарастал грибным мицелием.
6
Рис. 6. Супрессия Fusarium oxysporum
ризосферными
штаммами
при
совместном
выращивании
в
присутствии
2
мМ
никеля:
(1) P. aureofaciens
BS1393(pBS501),
(2) P. fluorescens
38a(pBS501),
(3) P. chlororaphis PCL1391(pBS501);
(4) BS1393, (5) 38a, (6) PCL1391.
1
Fusarium
oxysporum
2
5
4
3
3.3 Аккумуляция кобальта устойчивыми штаммами. На основе
штамма P. aureofaciens BS1393 разработан и широко применяется биопрепарат
для защиты и стимуляции роста растений «Псевдобактерин-2» (Боронин,
Кочетков, 1995). В связи с загрязнением почв тяжелыми металлами необходимо
было выяснить возможность использования устойчивого варианта
BS1393(pBS501) на загрязненных почвах. Было показано, что при выращивании
P. aureofaciens BS1393(pBS501) и C. testosteroni BS501(pBS501) в среде,
содержащей от 0.25 до 2 мМ хлорида кобальта, в клетках штаммов
увеличивалось содержание кобальта (табл. 3).
Таблица 3. Аккумуляция кобальта штаммами C. testosteroni BS501(pBS501) и
P. aureofaciens BS1393(pBS501)
Концентрация
Со2+ в среде,
мМ
(мкг Со/мл)*
Со,
мкг/мг
сухой
биомассы
Сухая
биомасса,
мг/мл
культуры
%
Со,
Сухая
%
акку
мкг/мг
биомасса, акку
муля
сухой
мг/мл
муля
ции биомассы культуры ции
C. testosteroni BS501(pBS501)
0.25 (14.7)*
0.5 (29.4)
1.0 (58.9)
1.5 (88.4)
2.0 (117.8)
0.11±0.02
0.34±0.03
0.51±0.01
0.91±0.01
0.86±0.03
4.0±0.1
3.8±0.2
3.8±0.2
3.6±0.1
3.5±0.1
3
4
3
3
2
P. aureofaciens
BS1393(pBS501)
0.69±0.03
3.7±0.4
1.49±0.01
3.5±0.3
2.34±0.02
3.0±0.1
3.14±0.02
2.5±0.1
3.54±0.01
2.5±0.2
17
17
12
9
7
Из данных табл. 3 видно, что ризосферный штамм P. aureofaciens
BS1393(pBS501) аккумулировал в 3−6 раз больше металла по сравнению со
штаммом C. testosteroni BS501(pBS501). При концентрации кобальта в среде до
0.5 мМ через 18 часов роста в биомассе ризосферного штамма наблюдалась
максимальная аккумуляция − до 17%. При субингибирующей концентрации
металла в среде (2 мМ) его аккумуляция понижалась до 7%. Штамм
C. testosteroni BS501(pBS501), имеющий более высокий уровень устойчивости
(5 мМ), аккумулировал не более 4%.
15
3.4 Локализация кобальта в клетках. На поверхности клеток
устойчивых штаммов P. aureofaciens BS1393(pBS501) (рис. 7а) и C. testosteroni
BS501(pBS501) (рис. 7б), выращенных в присутствии кобальта, обнаружены
электронно-плотные гранулы и кристаллиты, соответственно.
(а)
(б)
кристаллиты
гранулы
(в)
(г)
гранулы
Рис. 7. Ультратонкие срезы клеток P. aureofaciens BS1393(pBS501) (а), C.
testosteroni BS501(pBS501) (б), P. aureofaciens BS1393 (в), выращенных в
присутствии 2 мМ кобальта, и P. aureofaciens BS1393(pBS501) (г), выращенных
в среде без кобальта. Стрелками указаны электронно-плотные структуры в виде
гранул (а, в) и кристаллитов (б). Шкала 0.5 мкм.
16
В чувствительном штамме P. aureofaciens BS1393 гранулы были обнаружены
не только на поверхности клеток, но также в цитоплазме и периплазматическом
пространстве клеток (рис. 7в), что может объясняться отсутствием у данного
штамма системы вывода токсичных катионов. Возможно, что гранулы в
клетках P. aureofaciens BS1393 и BS1393(pBS501) представляют собой
конгломераты связанных с кобальтом клеточных метаболитов, например,
сидерофоров, феназиновых производных или экзополисахаридов, которые
синтезируются во время роста штаммов. В пользу этого предположения
свидетельствует отсутствие гранул после инкубации отмытых клеток в среде с
кобальтом, хотя в этом случае клетки накапливали до 2 мкг Со/мг биомассы.
4. Ризосферный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) в
вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем
Известно, что соли никеля более токсичны для растений, чем соли
кобальта (Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989). Поэтому в вегетационных
экспериментах c растениями ячменя исследовали способность штамма
P. aureofaciens BS1393(pBS501) защищать растения от аккумуляции никеля.
Никель вносили в торфосмесь в концентрациях 235, 470 и 940 мг/кг, что
согласно гигиеническим нормативам соответствует примерно 2.5, 5 и 10 ПДК
валового содержания никеля. Предварительные эксперименты показали, что
при данных концентрациях никель оказывает негативное влияние как на рост
ячменя, так и на численность бактерий в ризосфере.
4.1 При загрязнении 235 мг никеля/кг торфосмеси (2.5 ПДК)
устойчивый штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501) обладал численным
преимуществом в ризосфере ячменя по сравнению с бесплазмидным вариантом
P. aureofaciens BS1393. Через 2 недели роста растений численность
устойчивого штамма в ризосфере (6.2108 КОЕ/см корня) была на два порядка
выше численности чувствительного штамма BS1393 (5.4106 КОЕ/см корня).
Очевидно, это преимущество и обеспечило бóльшую стимуляцию роста
растений (рис. 8).
Рис. 8. Развитие растений ячменя
при уровне загрязнения никелем
2.5 ПДК (1, 3, 4); 1 – растения без
инокуляции; 3 и 4 – растения
инокулированы
штаммами
P. aureofaciens
BS1393
и
P. aureofaciens
BS1393(pBS501),
соответственно; 2 – растения без
инокуляции, выращенные в чистом
субстрате.
При сравнении массы инокулированных и контрольных растений было
показано, что даже в условиях загрязнения никелем чувствительный штамм
17
P. aureofaciens BS1393 обеспечивал увеличение массы корней в 2.5 раза и
надземной части растений на 30%. Однако устойчивый штамм P. aureofaciens
BS1393(pBS501) более эффективно стимулировал рост растений: обеспечивал
прирост массы корней в 4.5 раза и надземной части растений на 48% (табл. 4).
В среднем общая масса растения, инокулированного P. aureofaciens
BS1393(pBS501), была на 40% больше массы растения, инокулированного
P. aureofaciens BS1393. При этом плазмидосодержащий штамм, по сравнению с
исходным штаммом, обеспечивал двукратное увеличение массы корней и на
14% − надземной части растений.
Таблица 4. Влияние PGPR Pseudomonas на массу ячменя и аккумуляцию
никеля в растениях при содержании 235 мг Ni/кг торфосмеси (2.5 ПДК)
Надземная
Корни
Целое
часть
растение
сухая масса, мг
65±3
18±4
83
84±2
43±2
127
96±3
80±3
176
концентрация Ni, мг/кг сухой массы
30±5
46±5
38±5
100±15
330±20
177±17
80±10
108±15
92±12
78±4
38±3
116
Обработка семян
Без инокуляции
P. aureofaciens BS1393
P. aureofaciens BS1393(pBS501)
Без инокуляции
P. aureofaciens BS1393
P. aureofaciens BS1393(pBS501)
Без инокуляции в чистом субстрате
Помимо стимулирующего эффекта на растения, инокуляция семян ячменя
устойчивым штаммом способствовала снижению токсического воздействия
никеля на растения и уменьшению аккумуляции металла в растительных
тканях. Как видно из данных табл. 4, в корнях растений, инокулированных
плазмидосодержащим штаммом, концентрация никеля (108 мг никеля/кг сухой
массы растений), была в 3 раза меньше, чем в корнях растений,
инокулированными исходным штаммом (330 мг никеля/кг массы растений). В
надземной части растений содержание никеля было сравнимо при обоих
вариантах инокуляции (80−100 мг никеля/кг массы растений) (табл. 4).
Поскольку в ризосфере растений численность устойчивого штамма была
значительно выше численности чувствительного, возможно, именно это
способствовало большей иммобилизации никеля бактериями и уменьшению
концентрации свободных катионов в зоне всасывания корней.
4.2 При загрязнении 470 мг никеля/кг торфосмеси (5 ПДК) через
2 недели роста растений было отмечено уменьшение численности
интродуцированных бактерий в ризосфере (до 105 КОЕ/см корня) и отсутствие
стимулирующего влияния на массу растений (табл. 5). Однако, даже при такой
низкой численности клеток содержание никеля в корнях растений,
инокулированных штаммом P. aureofaciens BS1393(pBS501) (1110 мг никеля/кг
массы растений), было на 30% меньше, чем в растениях, инокулированных
исходным штаммом (1490 мг никеля/кг массы растений) (табл. 5).
18
Таблица 5. Влияние PGPR Pseudomonas на массу ячменя и аккумуляцию
никеля в растениях при содержании 470 мг Ni/кг торфосмеси (5 ПДК)
Надземная
Корни
Целое
часть
растение
сухая масса, мг
62±2
18±1
80
65±2
16±2
81
69±3
19±2
88
концентрация Ni, мг/кг сухой массы
130±20
940±40
535±30
160±20
1490±120
825±70
160±15
1110±80
635±45
78±4
38±3
116
Обработка семян
Без инокуляции
P. aureofaciens BS1393
P. aureofaciens BS1393(pBS501)
Без инокуляции
P. aureofaciens BS1393
P. aureofaciens BS1393(pBS501)
Без инокуляции в чистом субстрате
В надземной части растений, инокулированных как устойчивым, так и
чувствительным штаммами, содержание никеля было одинаковым (160 мг
никеля/кг массы растений) (табл. 5). Однако, как видно из рис. 9, штамм
P. aureofaciens BS1393(pBS501) защищал растения от токсического воздействия
никеля. При инокуляции устойчивым штаммом количество растений с
признаками хлороза (обесцвечивания листьев) на протяжении 4-х недель роста
увеличивалось не так стремительно (от 7 до 50%), как при инокуляции
исходным штаммом (от 20 до 80%) или в вариантах без инокуляции (от 17 до
80%) (рис. 9).
100
количество
растений с 80
признаками 60
хлороза
40
(%)
20
75
76
50
0
BS1393(pBS501)
40
17
7
0
1
50
36
20
0
80
23
2
3
4 недели
Без инокуляции
BS1393
Рис 9. Влияние инокуляции семян ячменя ризосферными штаммами
P. aureofaciens BS1393 и P. aureofaciens BS1393(pBS501) на развитие хлороза у
растений, выращенных при загрязнении 470 мг Ni/кг субстрата.
4.3 При загрязнении 940 мг никеля/кг торфосмеси (10 ПДК)
численность штаммов через 2 недели роста была очень низкой (3.2–4.7 
102 КОЕ/см корня), и ризосферные бактерии не стимулировали рост растений.
Только в течение первой недели роста устойчивый штамм P. aureofaciens
19
BS1393(pBS501) обеспечивал защиту растений от токсического действия
никеля (29% пораженных растений), в то время как 65% растений,
инокулированных чувствительным штаммом, имели признаки хлороза.
5. Устойчивые к кобальту/никелю PGPR Pseudomonas-деструкторы ПАУ
5.1 Получение двухплазмидных штаммов. Одним из перспективных
подходов для биоремедиации почв со смешанными загрязнениями тяжелыми
металлами и органическими токсикантами является применение устойчивых к
тяжелым металлам штаммов-деструкторов (Weyens et al., 2010, 2011). В
настоящей работе плазмида pBS501 с помощью трансформации была
перенесена в штаммы P. aureofaciens BS1393, P. chlororaphis PCL1391 и
P. fluorescens 38a, содержащие природную плазмиду биодеградации
нафталина/фенантрена
pBS216.
В
полученных
трансформантах
визуализированы две плазмиды размером около 65 и 85 т.п.н.,
соответствующие по размеру pBS501 (65 т.п.н.) и pBS216 (85 т.п.н.) (рис. 10).
1
2
3
4
5
Рис.
10.
Электрофореграмма
тотальной ДНК в 0.8% агарозном
85 т.п.н.
геле: (1) pBS216; (2) pBS501;
двухплазмидные
штаммы
65 т.п.н.
(3) BS1393(pBS216,pBS501);
(4) PCL1391(pBS216,pBS501),
(5) 38a(pBS216,pBS501).
Кроме того, наличие гена cnrA плазмиды pBS501 и гена nahAc
нафталинового оперона плазмиды pBS216 в полученных рекомбинантных
штаммах подтверждалось с помощью ПЦР, результаты которой представлены
на рис. 11.
(а)
(б)
М 1 2 3
4
5
М
1
2
3 4 5
3.25
т.п.н.
500 п.н.
Рис. 11. Электрофореграмма результатов ПЦР гена cnrA (а) и nahAc (б):
(2) BS1393(pBS216,pBS501),
(3)
PCL1391(pBS216,pBS501),
(4) 38a(pBS216,pBS501); (а) (1) «–» контроль BS1393(pBS216), (5) «+» контроль
cnrXYHCBA:pSUP202; (б) (1) «+» контроль BS1393(pBS216), (5) «–» контроль
BS1393(pBS501; М – маркер.
Уровни устойчивости к кобальту и никелю при росте реципиентных
штаммов на нафталине не превышали 50 и 100 мкМ, соответственно. У
трансформантов P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501), P. chlororaphis
PCL1391(pBS216,pBS501) и P. fluorescens 38a(pBS216,pBS501) уровни
20
устойчивости повышались в 4–8 раз к кобальту и в 2–4 раза к никелю и
составили 200–400 мкМ, однако были ниже, чем уровни устойчивости
штаммов, выращенных на глюкозе или глютамате, (табл. 2).
5.2 Активности ключевых ферментов биодеградации нафталина
Известно, что тяжелые металлы ингибируют ферменты клеточного
метаболизма, в том числе и специфические оксигеназы (Sandrin, 2003). При
выращивании полученных нами рекомбинантных штаммов на нафталине в
присутствии 100 мкМ никеля, вплоть до стационарной фазы роста сохранялись
высокие активности ключевых ферментов биодеградации нафталина
нафталиндиоксигеназы, салицилатгидроксилазы, катехол-2,3-диоксигеназы,
кодируемых плазмидой pBS216, и катехол-1,2-диоксигеназы, кодируемой
хромосомой штаммов (табл. 6). Из данных, представленных в табл. 6, видно,
что у чувствительных штаммов BS1393(pBS216) и PCL1391(pBS216)
активности исследуемых ферментов понижались почти на порядок, а в штамме
38a(pBS216) не регистрировались.
Таблица 6. Удельная активность ключевых ферментов биодеградации
нафталина у ризосферных штаммов-деструкторов, выращенных до
стационарной фазы роста на нафталине в присутствии 100 мкМ никеля
Штамм
BS1393(pBS216,pBS501)
BS1393(pBS216)
PCL1391(pBS216,pBS501)
PCL1391(pBS216)
38a(pBS216,pBS501)
38a(pBS216)
Удельная активность ферментов,
нмоль/мин мг белка
НО
7
0.3
1.6
0.2
2
н.о.
СГ
30
4.3
36.8
4.1
62
н.о.
К1,2О
63
7.4
55.3
7.5
28
н.о.
К2,3О
14
25
1.2
27.4
18
н.о.
Примечания: н.о. – активность не определяется. НО − нафталиндиоксигеназа,
СГ − салицилатгидроксилаза, К2,3О − катехол-2,3-диоксигеназа, К1,2О −
катехол-1,2-диоксигеназа.
Ранее ингибирующее влияние никеля и цинка на деградацию
хлоробифенилов исследовали при высокой плотности культуры устойчивых
штаммов-деструкторов (Springael et al., 1993). В настоящей работе влияние
никеля (100 мкМ) на биодеградацию нафталина (1 г/л) оценивалось во время
роста культуры с низкой плотностью заражения (107 КОЕ/мл), при этом
нафталин использовался как единственный источник углерода. Устойчивые
штаммы-деструкторы P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) и P. chlororaphis
PCL1391(pBS216,pBS501) менее чем за сутки культивирования в присутствии
21
100 мкМ никеля достигали численности бактерий 108 и 1010 КОЕ/мл,
соответственно, и окисляли почти весь нафталин (табл. 7). Численность
чувствительных штаммов P. aureofaciens BS1393(pBS216) и P. chlororaphis
PCL1391(pBS216) (5.0  106 и 7.0 × 107 КОЕ/мл, соответственно); в течение
1.5 суток почти не возрастала, а биодеградация нафталина составила около 10%
(табл. 7).
Таблица 7. Биодеградация нафталина (1 г/л) ризосферными штаммамидеструкторами при культивировании в присутствии 100 мкМ никеля
Варианты
КОЕ/мл
Контроль испарения
нафталина
PCL1391(pBS216,pBS501)
BS1393(pBS216,pBS501)
PCL1391(pBS216)
BS1393(pBS216)
среда без
бактерий
1.2 × 1010
1.0  108
7.0 × 107
5.0  106
Концентрация нафталина в
среде, мг/л
21 ч
36 ч
870.0 ± 22.0
191.0 ± 40.0
9.0 ± 0.1
12.0 ± 0.2
но
но
не определяли
не определяли
168.0 ± 17.0
170.0 ± 16.0
%
деграда
ции
98
98.6
12
10
5.3 Стабильность плазмид. Успешность использования штаммов,
содержащих плазмиды с целевыми функциями, в полевых условиях зависит от
стабильности этих плазмид. После 10 пассажей штаммов P. aureofaciens
BS1393(pBS216,pBS501) и P. fluorescens 38a(pBS216,pBS501) в неселективных
условиях стабильность обеих плазмид составила 50 и 35%, соответственно,
тогда как в штамме P. chlororaphis PCL1391(pBS216,pBS501) обе плазмиды
сохранялись в 100% клеточной популяции.
6. Рекомбинантный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) в
вегетационных экспериментах, моделирующих смешанное загрязнение
В настоящей работе было показано, что устойчивый штамм
P. aureofaciens BS1393(pBS501) стимулирует рост растений, выращиваемых в
условиях загрязнения никелем. Поэтому было важно выяснить, сохраняет ли
эту способность двухплазмидный вариант этого штамма P. aureofaciens
BS1393(pBS216,pBS501) в условиях смешанного загрязнения ПАУ и никелем
(см. Материалы и методы). Показано, что в отсутствие никеля численность как
чувствительного BS1393(pBS216), так и устойчивого BS1393(pBS216,pBS501)
штаммов в ризосфере сорго (при загрязнении нафталином) и ячменя (при
загрязнении нафталином и фенантреном) была одинаковой (~104 × КОЕ/см
корня). При этом инокулированные растения имели бόльшую массу, чем
растения без инокуляции (табл. 8).
Однако в условиях смешанного загрязнения численность устойчивого
штамма-деструктора P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) в ризосфере (2.4 ×
104 и 5.2 × 105 КОЕ/см корня сорго и ячменя, соответственно) была на порядок
выше численности чувствительного штамма BS1393(pBS216) (4.0 × 103 и 1.3 ×
22
104 КОЕ/см корня сорго и ячменя, соответственно). При инокуляции семян
устойчивым штаммом наблюдалось увеличение массы сорго и ячменя на 70 и
57%, соответственно, по сравнению с массой не инокулированных растений.
Тогда как инокуляция чувствительным штаммом BS1393(pBS216) только на
25% увеличивала массу сорго и не стимулировала рост ячменя (табл. 8).
Таблица 8. Влияние вариантов P. aureofaciens BS1393 на массу растений,
выращенных в условиях смешанного загрязнения почвы ПАУ и никелем
Обработка семян
Без инокуляции
BS1393(pBS216)
BS1393(pBS216,pBS501)
Инокуляция растений
Без инокуляции
BS1393(pBS216)
BS1393(pBS216,pBS501)
Масса растения, мг
сорго
чистая почва нафталин нафталин + никель
77.6±5.1
36.8±2.4
44.9±2.5
64.8±4.2
56.0±3.1
56.2±1.6
74.1±5.8
51.6±2.2
77.6±3.4
ячмень
нафталин/ нафталин/фенантрен
чистая почва
фенантрен
+ никель
42.3±3.5
24.4±2.0
28.4±2.3
52.3±2.7
45.3±1.6
28.5±1.7
47.4±3.1
39.4±1.5
44.0±2.0
Сравнение растений с различными вариантами инокуляции показало, что
штамм P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) обеспечивает бóльшую
прибавку массы сорго (на 38%) и ячменя (на 54%) по сравнению с
чувствительным штаммом P. aureofaciens BS1393(pBS216).
Таким образом, результаты вегетационных экспериментов показали
потенциальную возможность использования бактерий группы PGPR
Pseudomonas, содержащих детерминанту устойчивости к кобальту/никелю cnrтипа, в качестве биопрепаратов для стимуляции роста и защиты растений при
высоком уровне загрязнения никелем (до 5 ПДК), а также при смешанных
загрязнениях никелем и полиароматическими углеводородами. Полученные в
работе устойчивые ризосферные штаммы-деструкторы ПАУ могут быть
рекомендованы для разработки нового поколения биопрепаратов,
предназначенных для стимуляции роста и защиты растений, а также для
биоремедиации почв при смешанных загрязнениях ПАУ и тяжелыми
металлами.
Депонирование
штамма.
Штамм
P.
aureofaciens
BS1393(pBS216,pBS501)
депонирован
во
Всероссийской
коллекции
микроорганизмов под номером ВКМ В-2501 Д.
23
ВЫВОДЫ
1. Из различных загрязненных источников выделены и охарактеризованы
штаммы бактерий, устойчивые к кобальту, никелю, цинку и кадмию.
У бактерий рода Comamonas впервые обнаружена плазмида устойчивости к
тяжелым металлам. Показано, что конъюгативная плазмида pBS501 в
штамме, идентифицированном как Comamonas testosteroni, содержит
детерминанту устойчивости к кобальту/никелю, гомологичную оперону cnr
из Cupriavidus metallidurans CH34.
2. Получены
трансконъюгантные
штаммы
ризосферных
бактерий
P. aureofaciens, P. fluorescens, P. chlororaphis, содержащие плазмиду
pBS501, способные к колонизации ризосферы, синтезу индольных
соединений и супрессии фитопатогенов в присутствии высоких
концентраций никеля/кобальта.
3. Трансконъюгантный штамм P. aureofaciens BS1393(pBS501), растущий в
присутствии 0.5 мМ хлорида кобальта, способен аккумулировать из среды
до 17% кобальта, который локализуется на поверхности клеток в виде
гранул.
4. В вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем
(235 мг/кг субстрата), устойчивый к кобальту/никелю ризосферный штамм
P. aureofaciens BS1393(pBS501) обеспечивает значительный прирост
биомассы ячменя (до 40%) и двукратное снижение аккумуляции никеля в
растениях, по сравнению с исходным чувствительным штаммом
P. aureofaciens BS1393.
5. Сконструированы ризосферные штаммы P. aureofaciens, P. fluorescens,
P. chlororaphis, содержащие две плазмиды – устойчивости к
кобальту/никелю и биодеградации ПАУ, способные полностью окислять
нафталин в присутствии 100 мкМ никеля. Инокуляция семян ячменя и сорго
штаммом P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) обеспечивает увеличение
биомассы растений на 50–70% в условиях смешанного загрязнения почвы
ПАУ и никелем.
Благодарности. Автор искренне признателен сотрудникам, способствовавшим
выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. А.В. Сиунову, к.х.н.
М.Г. Шляпникову, к.б.н. Н.Е. Сузиной, к.б.н. А.В. Лисову, вед. инж. ИБК
А.Ю. Иванову, м.н.с. Т.О. Анохиной. Особую благодарность автор выражает
своему руководителю к.б.н. В.В. Кочеткову. Автор искренне признателен чл.корр. РАН проф. А.М. Боронину за ценные советы, внимание и постоянную
поддержку.
Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ №02-04-48708;
Программы фундаментальных исследований №13 РАН (проект 4.1.1.), проектов
РНП №2.1.1.9321 и №2.1.1/4341; ФЦП ГК №02.512.11.2337, №02.740.11.0682,
№02.740.11.0040, №14.740.11.0414, №43.073.1.1.2502; проектов МНТЦ №4033
и IPP ANL-72-0227-RU (DOE-IPP-CRDF RBO-10118).
24
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи
1. Анисимова Л.А., Сиунова Т.В., Боронин A.M. Устойчивость к металлам
грам-отрицательных бактерий, выделенных из почвы и сточных вод
индустриальных регионов // Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 5. С. 843–
848.
2. Иванов А.Ю., Гаврюшкин А.В., Сиунова Т.В., Хасанова Л.А., Хасанова
З.М. Устойчивость некоторых штаммов бактерий рода Pseudomonas к
повреждающему действию ионов тяжелых металлов // Микробиология.
1999. Т. 68, №3, С. 366–374.
3. Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сузина Н.Е., Боронин А.М.
Продукция феназиновых антибиотиков у штамма Pseudomonas
aureofaciens, содержащего плазмиду резистентности к кобальту и никелю //
Микробиология. 2002. Т. 71. № 6. С. 778–785.
4. Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Боронин А.М. Влияние ризосферных
бактерий на аккумуляцию никеля растениями ячменя // Агрохимия. 2006.
№ 10. С. 80–84.
5. Сиунова Т.В., Анохина Т.О., Машукова А.В., Кочетков В.В., Боронин А.М.
Ризосферный штамм Pseudomonas chlororaphis, способный к деградации
нафталина в присутствии кобальта/никеля // Микробиология. 2007. Т. 76.
С. 212–218.
6. Боронин А.М., Кочетков В.В., Сиунова Т.В., Анохина Т.О., Сизова О.И.
Изменение микробного сообщества ризосферных микроорганизмов под
влиянием антропогенного загрязнения окружающей среды и интродукции в
ризосферу плазмидосодержащих бактерий / Коллективная монография
«Изменение окружающей среды и климата» в 8-ми томах. Т. 4. «Процессы
в
биосфере:
изменения
почвенно-растительного
покрова
и
территориальных вод РФ, круговорот веществ под влиянием глобальных
изменении климата и катастрофических процессов», Пред. ред. кол. Н.П.
Лаверов, РАН.-М. ИФЗ РАН, 2008, С. 113−124.
7. Сиунова Т.В., Сиунов А.В., Кочетков В.В., Боронин А.М. cnr-подобный
оперон в штамме Comamonas sp., кодирующий устойчивость к кобальту и
никелю // Генетика. 2009. Т. 45, № 3, С. 336–341.
8. T.V.Siunova, T.O. Anokhina, O.I. Sizova, V.V. Kochetkov, A.M. Boronin.
Impact of Plant Growth Promoting Rhizobacteria Pseudomonas in
Phytoremediation Process / Handbook of Phytoremediation. Ed. by I.A.
Golubev, 2011. Ch. 17, pp. 551−572.
Патент
Анохина Т.О., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Кочетков В.В., Боронин А.М. Штамм
бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2501 Д для биодеградации
полициклических ароматических углеводородов в условиях загрязнения почв
солями никеля. Патент РФ на изобретение №2396339. Приоритет изобретения
02.07.2008 г.
25
Тезисы
1. Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сиунова Т.В., Мордухова Е.А., Сизова О.И.,
Анохина Т.О., Балакшина В.В, Боронин А.М. Использование генетически
модифицированных ризосферных бактерий рода Pseudomonas в
фиторемедиации // Сб. тезисов конференции «Экобиотехнология: Борьба с
нефтяным загрязнением окружающей среды». Пущино, 2001, С. 85−87.
2. Кочетков В.В., Валидов Ш.З., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Анохина Т.О.,
Балакшина
В.В.,
Боронин
А.М.
Микробиологические
аспекты
биоремедиации техногенно-загрязненных территорий // Тезисы докладов.
Всероссийская конференция «Сельскохозяйственная микробиология в
ХIХ−ХХI веках». Санкт-Петербург, 14−19 июня 2001 г., С. 64−65.
3. Сизова О.И., Сиунова Т.В., Верниковская Д.И., Кочетков В.В.,
Боронин А.М. Использование природных и генетически модифицированных
бактерий Pseudomonas aureofaciens для защиты растений и биоремедиации //
Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции
«Биотехнология 2003», Сочи, 22−26 сентября, 2003 г., С. 53−54.
4. Сиунова Т.В., Кочетков В.В., Сизова О.И., Боронин А.М. Взаимодействие
ризосферных бактерий и растений в почве, загрязненной никелем // 1-я
Международная
геоэкологическая
конференция
«Геоэкологические
проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами», Тула,
30−31 октября, 2003 г., С. 457−461.
5. Кочетков В.В., Сиунова Т.В., Сизова О.И., Анохина Т.О., Машукова А.В.,
Боронин А.М. Ризосферные штаммы бактерий рода Pseudomonas для
фиторемедиации почв с комплексным загрязнением // Материалы 8-го
международного
семинара-презентации
инновационных
научнотехнических проектов «Биотехнология – 2005», Пущино 18−19 ноября
2005 г., С. 143−145.
6. Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I., Boronin A.M.. Plantgrowth promotion rhizosphere Pseudomonas for phytoremediation of cocontaminated soils // 11 International Symposium on Microbial Ecology–ISME11, Vienna, Austria, August 20−25, 2006. Book of abstracts, P. 351.
7. Negri M. C., Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I., Zyakun
A.M., Boronin A.M. Plasmid-Bearing Rhizosphere Pseudomonas for Enhanced
Phytoremediation Performance // 4th International Phytoremediation Conference,
Denver, Colorado, September, 2007.
8. Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I., Boronin A.M.
Beneficial Rhizosphere Bacteria for Bioremediation of Oil-Contaminated Soils //
2nd International Conference RHIZOSPHERE, Montpellier, France, August
25−31, 2007.
9. Boronin A.M., Kochetkov V.V., Siunova T.V., Anokhina T.O., Sizova O.I.,
Vinogradova E.V., Sokolov S.L. Plasmid Bearing Rhizosphere Bacteria
Pseudomonas for Phytoremediation // International Symposium on Applied
Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS) – «What can microbiology and
molecular biology offer oil industry?» Colchester, England, September 16−18,
2007.
26