Начало формы Ж.К. ИБРАИМОВА, Р.И. БЕРСИМБАЕВ*, М.К

Ж.К. ИБРАИМОВА, Р.И. БЕРСИМБАЕВ*, М.К. ТАНКИМАНОВА
ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ГАМЕТОЦИДНОЙ ХРОМОСОМЫ AEGILOPS SPELTOIDES В
ГЕНОМЕ ПШЕНИЦЫ
(*Казахский национальный университет имени аль-Фараби,
Институт общей генетики и цитологии, г.Алматы)
Методами световой микроскопии и анализом гистологических препаратов ткани, а также
электрофоретическим анализом молекул ДНК, выявлены морфологические и биохимические
признаки гибели клеток алейронового слоя во время прорастания зерна пшеницы. Показано,
что ГК усиливает физиологическую гибель клеток алейронового слоя. Это действие ГК
сопровождается морфологическими и биохимическими изменениями характерными для
апоптической гибели клеток. При этом АБК, наряду с другими ГК-специфическими эффектами
(например, синтез и секреция гидролитических ферментов), ингибирует и этот эффект ГК.
Изучение регуляции как секреторной активности, так и гибели клеток алейронового слоя
зерна на разных стадиях онтогенеза растений являются важным в решении актуальных
проблем сельского хозяйства и биотехнологии (формирование и хранение урожая,
размножение растений регенерантов, биологические и технологические качества зерна и др.)
/1/.
Во время прорастания алейроновые слои зерна пшеницы синтезируют и секретируют ряд
гидролитических ферментов (включая альфа-амилазу) /2/. Индукция синтеза этих гидролаз
зависит от присутствия в ткани гибберелловой кислоты (ГК). Гиббереллин-зависимый синтез
этих гидролаз тормозится природным антагонистом этого фитогормона - абсцизовой кислотой
(АБК) /2, 3/. На последующих стадиях онтогенеза растений клетки алейронового слоя зерна
элиминируются. Предполагается, что физиологическая гибель алейроновых клеток
программирована, т.е. генетически детерминирована (апоптоз) /4/.
Несмотря на то, что механизмы регуляции активности клеток алейронового слоя зерна
достаточно интенсивно изучаются /5, 6/, малопонятными и почти неизученными остаются
процессы контроля гибели клеток.
В настоящей работе проведены исследования по изучению морфологических и
биохимических признаков гибели клеток алейронового слоя зерна пшеницы и изучена роль
гибберелловой и абсцизовой кислот в регуляции этого процесса.
Материалы и методы исследования
В исследованиях использовали семена гексаплоидной пшеницы (Triticum aestivum) сорта
Казахстанская 4. Изолированные алейроновые слои выделяли по методике описанной в
работе /2/. Алейроновые слои инкубировали (15-20 алейроновых слоя на 2мл) в буфере
содержащем 0,2мМ натрий-ацетата (рН5.0), хлорамфеникол (25мкг/мл) и/или стрептомицин
(5мкг/мл). ГК, АБК добавляли в фиксированных концентрациях как указано в тексте и таблице.
В контрольных вариантах ГК и АБК исключали из среды инкубации. Для определения
жизнеспособности клеток, алейроновые слои инкубировали в 1% растворе метиленового
синего. Затем определяли процентное количество живых неокрашенных клеток в камере
Горяева. Для выделения высокополимерной клеточной ДНК использовали фенольный метод
/7/. После инкубации ткань гомогенизировали в фарфоровой ступке в жидком азоте.
Полученному порошку добавляли 0,7мл буфера для экстракции, который содержал: 100мМ
Трис-НСl (pH 8,0), 2% SDS, 20мМ ЭДТА, 1,4М NaCl, 0,2% 2-меркаптоэтанол. Инкубировали в
течение 30 минут при 600С. К полученному экстракту добавляли равный объем хлороформа и
через 15 минут инкубации центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут. Затем
отбирали водную фазу и проводили экстракцию 2/3 объемом охлажденного (-20оС)
изопропанола. Центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант сливали,
а осадок содержащий ДНК просушивали на воздухе и ресуспендировали в 500мкл ТЕ буфера,
который содержит 10мМ трис-HCl и 0,1мМ ЭДТА (рН 7,5). К полученной суспензии добавляли
равный объем смеси фенол/хлороформ (1:1). Через 15 минут смесь центрифугировали при
5000 об/мин, в течение 10 минут. Затем отбирали водную фазу и добавляли 1/10 объема 3М
ацетата натрия (рН 7,0) и 2/5 объема холодного этанола. Центрифугировали при 5000 об/мин
в течение 10 минут. Супернатант сливали, а осадок содержащий ДНК просушивали на
воздухе и ресуспендировали в 50мкл ТЕ буфера (рН 7,5). Раствор ДНК хранили в
холодильнике при температуре - 20оС. Электрофоретическое фракционирование ДНК
проводили в 1,8% агарозном геле.
Результаты и их обсуждение
Как видно из таблицы в контрольных вариантах (без ГК и АБК) гибель клеток увеличивалась
незначительно в течении всего времени инкубации. При этом никаких морфологических
изменений по сравнению со свежевыделенными клетками алейронового слоя не
наблюдалось (рис.1а, окраска метиленовым синим). Инкубация ткани алейронового слоя с ГК
в дозе 1мкМ в течение 16 и 24 часов приводило к увеличению гибели клеток на 5,3 и 16,5%
соответственно, по сравнению с контролем. Присутствие ГК в течение 48 часов приводило к
существенной стимуляции гибели клеток и достигла 60% по сравнению с контролем (таблица
1). Это действие ГК сопровождалось морфологическими изменениями характерными для
апоптической гибели (целостность мембраны, сжатие цитоплазмы и др.) (см. рис.1в-d).
Как отмечалось выше многие эффекты ГК, в том числе и ГК-индуцированный синтез и
секреция альфа-амилазы, ингибируется природным антагонистом этого фитогормона абсцизовой кислотой.
Ингибирует ли АБК и этот эффект ГК на физиологическую гибель клеток алейронового слоя
зерна пшеницы?
Таблица 1.
Влияние гибберелловой и абсцизовой кислот на физиологическую гибель клеток
алейронового слоя зерна пшеницы
Условия опыта
Контроль
ГК (1мкМ)
ГК (1мкМ)+АБК (5мкМ)
АБК (10мкМ)
Гибель клеток, в %
16 часов
24 часов
4,9 ± 1,3
8,5 ± 2,0
10,2 ± 2,3
25,0 ± 3,2
3,3 ± 1,1
9,6 ± 2,2
4,6 ± 2,3
10,8 ± 2,0
48 часов
11,4 ± 2,0
69,0* ± 5,6
9,4 ± 3,7
11,6 ± 3,0
* - Р < 0.05 по сравнению с контролем
В наших экспериментах, внесение АБК в дозе 5мкМ полностью блокировало ГКстимулированную гибель клеток алейронового слоя. При этом внесение в инкубационную
среду только АБК не усиливало физиологическую гибель клеток (табл.1 и рис.1с).
Наблюдаемые в представленных выше экспериментах эффект ГК на физиологическую
гибель клеток алейронового слоя и индукция морфологических изменений апоптического
характера, могут указывать на то, что эти процессы могут контролироватся гибберелловой
кислотой.
Надо отметить, что ряд косвенных данных поддерживает предположение об участии ГК в
апоптической гибели клеток алейронового слоя во время прорастания зерна ячменя /2, 4/.
Однако прямых экспериментальных данных о правомерности такого предположения нет.
Известно, что одним из достоверных признаков апоптической гибели клеток является
фрагментация геномной ДНК. При этом этот процесс имеет специфические особенности происходит межнуклеосомное расщепление ДНК и в связи с этим образуются фрагменты,
величина которых кратна величине отдельной нуклеосомы. На электрофореграмме эти
фрагменты разного размера дают характерную картину "лестницы" /8/.
В наших экспериментах с помощью электрофореза в агарозном геле была проанализирована
степень полимерности ДНК в проростках зерна пшеницы от одного до 4-х дней прорастания.
В сухих не проросших и однодневных проростках тотальная ДНК была представлена
высокополимерными молекулами, т.е. фрагментация не обнаруживалась. ДНК, выделенная
из 2-х дневных проростков, имеет своеобразные хвосты. Однако по картине фрагментации
сложно установить причину фрагментации (Рис. 2).
Анализ электрофоретического распределения ДНК в зернах 3-х и 4-х дневных проростков
показало характерное для апоптоза распределение в виде "лестницы". Причем по мере
увеличения срока прорастания усиливается характер фрагментации ДНК.
Рис.1.
Эффект ГК и АБК на жизнеспособность клеток алейронового слоя зерна пшеницы
(окрашивание метиленовым синим): А - свежевыделенные клетки алейронового слоя; В - ГК
(1мкМ), С - ГК+АБК (5мкМ), D - ГК(1мкМ), увеличенный снимок (100х).
Эти результаты на наш взгляд поддерживают, предположение об апоптической гибели клеток
алейронового слоя зерна пшеницы.
Рис.2.
Электрофоретический анализ полимерности ДНК. А - Электрофореграмма зерна пшеницы
при прорастании: 1- сухие зерна, 2,3,4,5 - 1,2,3,4-х дневные проростки, соответственно. ВДействие ГК и АБК на фрагментацию ДНК клеток алейронового слоя зерна пшеницы. 1контроль, 2-АБК (5мкМ), 3-ГК (1мкМ), 4-АБК+ГК.
Можно предполагать, что действие ГК на физиологическую гибель клеток алейронового слоя
зерна пшеницы сопровождается фрагментацией клеточной ДНК. Для изучения действия ГК и
АБК на степень полимерности клеточной ДНК, нами были проведены специальные
эксперименты на изолированных алейроновых слоях зерна пшеницы. Для этого проводили
электрофоретический анализ препаратов ДНК после 72 часов инкубации с ГК, совместно с
АБК. В контрольных вариантах ГК и АБК исключали.
Как видно из результатов приведенных на рис.2, тотальная ДНК в контрольном варианте и в
присутствии только АБК (5мкМ), является высокополимерной, т.е. фрагментации ДНК не
наблюдается. Инкубация алейроновых слоев в течение 72 часов с ГК (1мкМ) приводит к
усилению фрагментации ДНК в виде лестницы, что характерно для апоптической гибели
клеток. Добавление АБК в дозе 5 мкМ блокировало ГК- индуцированную фрагментацию
клеточной ДНК (рис.2В).
Таким образом, методами световой микроскопии, анализом гистологических препаратов
ткани, а также электрофоретическим анализом молекул ДНК, выявлены морфологические и
биохимические признаки гибели клеток алейронового слоя во время прорастания зерна
пшеницы. Показано, что ГК усиливает физиологическую гибель клеток алейронового слоя.
Это действие ГК сопровождается морфологическими и биохимическими изменениями
характерными для апоптической гибели клеток. При этом АБК, наряду с другими ГКспецифическими эффектами (например, синтез и секреция гидролитических ферментов),
ингибирует и этот эффект ГК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кефели В.И., Власов П.В., Прусокова Л.Д.. Общие проблемы регуляции онтогенеза//Итоги
науки и техники.ВИНИТИ,Сер.физиология растений,М.,1989,-7, с.6.
2. Gilroy Simon and Jones R.L. Gibberellic acid and abcisic acid coordinately regulate cytoplasmic
calcium and secretory activity in barley aleurone protoplasts // Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 89, 1992.,
P.3591-3595.
3. Gilroy S. and Jones R.S. Perception and abscisic acid at the external face of the plasma
membrane of barley (Hordeum vulgare L.) aleurone protoplasts // Plant Physiol. 104, 1994., P.11851192.
4. Wang M., Oppedijk B.J., Lu X., Van Duijn B., Schilproort R.A. Apoptosis in barley aleurone during
germination and its inhibition by abcisic acid // Plant Mol Biol, 32, 1996, P. 1125-1134.
5. Chen X., Chang B., Wu B Title Cloning of a Ca(2+)-ATPase gene and the role of cytosolic Ca2+
in the gibberellin-dependent signalling pathway in aleurone cells // Plant J., 11, 1997, P.363-71.
6. Ritchie S., Gilroy S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by
phospholipase D activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1998, P.2697-2702.
7. Маниатис Т., Сэмбрук Дж., Фрич Э. Молекулярное клонирование (практическое
руководство). // -М.: -Мир, -1984, -425с.
8. Dean P.J.,David J.M., Pierluigi N., Sten O. Calcium activated DNA fragementation in rat liver
nuclei // J.Biol.Chem. 264, 1989, -Р.6398-6404.
SUMMARY
Analysis of histological preparations and DNA fragmentation revealed apoptosic characters of wheat
aleurone cells death during germination. Role of gibberellic and abscisic acid in programmed
aleurone cell death apoptosis was investigated.