На правах рукописи ПОЛИВАНОВА АННА ЭДУАРДОВНА
реклама
На правах рукописи ПОЛИВАНОВА АННА ЭДУАРДОВНА СИСТЕМНЫЕ БИОМАРКЕРЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ 14.00.43 – Пульмонология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва-2008 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт пульмонологии» Федерального медико-биологического агентства России Научный руководитель: доктор медицинских наук Аверьянов Александр Вячеславович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Дидковский Николай Антонович доктор медицинских наук Анаев Эльдар Хусеевич Ведущая организация: ФГУ ВПО Московский государственный медицинский университет Росздрава Защита состоится « » …………………….2008 года в ………часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.053.01 при ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России ( 105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России( 105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д.32) Автореферат разослан « » ……..2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Васильева О.С. 2 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Современная концепция хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) трактует ее как заболевание с системными проявлениями, при котором даже поражение легких рассматривается как один из компонентов болезни (GOLD, 2006, 2007). Концепция системной воспалительной реакции, или системного воспаления, у больных ХОБЛ относительно нова. Основная локализация воспаления при ХОБЛ — малые дыхательные пути, но активное воспаление присутствует также и в крупных бронхах, и в легочной паренхиме, и в легочных сосудах (GOLD, 2005). При ХОБЛ частой находкой является повышение уровня биологических маркеров воспаления в периферической крови (СРБ, фибриноген, лейкоциты, провоспалительные цитокины - ИЛ 1β, ИЛ 6, ИЛ 8, ФНО-α). (Agustí A., 1997; Hoidal J.R., 2001;Henson P.M., 2006) Предполагается, что взаимосвязь между местным (т.е. бронхолегочным) и системным воспалением осуществляют: 1) выход стрессиндуцированных цитокинов и свободных радикалов из бронхолегочной системы в системную циркуляцию; 2) активация лейкоцитов периферической крови или клеток-предшественников в костном мозге; 3) стимуляция костного мозга и печени провоспалительными медиаторами, высвобождаемыми воспалительными и структурными клетками (Barnes P.J., 2000). Однако точные механизмы системного воспаления при ХОБЛ изучены недостаточно. В настоящее время имеется ряд исследований, посвященных изучению системных биомаркеров ХОБЛ непосредственно в ткани легкого, мокроте, бронхо-альвеолярной жидкости, однако работ об изучении биомаркеров протеолиза-антипротеолиза, регенерации, воспаления в сыворотке больных при гетерогенных фенотипах ХОБЛ недостаточно для понимания их роли в патогенезе данного заболевания (Finlay G.A. et al, 1997; Betsuyaku T. Et al, 1999; Tanino M. Et al, 2002). Таким образом, остается еще ряд нерешенных вопросов о роли протеазантипротеаз и воспаления в патофизиологии эмфиземы, о взаимосвязи между воспалением, протеазной активностью и ремоделированием экстрацеллюлярного матрикса у больных ХОБЛ, о взаимосвязи протеаз, ангиогенных и фиброгенных факторов в системном воспалении, решение которых, поможет как в понимании патогенеза ХОБЛ, так и в дальнейшей тактике ведения этих больных. На основании вышеизложенного, изучение особенностей системных биомаркеров, как патогенетических факторов развития эмфиземы, у больных ХОБЛ является актуальной проблемой и обусловливает цель и задачи настоящего исследования. 3 ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить взаимосвязь биомаркеров системного воспаления и регенерации в сыворотке крови с клинико – функциональными параметрами у больных с гетерогенными фенотипами хронической обструктивной болезни легких. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. 1. Изучить особенности концентрации биомаркеров системного воспаления и регенерации в сыворотке крови у больных ХОБЛ стабильного течения. 2. Установить взаимосвязи системных биомаркеров ХОБЛ с клинико- функциональными характеристиками больных. 3. Изучить клинические, функциональные особенности больных с гетерогенными фенотипами ХОБЛ и дать характеристику системных биомаркеров воспаления и регенерации. 4. Уточнить роль системных биомаркеров воспаления и регенерации в развитии отдельных форм эмфиземы легких. НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В представленной работе впервые: 1. Установлено, что у больных ХОБЛ в начальных стадиях значительно повышен уровень ТФР-β в сыворотке крови, что свидетельствует о регенеративной активности легких. 2. Выявлены значимые корреляционные взаимосвязи уровня систолического давления в легочной артерии с ТФР-β, ИЛ-8, ФНО-α, ММП-9 у больных ХОБЛ в фазе стабильного течения, что свидетельствует о роли данных биомаркеров в формировании легочной гипертензии. 3. Обнаружена достоверная корреляционная взаимосвязь ЭФР и ТИМП-1 в группе больных ХОБЛ в фазе стабильного течения, что свидетельствует о зависимости процессов ангиогенеза и антипротеолиза. 4. Установлено, что эмфизематозный и бронхитический фенотипы ХОБЛ достоверно отличаются по концентрациям ММП-9, ММП-9/ТИМП-1 и НЭ в сыворотке крови. 5. Обнаружено, что в группе больных ХОБЛ с тяжелой степенью выраженности эмфиземы число взаимосвязей НЭ с другими биомаркерами системного воспаления в 4 раза превышает таковое в группе больных с нетяжелой эмфиземой, что подтверждает участие данного биомаркера в развитии эмфиземы. 4 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. 1. Выявленные взаимосвязи между клинико-функциональными параметрами и системными биомаркерами у больных ХОБЛ позволяют уточнить отдельные звенья патогенеза данной болезни. Исследование 2. системных биомаркеров ХОБЛ позволяет дополнить характеристики фенотипа ХОБЛ, прогнозировать течение заболевания, провести раннюю диагностику молекулярного дисбаланса, который может привести к прогрессированию болезни. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены и обсуждены на: -15-м, 16-м, 17-м Национальных Конгрессах по болезням органов дыхания, (Москва, 2005; Санкт-Перербург, 2006; Казань, 2007 гг.); -Ежегодных Конгрессах Европейского Респираторного Общества (Мюнхен, 2006; Стокгольм, 2007); -Научной сессии ФГУ НИИ Пульмонологии Росздрава 2007г. (Москва); -Совместном заседании ФГУ НИИ Пульмонологии Росздрава и кафедры госпитальной терапии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (Москва, 2007 г). ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из которых 4 журнальные статьи (в ведущих рецензируемых журналах согласно перечню ВАК Минобразования и науки РФ), 8 тезисов национальных и европейских конгрессов, из них 3 – в зарубежной печати (European Respiratory Journal). ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на 118 страницах машинописи. Состоит из введения, глав обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Иллюстрирована 4 рисунками и 23 таблицами. Библиографический указатель содержит отечественных и зарубежных источников. Диссертация изложена на русском языке. 5 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Общее количество, участвовавших в исследовании, составило 41 человек. Критерии включения: Обязательными клиническими и функциональными критериями для включения больных в исследование были: 1. Подтвержденный диагноз ХОБЛ (ОФВ1/ФЖЕЛ <70%) 2. Возраст 40 - 75 лет. 3. Фаза стабильного течения (не менее 4-х недель после завершения предшествующего обострения) 4. ИКЧ >10 пачка/лет 5. Способность больного выполнять необходимые процедуры, связанные с исследованием Критерии исключения: 1. Сопутствующие болезни органов дыхания (рак, туберкулез, бронхиальная астма, пневмония, пороки развития легких и др.) 2. Острые или обострение хронических воспалительных заболеваний других органов и систем 3. Прием системных глюкокортикостероидов 4. Злокачественные новообразования любой локализации 5. Противопоказания к лучевой нагрузке В первую группу было включено 32 больных ХОБЛ (подтвержденным данными анамнеза, клинической картиной, рентгенологическими, функциональными методами диагностики) легкой и средней степени тяжести заболевания в стадии стабильного течения. Вторую группу (контрольную) составили 9 человек– курильщики (стаж курения не более 10 лет), не страдающие ХОБЛ. Все больные находились на амбулаторном лечении. Характеристика больных ХОБЛ и контрольной группы, включенных в исследование, представлена в табл. 1. Таблица 1 Характеристика больных ХОБЛ и контрольной группы, включенных в исследование. 6 Признаки Mean±SD ХОБЛ Курильщики (n=32) (n=9) 60,9±8,3 56,7±7,6 28/4 9/0 ИКЧ (пачка/лет) 39,9±18,8 7,2±1,6 ИМТ, кг/м² 23,1±4,2 26±1,5 Одышка, по Borg (баллы) 4,04±1,3 0 Кашель (баллы) 3,6±0,8 1,7±0,3 ЧСС, мин¹ 87,1±13,6 84±8,7 SatO2,% 95,1±2,4 97±1,9 FEV1,% должн. 57,7±22,8 88,2±7,5 FVC,% должн. 88,8±20,7 96,3±3,8 FEV1/ FVC 50,7±14,8 89,8±6,8 VC,% должн. 90,2±18,7 98,2±4,2 IC,% должн. 85,1±21,9 94,3±3,1 СДЛА, мм рт. ст. 29,9±8,2 19,1±1,9 рН 7,47±0,02 7,41±0,4 PaО2, мм рт.ст. 75,1±13,6 88,3±7,1 PaСО2, мм рт.ст. 36,9±4,9 38,1±0,2 Возраст, лет Пол (м/ж) Больные ХОБЛ, отобранные по критериям включения-исключения, были подразделены на 2 основные группы: больные с эмфизематозным фенотипом (25 пациентов) и больные с бронхитическим фенотипом (7 пациентов). Критерием деления явились данные компьютерной томографии высокого разрешения (наличие или отсутствие хотя бы одного участка деструкции легочной паренхимы) (Boschetto P.,2006). Группа больных с эмфизематозным фенотипом, в свою очередь была разделена на пациентов с тяжелой степенью выраженности эмфиземой (8 человек) и нетяжелой (17 человек). Больные ХОБЛ с индексом эмфиземы больше 3 оценивались как больные с тяжелой степенью выраженности эмфиземы и, соответственно, с индексом эмфиземы меньше 3 как больные с нетяжелой степенью выраженности эмфиземы (Cederlund K. et al, 2002). ДИЭ - индекс эмфиземы, который представляет собой отношение между допустимым (индивидуальные возрастные нормы) уровнем плотности легочной ткани в 7 диапазоне -950-1000 единиц Хаунсфилда и выявленным. Группа больных с буллезной эмфиземой составила 12 человек, больные без булл - 13 человек. Во всех группах производилась оценка клинико-функциональных показателей, маркеров системного воспаления, оценка взаимосвязи иммунологических маркеров воспаления, сосудистых и тканевых факторов роста с клинико-функциональными и рентгено - морфологическими показателями. У всех больных оценивались приведенные ниже клинические и функциональные показатели: диспное по шкале Borg (Borg, 1982) показатели газового состава артериальной крови показатели функции внешнего дыхания тест с 6-минутной ходьбой показатели компьютерной томографии сывороточные уровни маркеров воспаления, протеаз-антипротеаз, факторов роста Субъективный уровень диспное оценивался пациентом самостоятельно по интегральной шкале Borg . Данная шкала включает в себя словесные описания ощущений диспное, которые расположены на неравных расстояниях друг от друга и соответьствуют определенному числу баллов. Для оценки питательного статуса пациентов использовался индекс массы тела (ИМТ), ИМТ рассчитывался по формуле ИМТ=масса тела (кг)/рост2(м). При оценке функции внешнего дыхания использовались показатели FEV1, FVC, FEV1/FVC, VC, IC, VT, RV, TLC, RV/TLC, ERV. Исследование спирометрии проводилось путем анализа кривой «поток-объем» на компьютерном анализаторе Flowscreen фирмы Erich Jaeger, Германия. Определение диффузионной способности легких проводилось на аппарате MasterScreen Body фирмы Jaeger, Германия. Исследовались следующие показатели: DLCO - диффузионная способность легких, DLCOva - отношение диффузионной способности легких к альвеолярному объему. Определение силы дыхательной мускулатуры неинвазивным методом. Исследование проводилось на аппарате MasterScreen Body фирмы Jaeger, Германия. Исследовались следующие показатели: Ро1 - оценка инспираторной активности 8 дыхательного центра, PImax – максимальная пиковая скорость вдоха, PEmax максимальная пиковая скорость выдоха. 6-минутный тест с ходьбой проводился в соответствии со стандартным протоколом при помощи пульсоксиметра фирмы Mediaid-305 (США). Пациент должен был пройти по измеренному коридору в своем собственном темпе, стараясь пройти максимальное расстояние в течение 6 минут (Enright, 1998). До и после проведения теста определялись сатурация кислорода крови, частота сердечных сокращений и частота дыхания. Неинвазивная оценка гемодинамики проводилась методом ЭХО-КГ с допплерографией на ультразвуковом анализаторе Vivid-7 (“General Electric, США). Оценивалось систолическое давление (СДЛА) в a. рulmonale в мм.рт.ст. Спиральная компьютерная томография с использованием полуавтоматической программы измерения плотности легочной ткани Pulmo CT (Siemens®) проводилась на компьютерном томографе Somatom Emotion фирмы Siemens , Германия. Определялись: доля эмфиземы от общего объема легких, средняя плотность легочной ткани, распределение плотности по объему легких, выявление бронхоэктазов, булл, других изменений легочной ткани по стандартной методике сканирования (проводится на высоте вдоха с задержкой дыхания, 2-х миллиметровыми срезами с шагом в 10 мм в краниокаудальном направлении без контрастирования ). Газовый состав артериальной крови проводился экспресс-методом на автоматическом анализаторе RapidLab-348 фирмы Bayer, Германия). Забор крови для анализа осуществлялся путем пункции лучевой артерии гепаринизированным шприцем. Определялись следующие показатели: pH, pO2, pCO2,HCO3. Определение уровня альфа-1-антитрипсина и альфа-2 макроглобулина в сыворотке крови методом нефелометрии. Исследование проводилось при помощи нефелометра BN ProSpec фирмы DADE BEHRING, США-Германия. Для определения активности нейтрофильной эластазы (НЭ), матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9, тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 (ТИМП-1), интерлейкина-8 (ИЛ-8), фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α), трансформирующего фактора роста-бета (ТФР-β), эндотелиального фактора роста (ЭФР) использовались наборы фирмы BIOSOURCE (США), Bender MS (Швейцария). Исследование проводилось методом иммуноферментного анализа в соответствии с рекомендациями производителя. Постановка реакций выполнялась методом парных сывороток. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с определением средних значений полученных показателей (М) и стандартных отклонений (±σ). Все численные данные представлены как Mean+SD. Достоверность различий количественных 9 показателей между группами в случае непараметрического распределения определяли при помощи критерия Mann-Whitney U-test. Корреляционную зависимость рассчитывали по методу Спирмена. Доверительный интервал >95% принимался как статистически значимый. Различия считались статистически достоверными при р < 0,05. При анализе сывороточных концентраций биомаркеров установлено их непараметрическое распределение, данные представлены как медиана, 25-75 процентиль. Вся статистическая обработка результатов проведена при помощи пакета прикладных программ Statistica for Windows, Release 6.0 StatSoft, Inc. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 Системные биомаркеры в сыворотке крови у больных ХОБЛ и в контрольной группе. 1.1 Уровень системных биомаркеров в сыворотке крови в группе больных ХОБЛ и в контрольной группе. Средние значения исходных показателей цитокинов (ИЛ-8, ФНО-α), факторов роста (ЭФР, ТФР-β) и протеаз-антипротеаз (ММП-9, ТИМП-1, ААТ, НЭ, α2макроглобулин) в сыворотке крови в обеих указанных группах представлены в табл. 2. Таблица 2 Концентрация системных биомаркеров в сыворотке крови в группе больных ХОБЛ и в контрольной группе. Показатель Median (25-75 percentile) Больные ХОБЛ Здоровые курильщики 12,9 (11,1-16,4)*** 7,5 (6,2-9,8) 6,8 (5,4-8,6) 6,5 (6,1-7,3) ЭФР, пг/мл 122,2 (70,7-201,4) 103,2 (87,3-119,8) ММП-9, нг/мл 329,4 (224,0-728,3) 264,1 (208,9-289,4) ТИМП-1, нг/мл 557,4 (468,5-640,9) 573,8 (501,5-611,7) ААТ, г/л 1,54 (1,33-1,8) 1,39 (1,38-1,44) ТФР-β, нг/мл 1,42 (0,74-1,6) 1,15 (1,11-1,32) 184,8 (117,1-465,5)* 115,9 (88,5-118,5) 0,56 (0,41-1,56) 0,75 (0,62-0,83) 120,5 (61,9-316,6) 79,5 (64,1-86,6) 1,36 (1,18-1,54) 1,51 (1,43-1,6) ИЛ-8, пг/мл ФНО- α, пг/мл НЭ, нг/мл ММП-9/ ТИМП-1 НЭ/ААТ α2макроглобулин, г/л *- р<0,05 **- р<0,01 ***- р<0,001 по сравнению со здоровыми курильщиками 10 Обе группы достоверно отличались друг от друга по значениям ИЛ-8 (р<0,001) и НЭ (р<0,05). Также имелась тенденция превышения уровней ЭФР, ТФР-β, ММП-9 в сыворотке крови больных ХОБЛ, однако, она не достигла статистически значимых величин. 1.2 Взаимосвязь уровней системных биомаркеров в сыворотке крови и клинико функциональных показателей у больных ХОБЛ. При изучении взаимосвязей ИЛ-8 с функциональными показателями выявлены достоверные отрицательные корреляционные связи между ИЛ-8 и FEV1% (r=-0,41), FVC% (r=-0,53), СДЛА (r=-0,66) и положительные слабой силы корреляционные взаимосвязи между ИЛ-8 и RV% (r=0,4), RV/TLC% (r=0,41), что свидетельствует о роли воспалительных хемокинов в развитии обструктивных нарушений. Выявленные нами отрицательные корреляционные взаимосвязи уровня СДЛА с концентрацией ИЛ-8 (r=-0,66) и ФНО-α (r=-0,58) совпадают с данными Puxeddu I., Dirkje S. P о том, что как ИЛ-8, так и ФНО-α стимулируют экспрессию ЭФР, усиливающего сосудистый рост и снижающего величину давления в легочной артерии (Puxeddu I. et al, 2005; Dirkje S. P. et al, 2006) (рис.1). r=-0,58 ТФР-β r=-0,58 ММП9 СДЛА ИЛ-8 r=-0,66 ФНО -α r=0,61 Рис. 1 Корреляционные взаимосвязи СДЛА и системных биомаркеров в сыворотке крови у больных ХОБЛ. Сильная прямая корреляционная взаимосвязь установлена между сывороточным уровнем ТФР-β и величиной СДЛА (r=0,61) в группе больных ХОБЛ. Несмотря на то, что существуют исследования, доказывающие протективные свойства ТФР-β при ХОБЛ за счет усиления синтеза эластина, стимуляции ЭФР и васкуляризацию легких (Jeon S.H. et al, 2007) известно, что при первичной легочной гипертензии имеется повреждение 11 сигнальной системы ТФР-β, создавая невозможность осуществления его протективных эффектов (Richter A. et al, 2004). Еще одна достоверная обратная корреляционная связь в группе больных ХОБЛ установлена между СДЛА и уровнем ММП-9 (r=-0,58). Поскольку металлопротеиназы ответственны за неоангиогенез, подавление их активности приводит к нарушению сосудистого роста. Вероятно, активная васкуляризация легких под влиянием ММП-9 может объяснять обратную зависимость с величиной СДЛА (Stamenkovic I., 2003; Joyce E., 2005). 1.3 Корреляционные взаимосвязи уровней системных биомаркеров в сыворотке крови в группе больных ХОБЛ и в контрольной группе. Для определения механизмов влияния друг на друга были изучены взаимосвязи цитокинов, факторов роста и протеаз – антипротеаз между собой. В группе больных ХОБЛ были выявлены слабой силы корреляционные взаимосвязи между ФНО-α и ММП-9, ТИМП-1 и ИЛ-8, что подтверждает данные о взаимном влиянии этих показателей друг на друга и их деструктивную роль при ХОБЛ, что подтверждается данными Nacamura H (Nacamura H. et al,1991). Обнаружена умеренной силы положительная корреляционная связь между ЭФР и ТИМП-1 в группе больных ХОБЛ; в контрольной группе достоверных взаимосвязей не получено. Также в группе больных ХОБЛ нами были получены сильные корреляционные связи между ММП-9 и НЭ, НЭ/AAT, умеренной силы между ММП-9 и ИЛ-8 , слабой силы между ММП-9 и ФНО-α, что подтверждает роль ММП-9 в деструктивных процессах и поддержании воспаления при ХОБЛ и стимулирующем влиянии НЭ на экспрессию ММП-9 (Campbell E.J. et al, 1991). В контрольной группе выявлена одна сильная взаимосвязь между ММП-9 и α2макроглобулином, что свидетельствует о балансе повреждающих и защитных механизмов у этих больных. Нами выявлены значимые положительные корреляционные связи в группе больных ХОБЛ между ТИМП-1 и ЭФР, ФНО-α. В контрольной группе достоверных связей не было получено. Положительные корреляционные связи обнаружены в группе больных ХОБЛ: умеренной силы между ТФР-β и НЭ, НЭ/AAT, и слабой силы корреляционная связь между ТФР-β и ММП-9/ТИМП-1, а в контрольной группе статистически значимые корреляционные связи отсутствуют. Эти данные свидетельствует о роли ТФР-β в развитии фибропластических процессов при ХОБЛ. 2. Различие системных биомаркеров в сыворотке крови у больных ХОБЛ 1-4 стадий. 12 При исследовании различий показателей цитокинов, факторов роста, протеазно антипротеазного статуса у больных ХОБЛ 1-4 стадий в сыворотке крови выявлена статистически значимая разница по концентрациям TФР-β и ИЛ-8 (рис. 2, 3). 1,5 1,11 p<0,05 1 0,8 ТФР-бета, нг/мл 0,5 0 ХОБЛ начальная стадия ХОБЛ терминальная стадия Рис. 2 Концентрация ТФР-β в сыворотке крови у больных ХОБЛ. 20 15,6 p<0,01 15 12,1 ИЛ-8, пг/мл 10 5 0 ХОБЛ начальная стадия ХОБЛ терминальная стадия Рис. 3 Концентрация ИЛ-8 в сыворотке крови у больных ХОБЛ. Высокая продукция ТФР-β имеет место в начальных стадиях ХОБЛ (1 и 2 стадии), что возможно объясняется протективной функцией данного биомаркера в отношении паренхимы легких. В терминальной стадии ХОБЛ мы наблюдали резкое снижение продукции ТФР-β, что, по-видимому резко нарушает регенераторную функцию легких и ведет к резкому прогрессированию болезни. 3. Системные биомаркеры в сыворотке крови у больных с гетерогенными фенотипами ХОБЛ. 3.1 Уровень системных биомаркеров в сыворотки эмфизематозным и бронхитическим фенотипами ХОБЛ. 13 крови у больных с Достоверные отличия между группами больных с эмфизематозным и бронхитическим фенотипами выявились в таких показателях, как ИМТ (p<0,01), расстоянии, пройденном при проведении теста c 6-минутной ходьбы (p<0,05), DLCO SB (p<0,05) , DLCO/VA (p<0,01), НЭ (p<0,05), НЭ/ААТ (p<0,05), ММП-9 (p<0,05), ММП9/ТИМП-1 (p<0,01) (табл. 3). Больные с эмфизематозным фенотипом достоверно имели более низкий ИМТ, были менее физически выносливы в тесте с 6-ти минутной ходьбой и имели более низкие показатели диффузионной способности по сравнению с больными ХОБЛ с бронхитическим фенотипом. Таблица 3 Функциональные и клинические отличия фенотипов ХОБЛ. Показатель Mean±SD Эмфизематозный фенотип Бронхитический фенотип (n=25) (n=7) FEV1% 55,2±22,7 68,5±21,9 FVC% 89,1±20,5 87,3±15,3 FEV1/ FVC 47,8±14,1 63,0±11,7 IC% 83,1±21,6 93,7±22,8 RV% 187,7±44,5 185,2±41,6 TLC% 123,2±14 123,7±14,8 RV/TLC 144,4±24,6 146,8±30,7 PI max, % 74,5±19,7 59,8±35,8 DLCO SB 59,1±16,3* 73,7±11,2 DLCO/VA 65,8±18,8** 85,7±14,8 раО2, мм рт.ст. 75,5±12,1 73,9±19 рСО2, мм рт.ст. 36,2±4,6 39,1±5,3 СДЛА, мм рт.ст. 18,8±2,2 15,5±6,1 Возраст, лет 60,9±8,1 60,5±8,2 Кашель, баллы 1,23±0,5 1,33±0,5 Одышка, баллы 4,7±2,4 3,2±2,1 ИКЧ, п/лет 26,9±3,6 16,7±5,1 6 MWT, м 410,8±138,1* 554,1±102,9 ИМТ, кг/м2 22,1±3,9** 27±3,5 14 *- р<0,05 ** p<0,01 ***- p<0,001 по сравнению с бронхитическим фенотипом ХОБЛ Средние значения ИЛ-8, ФНО-α, ЭФР, ММП-9, ТИМП-1, ММП-9/ ТИМП-1, TФРβ, НЭ, ААТ, НЭ/ААТ и α2макроглобулином, полученные у больных ХОБЛ с эмфизематозным и бронхитическим фенотипами представлены в табл. 4. Таблица 4 Уровни биомаркеров системного воспаления в сыворотке крови у больных с гетерогенными фенотипами ХОБЛ. Показатель Median (25-75 percentile) Эмфизематозный фенотип (n=25) 13,0 (11,0-16,2) Бронхитический фенотип (n=7) 11,9 (11,3-18,1) 7,3 (5,7-8,7) 5,7 (4,6-6,3) 123,7 (66,5-299,3) 94,2 (78,3-162,6) ММП-9, нг/мл 377,0 (295,8-937,1)* 223,5 (128,1-380,6) ТИМП-1, нг/мл 555,8 (482,1-642,1) 557,4 (455,0-604,4) 0,63 (0,5-1,6)** 0,38 (0,2-0,6) 1,0 (0,7-1,7) 0,92 (0,92-1,1) НЭ, нг/мл 195,1 (125,7-494,8)* 110,6 (60,2-309,4) ААТ, г/л 1,54 (1,3-1,8) 1,55 (1,27-1,59) НЭ/ААТ 123,8 (66,7-369,2)* 59,0 (45,9-194,6) 1,3 (1,2-1,5) 1,4 (1,1-1,5) ИЛ-8, пг/мл ФНО-α, пг/мл ЭФР, пг/мл ММП-9/ТИМП-1 TФР-β, нг/мл α2макроглобулин, г/л *- р<0,05 **- р<0,01 по сравнению с больными бронхитическим фенотипом ХОБЛ Как видно из представленной таблицы, больные с эмфизематозным фенотипом имели достоверно более высокие концентрации сывороточных значений ММП-9, ММП9/ТИМП-1, НЭ и НЭ/ААТ, что подтверждает их роль в развитии эмфиземы. 3.2 Корреляционные взаимосвязи системных биомаркеров в сыворотке крови при гетерогенных фенотипах ХОБЛ. В группе больных ХОБЛ с эмфизематозным фенотипом обнаружены умеренной силы корреляционные взаимосвязи между НЭ и ИЛ-8, ММП-9, ММП-9/ТИМП-1, TФР-β. А в группе больных ХОБЛ бронхитического фенотипа получены сильные корреляционные связи между НЭ и ММП-9, ММП-9/ТИМП-1, ТФР-β. Наличие корреляционной связи между НЭ и ИЛ-8 в группе больных с эмфизематозным фенотипом 15 и отсутствие данной связи в группе больных с бронхитическим фенотипом свидетельствует о том, что развитие эластолизиса тесно связано с хроническим воспалением. Также в группе ХОБЛ с эмфизематозным фенотипом выявлена умеренной силы корреляционная связь между ААТ и ЭФР. У больных с бронхитическим фенотипом выявлена сильная корреляционная связь между ААТ и α2макроглобулином, что подтверждает их протективную роль в развитии эмфиземы. В группе больных ХОБЛ с эмфизематозным фенотипом получена статистически достоверная корреляционная связь между ТИМП-1 и ФНО-α. Умеренной силы корреляционные связи получены в группе больных ХОБЛ с эмфизематозным фенотипом между ТФР-β и НЭ, НЭ/ААТ, а в группе ХОБЛ бронхитического фенотипа между ТФР-β и НЭ. Выявлена умеренной силы корреляционная связь между ЭФР и ААТ, ТИМП-1 в группе больных ХОБЛ с эмфизематозным фенотипом. В группе больных ХОБЛ бронхитического фенотипа достоверных корреляционных связей не получено. 4. Системные биомаркеры в сыворотке крови у больных ХОБЛ с эмфиземой разной степени тяжести. 4.1 Уровень системных биомаркеров ХОБЛ в сыворотке крови в группах больных с эмфиземой разной тяжести. Средние значения исходных показателей цитокинов, факторов роста и протеазантипротеаз в сыворотке крови в группах больных ХОБЛ с тяжелой эмфиземой и нетяжелой эмфиземой представлены в табл. 5: Таблица 5 Концентрация системных биомаркеров в сыворотке крови в группах больных ХОБЛ с разной степенью выраженности эмфиземы. Показатель Median (25;75 percentile) Тяжелая степень выраженности эмфиземы (n=11) 13,0 (11,8-17,1) Нетяжелая степень выраженности эмфиземы (n=14) 13,9 (11,0-16,7) 8,3 (6-11,9) 7,3 (5,7-8,5) 124,1 (89,3-434,4) 130,0 (61,6-208,5) ММП-9, нг/мл 586,1 (295,8-1011,2)* 315,2 (295,8-937,1) ТИМП-1, нг/мл 585,8 (482,1-646,0) 604,4 (483,0-639,7) 1,7 (1,4-2,0) 1,5 (1,3-1,7) ИЛ-8, пг/мл ФНО- α, пг/мл ЭФР, пг/мл ААТ, г/л 16 ТФР-β, нг/мл НЭ, нг/мл ММП-9/ ТИМП-1 НЭ/ААТ α2макроглобулин, г/л 0,92 (0,7-10,5) 0,9 (0,9-1,48) 156,9 (116,0-727,3) 204,0 (162,0-494,8) 1,1 (0,5-1,6)* 0,5 (0,5-1,7) 113,7 (60,4-317,6) 137,8 (103,8-429,9) 1,5 (1,3-1,9) 1,3 (1,2-1,5) *- р<0,05 ** p<0,01 ***- p<0,001 по сравнению с нетяжелой эмфиземой Как видно из табл. 5 концентрации ММП-9 и ММП-9/ТИМП-1 в сыворотке крови достоверно выше у больных ХОБЛ с тяжелой степенью выраженности эмфиземы. 4.2 Корреляционные взаимосвязи системных биомаркеров ХОБЛ в сыворотке крови и клинико - функциональных показателей в группах больных с эмфиземой разной степени выраженности. В группе больных ХОБЛ с тяжелой степенью выраженности эмфиземы выявлены сильные прямые корреляционные взаимосвязи между ИЛ-8 и FEV1%, FVC%, pCO2, IC. Между ФНО-α и pCO2, ИКЧ в группе больных ХОБЛ с тяжелой степенью выраженности эмфиземы нами получены сильные корреляционные взаимосвязи, в отличие от больных ХОБЛ с нетяжелой, где выявлена одна умеренной силы корреляционная взаимосвязь между ФНО-α и TLC%. У больных ХОБЛ с нетяжелой степенью выраженности эмфиземы получена сильная отрицательная корреляционная взаимосвязь между ЭФР и модифицированным индексом Тиффно, в отличие от группы больных ХОБЛ с тяжелой степенью выраженности эмфиземы, в которых корреляционных взаимосвязей ЭФР не выявлено. В исследуемых группах обнаружены обратные корреляционные взаимосвязи ТФРβ и DLCO/VA, ИМТ - у больных ХОБЛ с нетяжелой степенью выраженности эмфиземы, и прямая взаимосвязь с DLCO SB - у больных ХОБЛ с тяжелой степенью выраженности эмфиземы. Между расстоянием, пройденным при проведении теста с 6-ти минутной ходьбой и ММП-9, получена сильная отрицательная корреляционная взаимосвязь в группе больных ХОБЛ с тяжелой степенью выраженности эмфиземы. Обе группы достоверно отличались по степени выраженности одышки (р<0,001), FEV1% (р<0,01), FEV1/ FVC (р<0,05), RV% (р<0,01), расстоянием, пройденным при проведении теста с 6-и минутной ходьбой (р<0,05). 4.3 Взаимосвязь сывороточных уровней биомаркеров ХОБЛ в группах больных с эмфиземой разной тяжести. 17 В группе больных с тяжелой степенью выраженности эмфиземы, в отличие от больных ХОБЛ с нетяжелой степенью выраженности эмфиземы число взаимосвязей НЭ и маркеров воспаления, факторов роста, протеаз-антипротеаз в 4 раза выше, чем в группе сравнения. Полученные сильные прямые корреляционные связи между НЭ и ММП-9, ММП-9/ТИМП-1, ТФР-β, ЭФР в группе больных ХОБЛ с тяжелой степенью выраженности эмфиземы подтверждают роль протеиназ и факторов роста в развитии эмфиземы. Мы обнаружили сильные корреляционные взаимосвязи в группе больных с тяжелой эмфиземой между ЭФР, показателем эндогенной регуляции ангиогенеза, и НЭ, ТФР-β, что свидетельствует о том, что нарушение ангиогенеза является одной из составляющих в развитии эмфиземы. В группе больных ХОБЛ с нетяжелой эмфиземой выявлена только одна корреляционная взаимосвязь между ЭФР и ААТ, играющих содружественную роль в сдерживании эмфизематозного процесса (рис. 4,5). ТФРβ r=0,97 ЭФР ЭФР r=0,56 r=0,79 ААТ НЭ Рис. 4 Корреляционные взаимосвязи Рис. 5 Корреляционные взаимосвязи ЭФР в группе больных ХОБЛ ЭФР в группе больных ХОБЛ с нетяжелой эмфиземой с тяжелой эмфиземой Нами получены сильные корреляционные связи между ТИМП-1 и ЭФР, ИЛ-8, α2макроглобулином в группе больных ХОБЛ с тяжелой эмфиземой. В группе больных ХОБЛ с нетяжелой эмфиземой выявлена сильная корреляционная связь между ТИМП-1 и ФНО-α. 5. Взаимосвязь системных биомаркеров в сыворотке крови у больных ХОБЛ с буллезной эмфиземой и в группе больных ХОБЛ без булл. 18 5.1 Уровень системных биомаркеров в сыворотке крови в группах больных ХОБЛ с буллезной эмфиземой и эмфиземой без булл. Средние значения исходных показателей цитокинов ИЛ-8, ФНО-α, ЭФР, ТФР-β, ММП-9, ТИМП-1, ААТ, НЭ, α2макроглобулина в сыворотке крови в группах больных ХОБЛ с буллезной эмфиземой и эмфиземой без булл представлены в табл. 6. Таблица 6 Концентрация биомаркеров системного воспаления в сыворотке крови в группах больных ХОБЛ с буллезной эмфиземой и эмфиземой без булл. Показатель Median (25;75 percentile) Буллезная эмфизема Эмфизема без булл (n=12) (n=13) 13,1 (11,8-15,0) 12,8 (11,0-18,1) 7,7 (6,6-8,7) 6,3 (5,1-9,9) 124,1 (87,7-364,9) 120,7 (70,3-194,4) ММП-9, нг/мл 586,1 (309,6-1017,5)* 295,8 (186,1-590,1) ТИМП-1, нг/мл 604,4 (488,2-642,1) 547,6 (448,9-642,1) ААТ, г/л 1,55 (1,0-1,9) 1,5 (1,4-1,8) ТФР-β, нг/мл 0,92 (0,7-1,5) 0,92 (0,7-2,4) 181,9 (116,0-581,2) 187,7 (118,2-476,7) 1,1 (0,5-1,6)* 0,5 (0,4-1,3) 134,7 (60,4-531,9) 126,7 (63,4-315,7) 1,3 (1,2-1,9) 1,4 (1,1-1,5) ИЛ-8, пг/мл ФНО- α, пг/мл ЭФР, пг/мл НЭ, нг/мл ММП-9/ ТИМП-1 НЭ/ААТ α2макроглобулин, г/л *- р<0,05 ** p<0,01 ***- p<0,001 по сравнению с эмфиземой без булл В группе больных ХОБЛ с буллезной эмфиземой выявлено незначительное повышение концентраций ИЛ-8, ЭФР, НЭ/ААТ в сыворотке крови. Уровень ММП-9 более чем 1,5 раза достоверно выше в группе больных ХОБЛ с буллезной эмфиземой по сравнению с эмфиземой без булл. 5.2 Взаимосвязь уровней системных биомаркеров ХОБЛ в сыворотке крови в группах больных с буллезной эмфиземой и у больных с эмфиземой без булл. Обе группы достоверно отличались только по показателям ММП-9 и ММП9/ТИМП-1. Значение ММП-9 в формировании булл впервые показано в нашем исследовании. Сывороточный уровень ММП-9 у больных ХОБЛ с буллезной эмфиземой 19 значительно превышает таковой у больных с эмфиземой без булл. Сывороточные уровни ТИМП-1 в обеих группах были приблизительно одинаковыми. Как у больных с буллезной эмфиземой, так и больных с эмфиземой не имеющих булл нами выявлены корреляционные взаимосвязи между ИЛ-8 и НЭ, ММП-9, однако, в группе больных ХОБЛ с буллезной эмфиземой взаимосвязи сильнее, что позволяет думать о том, хемокиновые реакции при буллезной эмфиземе более выражены, чем при других формах болезни. В группе больных ХОБЛ с эмфиземой без булл обнаружены корреляционные взаимосвязи между ФНО-α и ММП-9, ТИМП-1, ЭФР. Отношение ММП-9/ТИМП-1 в группе больных ХОБЛ без булл выше такового в группе ХОБЛ с буллезной эмфиземой. Что позволяет сделать вывод о том, что одним из сдерживающих факторов развития булл является достаточный уровень и активность ТИМП-1. Наличие сильной прямой корреляционной взаимосвязи между ФНО-α и ЭФР у больных без булл может свидетельствовать о регенеративной активности сосудов, направленной на сохранение ткани легкого. Возможно увеличение числа и силы связей ФНО-α, ЭФР, ТФР-β ТИМП-1, ММП-9 у больных ХОБЛ без булл по сравнению с больными ХОБЛ с буллезной эмфиземой связано с многообразием клеточных и биохимических реакций при буллезной эмфиземе, как более тяжелого деструктивного процесса. ВЫВОДЫ 1. Установлено достоверное увеличение уровней ИЛ-8 и НЭ в сыворотке крови у больных ХОБЛ по сравнению с курильщиками без ХОБЛ, что свидетельствует о сохраняющихся процессах воспаления и протеолиза в фазу стабильного течения болезни. 2. Выявлены достоверные корреляционные взаимосвязи уровня СДЛА с ТФР-β (r=0,58), ИЛ-8 (r=-0,66), ФНО-α (r=0,61), ММП-9 (r=-0,58), что свидетельствует о роли данных биомаркеров в регуляции давления в легочной артерии у больных ХОБЛ. 3. Высокая концентрация ТФР-β на ранних этапах болезни (1-2 стадии) и незначительная при тяжелом и крайне тяжелом течениях (3-4 стадии) ХОБЛ, свидетельствует об истощении его протективной функции на поздних стадиях заболевания. 20 4. Эмфизематозный фенотип при ХОБЛ характеризуется наличием достоверно более высоких концентраций ММП-9, ММП-9/ТИМП-1, НЭ и НЭ/ААТ в сыворотке крови. 5. Эмфизематозный фенотип при ХОБЛ характеризуется более низким ИМТ, DLСО и низкой толерантностью к физической нагрузке в отличие от больных ХОБЛ с бронхитическим фенотипом. 6. У больных ХОБЛ с тяжелой эмфиземой выявлены высокие корреляционные взаимосвязи концентраций ЭФР с НЭ (r=0,79), ТФР-β (r=0,97) в сыворотке крови, доказывающие взаимосвязь процессов ангиогенеза с протеолизом и фиброгенезом у данной категории больных. 7. Больные с тяжелой эмфиземой характеризуются более высокими концентрациями ММП-9 и ММП-9/ТИМП-1 в сыворотке крови по сравнению с пациентами с нетяжелой эмфиземой, что подтверждает роль данных маркеров в формировании эмфиземы. 8. При буллезной эмфиземе выявлены более высокие концентрации ММП-9 и ММП9/ТИМП-1 в сыворотке крови, свидетельствующие о их участии в развитии булл. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Выявление у больных ХОБЛ высокого сывороточного уровня ТФР и низких уровней ИЛ-8, ФНО, ММП-9 в стабильном состоянии являются фактором риска развития легочной гипертензии и требуют мониторирования уровня давления в легочной артерии. 2. Низкий ИМТ и низкие показатели диффузионной способности легких характерны для больных эмфизематозным фенотипом ХОБЛ и требуют более углубленного обследования пациентов с применением метода компьютерной томографии для выявления форм, тяжести и распространенности эмфиземы. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Нейтрофильная эластаза и болезни органов дыхания / А.В.Аверьянов, А.Э.Поливанова // Пульмонология (5) 2006 – c.74-79. 2. Дефицит α1-антитрипсина и хроническая обструктивная болезнь легких / А.В.Аверьянов, А.Э.Поливанова // Пульмонология (3) 2007 – c.103-109. 21 3. Роль эмфиземы в прогрессировании хронической обструктивной болезни легких / А.В.Аверьянов, А.Г. Чучалин, А.Э.Поливанова, А.В. Черняк, Г.Э. Поливанов, Г.В. Неклюдова, Ж.К. Науменко, В.П. Колосов // Уральский медицинский журнал 3(43) 2008 – с.89-95. 4. Аспекты патогенеза эмфиземы легких у больных ХОБЛ / А.В.Аверьянов, М.В. Самсонова, А.Л. Черняев, А.Г. Чучалин, А.Э.Поливанова, Г.В. Николаев, В.И. Перепечин // Пульмонология (3) 2008 –с. 48-53. 5. Матриксная металлопротеиназа-9 у больных ХОБЛ / А.Э.Поливанова, А.В. Аверьянов, А.Г.Чучалин, К.А. Зыков, А.В. Черняк, Г.Э. Поливанов // Сборник трудов 16 Нац. Конгресса по болезням органов дыхания, Санкт-Петербург-2006 – с. 231. 6. Эндотелиальный фактор роста у больных ХОБЛ / А.Э.Поливанова, А.В. Аверьянов, А.В. Черняк, А.Г. Чучалин, К.А. Зыков, Г.А. Ткачев // Сборник трудов 16 Нац. Конгресса по болезням органов дыхания , Санкт-Петербург-2006-с.323. 7. Neutrophil elastase in severe COPD and asthma exacerbation / Аnna Polivanova, Kirill A. Zykov, Alexander Averyanov, V.B. Beilina, E.I. Kaznacheeva // Eur. Resp. J. vol.28. suppl.50 (2006) p.211. 8. Functional assessment of predominant emphysema localization / G.Polivanov, A. Averyanov, А. Polivanova, A. Cheryak, A. Chuchalin // Eur. Resp. J. vol.28. suppl.50 (2006) p.334. 9. Анализ структуры легочной ткани и внутригрудных объемов на разных стадиях ХОБЛ / Аверьянов А.В., Поливанов Э.Г., Поливанова А.Э., А.В. Черняк, А.Г. Чучалин // Сборник трудов 16 Нац. Конгресса по болезням органов дыхания ,2006 с.214. 10. Корреляционные связи рентгенологическими и маркеров воспаления биохимическими с показателями функциональными, у больных ХОБЛ А.В.Аверьянов, А.Э.Поливанова, А.В.Черняк, К.А. Зыков, А.Г. Чучалин, Г.А. Ткачев / Сборник трудов 16 Нац. Конгресса по болезням органов дыхания, СанктПетербург-2006 с.214. 11. Взаимосвязь рентгенологических и функциональных показателей у больных ХОБЛ/ Поливанов Э.Г., Аверьянов А.В., Поливанова А.Э., А.В. Черняк, Н.Н. Мещерякова, А.Г. Чучалин // Сборник трудов 16 Нац. Конгресса по болезням органов дыхания , Санкт-Петербург-2006, с.231. 22 12. Differences in serum levels of inflammatory markers , proteases and antiproteases in COPD patients with and without emphysema / Аnna E.Polivanova, Alexander Averyanov, Kirill A. Zykov //. Eur. Resp. J. vol.28 suppl.50 2007 36 S. 23
