2.2. Клиническая диагностика

ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов для количественного определения активности креатинкиназы МВ-фракции в сыворотке или плазме крови
человека иммунным кинетическим методом
«КРЕАТИНКИНАЗА-МВ -UTS»
Набор КРЕАТИНКИНАЗА-МВ-UTS разрешен к производству, продаже и применению на территории РФ.
Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/11189
Информация для заказа набора «КРЕАТИНКИНАЗА-МВ-UTS»
Кат. №
КК-МВ-030-100
где v – объем фотометрической ячейки анализатора.
Комплектация
Количество определений
Р1 80 мл + Р2 20 мл
100/v
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Набор реагентов «КРЕАТИНКИНАЗА-МВ-UTS» предназначен для определения активности МВ-фракции креатинкиназы в сыворотке крови человека
кинетическим методом с применением иммуноингибирования, рекомендованным Международной Федерацией Клинической Химии (IFCC) в клиникодиагностических и биохимических лабораториях для целей диагностики заболеваний и контроля проводимого лечения пациентов.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
2.1. Принцип метода
2.1. На первой стадии в исследуемом образце происходит ингибирование активности субъединицы М фракций креатинкиназы ММ (полностью) и МВ
(наполовину) с помощью специфичных антител. Затем под действием оставшегося активным в образце фермента креатинкиназы ВВ-фракции и половины МВфракции происходит перенос фосфатной группы с креатинфосфата на АДФ. В ходе последовательных ферментативных реакций НАДФ восстанавливается до
НАДФН. Увеличение концентрации НАДФН пропорционально исходной активности МВ-фракции креатинкиназы в пробе и измеряется фотометрически при
длине волны 340 нм.
КК ( АМФ. N  Ацетил Lцистеин)
Креатинфосфат  АДФ 
 Креатин  АТФ
Гексокиназа
АТФ  Глюкоза 
 АДФ  Глюкозо  6  Ф

Г 6Ф ДГ , H
Глюкозо  6  Ф  НАДФ   Н 2О 


Глюконат  6Ф  НАДФН  2.2.
Фотометрическое измерение основано на
наличии максимума поглощения света на длине волны 340 нм молекулами НАДФН. Все остальные компоненты реакционной смеси не поглощают свет на этой
длине волны. Таким образом, скорость увеличения концентрации НАДФН измеряется фотометрически при 340 нм и прямо пропорциональна активности МВфракции креатинкиназы в образце 1, 2].
2.2. Клиническая диагностика
2.2.1 Креатинкиназа – фермент, присутствующий в мышцах (М) и клетках мозга (В). В сыворотке фермент существует в виде димеров ММ, МВ, ВВ. В норме
активность МВ-фракции составляет 6% от общей активности креатинкиназы в сердечной мышце и до 3% в скелетных мышцах. Повышенные значения МВфракции наблюдаются при повреждениях сердечной мышцы (до 25% от общей креатинкиназы) и болезнях скелетных мышц. [1,2,3].
2.2.2. Клинический диагноз не может быть поставлен по результатам одного анализа, он должен объединять как клинические, так и лабораторные данные.
3. СОСТАВ НАБОРА
3.1. Поскольку рабочий реагент, содержащий все компоненты для обеспечения химической реакций, не стабилен, набор реагентов поставляется в виде двух
растворов Р1 и Р2.
Компоненты и их состав:
Наименование
Состав
Концентрация
Реагент 1 (Р1)
Имидазол буфер рН 6,7
100 ммоль/л
Буферный раствор
Глюкоза
20 ммоль/л
N-ацетил-L-цистеин
20 ммоль/л
Ацетат магния
10 ммоль/л
НАДФ
2,5 ммоль/л
Гексокиназа
более 4000 Е/л
ЭДТА
2 ммоль/л
Реагент 2 (Р2)
Субстратный
раствор
Креатинфосфат
АМФ
АДФ
Ди(аденозин-5’)-пентафосфат
Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа
Человеческие антитела к КК-М
30 ммоль/л
5 ммоль/л
2 ммол/л
10 мкмоль/л
более 1500 Е/л
достаточно для ингибирования более 3000 Е/л КК-ММ
4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
4.1. Набор обеспечивает линейную область определения активности креатинкиназы от 2 Е/л до 600 Е/л, отклонение от линейности не превышает 5%.
4.2. Чувствительность – не более 2 Е/л.
4.3. Воспроизводимость: коэффициент вариации результатов определений – не более 5%.
4.4. Качество набора можно оценивать по отечественным или зарубежным контрольным сывороткам, аттестованным по значению активности
креатинкиназы методом IFCC.
4.5. Для калибровки автоматизированных фотометрических систем рекомендуется использовать сывороточные калибраторы, аттестованные по значению
активности креатинкиназы методом IFCC.
4.6. Нормальные величины активности креатинкиназы-МВ в сыворотке или плазме взрослого человека составляют не более 2,0-19,5 Е/л при температуре 37 0С.
4.7. Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон значений нормальных величин для обследуемого контингента людей.
4.8. Перечень лекарственных препаратов, влияющих на определение активности креатинкиназы, приведены в обзоре [4].
5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
5.1. Потенциальный риск применения набора – класс 1 (ГОСТ Р 51609-2000). Основной риск косвенный и связан с возможностью получения неверного
результата анализа, что может привести к неправильно поставленному диагнозу и назначению неэффективного лечения пациента. Для снижения указанного
риска необходимо в каждой аналитической серии контролировать качество результатов анализов с применением контрольных сывороток в соответствии с
ОСТ 91500.13.0001-2003.
5.2. При выполнении лабораторного исследования необходимо соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии,
противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы
Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).
5.3. При работе с биологическими пробами следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы крови человека следует
рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирусы гепатита или любой другой
возбудитель вирусной инфекции.
6. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ
- Спектрофотометр, программируемый фотометр или анализатор, длина волны 340 нм, термостатируемая при 30 или 370 (±0,5 0С) кювета с длиной оптического
пути 10 мм*
- Термостат или водяная баня, обеспечивающие температуру 30 или +37 0 (±0,5 0С)
- Секундомер
- Пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 40, 50 и 1000 мкл
- Цилиндры мерные объемом 25 и 100 мл
- Колба коническая вместимостью не менее 150 мл
- 0,9% раствор NaCl (физиологический раствор)
- Вода дистиллированная или деионизированная.
- Перчатки резиновые или пластиковые.
*Внимание: при использовании кювет с длиной оптического пути, отличной от 10 мм, требуется перерасчет фактора набора. При использовании
биохимического анализатора с ненормированной длиной оптического пути требуется калибровка по сывороточным калибраторам, аттестованным
по значению активности креатинкиназы методом IFCC.
7.1. Негемолизированная сыворотка или плазма крови 1].

7. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Не использовать ЭДТА, гепарин, цитрат или фторид в качестве антикоагулянта, так как они непредсказуемо влияют на скорость реакции.
7.2. Сыворотку или плазму крови следует отделить от форменных элементов крови не позднее, чем через 1 час после забора крови.
7.3. Образцы сыворотки и плазмы крови стабильны при температуре +2-8 0С не более 2 дней, или 1 месяца при –20 0С.
8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
8.1. Определение активности общей креатинкиназы. Определить активность общей креатинкиназы при 37 0С, используя набор реагентов
«КРЕАТИНКИНАЗА-UTS».
8.2. Определение активности креатинкиназы-В.
8.3. Для запуска реакции субстратом реагенты готовы к использованию. Отобрать компоненты реакционной смеси с использованием пипеточных
дозаторов в объемах, указанных в таблице:
Наименование
Реагент 2
Сыворотка или плазма крови
Объем, мкл
250
50
Перемешать, инкубировать 2 минуты, затем добавить
Реагент 1
1000
8.4. Инкубировать 5 минут и измерить значение оптической плотности анализируемого образца (Dо) при длине волны 340 нм против дистиллированной
воды.
8.5. Повторить измерения оптической плотности пробы 3 раза с интервалом в 1 минуту (D1, D2 и D3).
Рассчитать среднее изменение оптической плотности пробы в минуту (ΔD):
ΔD = [(D0 –D1)+ (D1 –D2)+ (D2 –D3)]/(3*t),
где t – интервал времени (мин).
8.6. Запуск реакции образцом. Приготовление рабочего реагента. Смешать в колбе конической 4 объема Реагента 1 и 1 объем Реагента 2, отмеренные
мерными цилиндрами. Раствор рабочего реагента стабилен 14 суток при температуре 2-8 0С. Защищать от воздействия света.
8.2. Раствор рабочего реагента прогреть до температуры 37 0С.
8.3. Оптическая плотность рабочего реагента при 340 нм не должна превышать 0,30 ед. опт. плотн. (Б), (при использовании кювет с длиной
оптического пути 10 мм).
8.5. Проведение реакции.
Отобрать компоненты реакционной смеси с использованием пипеточных дозаторов в объемах, указанных в таблице:
Наименование
Объем, мкл
37 0С
Рабочий реагент
1000
Сыворотка или плазма крови
40
8.5. Инкубировать 5 минут и измерить оптическую плотность анализируемого образца (Dо) при выбранной температуре, при длине волны 340 нм против
дистиллированной воды.
8.6. Повторить измерения оптической плотности пробы 3 раза с интервалом в 1 минуту (D1, D2 и D3).
8.7. Рассчитать среднее изменение оптической плотности пробы в минуту (ΔD):
ΔD = [(D0 –D1)+ (D1 –D2)+ (D2 –D3)]/(3*t),
где t – интервал времени (мин).
8.8. Активность креатинкиназы-В в сыворотке или плазме крови А (Е/л) определить по формуле:
А = 4180ΔD Е/л
Для получения значения активности креатинкиназы-МВ полученную величину нужно умножить на 2.
8.9. Активность креатинкиназы-МВ в процентном отношении:
(Активность креатинкиназы-МВ) / (Активность общей креатинкиназы) х 100 % = % Активность КК-МВ
8.10. Для проведения анализа на полуавтоматическом анализаторе должен быть выбран кинетический режим измерений.
8.11. Пробы смешать, поместить в фотометрическую ячейку анализатора.
8.12. Результат анализа - активность креатинкиназы-МВ рассчитывается автоматически при введении в память полуавтоматического биохимического
анализатора фактора, равного 8360.
Для выполнения измерений на автоматическом биохимическом анализаторах следует:
Установить программу определения активности креатинкиназы-МВ согласно таблице:
Наименование параметра
Значение
Метод измерения
кинетический
Длина волны, нм
340
Измерение против
Воздух или дист. вода
Температура реакции
37 ОС
Единица измерения
Е/l, (МЕ/л)
Число знаков после запятой
0
Изменение оптической плотности
Уменьшается
Фактор*
Зависит от длины оптического пути
Соотношение рабочего реагента/проба
25:1
Количество измерений, не менее
3
Время лаг-фазы, мин
5
Время реакции, мин
1-3
Верхний предел абсорбции реагента против воды, Б
0,3
Нижний предел абсорбции реагента против воды, Б
0
Максимальная скорость изменения абсорбции, Б мин
0,27
Границы линейности, МЕ/л
2-600
Минимум нормы, МЕ/л
2,0**
Максимум нормы, МЕ/л
19,5**
* - Перед первым использованием набора а также при получении новой серии необходимо определить значение фактора по мультикалибратору,
аттестованному по активности креатинкиназы-МВ методом IFCC. Полученное значение ввести в память анализатора.
** - Нормальные величины активности креатинкиназы-МВ у мужчин.
Соотношение между активностью КK-MB и общей активностью КK, которое равняется приблизительно 4% должно вызывать подозрения, а выше 10%
ассоциироваться с острым инфарктом миокарда5.
9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
9.1. Набор реагентов «Креатинкиназа-МВ-UTS» должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2-8 ОС в течение всего срока
годности. Замораживание компонентов набора не допускается.
9.2. Срок годности набора указан на этикетке набора.
9.3. Реагенты 1 и 2 после вскрытия флаконов могут храниться при температуре 2–8 0С в плотно закрытых флаконах в темном месте в течение 6 месяцев.
9.4. Рабочий реагент можно хранить в плотно закрытом флаконе при температуре 2–8 0С не более 14 суток в защищенном от света месте.
9.5. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.
Список литературы
1. Szasz, G., Grober, W and Bernt, E. Clin. Chem. 22 : 650 (1976)..
2. German Society for Clinical Chemistry: Recommendations of the Enzyme Commision. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 15 : 255 (1977).
3. Young, D.S. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests. 4 th Edition. AACC Press (1995).
4. Auvinen, S. Acta. Med. Scand. (Suppl. 539) (1972)..
5. Doran, G.R., and Wilkinson, J.H. Clin. Chim. Acta. 62 : 203 (1975).
6. Fisher, M.D., Carliner, N.H., Becker, L.C., Peters, R.W. y Plotnick, G.D. J.A.M.A. 249 : 393 (1983).
Производится ООО «Эйлитон» по заказу ЗАО «А/О Юнимед».
По вопросам, касающимся качества набора «ЛДГ–UTS» следует обращаться в ЗАО «А/О ЮНИМЕД» по адресу: 129301, Москва, ул. Касаткина, 3а;
Тел. (495) 734-91-31, 8-800-333-91-31,
Факс: (495) 564-86-41;
E-mail: [email protected]; http://www.unimedao.ru