ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ РУЧНОЙ МЕТОДИКИ МЕТОДОЛОГИЯ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ
С ПОМОЩЬЮ РУЧНОЙ МЕТОДИКИ
МЕТОДОЛОГИЯ
Это информативный клинический метод анализа белков сыворотки крови, плазмы,
мочи, цереброспинальной и других биологических жидкостей с помощью
электрофореза. Электрофорез является единственным надежным способом
обнаружения парапротеинов в биологических жидкостях, а также - первичной
процедурой отбора.
Клиническое использование электрофореза белков в целом основано на простом
электрофоретическом разделении белков с учетом их относительной подвижности и
молекулярной массы (альбумин, α1, - α2 ... β (β1, β2) ,гамма- глобулин)
КЛИНИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ, ХРАНЕНИЕ.
Для проведения анализа используется следующий материал:
1. Кровь: анализ проводить на сыворотке крови, чтобы исключить появление участков
фибриногена (в плазме), т.к. их миграция в гамма-зону может привести к ложной
интерпретации данных. Производится забор венозной крови в пробирку, натощак. После
центрифугирования, надосадочную жидкость (сыворотку) можно хранить при 4-8°С в
течение 48-72 часов. Хранение при температуре -20°С, может нарушить некоторые
электрофоретические модели. Известно, что белки являются стабильными в течение 2-3
дней при температуре 4°C, но компоненты сыворотки, такие как липопротеиды и
изоферменты являются неустойчивыми, и поэтому сыворотка должна быть протестирована в
течении 1-2 часов. Следует проявлять осторожность для предотвращения гемолиза в
сыворотке крови, а так же не использовать хилезную кровь, поскольку - это может
привести к появлению ложных пиков в зоне α2 и β-фракций.
2. Спинномозговая жидкость (ликвор): Ликвор на 99% состоит из воды (плазма крови —
на 93%). Осмолярность ликвора и крови очень схожи, другие показатели имеют
незначительные различия. Около 80% белка поступает в ликвор из крови и 20%
продуцируется клетками ЦНС. Фильтрационное сопротивление для белков плазмы
повышается в зависимости от молекулярного размера и, следовательно, отношение крупных
белков обычно намного ниже, в ликворе, чем в плазме. Содержание белка в СМЖ в
диапазоне 15-40 мг/дл. Поэтому для электрофореза необходимо использовать 150-кратную
концентрацию.
3. Анализ мочи: Анализ мочи показывает, что в нормальной моче содержится несколько
видов белков в разбавленном состоянии, поэтому для получения достоверных данных моча
должна быть концентрированной. Для обнаружения белка Бенс-Джонса, свободных Каппа и
Лямбда легких цепей, образцы должны иметь концентрацию ≥100 мг/дл – для общего белка
и около 80 г/дл – для иммуноглобулинов.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
• Работать только в одноразовых перчатках - буфер токсичен;
• Работа с уксусной кислотой требует наличия вытяжных шкафов;
• Все реагенты должны быть использованы в соответствии с инструкциями, и до
истечения даты, указанной на наборе;
•
•
•
•
Не использовать агарозный гель, если он недостаточно просушен;
Агарозный гель не замораживать;
Хранить набор в горизонтальном положении;
Не использовать гемолизированную сыворотку или плазму (фибриноген).
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
1.НЕОБХОДИМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Источник питания 25-250B «Hellabio».
Камера для электрофореза «Hellabio».
Держатель геля «Hellabio».
Набор контейнеров для окрашивания /отмывки «Hellabio».
Сушильная камера геля «Hellabio».
Вортекс «Micro-Spin», «Minigen»
Компьютер, сканер, принтер.
Программное обеспечение HELLABIOSCAN GEL ANALYZER или денситометр (520 – 600нм).
Набор автоматических пипеток переменного объема.
Халат и одноразовые перчатки.
Одноразовые микропробирки на 1,5мл .
Штатив для микропробирок.
Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема 5-40 мкм.
Емкость для хранения буфера объемом 1000мл.
Емкость для хранения окрашивающего раствора объемом 500 мл.
Мерный цилиндр объемом 1000 мл.
Ножницы.
Емкость с дезинфицирующим раствором.
2. НЕОБХОДИМЫЕ РЕАГЕНТЫ И ОБОРУДОВАНИЕ – содержатся в каждом наборе
Hellabio.
Внимание! Для получения наилучших результатов реагенты, входящие в комплект, должны
быть использованы вместе. Для постановки необходимо 600 мл 10% уксусной кислоты.
Код
PE 10
PE 14
PE 20
PE 28
MPE
Тест/набор
100
140
200
280
48
Содержимое наборов (необходимые реагенты):
Реактив
Агарозные гели (Agarose Gels)
Электрофорезный буфер (Electrophoresis Bufffer)
Окрашивающий раствор (Staining Solution)
Фильтровальные полосы для геля (Gel Blotter Strips)
Раствор для разведения (Diluent Solution)
Шаблоны образцов (Sample Templates)
Методические рекомендации на русском/английском языках
Объем (мл)
40
40
5 мл
-
Количество (шт)
10
1
1
1
1
1
2
Подготовка реактивов для проведения электрофореза:
Все реактивы фирмы Hellabio должны храниться при температуре 4-25°C до истечения даты, указанной
на комплекте(в среднем 15месяцев). Внимание: буфер токсичен, работать в перчатках.
1. Приготовление рабочего буфера: взять мерный цилиндр на 1000 мл.
2. Развести 40 мл концентрированного буфера (Protein Electrophoresis Buffer) в 960 мл
дистиллированной воды.
3. Перелить рабочий буфер в подготовленную емкость и пометить дату, рабочий буфер хранится
3 месяца, с даты изготовления, при комнатной температуре в темном прохладном месте, в
закрытой колбе.
4. Приготовление рабочего окрашивающего раствора: хорошо взболтать окрашивающий раствор
(Protein Staining Solution).
5. Взять мерный цилиндр на 250 мл и смешать 210 мл 10% уксусной кислоты с 40 мл
окрашивающего раствора (Protein Staining Solution).
6. Перелить рабочий раствор окрашивающего раствора в емкость для хранения. Расход
окрашивающего раствора обеспечивает возможность постановки соответственно
комплектации набора (10 пластинок).
7. В качестве отмывочного раствора будет использоваться 10% уксусная кислота.
Порядок работы
1. Отобрать необходимое количество микропробирок, включая контроль. Промаркировать
пробирки. Внести в каждую по 10 мкл свежего образца сыворотки (не плазмы) и по 20
мкл раствора для разведения (Diluent Solution). Пробы тщательно перемешать на
вортексе.
2. Заполнить электрофорезные камеры необходимым количеством рабочего буфера в
зависимости от объема камеры;
3. Раскрыть упаковку агарозного геля. Используя одноразовый наконечник, приподнять
пластину агарозного геля (место обозначено стрелкой) и извлечь гель из упаковки.
Положить гель в горизонтальном положении на крышку
упаковки.
4. Извлечь фильтровальную полосу (Gel Blotter Strips) из
упаковки. Промокнуть гель фильтровальной полосой в зоне
нанесения образца (отмечено двумя точками на краях геля).
Удалить фильтровальную полосу с агарозного геля.
5. Извлечь шаблон образцов из упаковки (Sample
Tamplates). Установить шаблон для
образцов в зоне нанесения. Провести указательным пальцем по шаблону, для усиления
контакта шаблона с гелем и предотвращения попадания пузырьков воздуха в лунку для
образца.
6. В каждую лунку шаблона образцов внести по 5мкл пробы и оставить на 1 минуту.
7. Взять фильтровальную полосу. Промокнуть шаблон образцов
фильтровальной полосой. Одномоментно удалить шаблон
образцов и фильтровальную полосу с поверхности геля.
8. Установить гель в гелевый держатель. Опустить гелевый
держатель в элекрофорезную камеру. Образцы находятся на
катодной стороне.
9. Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (белок движется к
положительному аноду). При использывании камеры и источника питания «Hellabio»
параметры следущие : напряжение 120 В, время электрофореза 20 минут (в случае
использования мини гелей, на 3 лунки - 18 мин/120 В).
10. Отключить источник питания от электрофорезной камеры. Извлечь гель из гелевого
держателя.
11. Поместить гель в сушильную камеру (температура 75°С). Высушить гель полностью
(показателем является отсутствие пятен на пластине геля).
12. Подготовить камеру окрашивания/отмывки, для этого: заполнить один контейнер
рабочим окрашивающим раствором, три контейнера 10% уксусной кислотой.
13. Поместить высушенный гель (пленку) в контейнер для окрашивания на 5 минут.
14. Извлечь окрашенный гель. Промыть пленку по 5 минут в 3-х контейнерах для промывки.
15. Поместить гель в сушильную камеру (температура 75°С). Просушить гелевую пластину.
16. Перенести гельевую пластину в сканер. Получить изображение и оценить результаты в
программе HellabioScan или используя фильтр денситометра 520-600 нм.
УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Калибровка: Оценку электофорограмм при парапротеинемии можно легко сделать
визуально. Для количественного анализа можно использовать HellabioScan или денситометр
(520 – 600нм).
Интерпретация результатов: Качественная интерпретация результатов может быть
произведена визуально путем сравнения образца с шаблоном. Для количественной
интерпретации результатов используют программу HellabioScan или денситометр (520нм600нм).
Точность: При проведении электрофореза на агарозном геле допустимо отклонение
показателей в пределах 5%, в исследуемых образцах по сравнению с контрольным.
Значения, приведенные в таблице для электрофореза сывороточных белков на агарозном
геле Hellabio. Диапазон нормальных значений для агарозных гелей Hellabio был определен
путем расчета среднего значения + / -2 стандартное отклонение по каждой белковой фракции
(исследованы 200 образцов сывороток крови практически здоровых взрослых доноров
мужчин и женщин).
Для каждой лаборатории рекомендовано выработать собственный диапазон показателей
нормы согласно системе анализа (HellabioScan или денситометрии). Сделать это необходимо
единоразово, для дальнейшего использования и контроля. Качественная интерпретация
результатов может быть произведена визуально путем сравнения образца с шаблоном. Для
количественной интерпретации результатов используют программу HellabioScan или
денситометр (520нм-600нм).
Белковые
фракции
Показатели нормы,
%
Альбумин
α1 α2 βγ-глобулин
52.0 … 65.0
2.0 - 5.5
6.0 - 11,7
8.2 - 14,7
9.5 … 19.8
Электрофореграмма
Протокол