Морфологическая верификация роли апоптоза в гибели

Морфологическая верификация роли апоптоза в гибели
кардиомиоцитов при ишемической болезни сердца.
Т.Э.Владимирская, И.А.Швед, Г.Я.Хулуп
Белорусская медицинская академия последипломного образования,
г. Минск, Беларусь
Основной
постулат,
который
принят
в
настоящее
время
большинством исследователей, сводится к признанию апоптоза в качестве
одного из механизмов, лежащих в основе гибели кардиомиоцитов в
ишемических участках сердца [1-6]. Апоптоз кардиомиоцитов имеет свои
отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на
ультраструктурном уровне. Доказано, что апоптоз может быть ответственен за
итог смерти кардиомиоцитов во время острого инфаркта миокарда так же как и
за прогрессирующую потерю выживших клеток в пораженном миокарде.
Типичный апоптоз может быть индуцирован в кардиомиоцитах в условиях
эксперимента. В клинике при поражениях сердца, напротив, существует очень
мало прямых морфологических доказательств апоптоза кардиомиоцитов,
происходящего на всех стадиях инфаркта миокарда (ИМ), ишемической
болезни сердца (ИБС), несмотря на доступность большинства непрямых
доказательств, включающих такие, как детекцию ДНК-фрагментации и
апоптоз-связанных факторы. По этой причине, потенциальная эффективность
терапевтического вмешательства для предупреждения апоптоза остается
спорной [7, 8].
Целью данного исследования было выявление апоптоза кардиомиоцитов
(КМЦ) лиц с кардиоваскулярной патологией (ИБС) и характеристика
особенностей апоптотической гибели КМЦ при ИБС.
Материал и методы исследования.
В исследовании использованы 27 сердец умерших больных, страдавших
ИБС. В качестве сравнения изучены сердца (n=5) лиц без кардиоваскулярной
патологии, погибших от несчастных случаев.
1
В группу ИБС были включены 27 наблюдений: 15 мужчин (средний
возраст 58,3±5,3), 12 женщин (средний возраст 75,4±2,8).
Причина
смерти,
верифицированная
на
основе
результатов
морфологических исследований: ишемическая болезнь сердца — в 27
наблюдениях, в том числе
1. инфаркт миокарда (в т.ч. донекротическая стадия) в - 7;
2. постинфарктный кардиосклероз в - 9;
3. сердечная недостаточность в - 11;
Материал для исследования во всех случаях брался из правого и левого
желудочков, межжелудочковой перегородки на среднем уровне, из передней,
боковой и задней стенки сразу. Вырезали продольные и поперечные кусочки,
включающие все оболочки сердца. Кусочки сердца (правый и левый
желудочки, межжелудочковая перегородка) фиксировали в 10% нейтральном
формалине в течение 48 часов. Затем промывали в проточной воде,
обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, проводили через спиртхлороформ, хлороформ, хлороформ-парафин и заливали в парафин. Из
парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 4-5 мкм, которые
окрашивали гематоксилином и эозином, гематоксилином-основным фуксиномпикриновой
кислотой
(ГОФП),
комбинированным
методом
для
одномоментного выявления эластических, коллагеновых и мышечных волокон
(MSB и по Харту) и ШИК-методом для верификации морфологических
признаков ИБС.
Для выявления апоптоза использовали коммерческий набор Cardio
TACS™ Colorometric TUNEL System (Trevigen, США). Данный метод
разработан специально для выявления апоптотической гибели кардиомиоцитов,
основан на мечении концевых отделов апоптозоспецифичных моно- и
олигонуклеосомных фрагментов ядерной ДНК Terminal deoxynucleotidyl
transferase (TdT) с последующей их визуализацией путем присоединения
вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой, и образования
иммунокомплексов с субстратом (диаминобензидин). Специальный реагент
2
CytoninTM позволяет идентифицировать апоптотические кардиомиоциты и
дифференцировать их от других клеток миокарда. Для фонового окрашивания
применялся гистологический краситель Nucleare Fast Red.
Изучение препаратов, и изготовление микрофотографий проводили с
помощью
микроскопа
DMLS
с
программным
обеспечением
(«Leica»,
Германия). Измерения проводили на увеличении 400 в 5 случайно выбранных
полях зрения по каждому препарату. Апоптозный индекс (АИ) вычислялся по
TUNEL-позитивным КМЦ на 100 клеток по следующей формуле:
АИ =
Число TUNEL-позитивных КМЦ
Общее число КМЦ
 100
Результаты и обсуждение.
При изучении гистологических препаратов сердца лиц с ИМ на
ишемической стадии (3 умерших) наблюдались следующие изменения:
неравномерная гипертрофия КМЦ, в зонах ишемии, саркоплазма КМЦ
отличалась оксифилией, нечеткой поперечной исчерченностью. Отмечались
сегментарные и субсегментарные контрактуры I и II степени, распад
миофибрилл на глыбки в результате очагового лизиса. В КМЦ наблюдались
зоны неравномерного окрашивания с участки яркой эозинофилии, волнистость
контуров КМЦ. В гистологических срезах умерших, как в зонах ишемии, так и
вне их, при трехцветной окраске (MSB) определялись диффузный сетчатый и
мелкоочаговый периваскулярный фиброз, различной степени выраженности
отек стромы.
В коронарных артериях умерших от острого ИМ выявлялись
нестабильные
атеросклеротические
бляшки
с
повреждением
соединительнотканной покрышки с развитием пристеночного тромба, либо
явления коронаротромбоза. Микроскопически наблюдалось неравномерное
кровенаполнение капилляров, с формированием лейкостазов, очаги венозного
полнокровия, отек стромы с появлением в ней единичных лейкоцитов. ИМ на
3
некротической стадии выявлен у 3 умерших. Исследование микропрепаратов
сердца показало наличие ишемического некроза с геморрагическим ободком.
По
периметру
некроза
наблюдался
лейкоцитарный
вал
без
распада
нейтрофилов, отграничивающий участки повреждения. Микроскопически
наблюдался выраженный коагуляционный некроз КМЦ, цитоплазма их
гомогенная, ярко оксифильная, часть клеток фрагментированы, в единичных
сохранялись ядра. Наблюдались неравномерное полнокровие капилляров, стаз в
мелких сосудах, сосуды полнокровные, мелкие очаги кровоизлияний. На стадии
начальной
организации
ИМ
был
выявлен
у
одного
умершего.
В
микропрепаратах сердца отмечались резорбция некротизированных миоцитов,
некроз единичных КМЦ, элементы грануляционной ткани: макрофаги,
лимфоциты,
фибробласты,
мелкие
полнокровные
кровеносные
сосуды,
сидерофаги. Формировались тонкие рыхло расположенные коллагеновые
волокна.
При изучении гистологических препаратов сердца лиц с постинфарктным
кардиосклерозом
(9
умерших)
наблюдались
следующие
изменения:
крупноочаговый и мелкоочаговый кардиосклероз, склероз интрамуральных
артериол, полиморфизм, гипертрофия и/или атрофия мышечных волокон и
контрактуры КМЦ. Коллагеноволокнистые рубцы в случаях крупноочагового
кардиосклероза
представлены
грубоволокнистой
гиалинизированной
бессосудистой тканью, состоящей из коллагеновых волокон с признаками
метахромазии.
Отмечался
лимфогистиоцитарная
диффузного
неравномерный
отек
инфильтрация интерстиция
мелкоочагового
и
стромы,
жировая
и
миокарда. В случаях
атеросклеротического
кардиосклероза
наблюдалось обилие тонких коллагеновых волокон, присутствие элементов
грануляционной ткани: сосуды, зрелые фибробласты, макрофаги. Отмечались
выраженные
дистрофические
изменения
КМЦ:
контрактуры,
очаговый
миоцитолизис, первичный глыбчатый распад миофибрилл. В коронарных
артериях выявлялись атеросклеротические бляшки. В микропрепаратах
миокарда умерших от острой или прогрессирующей хронической сердечной
4
недостаточности (11 умерших) во всех случаях наблюдался выраженный
полиморфизм КМЦ (гипертрофия и атрофия), волнистость контуров КМЦ,
выраженный отек стромы. В 10 случаях из 11 отмечалась распространенная
фрагментация
мышечных
волокон,
сопровождающаяся
лейкоцитарной
реакцией стромы. В одном наблюдении отмечался некроз проводящих
миоцитов, избыточное накопление липофусцина в цитоплазме КМЦ, изменение
формы ядер
КМЦ, липоматоз стромы
миокарда (рис.1а). Изменения
гемодинамики во всех случаях были однотипными и включали малокровие
артериальных сосудов, полнокровие вен и сосудов МЦР, очаговый распад
стенки вен, стаз крови в капиллярах, умеренно выраженный периваскулярный
фиброз.
В микропрепаратах миокарда лиц без кардиоваскулярной патологии,
окрашенных методом TUNEL, апоптоз КМЦ не выявлялся. Ядра КМЦ на
контрольных препаратах окрашивались ядерным красителем Nuclear Fast Red в
красно-коричневый цвет, цитоплазма КМЦ имела желтоватую окраску.
При исследовании микропрепаратов сердца лиц с ИМ выявлялись
множественные клетки с апоптотически измененными ядрами. Наблюдались
следующие морфологические признаки апоптоза: конденсированный хроматин
блестящий и четко отграниченный, располагался вблизи ядерной оболочки,
принимая форму полукруга, полумесяца или подковы. Клетка сморщена в связи
с конденсацией цитоплазмы, которая происходит перед тем, как клетка делится
на множество долек и затем фрагментируется (рис.1).
Апоптотический индекс при ИМ составил 21,6±7,0%. Обращало на себя
внимание различие в частоте встречаемости и локализации апоптотических
КМЦ при ИМ на донекротической стадии (АИ=30,1±7,7%) и на стадии некроза
(АИ=7,7±3,8). Апоптотические клетки при ишемическом ИМ определялись в
зоне,
идентичной
зоне
ишемии,
на
микропрепаратах,
окрашенных
общегистологическими методами. Практически все сохранившиеся ядра в КМЦ
с волнистыми контурами (сегментарные контрактуры) имели признаки
апоптоза. При ИМ с отчетливо выявляемой зоной некроза АИ был значительно
5
более низким. Апоптотические клетки регистрировались в зоне некроза, и в
незначительных количествах в перифокальной зоне.
Отчетливая картина апоптотической гибели клеток наблюдалась в
миокарде умерших с крупноочаговым кардиосклерозом (АИ=47,4±12,5%).
Сохранившиеся миоциты в зоне рубца и в перифокальной зоне имели
апоптотически измененные ядра (рис.2).
В случаях мелкоочагового и атеросклеротического кардиосклероза АИ
был значительно ниже и составлял 1,2±0,8%. В среднем у пациентов с
постинфарктным кардиосклерозом АИ составил 16,5±5,5%.
В микропрепаратах сердца умерших от сердечной недостаточности более
часто по сравнению с другими умершими от ИБС выявлялись полиморфные
интенсивно окрашенные внеклеточно располагающиеся апоптотические тельца
(рис. 3).
АИ в миокарде умерших от сердечной недостаточности составлял в
среднем 9,5±2,5%. Апоптотические клетки выявлялись практически по всей
площади
среза,
наибольшее
их
количество
отмечалось
в
зонах,
соответствующих зонам фрагментации КМЦ и в КМЦ с волнистыми контурами
- контрактурно измененные КМЦ (рис.4).
Заключение.
Проведенные исследования показывают, что апоптоз является основной
формой гибели КМЦ при ранней (донекротической) стадии ИМ, при
крупноочаговом постинфарктном кардиосклерозе и ИБС с острой или
прогрессирующей хронической сердечной недостаточностью. У умерших
больных с ИМ апоптотический индекс варьирует от 30,1±7,7% при
ишемической стадии ИМ до 7,7±3,8% при ИМ на стадии некроза.
Апоптотические
индексы
у
умерших
больных
с
постинфарктным
кардиосклерозом и сердечной недостаточностью составляют 16,5±5,5% и
9,5±2,5% соответственно.
6
Список литературы:
1.
MacLellan WR, Schneider MD. Death by design. Programmed cell death in
cardiovascular biology and disease // Circ Res. – 1997. - №81. – Р.137–144.
2.
Elsasser A, Suzuki K, Schaper J. Unresolved issues regarding the role of
apoptosis in the pathogenesis of ischemic injury and heart failure // J Mol Cell
Cardiol.- 2000. - №32. – Р.711–724.
3.
Narula J, Kolodgie FD, Virmani R. Apoptosis and car-diomyopathy // Curr
Opin Cardiol. – 2000. - №15. – Р.183–188.
4.
Rodriguez M, Lucchesi BR, Schaper J. Apoptosis in myocardial infarction
// Ann Med. – 2002. - №34. –Р.470–479.
5.
Takemura G, Fujiwara H. Role of apoptosis in remodel-ing after
myocardial infarction // Pharmacol Ther. – 2004. – №104. – Р.1–16.
6.
Reeve JL, Duffy AM, O’Brien T, Samali A. Don’t lose heart - therapeutic
value of apoptosis prevention in the treatment of cardiovascular disease // J Cell Mol
Med. – 2005. - №9. – Р.609–622.
7.
Meldrum D.R. Tumor necrosis factor in the heart // Amer. J. Physiology. –
1998. – № 3, Pt 2. – Р. 577-595.
8.
Freude B, Masters TN, Robicsek F, Fokin A, Kostin S, Zimmermann R,
Ullmann C, Lorenz-Meyer S, Schaper J. Apoptosis is initiated by myocardial
ischemia and executed during reperfusion // J Mol Cell Cardiol. -2000.-№ 32. – Р.
197–208.
7
1.Апоптоз при ИМ. Характерное
расположение блестящего
гомогенного конденсированного
ядерного хроматина на
периферии ядра. Метод TUNEL x
400
2. Апоптоз при крупноочаговом
кардиосклерозе. В зоне рубца –
КМЦ с апоптотическими ядрами.
Метод TUNEL x100
3. Апоптоз при сердечной
недостаточности. Множественные
апоптотические тельца. Метод
TUNEL x 400
4. Апоптоз при сердечной
недостаточности.
Фрагментированные КМЦ с
апоптотическими ядрами. Метод
TUNEL x100
8