ОТВЕТ АНТИКОАГУЛЯНТНЫХ ПУТЕЙ ПРИ ДВС

ОТВЕТ АНТИКОАГУЛЯНТНЫХ ПУТЕЙ ПРИ ДВС
Флетчер Тейлор
Оклахома, США 2004 г.
Введение
В первой части данного обзора будут рассмотрены 4 функциональных домена
гемостатической системы и патофизиология их реакции у человекообразных обезьян
(бабуинов) при гемостатическом и воспалительном стрессах. Особое внимание будет
уделено антикоагулянтному домену и его роли в регуляции ответа других трех доменов на
различные степени стресса. Во второй части этого обзора будет описано каким образом
такой подход может использоваться в процессе определения различия между
компенсированными реакциями (скрытый ДВС) и некомпенсированными (ДВС-синдром с
клиническими проявлениями) на воспалительный стресс, наблюдаемый при сепсисе и
травматическим повреждением. Реакция компонентов антикоагулянтной системы будет
особо рассмотрена и соотнесена с молекулярными маркерами микрососудистого
эндотелиального повреждения для того, чтобы продемонстрировать их диагностическую
ценность как маркеров ранней стадии ДВС и микрососудистого повреждения у пациентов
с риском развития септического шока.
А. Регуляторная роль и патофизиология реакции антикоагулянтных факторов на
гемостатический и воспалительный стрессы (механизмы действия):
Четыре функциональных домена гемостатической системы:
Антикоагулянтный и коагулянтный домены, действующие через сосудистый эндотелий и
тромбоциты, конкурируют друг с другом за контроль образования тромба.
Фибринолитический и антифибринолитический домены аналогичным образом
конкурируют друг с другом за контроль удаления тромба. Все четыре домена реагируют
на тромбин через его воздействие на эндотелий сосудов, тромбоциты и фибриноген.(1,2)
Ключом к пониманию этой комплексной системы является то, что существует градация
ответов на тромбин. Сосудистый эндотелий и связанные с ним антикоагулянтная и
фибринолитическая системы являются наиболее чувствительными, далее следуют
тромбоциты, а фибриноген является последним по быстроте реакции. При нормальных
обстоятельствах небольшие количества тромбина, которые образуются «спонтанно» в
микрососудах, связываются рецепторами сосудистого эндотелия, такими как
тромбомодулин (ТМ).(3,4) Эти взаимодействия ведут к образованию активированного
протеина С (АПС)(3) и к высвобождению активатора тканевого плазминогена (АТП).(5,6)
Активированный протеин С блокирует дальнейшую выработку тромбина путем
инактивации факторов Vа и VIIIа по типу негативной обратной связи.(3,4) Активатор
тканевого плазминогена лизирует любой фибрин (FDP), который может образовываться
путем активации плазминогена в плазмин.(7)
Коагулянтная и фибринолитическая системы начинают действовать в случаях, когда
эндотелий отсутствует (повреждение сосуда) или не функционирует из-за нарушения
обмена веществ (например, при диабете)(8) или из-за действия воспалительных медиаторов
(цитокинов, эндотоксинов).(9-12) Отсутствие эндотелия подвергает тромбоциты действию
коллагена, начинается аггрегация тромбоцитов, сосредоточение факторов свертывания
(Ха)(13) и высвобождение из этих тромбоцитов ингибитора активатора плазминогена
(ИАП).(14-16) Стимулирование дисфункционального эндотелия или активация
моноцит/макрофагов воспалительными медиаторами приводит к экспрессии тканевого
фактора,(17) который активирует как прокоагулянтные, так и антифибринолитические
реакции, описанные выше.
Эта четырех-квадрантная система предназначена, с одной стороны, для поддержания
жидкого состояния крови, с другой - чтобы предупредить утечки в сосудистой стенке.
Необратимый микрососудистый тромбоз происходит только тогда, когда оба этих
элемента, которые сохраняют жидкое состояние (антикоагулянт/фибринолитические
квадранты) становятся нефункциональными из-за ненормальных метаболических или
воспалительных состояний. Поскольку антикоагулянтная система является главной темой
этого обзора, компоненты этой области будут описаны. Также будут рассмотрены влияния
гемостатического и воспалительного стрессов в чистом виде на равновесие между этой
системой и между другими тремя функциональными областями.
Протеин С и другие антикоагулянтные системы, которые происходят из сосудистого
эндотелия.
Существует несколько регулирующих сетей (антикоагулянтная и
профибринолитическая), действующих через эндотелий. Вместе их можно рассматривать
как регулирующую сеть, связанную с эндотелием (РССЭ), которая защищает эндотелий
сосудов.
а. Система протеина С представляет собой антикоагулянтную тромбин-зависимую
систему, в которой образование тромбина влечет за собой образование на поверхности
эндотелия эквивалентной концентрации активированного протеина С через комплекс
тромбин/тромбомодулин (ТМ).(8) АПС инактивирует прокоагулянтные кофакторы Vа и
VIIIа, что блокирует дальнейшее образование тромбина. Эта реакция усиливается вторым
эндотелиальным рецептором протеина С (ЭРПС)(18-21) и кофактором протеина S.(22,23)
в. Система ингибитора пути тканевого фактора (ИПТФ) представляет собой
зависящую от фактора Ха антикоагулянтную систему требований, в которой за
образованием фактора Ха следует образование в плазме и на поверхности эндотелия
эквивалентной концентрации комплекса фактор Ха/ИПТФ.(24) Этот комплекс блокирует
активность прокоагулянтного комплекса тканевой фактор/VIIа, скопившегося на
поверхностях поврежденных нефункциональных эндотелиальных клеток и активированых
моноцит/макрофагов.(25)
с. Простациклин высвобождается дозо-зависимым образом из эндотелия с помощью
тромбина.(26) Это снижает эксперессию GРIIв-IIIа тромбоцитов посредством повышения
активности циклической АМФ, ослабляя связь фибриногена с тромбоцитами и
активацию/аггрегацию тромбоцитов.
d. Антитромбин, связанный с гликозаминовыми (GАG) концами на поверхности
эндотелия, связывается стехиометрически с тромбином. Он непосредственно блокирует
его протеолитическое действие и «выбивает» тромбин из комплексов
тромбин/тромбомодулин.(27)
е. АТП, хотя он не является антикоагулянтом, также высвобождается из эндотелия
посредством тромбина дозозависимым образом.(28) АТП ограничивает отложение фибрина
путем удаления его, активизируя плазминоген, связанный с фибрином в плазмин,
который, в свою очередь, лизирует фибрин по мере его образования.(28)
В то время как каждая из этих систем имеет другие функции, их антикоагулянтные
функции происходят их эндотелия. Каждая действует на различных этапах коагуляции.
Например, протеин С и ИПТФ блокируют коагуляцию путем позитивной ферментной
обратной связи, направленной на факторы Vа и кофакторы VIIIа и комплекс тканевой
фактор/фактор VII, соответственно. Это создает условия для гибкой ферментативной
реакции, интенсивность которой определяется количеством тромбина или фактора Ха,
первоначально образованного поблизости от клеточной поверхности эндотелия.
Антитромбин, в отличие от этого, с его гепариноподобными GAG-ми кофакторами,
напрямую связывается с тромбином стехиометрически и освобождает его от рецепторов
(тромбомодулина) на поверхности эндотелия.(27)
Тот факт, что все эти антикоагулянтные регуляторные системы действуют с
эндотелия сосудов помещает их в лидирующую позицию защиты эндотелия, особенно
эндотелия микрососудов от воспалительного/гемостатического стресса, происходящего от
активации инородными материалами (например, бактериями, вирусами и др.) плазмы и
клеточных компонентов крови и фиксированных макрофагов. Поскольку воспалительный
стресс, причиной которого является сепсис или травма, оказывает влияние прежде всего
на эндотелий сосудов, знание реакции и состояния антикоагулянтных систем было бы
полезным при ранней диагностике и лечении этих расстройств.
Модель гемостатического стресса, в основе которой лежат фосфолипиды Ха
фактора и модель воспалительного стресса, в основе которой – сепсис E.coli у
человекообразной обезьяны, дали основную патофизиологическую информацию, на
которой базируются клинические диагностические наблюдения, описанные во второй
части данного обзора. Поскольку самая полная информация была получена о системе
протеина С, основное внимание будет уделено именно этой системе.
В. Гемостатический стресс: реакция антикоагулянтных компонентов
гемостатической системы на инфузию фактора Ха плюс пузырьков фосфолипидов.
Внутривенное вливание фактора Ха+фосфолипидные пузырьки (fХа/РСРS)
бабуинам производит кратковременный выброс очень высокой концентрации
тромбина.(29) Образование такого большого количества тромбина у бабуина не имело
отрицательного эффекта, т.к. большинство произведенного таким образом тромбина
связывается преимущественно с рецепторами эндотелиальной клетки, включая
тромбомодулин.(3,4) Этот комплекс тромбин/тромбомодулин превращает адекватно
большие количества протеина С в АПС, который, в свою очередь, инактивирует
тромбообразующие кофакторы Vа и VIIIа по типу негативной обратной связи.(3,4) В
результате этого как активация тромбоцитов, так и образование фибрина носит очень
ограниченный характер. Аналогичным образом создаются довольно низкие концентрации
АТП, а за этим следует ограниченная фибринолитическая активность, что характеризуется
образованием низких концентраций продуктов деградации фибрина (ПДФ).(29)
В отличие от вышесказанного, на рис.3в показан эффект вливания комплекса
fХа/РСРS вместе с антителом к протеину С.(29) В отсутствии регуляции посредством
антикоагулянтного домена fХа/РСРS содействует образованию пропорционально большей
концентрации тромбина, что ведет к полной коагулопатии потребления (ДВС), при
которой тромбоциты активируются и секвестрируются и формируется фибрин, истощая
запас циркулирующих тромбоцитов и фибриногена у человекообразной обезьяны. На
рисунке также видно, что очень высокая концентрация АТП высвобождается из эндотелия
с помощью тромбина. Возникает быстрый и мощный ответ фибринолитической системы,
который предотвращает прогрессированиекоагулопатии потребления в катастрофически
необратимую тромботическую коагулопатию.
На рис.3с показано влияние инфузии fХа/РСРS вместе с антителами как к протеину
С, так и к АТП.(30) При отсутствии как антикоагулянтного, так и фибринолитического
регуляторного ответа fХа/РСРS содействует развитию микрососудистой тромботической
коагулопатии (МТК), которая является смертельной. Следует отметить, что
тромботические расстройства гемостатической системы, такие как гемолитический
уремический синдром(30) или тромбоцитопеническая пурпура(30) могут являться
проявлением распространенной МТК без демонстрации коагулопатии потребления.
Причина этого заключается в том, что несмотря на то, что фибрин откладывается в
микрососудах, замена фибрина происходит недостаточно быстро, чтобы превысить
способность печени производить больше фибриногена. За исключением необычных
ситуаций, требуется повышенная активность коагуляционной и фибринолитической
систем, чтобы обеспечить коагулопатию потребления такую, как показано на рис. 3в.
С. Воспалительный стресс: реакция антикоагулянтных компонентов
гемостатической системы на инфузию E.coli.
Описательные исследования:
Хотя реакция коагулопатии потребления (ДВС) на инфузию LD100 E.coli у
бабуина сложнее, чем та, которая была показана в реконструктивных исследованиях,
описанных выше, она может быть логически обоснована с использованием концепции
этих четырех доменов. Однако, прежде всего, будет описана и подразделена на стадии
патофизиология модели сепсиса, вызываемого E.coli.(31,32)
Стадия I продолжается первые 2 часа, когда происходит введение культуры E.coli. Это
воспалительная стадия, когда воспалительные медиаторы (например, цитокины)
высвобождаются, что сопровождается экспрессией интегриновых рецепторов с
обособлением активацией фагоцитов (нейтрофилов, моноцитов).
За этим следует стадия II, которая продолжается еще 6 часов. Это коагулопатическая
стадия, во время которой выделяется тканевой фактор, после чего следует поглощение
фибриногена и падение числа тромбоцитов.
За этой стадией следуют III и IV стадии, при которых высвобождаются внутриклеточные
ферменты (например, SGРТ), что указывает на обратимое повреждение (III стадия) и, в
итоге, необратимое повреждение клетки и падение АД (IV стадия).
На рис.4в показаны эти четыре стадии с точки зрения задействованных в них элементов
(например, нейтрофилов, тромбоцитов, макрофагов), все из которых при активации
(стадия I) присоединяются к эндотелию микрососудов, что приводит к тому, что он
становится нефункциональным, что, в свою очередь, приводит к возникновению
коагулопатии потребления или ДВС (II стадия) и нарушению проницаемости капилляров
и впоследствии к повреждению паренхиматозных клеток (III и IVстадии).
Исследование механизма:
В отличие от модели гемостатического стреса (fХа/РСРS) у бабуина, описанного
выше, который был восстановлен поэтапно, анализ механизма ответа на введение
культуры E.coli требует применения специфических антител против тех медиаторных и
регуляторных (антикоагулянтных) факторов, которые считаются наиболее важными.
Ключевой вопрос в этих исследованиях состоял в том, является ли необратимой
тромботическая закупорка микрососудов и кровотечение связью в цепи летальных
исходов или вторичным сопутствующим явлением. Мы сделали заключение, что в этой
модели это было вторичным сопутствующим явлением по следующим причинам: вопервых, микрососудистый тромбоз, когда он встречался, не был необратимым, не всегда
его находили при аутопсии.(33) Во-вторых, полное угнетение тканевого тромбоза,
кровотечения и инфаркта при отсроченной инфузии ИПТФ не защищало от LD100
E.coli.(34) В-третьих, полное угнетение реакций как коагулопатии потребления, так и
тромботической коагулопатии ингибированием активного центра Ха не защищало от
инфузии LD100 E.coli.(35) С другой стороны, антитело к фактору некроза опухолей, пока
оно защищено, не подавляло коагулопатию потребления.(36) Это дает основание
предположить, что необратимый микрососудистый тромбоз, хотя он и является
превосходным маркером выраженности ответа, не является звеном в цепи летальных
исходов в этой модели.
С другой стороны, подавление коагулопатической реакции с антителом к тканевому
фактору,(37) к фактору VIIа(38) с угнетенным активным центром, или ИПТФ на раннем
этапе(39,40) защищало, по меньшей мере, от 60 до 70 % животных от LD100 E.coli. Это дает
основание предположить наличие еще одной, возможно, провоспалительной роли для
этих, ранее задействованных в каскаде коагуляционных факторов, особенно комплекса
тканевой фактор/факторVIIа. Теперь известно, что факторVIIа, угнетенный активным
центром, подавляет ток Са2+ через мембраны клеток(41,42) и ИПТФ уменьшает появление
IL-6 и IL-8 в плазме вслед за инфузией LD100 E.coli.(39,40) Эти результаты дают основание
предположить, что активация проксимальных компонентов гемостатической системы
может усиливать и /или продлить начавшуюся воспалительную реакцию.
В отличие от вышеприведенных исследований, в которых антитела
использовались для защиты от летальной дозы E.coli, антитела против регуляторов
использовались в сублетальной модели E.coli, чтобы посмотреть, нельзя ли ее
преобразовать в летальную модель. Вмешательство с антителом, которое предотвращает
активацию протеина С, но не подавляет АПС, преобразовывало реакцию на сублетальную
дозу E.coli в летальную.(43) Аналогичные исследования проводились с блокирующим
антителом против эндотелиального рецептора протеина С (ЭРПС), антитело блокирует
связь протеина С/активированного протеина С с рецептором. Этот рецептор действует
вместе с ТМ, усиливая активацию протеина С тромбином. Одновременная инфузия
данного антитела с сублетальной дозой E.coli превращало сублетальную реакцию в
летальную, тогда как одновременная инфузия незаблокированного антитела против ЭРПС
к таким результатам не приводила.(44) Практически, такие же результаты были получены
при одновременной инфузии антитела к ингибитору тканевого фактора с эндотоксином на
кроликах.(45)
Напротив, добавление АПС или ИПТФ путем инфузии в модели с летальной дозой Ecoli
защищало от 60 до 70 % животных.(39,40,43) Как утверждалось ранее, это сопровождалось
уменьшением высвобождения IL-6 и IL-8 в плазму. Защита также обеспечивалась за счет
добавления антитромбина III, который подавляет находящиеся в начале каскада
свертывания факторы IХ, Х, также как и тромбин.(46) Однако, требовалась инфузия
больших количеств антитромбина перед инфузией Ecoli.(46)
Обоснование, подтверждающее антивоспалительную роль агентов, которые подавляют
начальные факторы коагуляционного звена в сублетальной модели E.coli, по-видимому,
сохраняются и в модели LD100 E.coli. Эти наблюдения подтверждают вывод, касающийся
защитной роли тех антикоагулянтных факторов, связанных с эндотелием, описанных
выше.
D. Ответная реакция молекулярных маркеров антикоагулянтных компонентов и
эндотелиального повреждения на увеличение концентрации E.coli (диагностические
исследования скрытого ДВС у модели сепсиса у бабуина, вызванного E.coli.)
Принимая во внимание вышеупомянутые физиологические и патофизиологические
данные, мы можем рассмотреть реакции антикоагулянтных компонентов на рост степени
стресса, вызванного сублетальными дозами E.coli, подобные тем, которые можно увидеть
на различных этапах и при различной степени клинического сепсиса или травмы.
Ответные реакции основных тестов коагуляции, используемых в настоящее время, будут
описаны в данной работе, после чего будут описаны реакции молекулярных маркеров
антикоагулянтных и прокоагулянтных факторов. Эти реакции будут соотноситься с
реакциями молекулярных маркеров эндотелиальных изменений и повреждений. Наша
цель состоит в том, чтобы продемонстрировать способность молекулярных
антикоагуляционных факторов обнаруживать различные степени стресса и показать как
тесно реакции этих маркеров связаны с реакциями микрососудистого эндотелиального
стресса и повреждением. В этом исследовании выдвигается предположение, что, вопервых, сепсис или посттравматический идиопатический респираторный дистресссиндром на ранней стадии представляет собой острое заболевание микрососудистого
эндотелия; во-вторых, отказ органа из-за сепсиса или травмы следует за воспалительными
изменениями и повреждением микрососудистого эндотелия; в-третьих, это повреждение,
в свою очередь, должно быть отображено изменениями антикоагулянтных факторов,
которые защищают его и с которыми нормальный эндотелий тесно связан; и, в
четвертых, эти маркеры должны отражать воспалительный стресс микрососудов до того
пока он не станет необратимым, чтобы своевременно произвести более эффективное
вмешательство.
Показаны образцы реакций двух общих тестов коагуляции (фибриноген и ПДФ) на
инфузии с 106 ,108 и 109 клеток на кг массы E.coli в течение 2-х часов. Также показана
реакция молекулярного маркера эндотелиального повреждения (растворимый ТМ).
Только после инфузии 109 клеток на кг массы E.coli появляется свидетельство
поглощения фибриногена и гемостатической декомпенсации (явный ДВС). В отличие от
этого, изменение ПДФ отражает воспалительный стресс, который следует за инфузией
108, а также 109 клеток на кг массы E.coli , в то время как растворимый ТМ
свидетельствует о стрессе дозозависимым образом, после инфузий всех трех
концентраций E coli. В то время как АТП и количество тромбоцитов являются
чувствительными индикаторами, они не являются специфичными для клинических
условий, таких как интенсивная терапия, поскольку оба этих маркера оказываются под
влиянием механических факторов, таких как катетеры, физиологический стресс,
воспалительный стресс.
Показаны образцы реакций двух молекулярных маркеров (тромбинантитромбиновый комплекс (ТАТ) и растворимый фибрин-мономер(РФМ)) на инфузию
трех концентраций E.coli, показанных выше. Реакция растворимого тромбомодулина
(РТМ) показана опять в связи с состоянием микрососудистого эндотелия. Реакция ТАТ
имеет пиковые значения в период от 4 до 6 часов дозозависимым образом. Реакции РФМ
уникальны. Во-первых, РФМ достигает достигает пиковых значений дважды после
инфузии 108 на кг массы E.coli- один раз через 4 часа, еще раз- еще более высоких
значений- по истечении 12-24 часов после инфузии.(46) Как будет показано на
человеческой модели с эндотоксемией, двухэтапная компенсированная реакция на
инфузии Е.соli, отражает начальную активацию факторов коагуляции бактериями (перед
проявлением активности тканевого фактора), после чего следует второй этап
прокоагулянтной активности, возникающей из-за эндотелиального
нарушения/повреждения, которые являются вторичными по отношению к воздействию
или проявлению тканевого фактора вследствие кислородного стресса после реперфузии
микрососудистого русла.(47)
Во-вторых, по мере возрастания интенсивности воспалительной стимуляции от 10 8 до 109
на кг массы E.coli, вторая стадия двухэтапной реакции РФМ сокращается и, в конечном
итоге, при концентрации 1010 на кг массы E.coli все количество РФМ, которое достигло
максимума, переместилось на 1-й этап. Как было показано ранее, растворимый
тромбомодулиновый маркер эндотелиального микрососудистого повреждения вновь
возвращается к базальной линии при концентрации 106 и 108 на кг массы E.coli, тогда как
он продолжает возрастать после инфузий более высоких концентраций E.coli. Эти
наблюдения показывают, что при компенсированной реакции на 108 на кг массы E.coli,
при которой нет падения концентрации фибриногена, прокоагулянтный ответ поддается
обнаружению, состоит из двух стадий и отражает увеличение степени повреждения
микрососудистого эндотелия.
Показаны образцы реакций трех антикоагулянтных факторов (протеин С, ИПТФ,
антитромбин) на инфузию трех концентраций E.coli, о которых говорилось выше. Реакция
растворимого ТМ и АТП вновь показана в связи с состоянием микрососудистого
эндотелия. Реакция протеина С очевидна по истечении 4-х часов после инфузии 106 на кг
массы E.coli. Это отражает реакцию растворимого тромбомодулинового маркера
эндотелиального повреждения и сравнимо по чувствительности и специфичности с
растворимым РФМ и ТАТ, как маркеров компенсированного ответа. Эта
чувствительность, вероятнее всего, является результатом того факта, что концентрация
протеина С в плазме близка к его Км, тогда как концентрация в плазме витамин-Кзависимых прокоагулянтных коферментовв 5 или 10 раз выше, чем у их Км,s.
Антитромбин, в отличие от протеина С, является сравнительно нечувствительным, но,
подобно фибрину, он служит маркером серьезности заболевания, который использовался
для предсказания вероятности выживания.
Е. Образец реакций молекулярных маркеров антикоагулянтных компонентов и
эндотелиального повреждения на эндотоксин (диагностические исследования
скрытого ДВС в человеческой модели эндотоксемии).
Показывает образцы реакций на 4 нг/кг эндотоксина комплексов протеин
С/АПС/РСI вместе с антитромбином и ИПТФ.(48) Протеин С и продукт АПС/PCI реагирует
рано во время 1-го этапа на прямое воздействие эндотоксина, тогда как уровни свободного
ИПТФ реагируют позднее, между этапами 1 и 2. Эта реакция совпадает с первыми
признаками появления антигена тканевого фактора в плазме, со снижением фактора VIIа,
вторым пиком РФМ и с длительным подъемом растворимого ТМ.(47)
Уровни лактата в этот период также возрастают и остаются выше нормы. Все эти
явления вместе с увеличением основной оксидазы и ростом концентраций
дополнительных комплексов С-РБ/с4d и С-РБ/с3d (не показано) дает основание
предположить наличие реперфузии ранее суженных микрососудов на 1-й стадии, как было
описано у Наск и др.(49) Обращает на себя внимание то, что нет значительных изменений
количества тромбоцитов или падения фибриногена (концентрация фибриногена
возрастает). Эта картина показывает компенсированный гемостатический ответ на
нарушение и повреждение микрососудистого эндотелия, что представляет собой
классический пример скрытого ДВС, подобно той, которую можно увидеть на начальной
стадии воспалительной реакции у пациентов с риском развития прогрессирующего
микрососудистого повреждения в некомпенсированном явном ДВС. Результаты
показывают, что антикоагулянт протеин С может надежно отражать эти ранние
изменения, но применимость измерений протеина С у пациентов, о которых говорилось
выше, показана в исследованиях Mesters и др., где они обнаружили низкие уровни
протеина С перед началом лихорадки у пациентов, принимающих цитостатическую
химиотерапию.(50) Они представляют основу для разработки критериев для лабораторной
диагностики скрытого ДВС подкомитетом по ДВС в Международном обществе тромбоза
и гемостаза.