Начало формы УДК 01.01.01.02.М16 УЛТАНБЕКОВА Г.Д

УДК 01.01.01.02.М16
УЛТАНБЕКОВА Г.Д., МУКАШЕВ Н.З., АЛИБЕКОВА Ш.Б., САДАНОВ А.К.
НОВОЕ В ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СУХОГО НИТРАГИНА
(Институт Фармацевтической биотехнологии МОН РК)
Работа посвящена изучению прироста биомассы клеток клубеньковых бактерий сои.
Приводятся методы анализа и контроля производства, а также производственный
процесс получения сухого нитрагина при получении экологически чистого продукта.
Производство и применение минеральных удобрений оказало революционизирующее
действие на продуктивность сельскохозяйственных культур. В настоящее время производство
сельскохозяйственной продукции немыслимо без внесения в почву минеральных удобрений.
Казахстану для поднятия сельского хозяйства рано или поздно придется подумать о
восполнении запасов питательных элементов в почве [1].
Между тем, систематическое внесение удобрений в почву в больших дозах чревато весьма
серьезными экологическими последствиями. Применение азотных удобрений сопровождается
попаданием нитратов в поверхностные и подземные воды. В первом случае происходит
эвтро-фикация водоемов, т.е. их цветение. Развитие и последующее отмирание водорослей
создает дефицит кислорода в воде, снижается рыбопродуктивность, портится качество
питьевой воды. Попадание нитратов в подземные воды, в частности в колодцы с питьевой
водой, ведет к поступлению нитратов в организм людей, особенно опасно это для детей.
Нитраты в крови блокируют перенос кислорода в организме, в результате ухудшается
кровоснабжение мозга, что служит причиной отставания умственного развития детей [2, 3, 4,
5].
Роль бобовых культур возрастает еще и потому, что они способны пополнить почвенные
запасы углеродом и азотом, обеспечивая тем самым сохранение плодородия почв и
удовлетво-рение последующей культуры в азоте. Важно определить реальный вклад
органического вещества и биологического азота в плодородие почвы и возможный уровень
урожая зерновых культур, который можно получить путем применения минеральных
удобрений [6].
Только микроорганизмы способны использовать запасы азота, содержащиеся в атмосфере, и
фиксировать молекулярный азот. Самостоятельно, частично в симбиозе с высшими
растениями они переводят инертный N в органические соединения и включают его
(непосредственно или через растения) в белок который, в конечном счете попадает в почву. В
результате связывания N клубеньковыми бактериями в симбиозе с растениями семейство
бобовых почва ежегодно обогащается азотом в количестве 100-200 кг/га. Свободноживущие
азотфиксирующие микроорганизмы вносят в почву до 5 кг азота на 1 га в год. Кроме того,
значительные количества связанного азота попадают в почву из атмосферы с осадками [7].
В связи с сокращением производства минеральных удобрений, в частности, азотных,
сельскохо-зяйственные угодья Казахстана получают все меньше азота. Биологический азот
значи-тельно дешевле технического, поэтому Д.Н.Прянишников призывал не менее 25%
площади севооборотов занимать бобовыми культурами. Кардинальным решением проблемы
обеспечения сельскохозяйственных культур азотом может быть обогащение почв
биологическим азотом за счет стимуляции симбиотической азотфиксации на корнях бобовых
растений. Технически данная проблема решается путем организации производства
землеудобрительного препарата нитрагина и проведения массовой нитрагинизации на
посевах бобовых растений Республики. Кроме того, нитрагинизация повышает урожай
растительной массы бобовых растений, в среднем, на 30-40%, а эффект нитрагинизации
семян такого растения, как соя достигает 50%. Ответственная за фиксацию азота
нитрогеназная система обладает нитрогеназной активностью. Все известные азотфиксаторы,
за исключением азотобактера, способны к выделению молекулярного водорода.
Нитрогеназная система восстанавливает не только молекулярный азот, но и ацетиллен. К
восстановлению ацетиллена способны корневые клубеньки бобовых растений (соя) и
анаэробные свободноживущие азотфиксирующие микрорганизмы [8].
В Казахстане в разное время (1970-1980 г.г.) клубеньковыми бактериями на корнях бобовых
растений занимались ученые Института микробиологии и вирусологии, Института
почвоведения МОН РК, Института земледелия им. В.Р.Вильямса [2, 6, 9].
В коллекции микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии МОН РК имеются
высококачественные культуры симбиотических азотфиксирующих микроорганизмов,
специфичных к люцерне, сое, доннику и козлятнику. В институте почвоведения МОН РК
Ш.Б.Алибековой (1993) выделена культура Bradyrhizobium japonicum, повышающая урожай
сои на 2-4 ц/га (20-30%). В основу технологии получения нитрагина положено выращивание
культур клубеньковых бактерий на питательных средах с последующим лиофильным
высушиванием с наполнителями и стабилизаторами.
В целях получения сухого нитрагина лиофильный метод высушивания клубеньковых бактерий
сои разрабатывается в Москве, Ленинграде, Киеве и др. городах СHГ [7, 8].
По внешнему виду сухой нитрагин имеет светло-серый или коричневый цвет, содержит в 1
грамме не менее 6 млрд. бактериальных клеток в момент выпуска. Гектарная порция - 200 г
препарата должна содержать не менее 1200 млрд. клеток. Срок годности сухого нитрагина 7
месяцев [6, 8].
Изучение прироста биомассы.
Rhizobium -7, Rhizobium-4 –клубеньковые бактерии сои и люцерны.
Прирост биомассы клеток культуры наблюдали при культивировании штаммов в 50 мл
посевной среды (ПН) следующего состава (г/л): Кукурузный экстракт - 6,0, Глюкоза - 10,0,
NаСI - 0,2, К2НРО4 - 0,5, (NН4)2SО4 - 0,5, МgSO4 *7Н2О - 0,2, рН среды - 6,75, режим
стерилизации - 0,8 атм., 30 мин.
Засев колб производили с косяка агаризованной среды №79 (рекомендованной авторами)
биомассой одной петли на колбу. Культивировали при +250С 24 часов на качалке при 220
об/мин. В процессе ферментации измерялась оптическая плотность КЖ и определялся титр
клеток по камере Горяева. Данные представлены в таблице 1.
Таблица 1. Показатели прироста биомассы клубеньковых бактерий
Методы анализа и контроль производства
1. Чистоту культуры определяют микроскопированием, делают 1-2 мазка культуры и
просматривают при увеличении 15х40 не менее 10 полей зрения.
При микроскопировании делают 1-2 мазка культуры и просматривают при увеличении 15х40
не менее 10 полей зрения.
При высеве на МПА по штриху должен остаться только слабый штрих oт внесенного
посевного материала.
2. Определение потенциальной активности азотфиксации в почве проводили ацетиленовым
методом, который основан на способности нитрогеназы восстанавливать ацетилен до
этилена в количестве, пропорциональном количеству азота, которое может быть
восстановлено в тех же условиях.
N2+6Н++6е-®2NH3
C2H2+2H2+2е--® C2H4
Оценка активности азотфиксации проводится косвенно - измерением количество
образовавшегося этилена,
Ацетиленовый метод позволяет определить потенциальную активность азотфиксации в
почве.
Производственный процесс получения сухого нитрагина проходит в следующем порядке:
Производственный процесс получения сухого нитрагина проходит в следующем составе:
1. Размножение посевной культуры в пробирках на косом агаре.
Для приготовления посевного материала используют чистые культуры сопровождаемая
паспортом, где дается характеристика штамма.
2. Приготовление посевной культуры в колбах.
В колбы в емкостью 750 мл разливают 400 мл питательные среды длявыращивания
посевного материала в колбах на качалке 220-240 об/мин, на 2-4 суток.
3. Выращивание посевного материала в инокуляторе.
Выращивание посевного материала в инокуляторах (в инокуляторе культура выращива-ется в
течение 1-1,5 суток при температуре 28-300С. Аэрирование культуры начинают через 3 часа
после посева продуванием воздуха в количестве 0,5 л на 1 л среды в минуту. Мешалку не
включают, сульфитное число должно быть близким 0,2-02 л/час. Через 1,5 суток заканчи-вают
выращивание в инокуляторе. Отбирают пробы на определение чистоты и титра культу-ры в 2
склянки. Из одной делают высев на косяк МПА, другую используют для подсчета тит-ра
клеток в камере Горяева. Титр клеток должен быть около 1,5 млрд/мл, рН не выше 7-7,5;
4. Подготовки ферментера и питательной среды. Массовое выращивание ведут в
ферментерах емкостью 1000 л.
Стерилизацию питательной среды в ферментерах ведут в два приема, Предварительно
стерилизацию воды с кукурузным экстрактом и мелом, а затем в ферментер вносят
остальные компоненты среды.
Состав среды: 1. Вода (водопроводная) - 800 л. 2. Кукурузный экстракт - 4,8 кг. 3. Техническая
глюкоза - 8,0 кг. 4. (NH4)2S04 - 400 г. 5. K2НP04 - 400 г. 6. NaCl - 100 г. 7. MgS04-7H20 - 160 г.
8. Мел - 800 г. 9. Агар - 400 г. 10. Пеногаситель - 800 мл. рН 6,1-6,2 - 20% HCl или NaOH для
нормализации рН.
5. Выращивание культуры в ферментере.
Выращивание культуры в ферментерах длится трое суток при температуре 28-300С. После
внесения посевного материала включают мешалку на 5-10 минут и берут пробу для
определения исходного количество клеток подсчетом в камере.
6. Сепарирование культуры и смешивание с защитной средой. В качестве защитной средой
используют мелассу, и другие вещества. Сепарация жидкой культуры для получения пасты
(культуру перед сепарацией охлаждают через рубашку ферментера водопроводной водой до
температуры этой воды). Выход пасты с 1000 л жидкой культуры 15-20 кг с влажностью 8085%. В качестве защитной среды при сушке используют мелассу в количестве 20% от веса.
7. Высушивание пасты в камерном сушильном аппарате.
8. Измельчение высушенной пасты, в шаровой мельнице.
9. Размол сухой культуры и смешиванием с наполнителем (каолином).
10. Расфасовка и упаковка готового препарата.
ЛИТЕРАТУРА
1. Доросинский Л.М. Клубеньковые бактерии и нитрагин. М., 1971. С.191.
2. Алибекова Ш.Б. Симбиотическая азотфиксация и эффективность нитрагинизации сои на
орошаемых почвах юго-востока Казахстана. Автореф. дис канд., Алма-Ата, 1993.
3. Kapulnik Y., Joseph CM, Phillips D,A. Flavon limitation fo root nodulation and symbiotic nitrogen
fixation in alfalfa. // Plant Physoil, 1987.
4. Ladha J.K., George Т., Bohiool B.B. Biological nitrogen fixation for sustainable agriculture. Kwer
Acad. Publ, 1992, Netherlands.
5. Мишустин Е.Н, Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота. M., 1968.
6. Сагидолдина А..Е. Выделение и определение активности клубеньковых бактерий люцерны.
// 1 Междунар. Конгресс “Экологическая методология возрождения человека и планеты
Земля”. -Алматы, 21-24 апреля. 1997. С.173.
7. Трепачев Е.П., Ягодина М.С., Азаров Б.Ф. Органическое вещество и азот бобовых в
земледелии Центрально-Черноземного района вклад в плодородие почвы и потребность в
азотном удобрении последующих культур. // Сельскохозяйственная биология, 1991, №5, С.1630.
8. Азаров Б.Ф. Сибиотический азот в земледелии центрально-черноземной зоны Российской
Федерации; Автореф. дисс. д.с.-х.н., М., 1995, 60с.
9. Курманбаев А.А, Мохамед Абдуль-Кадер Микробные препараты для растения донника. //
Разработка и совершенствование технологии производства биопрепаратов: Тез. докл. Межд.
науч. практ. конф, -2-4 авг. 1995г. Степногорск, 1995. С.152.
***
Rhizobium 7 ñîÿíû» ò¾éíåêòi áàêòåðèÿñûíû» áèîìàññàñûíû» ¼ñóií çåðòòåó. Åãó №79 ºîðåêòiê
îðòà¹à ñåáiëäi, åãó +25îÑ 24 ñà¹àò øàéºàëäû (220 àé/ìèí). Ôåðìåíòàöèÿ êåçiíäå äàºûë
ñ½éûºòû¹ûíû» îïòèêàëûº òû¹ûçäû¹ûí æ¸íå æàñóøà òèòði Ãîðÿåâ êàìåðàñûìåí àíûºòàëäû.
***
The Study of the growing of the biomass bacteria to soybean Rhizobium 7.
Sowing the flasks produced with jamb agar ambiences 79 biomasses of one loop on flask.
Cultivated under +250С 24 hours on rocking chair under 220 about/mines. In process ферментации
was measured absorbances kulituralinoy to liquids and was defined subtitle of the hutches on
camera Goryaeva.