методика замораживания сердца животного или человека

МИНИАТЮРНАЯ КРИО-БАРОКАМЕРА ДЛЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
КЛАТРАТНОЙ КРИОКОНСЕРВАЦИИ
С тех пор как нам впервые удалось обнаружить в природе наличие
совершенно нового вида анабиоза [1] и тем самым инициировать по
всему миру исследования этого неизвестного ранее проявления
жизнеспособности (так называемый «клатратный анабиоз» [2]) прошёл
достаточно продолжительный срок. Выдвинутый тогда амбициозный
проект «Альтернативная криобиология» к настоящему времени,
казалось бы, уже должен был получить свою практическую
реализацию. К сожалению данные работы хотя и ни свёрнуты
полностью, но ведутся ни так активно как того хотелось бы.
По всей видимости, причина инерционности связана, прежде всего, с
необходимостью проведения обязательных декомпрессионных
мероприятий на завершающем этапе любого из этих сложных в
инструментальном смысле экспериментов [10]. Именно отсутствие
соответствующей приборной базы и с нею связанной надёжной
методики является серьёзным препятствием на пути масштабного
осуществления таких операций.
Наличие доступного и самого простого газового оснащения (мы бы
даже сказали — элементарной «газовой крио-лаборатории») смогло
бы стимулировать исследовательский интерес к этой области.
Несмотря всё-таки на значительную повторяемость опытов по так
называемой «клатратной криоконсервации» [2], сведения об
устройствах, необходимых для её проведения, завуалированы самими
их авторами [5, 6, 7, 9]. Исключение составляют только отдельные
источники,
где
полностью
раскрывается
принцип
работы
исследовательского агрегата и приводится конкретная его схема [3, 4].
Но всё равно, сложные в технологическом исполнении и неудобные
при эксплуатации они не могут найти массового отклика среди
криобиологов.
В связи с объективными инструментальными потребностями
предлагается оригинальная конструкция простого лабораторного
прибора, в основе которого лежит аналог аппарата, относящийся ещё
к самым первым нашим наработкам [1]. Причём предлагаемая
оригинальная крио-барокамера состоит из готовых узлов, имеющихся
в розничной торговле, и может быть легко собрана в условиях любой
даже мало-оснащённой лаборатории самими заинтересованными
исследователями.
При этом мы намеренно (!) не рассматриваем здесь хорошо
отработанный (в тот период наших активных исследований) —
достаточно эффективный способ насыщения инертными газами
органов лабораторного животного путём принудительной ингаляции
во время проведения ИВЛ [1].
— Ведь разрабатываемая сейчас камера должна стать прототипом
будущего крио-бара-контейнера, как можно более простого в
конструкционном плане, именно для выделенных органов человека —
для их надёжного хранения и последующей транспортировки.
Таким образом, поставленная на сегодня задача — изготовление
универсального миниатюрного металлического сосуда для работы с
биологическими объектами (клетки, ткани, органы) в условиях низких и
криогенных температур, а также повышенных давлений инертных
газов («микро-крио-барокамера»), — легко решаема.
— Наши самые первые поверочные исследования по клатратной
криоконсервации биообъектов, в том числе и небольших размеров,
проведённые ещё в 1980-е годы [1], с использованием миниатюрного
криобароконтейнера собственной конструкции, могут лечь в основу
при разработке такого инструментария, что станет необходим уже для
сегодняшних масштабных исследований по данной тематике.
Использоваться будущий сосуд давления должен будет сразу на 2-х
этапах экспериментов.
Сначала, на 1-ом этапе — для клеточного материала.
В дальнейшем, на 2-ом этапе — для выделенного сердца крысы.
Итак. Уже для проведения экспериментов на клетках (на 1-м этапе)
необходима малая барокамера-капсула. — Это должен быть
миниатюрный сосуд среднего давления с габаритными размерами,
выбранными специально под горловину стандартного сосуда Дьюара,
например, 24-литрового.
Но в тоже время, исследовательская крио-капсула должна быть
универсальной и позволять вести дальнейшие экспериментирования с
органами мелких лабораторных животных (на 2-м этапе).
Необходимые условия :
— Микроагрегат мог бы помещаться в различные хладагенты, в
зависимости от желания самих экспериментаторов : обычный лёд,
холодный воздух морозильной камеры холодильника, «сухой лёд»,
пары жидкого азота, сам жидкий азот и др.
— Данная исследовательская микро-барокамера должна быть
рассчитана на максимальное рабочее давление в 10 атм, что
позволяло бы, наряду с выбором определённой рабочей температуры,
варьировать так же и этим параметром (в сторону уменьшения от
указанной величины).
— Согревать барокамеру-капсулу можно было бы или медленно
(естественным путём при комнатной температуре), или же быстро
(горячим воздухом или жидкостью).
— В крио-барокамере можно было бы замораживать или животные
клетки, или органы (сердце крысы).
В связи с такими широкими запросами, естественно, на первый план
выходят требования чисто экономического характера. И самое
главное из них — это необходимость создания «Крио-биологической
газовой лаборатории», основанной на едином протоколе клатратной
криоконсервации, так как она должна быть обязательно общей для
двух этапов. Что значительно удешевит весь процесс уникальных
исследований.
1. Замораживание биообъекта, находящегося в миниатюрной
крио-барокамере.
— По конструкционному исполнению наша будущая крио-барокамера
явится аналогом миниатюрного биологического (или же химического)
реактора заводского исполнения и будет выглядеть почти также как и
сам такой реактор :
По сути, стоит абсолютно такая же как и раньше (в 1980-е годы)
задача — осуществление «замораживания-согревания» всего данного
устройства-системы (с биообъектом внутри — в среде инертных
газов), нагруженного давлением — путём полного погружения всего
изделия в некий жидкий хладагент.
2. Погружные морозильные аппараты
— Одним из традиционных способов замораживания является —
иммерсионный (погружением).
— При этом способе хладагент контактирует непосредственно со всей
поверхностью объекта, и соответственно создаются лучшие условия
для теплообмена между поверхностью объекта и хладагентом.
— Эта особенность обусловила ряд преимуществ данного способа по
сравнению с воздушным холодильным оборудованием.
— Иммерсионный способ обеспечивает более высокую скорость
замораживания и меньший уровень потерь в процессе замораживания
и последующего оттаивания.
— Погружные морозильные аппараты предназначены для
замораживания объектов, погруженных в охлаждающую, не
изменяющую свое фазовое состояние жидкость (водный раствор соли
или гликоля).
3. Чиллеры
Чиллер — это специальное охлаждающее устройство, известное тем,
что наиболее часто применяется в системах кондиционирования
воздуха центрального типа.
В общем случае чиллером называют холодильную
предназначенную для охлаждения жидких теплоносителей.
машину,
Итак, чиллер — это холодильная машина, предназначенная для
охлаждения холодоносителя (воды, гликолевого раствора и т.п.).
Хотя основная сфера эксплуатации чиллеров — это системы
кондиционирования воздуха, но чиллеры применяются и в других
областях :
— В специальном медицинском оборудовании и в фармацевтической
сфере;
— В сфере лазерных технологий.
4. Чиллеры погружного типа
Чиллер погружного типа сконструирован таким образом, чтобы
пользователь мог поместить его в какой-нибудь уже существующий
резервуар с охлаждающей жидкостью — испаритель чиллера
помещается внутрь самого резервуара.
ВОЗМОЖНЫЕ СПОСОБЫ ЗАМОРАЖИВАНИЯ
ДЛЯ
КОНКРЕТНОГО НАШЕГО СЛУЧАЯ
I
Захолаживание только одним чиллером
(неуправляемое охлаждение; вообще нет согревания)
5. Лабораторные чиллеры погружного типа
Погружные охладители — недорогая альтернатива так называемым
«охлаждающим термостатам» !
Достигается :
— Отказ от применения «сухого льда» или жидкого азота.
— Диапазон температур до -50 °C.
— Быстрое охлаждение рабочих жидкостей до низких температур.
II
Пара «лабораторный чиллер — низкотемпературный термостат»
(недостаточно-управляемое охлаждение;
относительно-управляемое согревание)
6. Лабораторный чиллер погружного типа может работать в паре
с низкотемпературным термостатом (криотермостатом)
— Компенсирующее охлаждение
циркуляционными термостатами.
жидкостей
в
сочетании
с
— К типичным областям применения таких охладителей относятся:
контрохлаждение
нагревающих
термостатов,
использование
охладителей в качестве замены сухого льда.
7. Низкотемпературные чиллеры
— Низкотемпературные чиллеры, как правило, работают в областях
ниже –20°С и часто требуют особых низкотемпературных
теплоносителей или повышенной концентрации гликоля, поскольку
чем выше концентрация вещества в водном растворе, тем ниже
температура замерзания.
— В этих случаях хладоносителем является как правило
этиленгликоль. Данную жидкость можно охлаждать до −25 С и при
этом она не кристаллизуется.
8. Теплоносители (хладоносители) на основе гликолей
— Теплоносители (хладоносители) являются промежуточным телом, с
помощью которого осуществляется перенос тепла от охлаждаемого
объекта к холодильному агенту.
— Хладоносителем может служить вода, водные растворы солей или
жидкости с низкой температурой замерзания — антифризы и т. д.
— При температурах теплоносителя ниже точки замерзания воды,
также в целях предотвращения замерзания теплоносителя
трубопроводах при низких температурах окружающей среды,
качестве теплоносителей используют различные растворы и смеси
низкой температурой замерзания.
а
в
в
с
— Распространенными хладоносителями являются хлористый натрий
(NaCl), соли хлористого кальция (CaCl2), водные растворы гликолей.
— В связи с высокой коррозионной активностью солевых растворов,
расходы на ремонт оборудования могут многократно превысить
прямые затраты, поэтому в последнее время все более широкое
применение находят растворы многоатомных спиртов, в том числе
пропиленгликоля (ПГ), этиленгликоля, глицерина.
Гликоли — бесцветные сладковатые и высоковязкие жидкости с
точкой замерзания ниже -50 С. Различают два главных типа гликолей :
Пропиленгликоль — С3Н6 (ОH)2, благодаря нетоксичности находит
также применение в пищевой промышленности (в качестве пищевых
добавок).
Этиленгликоль — C2H4(ОН)2, в основном, используется там, где его
утечка не будет опасной для людей, животных и продовольственных
товаров. Он значительно дешевле пропиленгликоля и потери на
трение — намного ниже при низких температурах, чем для
пропиленгликоля.
9. Имеющийся в розничной продаже теплоноситель для систем
нагрева и охлаждения
— Antifrogen N / Антифроген Н
— Данный антифриз представляет собой смесь воды, основного
компонента (в данном случае, моноэтиленгликоля) и целевых
добавок. Для снижения коррозионной активности антифризов
используются ингибиторы коррозии. Ингибиторы коррозии, вещества,
снижающие скорость коррозии; применяются для антикоррозионной
защиты материалов, главным образом металлов. Также в состав
теплоносителя вводят ингибиторы накипеобразования, набухания и
растворения
резиновых
уплотнителей
систем
отопления,
пенообразования и мн. др.
II
Захолаживание «охлаждающим–нагревающим» лабораторным
термостатом
(хорошо управляемые — и охлаждение, и согревание)
10. Альтернативой относительно дешёвой и недостаточно
управляемой паре «чиллер–криотермостат» могут быть — более
дорогие, но хорошо управляемые «охлаждающие–нагревающие»
лабораторные термостаты :
— Классические охлаждающие термостаты с открытой ванной
предназначены для выполнения типичных лабораторных задач по
нагреву и охлаждению.
— Работают в диапазоне от -90°C до +200°C, с различной мощностью
охлаждения и нагрева, с воздушным или водяным охлаждением
системы рефрижерации.
— Эти приборы обладают высокой нагревательной и охлаждающей
способностью для короткого времени нагрева и охлаждения.
САМИ ЭКСПЕРИМЕНТЫ
Для проведения биологических экспериментов необходимо
— Исследования могли бы быть проведены в 2-а этапа :
1-й этап — на клетках млекопитающего.
2-й этап — на органах мелкого лабораторного животного (на сердце
крысы).
2-й этап будет разбит на 2-е серии экспериментов :
1-я серия — охлаждение в морозильной камере до -20 С.
2-я серия — охлаждение в жидком азоте до -196 С.
Для 2-го этапа (органные исследования — сердце крысы) каждая из 2х серий будет разбита ещё на 2-а подхода (2-ве группы) :
1-я группа — интактный эксперимент.
2-я группа — под защитой ксенона.
ЭКСПЕРИМЕНТЫ
С
ОРГАНАМИ
ЖИВОТНЫХ
ЭТАП 2 :
«ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА КРИОКОНСЕРВАЦИИ СЕРДЦА
КРЫСЫ»
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТ НА ВТОРОМ ЭТАПЕ
— Оптимизация режимов физического воздействия на биологический
объект для обратимого криосохранения органов мелких лабораторных
животных (сердце крысы) в атмосфере ксенона
ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ РАБОТ НА ВТОРОМ ЭТАПЕ
— 12 месяцев.
РАБОТА СО СТОРОННИМИ ОРГАНИЗАЦИЯМИ НА ВТОРОМ ЭТАПЕ
— Изготовление стенда (или же его покупка) для перфузии сердца.
Известно, что пересадка органов у мелких лабораторных животных —
наиболее
адекватный
метод
оценки
жизнеспособности
аллотрансплантанта в эксперименте (демонстрационный и вообще не
нуждающийся в биохимическом обеспечении).
А гетеротопическая пересадка сердца у крыс на магистральные
сосуды брюшной полости по Abbott — наиболее удобная для таких
целей хирургическая манипуляция.
Но всё же, менее затратной и не столь трудоёмкой методикой
является стендовая перфузия сердца (в плане отсутствия в таком
случае необходимости приобретения и содержания кроме доноров
ещё и дополнительных животных-реципиентов).
1. На сегодняшний день уже существует готовая установка IH-SR
промышленного
изготовления,
специально
предназначенная
для перфузии изолированного сердца мелких грызунов :
2. Есть и более дешёвый аналог вышеприведённой установки —
«Установка перфузии изолированного сердца по Лангендорфу»:
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ 2-ГО ЭТАПА
— Целью настоящего исследования (на 2-ом этапе) является
введение в клатратный анабиоз сердца крысы с последующим
выведением
из
этого
состояния
и
восстановлением его
функциональной активности.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ 2-ГО ЭТАПА
— Начнём рассмотрение с того, что будем считать, как бы уже
проведено 2-е серии экспериментов :
1. В 1-й серии была отработана методика при охлаждении органа
животного (крысиного сердца) до -20 С.
2. Во 2-й — до -196 С.
3. Эксперименты 1-й серии и 2-й серии проводились на одной и той
же — универсальной установке :
Для проведения лабораторной практической проверки и исследования
эффективности предложенного способа клатратной криоконсервации
каждая серия была поделена ещё на 2-ве группы :
1-я группа — интактный эксперимент.
2-я группа — под защитой ксенона.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДЕЙСТВИЙ
1. Введение животного в наркоз.
2. Иммобилизация животного.
3. Забор сердца.
4. Размещение органа в крио-бара-контейнере.
5. Для обработки сердца ксеноном, загерметизированную микробарокамеру, с помещённым в неё тут же выделенным органом,
медленно нагружали давлением Хе до 10 атм и пролонгировали в
таком состоянии в течение 60 минут — при комнатной температуре.
6. Затем постепенно снижали температуру всей испытательной
системы (состоит из сосуда давления и сердца внутри него) до 0°С,
помещая данное устройство в шугу (ледяную крошку), при этом не
снижая самого давления Хе.
7. После чего крио-капсулу с сердцем внутри неё, находящимся всё
под тем же давлением Хе в 10 атм, помещали в хладагент
низкотемпературного
криостата
с
подготовленной
заранее
температурой рабочей жидкости в 0°С и охлаждали в этом криостате
до -20°С (1-я серия).
8. По достижении данной температуры (-20°С), давление в криососуде полностью сбрасывали и приступали — или к согреванию
исследовательской системы до 0°С, или же ко 2-й серии
эксперимента.
9. Во 2-й серии крио-капсулу с сердцем внутри (как было сказано
выше, в этот период сосуд уже не нагружен давлением Хе !) вынимали
из криостата и помещали в пары жидкого азота (экспозиция 60 минут),
а затем медленно окунали данный криобароконтейнер с сердцем — в
сам жидкий азот, добиваясь постепенного охлаждения всей системы
до -196 С и выдерживали в течение 60 минут.
[ Необходимо ещё раз напомнить, что следует обязательно
сбрасывать давление Хе полностью — перед температурным
значением, соответствующим началу вымораживания газа ксенона (111,85 °C) ]
10. Размораживание образцов всех серий (1-й и 2-й) проводили путем
согревания до 0 С всего устройства, не нагруженного давлением Хе —
в хладагенте того же низкотемпературного криостата.
11. После чего сердце вынимали из крио-капсулы и приступали — или
к его перфузии аппаратным методом, или же осуществляли
гетеротопическую пересадку расконсервированного биообъекта.
Литература:
1. Щербаков П. В., Тельпухов В. И. Бессмертие под газом // Химия и
жизнь. – 2006. – № 8. – С. 34-39.
2. Тельпухов В.И., Щербаков П.В. Клатратная криоконсервация //
Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. 2012. – Т. 15. –
№ 3(42). – С. 77-80.
3. Пульвер А.Ю., Целиковский А.В., Пульвер Н.А., Артюхов И.В.,
Перегудов А.Г. Криоконсервация Saccharomyces cerevisiae с
использованием ксенона // Материалы Международной заочной
научно-практической конференции «Теоретические и практические
аспекты современной криобиологии». Сыктывкар, 2014. С. 220-226.
4. Худяков А.Н., Полежаева Т.В., Зайцева О.О., Соломина О.Н.
Устройство для криоконсервирования клеточных взвесей в атмосфере
газовых протекторов // Материалы Международной конференции
«Криоконсервация генетических ресурсов. Современное состояние,
проблемы и перспективы». Биофизика живой клетки. Том 10. 2014 год.
Стр. 209 – 211.
5. Sheleg Sergey, Hixon Hugh, Cohen Bruce et. al. Cardiac Mitochondrial
Membrane Stability after Deep Hypothermia using a Xenon Clathrate
Cryostasis Protocol — an Electron Microscopy Study // Int. J. Clin. Exp.
Pathol. 2008. 1 (5), P. 440—447.
6. Пономарев А. И., Макеев О. Г., Зверева А. И., Коротков А. В.
Исследование консервирующих свойств клатратов инертного газа
ксенона на модели краткосрочного хранения кожных лоскутков //
Материалы III Межрегиональной научно-практической конференции
«Клеточные технологии — практическому здравоохранению».
Екатеринбург. 2014 г. Стр. 78 – 83.
7. Способ криоконсервации мезенхимальных
стромальных клеток кожи. Патент РФ № 2433173.
мультипотентных
8. Макеев О. Г., Пономарев А. И., Коротков А. В. Применение
клатратобразующего газа для криоконсервации мезенхимальных
мультипотентных стромальных клеток // Вестник уральской
медицинской академической науки. – 2010. - №1. – С. 180 – 183.
9. Сведенцов Е.П., Лаптев Д.С., Полежаева Т.В., Зайцева О.О.,
Худяков А.Н., Шерстнёв Ф.С., Князев М.Г. Оценка криопротекторных
свойств
аргона
//
Международный
журнал
прикладных
и
фундаментальных исследований — 2012. — №4. — С. 55.
10. Смолин В.В., Соколов Г.М., Павлов Б.Н. Водолазные спуски до 60
метров и их медицинское обеспечение. – Москва: Фирма «Слово»,
2003. – 626 с.
П Р И Л О Ж Е Н И Е
(некоторые характеристики гидратов
тяжёлых инертных газов и метана)
Для получения при 0оС гидрата ксенона достаточно приложить всего
1,5 атм, но для гидрата криптона уже — 14,5 атм, а для гидрата аргона
все — 105 атм.
При 0°С гидрат метана стабилен под давлением порядка 25 бар (250
метров).
При -3,4оС для кристаллогидрата ксенона, при -27,8оС для
кристаллогидрата криптона, при -42,8оС для кристаллогидрата аргона
— давление диссоциации соответствует нормальному атмосферному
давлению.
При нормальном атмосферном давлении, гидрат метана сохраняет
устойчивость при соответствующей температуре — около -80°С.
При нормальном давлении температура перехода двуокиси углерода
(СО2) из твёрдого состояния в газообразное равна -78,5°С.
Видимая разница в вышеприведённых значениях, во-первых,
температуры, необходимой для стабилизации гидрата метана (-80°С),
во-вторых, реальной температуры замёрзшего углекислого газа (78,5°С), указывает на то, что гидраты метана, в конце концов,
окажутся в метастабильном состоянии. Но температурные
возмущения при этом будут столь ничтожны, что известный эффект
само-консервации гидратов (в данном случае, безусловно,
положительный) обеспечит, с запасом, сохранение их стабильности.