Отчет 1 этап по ГК № 14.740.11.0172 от 15.09.10
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Х.М.БЕРБЕКОВА(КБГУ) УДК 61 № госрегистрации 01201064882 Инв. № УТВЕРЖДАЮ Ректор, д.т.н., профессор Карамурзов Б.С. « » 2010 г. ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме: «Разработка новых методов индивидуальной коррекции сводно-радикального статуса при бактериальных инфекциях» (промежуточный, этап № 1) Наименование этапа: «Разработка методологии клинико-лабораторных исследований. Экспериментальные методы исследования сводно-радикального статуса пациентов. Экспериментальные методы исследования нарушения механизмов противобактериальной защиты» заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, д.м.н., профессор Руководитель НИР, __________________ З.Ф. Хараева Нальчик 2010 27.10.2010 СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ Руководитель темы Хараева З.Ф. Заведующая кафедрой Микробиологии, (Реферат, вирусологии и иммунологии, д.м.н., 27.10.2010 профессор введение, главы 1-7, заключение ) Исполнители темы: Старший научный сотрудник, Смирнова И.П. НОЦ Прикладная антропология КБГУ, 27.10.2010 (Главы 1-7) д.б.н., профессор Профессор, кафедра Инфекционные Иванова М. Р. болезни, д.м.н. 27.10.2010 Старший научный сотрудник, УНИИД, (Главы 1-7) Шевченко А. А к.б.н. 27.10.2010 Доцент, кафедра Микробиологии, (Главы 1-7) Блиева Л. З. вирусологии и иммунологии, к.б.н. 27.10.2010 Научный сотрудник, УНИИД, к.б.н. (Главы 1-7) Попов П. И. 27.10.2010 Научный сотрудник, УНИИД, к.б.н. (Главы 1-7) Голомазова К. А. 27.10.2010 Аспирант кафедры Микробиологии (Главы 1-7) Мизиева С. М. вирусологии и иммунологии 27.10.2010 Аспирант кафедры Микробиологии (Главы 1-7) Кузьмицкая Е. Ф. вирусологии и иммунологии 27.10.2010 Аспирант кафедры Инфекционных (Главы 1-7) Жемухова Р. Х. болезней 27.10.2010 Студент 5 курса медицинского факультета КБГУ. (Главы 1-7) Назранов Б. М. 27.10.2010 Студентка 5 курса медицинского (Главы 1-7) Захохова Д. Р. факультета КБГУ. 27.10.2010 2 (Главы 1-7) Студентка 4 курса Биологического Борисова А. А факультета КБГУ. 27.10.2010 Студентка 3 курса Биологического (Главы 1-7) Макарова М. В. факультета КБГУ. 27.10.2010 Нормокнтролер (Главы 1-7) Кольченко Е.А. 27.10.2010 3 Реферат Отчет 175 стр., 6 рис., 62 табл., 1 схема, 274 источника. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ, АНТИОКСИДАНТЫ, ФАГОЦИТРАНАЯ АКТИВНОСТЬ, БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ. Радикалы продуцируются фагоцитами в качестве молекул-«защитников». Однако повышение оксидантного статуса организма не означает одновременного увеличения сопротивляемости к патогенным бактериям и, в частности, к стафилококкам. В настоящее время большинство исследований окислительного метаболизма фагоцитов касается внеклеточной генерации активных метаболитов кислорода. Однако, известно, что часть радикалов образуется внутриклеточно. О механизме внутриклеточной генерации АФК, несмотря на интенсивные исследования, нет до сих пор однозначного мнения. Биологическая роль внутриклеточной генерации АФК в большинстве работ связывается с уничтожением поглощенных микроорганизмов. Однако, состояние свободно-радикального статуса и оценка внутриклеточной генерации АФК при инфекционных патологиях, характеризующихся длительной персистенцией микробов в организме практически не изучены. Поглощенные фагоцитом микроорганизмы при дефиците внутренних радикалов оказываются защищенными от сывороточных бактерицидных факторов и размножаются внутри клетки, вызывая вялотекущие хронические процессы, плохо поддающиеся традиционному лечению. Поиск причин неэффективности защитных радикальных систем, возможно, откроет и пути коррекции этих патологических состояний. В тоже время долговременное повышение радикалообразования в макроорганизме может привести к истощению антиоксидантной системы. Выявление закономерностей изменения содержания антиоксидантных ферментов при инфекционном процессе необходимо для объективной оценки состояния больного и для грамотного и патофизиологически обоснованного 4 назначения антиоксидантов в качестве терапетических средств. Целью исследования было изучение свободно-радикального статуса крови больных со стафилококковой инфекцией разной степени тяжести (локальные инфекции – абсцессы, флегмоны; ССВО, тяжелый сепсис) в динамике инфекционного заболевания. Проведено показателей сравнительное исследование у пациентов с различными по активности тяжести следующих бактериальными инфекциями: определение радикалообразующей активности нейтрофилов (ХЛ), измерение супероксид радикала нейтрофилами (реакция восстановления супероксидом цитохрома с), исследование уровня оксида азота (с помощью реактива Гриса), определение внутриклеточной составляющей кислородных радикалов методом флуоресцентных красителей, изучение активности антиоксидантных ферментов лейкоцитов, изучение фагоцитарной активности. Определены оксилительным нозологические стрессом, формы определены с наиболее выраженным перспективные направления дальнейшего поиска причин нарушения противобактериальной защиты, с целью использования в качестве прогностических, диагностических критериев и с целью выбора методов терапии. 5 Содержание Введение ....................................................................................................................... 8 Глава 1 Обзор теоретических и экспериментальных работ по исследуемой проблеме ..................................................................................................................... 10 1.1 Свободные радикалы в патогенезе бактериальной (стафилококковой) инфекции .................................................................................................................... 10 Глава 2 Выбор и обоснование принятого направления исследований и способов решения поставленных задач ................................................................................... 76 Глава 3 Оценка свободно-радикального статуса крови больных со стафилококковой инфекцией разной степени тяжести (локальные инфекции – абсцессы, флегмоны; синдром системного воспалительного ответа (ССВО), тяжелый сепсис) в динамике инфекционного заболевания (1, 2, 5, 7, 10, 14, 30 сутки): определение радикалообразующей активности нейтрофилов (ХЛ), измерение супероксид радикала нейтрофилами (реакция восстановления супероксидом цитохрома с), исследование уровня оксида азота (с помощью реактива Гриса), определение внутриклеточной составляющей кислородных радикалов методом флуоресцентных красителей, изучение активности антиоксидантных ферментов лейкоцитов ............................................................ 111 Глава 4 Создание модели для поиска нарушения механизмов антимикробной защиты микроорганизма, основанной на изучении взаимодействия нейтрофилов и бактерий выделенных у одного пациента .................................. 130 Глава 5 Оценка изменения эффективности фагоцитарных функций в динамике инфекционного заболевания в разные сроки инфекционного заболевания на фоне проводимой стандартной комплексной терапии ........................................ 131 Глава 6 Изучение активности супероксид дисмутазы (СОД) и каталазы в экстрактах лейкоцитов, суммарной антиоксидантной активности плазмы крови. ........................................................................................................................ 135 Глава 7 Разработка клинических карт пациентов со стафилококковой инфекцией разной степени тяжести ...................................................................... 139 6 Заключение .............................................................................................................. 143 Список использованных источников .................................................................... 151 7 Введение Несмотря на бурное развитие антибактериальной терапии и появление множества новейших антибиотиков с широким спектром действия, проблема изучения патогенеза стафилококковой инфекции и поиска наиболее эффективных средств борьбы с ней продолжает оставаться актуальной [1,2,3,4]. Основными неспецифическими клетками-эффекторами в защите от бактериальных инфекционных агентов, в том числе стафилококков, являются полиморфноядерные лейкоциты [5,6,7]. В последнее время нарушение функциональной активности нейтрофилов и цитокинового баланса организма рассматривается как причины и как следствие тяжелой гнойной инфекции и сепсиса [8,9,10,11]. Биохимическими маркерами антибактериального иммунитета являются некоторые параметры свободно-радикальных процессов в крови больного,такие как продукция свободных радикалов кислорода [12,13] и азота [14,15,16,17] фагоцитирующими клетками крови, активность основных антиокислительных ферментов в лейкоцитах, антиокислительная емкость плазмы [18]. В зависимости от типа и интенсивности бактериального стимула продукция свободных радикалов и направление их генерации изменяются. Так, в острой фазе бактериальной инфекции тканевые фагоциты и лейкоциты крови продуцируют максимальное количество свободных радикалов преимущественно внеклеточно [19,20], что объясняется необходимостью быстрой внеклеточной инактивации бактерий путем окисления бактериальных структур и необратимого повреждения ряда функций бактериальной клетки. Однако, несмотря на повышенную генерацию радикалов в острый период заболевания, в литературе описано снижение фагоцитарной активности нейтрофилов больных стафилококковой бактериальными этиологии) инфекциями [21,22,23,24]. (в том Понимание числе и причин неэффективности работы фагоцитарного звена при различных формах инфекционного процесса открывает возможность коррекции иммунодефицита. 8 Чрезмерный избыток активных форм кислорода и оксида азота трансформирует эффект радикалов из защитного в цитотоксический [25,26,27,28,29]. Это может быть как причиной разного рода заболеваний, так и сопровождать течение патологических процессов, таких как перитонит, сепсис, септический шок [30,31,32,33]. В этом случае радикалы могут проявлять токсическое действие и участвовать в разрушении ткани в ходе воспалительного процесса, дополняя действие липидных медиаторов и протеаз и других воспалительных медиаторов [34,35,36]. Условия, при которых радикалы меняют свои защитные свойства на токсические, могут быть связаны с концентрацией медиаторов воспаления, таких как простагландины и лейкотриены [37,38], металлов переходной валентности [39,40], цитокиновым профилем организма [41,42], но при высокой антиоксидантной емкости цитотоксический эффект будет незначительным [43,44]. Однако в последние годы установлено, что при целом ряде патологических процессов происходит снижение активности антиоксидантной системы (гипоксия, стресс, гнойновоспалительные заболевания брюшной полости, инфаркт миокарда) [45,46,47,48], что влечет за собой осложнения заболеваний. Целью исследования на первом этапе было исследование особенностей свободно-радикального статуса пациентов с (стафилококковыми) инфекциями разной степени тяжести. 9 бактериальными Глава 1 Обзор теоретических и экспериментальных работ по исследуемой проблеме Свободные 1.1 радикалы в патогенезе бактериальной (стафилококковой) инфекции За последние десятилетия накопилось большое количество экспериментальных данных, доказывающих участие свободных радикалов в патогенезе инфекционных (и в частности стафилококковых) заболеваний [49,50,51,52,53]. Все радикалы, образующиеся в нашем организме, можно разделить на 3 категории (таблица 1). Первичные радикалы, образующиеся из молекул за счет реакций одноэлектронного окисления с участием металлов переменной валентности. Это компоненты дыхательной цепи, такие как радикалы убихинона (коэнзимаQ), супероксид (О2-.) и окись азота (NO). Вторичными радикалами являются те, которые образуются, как правило, из первичных: перекиси водорода, липоперекисей, гипохлорита в присутствии ионов двухвалентного железа. К вторичным радикалам относятся, прежде всего, гидроксильный радикал и липидные радикалы, участвующие в реакциях цепного окисления ненасыщенных жирнокислотных цепей липидов биологических мембран и липопротеидов плазмы крови. Третичные радикалы – это радикалы, которые образуются при действии вторичных радикалов на молекулы антиоксидантов и других легко окисляющихся соединений [54]. Первичные радикалы специально вырабатываются нашим организмом и выполняют жизненно важные функции: перенос электрона в дыхательной цепи (убихинон), защита от микроорганизмов (супероксид) и регуляция кровяного давления (оксид азота), тогда как вторичные радикалы цитотоксическое действие и наносят организму большой вред [55]. Роль третичных радикалов может быть различной. 10 оказывают Таблица 1 - Метаболизм свободных радикалов. Образование радикалов Первичные радикалы: семихиноны супероксид оксид азота Радикалообразующие молекулы: Перекись водорода Перекиси липидов Гипохлорит ионы Fe2+ Вторичные радикалы: Гидроксил Липидные радикалы Удаление радикалов Восстановители СОД Гемоглобин Каталаза, пероксидазы Глутатионпероксидаза Церуроплазмин, ферритин, комплексоны Ловушки радикалов Ловушки радикалов Третичные радикалы При рассмотрении вопросов участия свободных радикалов в патогенезе инфекций, вызванных S.aureus, более подробно коснемся вопросов о роли активных форм кислорода и оксида азота. Активные формы кислорода. Физико-химические характеристики АФК. Свободным радикалом называется частица – атом или молекула, имеющая на внешней орбитали один или несколько неспаренных электронов. Образование радикалов из устойчивых молекул обусловлено появлением на свободной орбитали нового электрона или удалением электрона из пары. Эти процессы обычно происходят в результате реакций окисления или восстановления. Если электроны принадлежат к разным атомам и образуют между ними химическую связь, то разъединение этих электронов может также приводить к образованию свободных радикалов. Супероксиданион радикал - восстанавливает трехвалентное железо до двухвалентного, которое весьма токсично, так как разлагает перекиси липидов, перекись водорода и гипохлорит с образованием активных вторичных радикалов. Взаимодействуя с NO образует весьма токсичное соединение – пероксинитрит [56,57,58]. Гидроксильный радикал реагирует практически со всеми окружающими молекулами, но только малое число из 11 всех возможных взаимодействий приводит к биологически значимому эффекту (инактивация ферментов, появление новых антигенных свойств у макромолекул, окисление тиоловых групп белков и др.). Время полужизини гидроксил радикала в биологических системах составляет несколько микросекунд, а радиус диффузии около 100нм. Молекула перекиси водорода достаточно стабильна и не несет электрического заряда, сочетание этих свойств позволяет легко проникать через биологические мембраны, в отличие от других АФК. Проникая внутрь клетки, прекись может взаимодействовать с ионами железа и меди. Цитотоксичность перекиси связана, в основном, с тем, что в присутствии ионов железа, перекись водорода является источником гидроксил радикалов. Повреждающее действие синглетного кислорода проявляется в окислении аминокислотных остатков гистидина, триптофана, тирозина, цистеина, метионина, в поперечном сшивании и окислении ненасыщенных жирных кислот мембран. Механизмы генерации активных форм кислорода. Контакт фагоцитирующих клеток (тканевые макрофаги, моноциты, нейтрофилы крови, купферовские клетки печени, остеокласты костной ткани) с корпускулярными частицами или растворимыми стимуляторами приводит к резкому изменению метаболического профиля клетки [59]. К наиболее ярким сдвигам относится резкое повышение расхода глюкозы в реакциях гексозомонофосфатного шунта (ГМФШ). Одновременно возрастает потребление клеткой кислорода и образование его активных форм (АФК) – мощных биооксидантов: синглетного кислорода - О1, супероксидного радикала – О2-., гидроксильного радикала ОН., пероксида водорода Н2О2. Внезапность и скорость, с которой возникают эти реакции, послужили для образного сравнения их с взрывом. «Кислородный взрыв» - это одно из универсальных проявлений реактивности фагоцитов . Первичным метаболитом восстановления кислорода является супероксид анион-радикал [60]. В 60-х годах была выдвинута теория «супероксидзависимой токсичности кислорода». Согласно этой теории предполагалось, что образование супероксида является основной 12 причиной повреждений, вызываемых молекулярным кислородом и его производными. Реакциями, определяющими свойства супероксид аниона являются следующие реакции: 1. депротонирования субстрата (HX) О2-. +НХ <=>НО2. +Х2. окисление Х-+ О2-.<=> Х. + О223. восстановление О2-. +Х <=> О2 +ХОсновной же реакцией, определяющей свойства супероксид аниона, является реакция протонирования: О2-. +Н+<=> НО2. Протонированная форма супероксид аниона - НО2. является более сильным восстановителем, чем О2-.. По приведенным в литературе обширным данным, можно заключить, что супероксид анион и его протонированная форма достаточно сильные окислители: быстро окисляются гидрохиноны, аскорбат, а также ионы переменной валентности [61,62]. В других реакциях супероксид анион может выступать в качестве восстановителя. Взаимодействие О2-. с нитросиним тетразолием, люминолом, цитохромом «с» протекает с высокими значениями констант скорости реакции. Эти реакции используются для спекртрофотометрического и хемилюминесцентного методов. Химическая активность супероксида аниона сильно зависит от условий окружающей среды: полярности, рН, температуры. Однако, исходя из того, что супероксид анион, находящийся в неполярном окружении, легко окисляет углеводороды, можно предположить, что теория токсичности кислородных радикалов, в соответствии с которой основным звеном повреждения является диоксид, имеет немало оснований. Другой вопрос, каков конкретно механизм реакций супероксид аниона с биологическими субстратами и какие превращения претерпевает молекула супероксида в этих реакциях. В любой системе, где вырабатывается супероксид анион, можно 13 предполагать также и образование перекиси водорода в результате реакции дисмутации. Действительно, основные источники супероксид аниона в биологических системах – реакции с участием ксантиноксидазы, митохондриальных и микросомальных цепей электронов – одновременно служат источником Н2О2 [63,64]. Тем не менее, концентрация Н2О2 остается низкой, поскольку она зависит не столько от скорости образования Н2О2, сколько от скорости разложения перекиси водорода в присутствии ионов переменной валентности (реакция Фентона). Кроме того, Н2О2 является субстратом глутатион-пероксидазы и каталазы, которые катализируют следующие реакции: глутатион 2GSH+ Н2О2 ------------>>GSSG+ Н2О пероксидаза (здесь GSH и GSSG – восстановленный и окисленный глутатион) каталаза 2Н2О2------------>>2 Н2О+ О2 Благодаря активации фагоцитов особенно велика концентрация Н2О2 в очагах воспаления. В отличие от супероксид аниона пероксид водорода не является радикалом (т.е. не имеет неспаренных электронов), поэтому Н2О2 называют умеренным окислителем. Цитотоксическое действие Н2О2, повидимому, обусловлено тем, что он в присутствии ионов переменной валентности может быть источником ОН. радикалов, образование которых происходит в реакции Фентона: Н2О2+Fe +2------------>> ОН. + ОН-+Fe +3 Эта реакция является основной реакцией образования ОН. радикалов в биологических системах. Другой важной реакцией образования ОН. радикалов может быть реакция Хабера-Вайса: О2-.+ Н2О2 +Н + ------------>>1О2 + Н2О+ ОН. ОН..+ Н2О2 ------------>> Н2О+Н ++ О2-. В условиях, близких к физиологическим, скорость реакции Хабера-Вайса 14 определяется содержанием солей железа в исследуемой системе. Возможно, наиболее важным проявлением токсического действия ОН. радикалов является пероксидация липидов [65]. О2-. и ОН. радикалы участвуют также в процессе разрушения цепочки ДНК, причем наблюдается неспецифический разрыв связи (в любом нуклеотиде) [66,67]. Гидроксильный радикал реагирует с дезоксирибозой, рибозой, пуриновыми и пиримидиновыми основаниями нуклеиновых кислот, расщепление которых приводит к разрыву ДНК [68,69]. Синглетный кислород атакует соединения с двойной связью, и подобно гидроксильному радикалу, способен летально поражать биологические системы, с которыми он вступает во взаимодействие – окисляет белки, аминокислоты, липиды, нуклеиновые кислоты [70]. Основной механизм образования АФК сводится к резкому повышению образования НАДФН в клетке в результате активации гексозо-монофосфатного шунта и окисления НАДФН ферментным комплексом НАДФН-оксидазой [71]. Последняя, будучи мембраносвязанным ферментом, осуществляет одноэлектронное восстановление молекулярного кислорода до супероксидного радикала на внешней поверхности плазматической мембраны за счет окисления НАДФН на ее внутренней стороне [72]. При этом нарабатывается новая порция НАДФН, замыкая положительную обратную связь. Таким образом, основными системами продукции АФК в фагоцитах являются мембраносвязанная НАДФН-оксидаза цитолеммы, устойчивая к цианиду, электронно-транспортные цепи митохондрий, начальные этапы циклооксигеназного и липооксигеназного путей метаболизма арахидоновой кислот.Также система «миелопероксидаза-галоген-пероксид водорода», где продуцируются высокотоксичные галоид-производные оксиленного кислорода. Местом образования АФК могут быть также электроно-транспортные цепи микросом, суммарная мощность которых не меньше чем мощность дыхательной цепи митохондрий. Внутриклеточная продукция активных форм кислорода. В настоящее 15 время большинство исследований окислительного метаболизма фагоцитов касается внеклеточной генерации активных метаболитов кислорода [73,74,75]. Однако, известно, что часть радикалов образуется внутриклеточно [76,77,78]. О механизме внутриклеточной генерации АФК, несмотря на интенсивные исследования, нет до сих пор однозначного мнения. Из работ 80-х годов известно, что источником внутриклеточных радикалов могут быть О2-. радикалы, продуцируемые НАДФН-оксидазой снаружи клетки [79]. Супероксидный радикал и перекись водорода не входят непосредственно в цитоплазму, а продуцируются дискретно только в местах тесного контакта объекта фагоцитоза с плазмолеммой. Стимулированные нейтрофилы генерируют перекись либо на внешней стороне поверхности плазмолеммы, либо на внутренней поверхности фагосомы. Стимулированные макрофаги также обладают способностью вырабатывать перекись водорода во внутриклеточных везикулах. Kobzik L. С соавторами придерживается мнения, что внутриклеточная генерация АФК происходит в результате разобщения дыхательной цепи митохондрий. Folling F. с соавторами отдают предпочтение миелопероксидазе нейтрофилов, которая по их мнению, может продуцировать АФК внутрь клетки. В перитонеальных макрофагах метаболиты арахидоновой кислоты продуцируются как наружу, так и внутрь клетки. Причем вначале стимуляции одинаковое количество радикалов производных арахидоновой кислоты образуется и снаружи и внутри плазмалеммы, а затем внеклеточная продукция активных метаболитов кислорода снижается, хотя внутриклеточная остается на том же уровн. Dahlren C. с соавторами в работах по изучения вне- и внутриклеточной продукции радикалов приходит к заключению, что источники внутриклеточных радикалов могут быть различными в зависимости от типа и дозы активирующего агента. Биологическая роль внутриклеточной генерации АФК в большинстве работ связывается с уничтожением поглощенных микроорганизмов. Однако, состояние свободно-радикального статуса и оценка внутриклеточной генерации АФК при инфекционных патологиях, 16 характеризующихся длительной персистенцией микробов в организме практически не изучены. Поглощенные фагоцитом микроорганизмы при дефиците внутренних радикалов оказываются защищенными от сывороточных бактерицидных факторов и размножаются внутри клетки, вызывая вялотекущие хронические процессы, плохо поддающиеся традиционному лечению. Роль активных форм кислорода в антистафилококковом иммунитете. На участие АФК в антимикробной деятельности макрофагов указывают 2 категории явлений: 1) существование корреляции между способностью макрофагов генерировать АФК и ингибировать размножение внутриклеточных паразитов [80,81,82]; 2) наличие связи между антиоксидантной защитой некоторых микроорганизмов и их резистентностью к влиянию АФК [83,84]. Нейтрофилы и моноцитарно-макрофагальные клетки ответственны за неспецифическую резистентность организма при различных инфекционных патологиях, что определяется их способностью к поглощению и обезвреживанию микроорганизмов. Все антимикробные и антипаразитарные факторы фагоцитов можно разделить на две группы: кислород-зависимые и кислород-независимые [85,86]. К числу последних относятся - лизоцим, катионные белки, нейтральные протеиназы (эластаза, катепсин G), молочная кислота, аргиназа, сериновая протеаза и др. Кислороднезависимые механизмы бактерицидности играют существенную роль в защите от микроорганизмов. Замечено, что гипоксия в очаге воспаления, а также отсутствие генерации лейкоцитами активных форм кислорода у больных с наследственной формой хронического гранулематоза снижают, но полностью не подавляют способность фагоцитов убивать микроорганизмы [87]. Это, прежде всего, связывают с дефензинами – катионными белками, встраивающимися в бактериальную стенку и образующими каналы, подобные комплементу [88]. Дефензимы действуют в течении короткого периода в начале слияния фагосомы с лизосомой. Гистоны и лизосомные катионные белки лейкоцитов также обладают высокой бактерицидной активностью. Их действие основано на нарушении структуры и функции мембран микробной клетки. Впервые 15-30 17 минут (обратимая фаза) вследствие нарушения проницаемости мембран во внешнюю среду «вытекает» часть эндогенных компонентов микробной клетки. Вторая фаза (необратимая) длится 1-5 часов и связана с деструкцией стенки миробной клетк. По данным электронной микроскопии, у клеток S.aureus возникают разрывы цитоплазматической мембраны, резко изменяется клеточная стенка, уменьшается область, в которой располагается ядерный материал. Основой другого механизма, ответственного за деструкцию бактерий, является способность фагоцитов к респираторному взрыву. Баланс между этими двумя системами обеспечивает полноценное участие фагоцитарных клеток в противоинфекционной защите организма. Активные формы кислорода (АФК) имеют важное значение в бактерицидном действии фагоцитирующих клеток. Характерным примером, подтверждающим жизненно важное значение кислород-зависимых механизмов в противомикробной защите, является заболевание хронический гранулематоз [89]. Причиной этого заболевания является врожденный дефект НАДФНоксидазы. В отсутствии НАДФН-оксидазы фагоциты не могут продуцировать О2-., а значит и Н2О2 , ОН., НОCl. Сходные процессы происходят и в случае врожденного дефекта миелопероксидазы. В результате неполноценной оксидазной системы лейкоциты таких больных не способны убивать определенные микроорганизмы (представителей родов Staphylococcus, Klebsiella, Candida, Pseudomonas, Serratia, Salmonella), вследствие чего возникает рецидивирующий инфекционный процесс, часто переходящий в сепсис. Прежде лица, страдающие хроническим гранулематозом, редко доживали до юношеского возраста. Лечение современными антибиотиками изменило течение заболевания, и в настоящее время основные проблемы связаны с осложнениями недолеченных хронических инфекций, включая легочный фиброз, бронхоэктаз, стриктуры желудочно-кишечного и мочевого тракта. Как правило, инфекции у больных с выраженным дефектом кислородзависимой антимикробной функцией фагоцитов протекают особенно тяжело и 18 часто приводят к летальному исходу. При стафилококковой инфекции первой на внедрение бактерий отвечает система НАДФН-оксидазы [90]. Механизм активации радикал-продуцирующих клеток при бактериальной инфекции в основном рецептор-зависимый. Известно, что пептидогликан и его детерминанты обладают иммуностимулирующими и адъювантными свойствами. Janeway C.A. и Medzhitov R. доказали участие Toll-подобных рецепторов в адаптивном ответе иммунной системы на микробную агрессию [91]. При фагоцитозе инвагинация мембраны приводит к образованию фагосомы, где фермент локализован уже на внутренней стороне мембраны. В процессе окислительного метаболизма генерируются супероксид анион, перекись водорода, гидроксил анион, синглетный кислород. При изучении механизма инактивации золотистого стафилококка фагоцитами показано, что к основным бактерицидным факторам относится гидроксильный радикал, О2-. , и перекись водорода. Они участвуют в пероксидации липидов [92,93] и в процессе разрушения цепочки ДНК. Гидроксильный радикал реагирует с дезоксирибозой, рибозой, пуриновыми и пиримидиновыми основаниями нуклеиновых кислот, расщепление которых приводит к разрыву ДНК [94,95]. Перекись водорода обладает слабым бактерицидным действием в отношении стафилококка, но ее активность резко повышается в присутствии фермента миелопероксидазы. Миелопероксидаза является основной бактерицидной системой полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЯЛ). Это железосодержащий катионный белок с молекулярной массой 122кД, локализованный в азурофильных гранулах и фагосомах. В системе миелопероксидазы (в нейтрофилах), образуется гипохлоритион, также обладающий высокой реактивностью в отношении стафилококков. Бактерицидное действие миелопероксидазы проявляется только при наличии в среде перекиси водорода и галогенов. В основе механизма ее бактерицидного действия лежит галогенизация белков бактерий. Реакция протекает по следующей схеме: 19 миелопероксидаза Х- +Н2О2+АН-------------------> АХ+ОН-+Н2О, где Х- - галогены (I-,Cl-,Br-), A – белки бактерий. Концентрация компонентов миелопероксидазной системы в нейтрофилах возрастает при фагоцитозе. Перекись водорода образуется в результате окисления глюкозо-6-фосфата через гексозомонофосфатный шунт. При фагоцитозе ее образование в нейтрофилах увеличивается в 2-4 раза по сравнению с нормой. Йод поступает в нейтрофилы в виде гормонов щитоцидной железы. При недостаточной концентрации ионов йода в бактерицидной миелопероксидазной системе в процесс вовлекаются хлориды и бромиды. Гипохлорит может взаимодействовать с супероксидом с образованием других токсичных кислородных метаболитов, например, синглетного кислорода. Липофильные хлорамины, продукты взаимодействия гипохлорита с аминами, чрезвычайно токсичны, благодаря своей способности проникать через клеточные и бактериальные мембраны и атаковать внутриклеточные мишени. Кроме того, гипохлорит инактивирует железо- и серосодержащие белки. Одна из форм супероксиддисмутазы стафилококков содержит железо в активном центре, и взаимодействие с гипохлоритом ослабляет активность антиоксидантного фермента бактерий 96. Сходной активностью с гипохлоритом в отношении стафилококков обладает и пероксинитрит 97. Пероксинитрит – это продукт взаимодействия супероксида и NO 98. Это сильнейший оксидант, и благодаря отсутствию неспаренных электронов достаточно стабилен. Он эффективно окисляет SH-группы, липиды, ДНК, и белки 99,100,101. Для стафилококков пероксинитрит более токсичен, чем NO и даже гидроксильный радикал 102. Однако повышение оксидантного статуса организма не означает одновременного увеличения сопротивляемости к патогенным бактериям и, в частности, к стафилококкам. Так, при исследовании фагоцитарной активности нейтрофилов больных с генерализованной стафилококковой инфекцией 20 отмечается увеличение продукции кислородных метаболитов при значительном снижении фагоцитарной и бактерицидной активности клеток 103. Кроме того, обнаружено, что грамположительные бактерии, в силу структурных особенностей строения их клеточной стенки не подвержены бактерицидной активности сывороточных факторов 104,105. Это дает возможность бактериям длительно персистировать в организме, в том числе и внутриклеточно. Поиск причин неэффективности защитных радикальных систем, возможно, откроет и пути коррекции этих патологических состояний. По гипотезе Рябиченко Е.В. и соавт., возможно, выброс вне клетки оксидантов задействует все энергетические ресурсы, определяя неполноценность уничтожения и персистенцию инфекционного агента в организме 106. Причины могут лежать и в нарушении направления потоков генерации АФК. Повышенный внеклеточный внутриклеточном киллинге выброс бактерий радикалов в не фагосомах, участвует а во сниженный внутриклеточный пул АФК будет неэффективен. Кроме того, нельзя не учитывать и степень выраженности антиоксидантных свойств бактерий, которые благодаря имеющимся ферментам, инактивируют АФК. Роль антиоксидантной системы макроорганизма при стафилококковой инфекции. Существует устойчивое представление о том, что свободные радикалы в биологических системах представляют исключительную опасность. Однако многие нормальные физиологические процессы нуждаются в участии радикальных интермедиаторов кислорода. Так, чрезвычайно важно участие АФК и NO в процессе обезвреживания экзогенных агентов: бактерий, вирусов, простейших, грибов [107,108]. При стафилококковой инфекции, как при любом антигенном раздражении в макроорганизме также наблюдается всплеск защитных радикальных процессов [109,110]. Однако, если радикалы образуются длительно и в большом количестве параллельно с истощением возможностей антиоксидантной системы, либо происходит одномоментный мощный выброс радикалов в локальных участках клетки или организма, имеющих слабую антиокислительную защиту, то возможно радикальное 21 повреждение клеток и тканей [111,112,113,114]. Несмотря на то, что выброс АФК ограничен стафилококковых небольшой инфекциях, областью, часть например, реактивных при локальных оксидантов неизбежно поступает в окружающие ткани и кровь, вызывая существенные повреждения. Кроме того, любой воспалительный процесс сопровождается повышенным выбросом в кровоток компонентов комплемента, лейкотриенов, цитокинов и других провоспалительных медиаторов [115]. Патогенное действие АФК было бы гораздо более внушительным, если бы в организме не существовало своеобразного противовеса радикальному окислению в виде антиоксидантной системы. Организм справляется с «излишками свободных радикалов» за счет системы естественной антиоксидантной защиты [116,117]. Потеря естественной толерантности может быть обусловлена следующими факторами: во-первых, синергичными взаимоотношениями бактериальных продуктов (эндо- и экзотоксинов и др.), что может привести к еще более выраженному выбросу оксидантов фагоцитами; во-вторых, нарушением взаимоотношений нейтрофилов с тромбоцитами, способными модулировать и прекращать внеклеточный выброс АФК, индуцированный хемоаттрактантами; и, в-третьих, снижением антиоксидантного статуса организма, что определяет резистентность клеток и тканей к поражающему действию АФК. Последствия такой биохимической атаки были бы необратимыми, если бы не действие антиоксидантов. Найден целый класс веществ, препятствующих разрушительному эффекту радикалов. По определению B. Halliwell и J. Guttegidge антиоксидантом является «любая субстанция, присутствующая в незначительной концентрации по сравнению с окисляемым субстратом, значительно сдерживающая или полностью подавляющая окисление данного субстрата» [118]. Все антиоксиданты можно разделить на две группы: ферментные и неферментные. К последним относятся токоферолы, каротиноиды, хиноны, аскорбиновая кислота и металлосвязывающие белки. К ферментным антиоксидантам относятся супероксид дисмутаза (СОД), каталаза, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. 22 Одним из ключевых ферментных антиоксидантов является СОД эритроцитов быка, [119,120,121,122]. Впервые способность СОД, выделенной из катализировать реакцию дисмутации супероксид аниона была описана МакКордом и Фридовичем [123]. Этот фермент имеет молекулярную массу 32 кД и состоит из 2-х субъединиц, каждая из которых содержит по 1 атому Zn и Cu. Реакция с СОД состоит из двух стадий и заключается в переносе электрона с одного О2-. радикала на другой. Промежуточным акцептором этого электрона служит атом меди, входящий в активный центр СОД. Схематически этот процесс можно представить следующим образом: СОД-Сu2++ О2-.----------->> СОД-Сu++ O2 СОД-Сu++ О2-.----------->> СОД-Сu2++Н2О2 Zn 2+ не участвует в каталитическом цикле, ходя входит в активный центр. Кроме Zn и Cu-СОД были обнаружены и другие виды СОД, содержащие ионы Mn2+ или Fe3+. Время жизни экзогенной СОД, введенной в организм, составляет только 3-4 минуты. Увеличение пребывания фермента в организме достигается путем иммобилизации на полимерном носителе, либо путем заключения его в липосому. Каталаза (КАТ) способна ослабить токсичность, связанную с перекисью водорода, и с производными перекиси. В основе действия каталазы лежит реакция: каталаза 2Н2О2------------>>2 Н2О+ О2 Это наблюдается и в модельных системах, и в суспензиях фагоцитирующих клеток, которые продуцируют Н2О2 и повреждают бактерии, эритроциты, опухолевые клетки. Каталаза представляет собой гемовый фермент, состоящий из четырех субъединиц с общей молекулярной массой около 240 кД [124]. Механизм взаимодействия каталазы с перекисью связан с образованием промежуточных продуктов (соединение-1). Пероксидазы также являются ферментами, разрушающими Н2О2 , при 23 этом окислению подвергается субстрат (АН2): Н2О2+ АН2------------>>2 Н2О+А Пероксидазы различаются по субстратам окисления и строению активного центра. Глутатион-пероксидаза осуществляет следующую реакцию: Н2О2+ 2GSН------------>>2 Н2О+GSSG Глутатион-пероксидаза эритроцитов имеет молекулярную массу 84кД и состоит из четырех субъединиц, каждая из которых содержит атом селена в виде Se-цистеина, то есть аминокислоты цистеина, у которой атом серы замещен на атом селена [125]. Кроме того, существует большой класс гемсодержащих пероксидаз, использующих в качестве субстрата различные доноры атомов водорода – гваякол, бензидин, о-дианизидин. К этому классу ферментов относятся пероксидаза хрена, миелопероксидаза, лактопероксидаза и др. Известно, стафилококком что само угнетает по себе инфицирование активность макроорганизма супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы в эритроцитах, снижая защитный потенциал организма [126]. Гиперпродукция свободных радикалов в острой стадии инфекционного процесса неизбежно антиоксидантных должна ферментов привести к и, результат, как адаптационному повышению увеличению общей антиоксидантной емкости плазмы крови. В последние годы установлена тесная взаимосвязь между многими патологическими состояниями (гипоксией, стрессом, воспалениями, инфарктом миокарда) и процессами усиленного образования радикалов [127,128]. В связи с этим активно изучается состояние основных компонентов антиоксидантной системы у различных категорий больных, отражающее степень окислительного стресса и депрессии защитных механизмов организма. Большое количество экспериментальных и клинических работ свидетельствует, что при различных формах инфекций активность антиоксидантных компонентов может, как повышаться, так и понижаться [129,130,131]. При изучении антирадикальной системы больных перитонитом, в том 24 числе и стафилококковой этиологии, выявлено, что окислительный стресс вызывает разнонаправленные изменения активности антиоксидантных ферментов, что может отражать как степень их адаптации к сдвигам в системе прооксиданты-антиоксиданты, так и показывать характер дисбаланса ее составных частей. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы снижена на 11%, уровень каталазы снижен на 20%, в то время как активность супероксиддисмутазы повышена. Павлюченко И.И. с соавт. объясняет подобные данные проявлением дисбаланса и предлагает приводить уровень ферментов в виде отношения КАТ\СОД. Васильков В.Г. с соавторами обнаружили определенные взаимосвязи между показателями антиоксидантной системы и показателями крови (уровень Hb, альбумина, форменных элементов крови) у больных с хирургическими инфекциями [132]. Следствием нарушения антиоксидантного статуса организма при инфекции может быть снижение транспортной функции альбумина, так как молекула альбумина оказывается загруженной лигандами различной природы, среди которых большую роль играют продукты ПОЛ. Авторы отмечают также, что у пациентов со смертельным исходом (терминальная стадия перитонита) активность каталазы была сниженной. Подобные данные могут служить основой в установлении степени тяжести заболевания и являться прогностическим фактором и определять методы и способы коррекции нарушенных функций. Активно изучается состояние антиоксидантной системы и при критических состояниях, таких как системная воспалительная реакция или сепсис стафилококковой этиологии [133,134]. СОД и КАТ эритроцитов в острую стадию инфекционного процесса повышена более чем в два раза, однако на 3-4 сутки пребывания в стационаре уровень антиоксидантов значительно снижается [135,136,137]. Таким образом, выявление закономерностей изменения содержания антиоксидантных ферментов при инфекционном процессе необходимо для объективной оценки состояния больного и для грамотного и патофизиологически обоснованного назначения антиоксидантов в качестве терапетических средств. 25 Физико-химические характеристики оксида азота и его биосинтез в организме. Оксид азота (NO.) – нетипичная сигнальная молекула. NO. неорганическое, газообразное соединение со свойствами радикала (.N=O), имеет неспаренный электрон, что придает ему высокую реакционную способность 138,139. Показано, что NO присутствует в клетках и тканях человека и животных 140,141. Радикал NO может реагировать в биологических системах с кислородом, супероксидным анион-радикалом и ионами металлов переходной валентности 142,143. В связи с этим функциональный ответ клетки на действие NO многообразен и в значительной степени зависит не только от фенотипа клетки-мишени, но и от количества NO в клетке и окружающих молекул. Оксид азота хорошо растворим в воде и липидах, незначительные размеры молекулы NO позволяют ей легко и быстро диффундировать через мембраны, не нуждаясь в рецепторах 144. Время жизни не превышает 6-10 секунд, после чего он превращается при участии кислорода и воды в нитраты и нитриты. Оксид азота образуется в результате окисления кислородом гуанидиновой группы L-аргинина при участии фермента NO-синтазы (NOS). Кроме NO в реакции образуется цитруллин. Кислородные атомы как в NO, так и в цитруллине происходят из атмосферного кислорода. В процессе биосинтеза NO участвует 5 электронов. По своему механизму реакция подобна монооксидазной реакции с участием цитохрома Р-450. В ходе реакции образуется промежуточный продукт N-гидрокси-L-аргинин. Для активности NOS необходимы кальцийсвязывающий белок кальмодулин (СаМ), а также коферменты и простетические группы: тетрагидроптерин (BH4), NADP, FMN,FAD и гем. Таким образом, NOS – это биоптерофлавогемопротеин. В молекуле фермента выделяют 2 домена: оксигеназный (гемовый) домен на Nконце и редуктазный домен на С-конце. Редуктазный домен включается в транспорт электронов от NADPH, а в оксигеназном домене находится центр для связывания аргинина и активации кислорода. Между доменами расположен участок для связывания CaM, без которого любая форма фермента неактивна 145,146. 26 Три изоформы NOS очищены, клонированы и охарактеризованы на молекулярном уровне 147,148. Две из них стационарные (конститутивные): нейрональная –nNOS (NOS1) и эндотелиальная – eNOS (NOS3). Необходимо отметить, что любая ткань может содержать более чем одну форму NOS, принимающих участие в образовании NO при различных физиологических состояниях. Конститутивные формы фермента поддерживают низкий стационарный уровень NO, который не превышает нескольких микромолей и необходим для нейротрансмиссии, поддержания электрической активности нервных клеток, что крайне важно для сохранения долговременной памяти; для вазорелаксации, эрекции, секреции гормонов, регуляции почечной гемодинамики 149,150. Индуцибельная форма фермента (iNOS) экспрессируется во многих клетках (макрофаги, нейтрофилы, клетки печени, гладкомышечные клетки) после иммунологических стимулов и при воспалении, например под влиянием медиаторов этих процессов – цитокинов, а также при действии на клетку эндотоксинов 151,152. По данным Маеда Х. и Акаике Т. существует два основных механизма липополисахаридов индукции и и тейхоевых активации кислот iNOS: 1)действие грамположительных и грамотрицательных бактерий и 2) действие брадикинина, который часто образуется при бактериальных инфекциях 153. При участии iNOS высвобождается большое количество NO. Стационарный уровень NO в этих тканях достигает сотней микромолей и поддерживается в течении от нескольких часов до нескольких дней в зависимости от длительности стимула. Оксид азота диффундирует через мембраны, и действуя на близлежащие клетки-мишени, усиливает апоптоз, убивает патогенные бактерии и координирует Т-клеточный иммунный ответ. Молекулярные основы действия оксида азота. Оксид азота свободно секретируется из клетки без участия переносчиков, быстро передвигается и проникает в соседние клетки, не связываясь с мембранными рецепторами [154]. 27 Внутриклеточные эффекты NO зависят от его редокс состояния 155. С биологической точки зрения наиболее важными являются следующие редокс формы: NO.и NO+. Свободный радикал NO в клетке быстро взаимодействует с молекулярным кислородом, супероксидным анион-радикалом и металлами гемсодержащих и негемовых белков. В результате в клетке образуются нитрозильные комплексы гемового и негемового железа. Непосредственно с SH- группами белков взаимодействует NO+, который образуется из NO. после восстановления или взаимодействия с металлами. В результате в клетке при достаточном количестве тиолов под влиянием NO происходят нитрозилирование и изменение активности металлсодержащих белков, а также белков, имеющих реактивные цистеины. Таким образом, молекулярные основы физиологических эффектов NO связаны главным образом с реакциями нитрозилирования белков. В случае образования больших количеств NO последний может реагировать с супероксидным радикалом, образуя другую активную форму кислорода – пероксинитрит (ONOO-). Пероксинитрит обладает гораздо большей реакционной способностью, чем NO или супероксидрадикал 156. Пероксинитрит может вступать в реакцию восстановления с глутатионом и углекислым газом. В этом случае образуется нитрозопероксикарбонат (ONO2CO2-), который вызывает химическую модификацию реактивных остатков тирозина в белках, что сопровождается изменением их активности [157,158]. Кроме того, токсичный продукт пероксинитрит может неэнзиматически продуцировать гидроксильные радикалы, включая, таким образом, молекулу NO в образование новых активных форм кислорода. Показан и прямой цитотоксический эффект пероксинитрита на культуре клеток 159,160,161,162,163,164. Итак, в основе широкого разнообразия NO-эффектов в клетке лежат изменение редокс-формы молекулы NO, а также дополнительные реакции с 28 металлами, тиолами, остатком тирозина в составе белков. Увеличение количеств АФК может трансформировать эффекты NO из защитных в цитотоксические. Последние могут возникнуть при индукции iNOS бактериальными продуктами, цитокинами, а также при истощении в клетке тиолов и увеличении АФК. Оксид азота и патогенез стафилококковой инфекции. NO уничтожает множество типов патогенных микроорганизмов или останавливает их рост (вирусы, бактерии, грибы, простейшие) (таблица 2) 165,166,167. Стафилококковая инфекция сама по себе ведет к индукции iNOS параллельно с индукцией цитокинов, что является частью защитной реакции организма 168. Очевидно, что NO не единственный антипатогенный эффектор иммунной защиты, однако в значительном большинстве случаев он является либо индуктором, либо исполнителем бактерицидной программы. Следует выделить два феномена в реализации этой программы: 1) суицидная гибель клетокносителей ограничивает благоприятную среду размножения; 2) выделение токсичных для патогенов субстанций, оказывающих бактерицидное действие. Таблица 2 - Патогены, чувствительные к оксид азот зависимойантимикробной защите. Патоген Staphylococcus aureus Salmonella typhimurium Salmonella choleraesuis Brucella suis Legionella pneumophilia Leishmania major Mycobacterium tuberculosis Клетки-продуценты Нейтрофилы, макрофаги человека Макрофаги мыши -- Макрофаги мыши IL-10 Макрофаги мыши In vivo мыши IFN- TNF- In vivo мыши Альвеолярные макрофаги человека, Макрофаги мыши -IFN- 29 Участие цитокинов -- Особый интерес вызывает участие NO в эрадикации условно-патогенных бактерий, персистирующих внутриклеточно и защищенных от бактерицидных компонентов сыворотки крови и действия лекарственной терапии, к которым относится и стафилококк. Некоторые авторы указывают на участие NO в индукции апоптической гибели внутриклеточноперсистирующих патогенов. Гибель клеток–носителей лишает бактерии благоприятной среды для размножения, а утилизация погибших клеток окружаюшими фагоцитами затрудняет диссеминацию инфекционного процесса. Бактериальные продукты (токсины, пептидогликан, ЛПС) индуцируют в макрофагах синтез TNF-. Этот цитокин как аутокринный регулятор через рецепторы индуцирует iNOS. При этом синтез больших количеств NO. и апоптическая гибель вызываются только вирулентными штаммами бактерий 169. Следует отметить, что и способность к индукции апоптоза в моноцитарно-макрофагальных клетках и нейтрофилах тесно связана с их антибактериальной активностью 169. Нейтрофилы, составляющие около 2\3 всех лейкоцитов и способные функционировать в гипоксических очагах из-за наличия системы анаэробного гликолиза, являются одним из важнейших элементов неспецифической защиты организма. Секретирумые ими АФК являются мощным микробицидным фактором. В последнее время удалось показать, что в присутствии ИЛ-1, ФНО, ИНФ- нейтрофилы человека экспрессируют iNOS, появляющуюся в первичных гранулах совместно с миелопероксидазой. Последующая продукция NO и других высокоактивных соединений азота, таких как NO-, ONOOприводит к иммобилизации и уничтожению S.aureus путем нитрования тирозиновых остатков бактериальных белков 170. Этот L-агрининзависмый механизм показал свою исключительно важную роль и эффективность в антистафилококковой реакции в исследованиях как in vitro, так и in vivo. В работе Kaplan S. исследовали киллинг стафилококков в присутствии доноров NO и супероксид радикала 171. Обнаружено, что NO не влияет на жизнеспособность бактерий в первые 2 часа, в отличие от О2-.. И только при взаимодействии этих двух активных компонентов достигается 30 уничтожение стафилококков. В эксперименте in vivo мыши, лишенные гена iNOS, проявляли более высокую чувствительность к стафилококковой инфекции по сравнению с родительской линией 171. Реакции NO. с биополимерами лежат в основе бактерицидных феноменов и их можно разделить на 3 группы: 1) взаимодействие с гемовым и негемовым железом; 2) реакции с SH- и NH2-группами; 3) участие в других свободнорадикальных процессах. Наиболее изученной реакцией является активация гуанилатциклазы, опосредующая активацию лейкоцитов. Среди других белков, содержащих гемовое и негемовое железо, активность которых регулируется NO., выявлены NO-синтазы, дегидрогеназы дыхательного комплекса и фермент цикла Кребса – митохондриальная cis-аконитаза. Уменьшение доступности железа для микробов, индуцируемое IFN-, в некоторых работах рассматривается как основной механизм антимикробного действия макрофагов. Мишенью для NO в этом случае служит цитоплазматический железорегулирующий белок (IRP) 172,173. Другим способом антимикробного воздействия NO может быть инактивация антиоксидантных ферментов бактерий. Одна из форм супероксиддисмутазы бактерий содержит железо в активном центре, и образование нитрозильного комплекса с NO ослабляет активность антиоксидантного фермента бактерий 174. Антимикробную активность NO стали использовать и в практической медицине. Липатов К.В. с соавторами в комплексном лечении 40 больных с гнойными ранами мягких тканей применил метод NO-терапии, основанный на обработке ран газовым потоком, содержащем NO [175]. Раны обрабатывали ежедневно в течение 5-7 дней. Местное лечение ран, помимо этого, включало в себя использование антисептиков и мазей на полиэтиленоксидной основе. Уже к 3 суткам лечения после 2-3 сеансов NO-терапии у пациентов отмечено резкое уменьшение экссудации, перифокальных воспалительных явлений. Микробная обсемененность находилась на уровне 10 (исходная микробная обсемененность -10 2-3 6-8 микробных клеток на 1 г ткани микробных клеток на 1 г ткани). Анализ данных лазерной допплеровской флюориметрии показал улучшение 31 показателей микроциркуляци на 20-30%. Сопоставление субъективных и объективных характеристик ран в основной и контрольной группах через 5 суток лечения показало стихание воспалительных явлений и переход раневого процесса в фазу пролиферации у 90% больных. Таким образом, представленная тактика комплексного лечения гнойных ран с использованием NO позволила в короткие сроки ликвидировать раневую инфекцию и сократить сроки подготовки раневой поверхности к хирургическому закрытию. Однако цитотоксичность NO проявляется не только в отношении стафилококков. При длительно текущих хронических процессах или при таких острых состояниях как системная воспалительная реакция NO может выступать в качестве агрессора. С одной стороны оксид азота активно участвует в подавлении и элиминации возбудителя инфекционного заболевания и при применении L-NMMA, который блокирует образование NO, увеличивается летальность больных с септическим шоком [176,177,178]. С другой стороны, избыточная концентрация NO может быть токсической и привести индукции аутоиммунных процессов. За образование и длительное выделение большого количества NO ответственна индуцибельная форма NOS. Экспрессия iNOS увеличивается в различных клетках воспалительных стимулов, в том и тканях под действием многих числе цитокинов и бактериальных эндотоксинов, например при септическом шоке. В этом случае NO может проявлять токсическое действие и участвовать в разрушении тканей в ходе воспалительного процесса, дополняя действие липидных протеаз, активность макрофагов и нейтрофилов. Условия, при которых NO меняет свои протективные свойства на токсические для организма, могут зависеть и от локальной концентрации тиолов, металлов переходной валентности, активных форм кислорода и, возможно, других соединений, реагирующих с NO. Нельзя не отметить бактериального и то, что при хронических воспалительных процессах и вирусного происхождения продукция NO может способствовать развитию канцерогенеза. NO, супероксид и продукт их реакции – пероксинитрит становятся медиаторами воспаления, модифицируют 32 белки и повреждают нуклеиновые кислоты. При хроническом воспалении эти эффекты продолжаются в течение десяти и более лет, а результатом длительного процесса становится канцерогенез. Обобщая приведенные выше данные, можно заключить, что NO играет сушественную роль в патогенезе стафилококковых инфекций. Он может действовать как агент, который вызывает гибель патогенов, и может угнетать иммунную систему макроорганизма. В связи с этим регуляция синтеза NO имеет существенное значение для повышения эффективности терапии инфекционных заболеваний, как путь сенсибилизации самого патогенного начала и увеличения резистентности организма. Иммуноцитокины в регуляции радикалпродуцирующей способности нейтрофилов. Роль иммуноцитокинов в предстимуляции фагоцитарных клеток. Термин «иммуноцитокин» объединяет факторы пептидной и гликопротеидной природы, синтезирующиеся лимфоидными и нелимфоидными клетками и оказывающими воздействие на функциональную активность иммунной и других систем организма. К иммуноцитокинам относят интерлейкины, интерфероны, факторы некроза опухоли, ростовые факторы (ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ), цитотоксичные и супрессорные факторы. Границы между группами условны и в значительной степени связаны с обстоятельствами их открытия. Главными медиаторами, модулирующими активность фагоцитарных клеток при инфекции являются интерлейкины (ИЛ), интерфероны (ИФН), факторы некроза опухоли (ФНО) [179,180]. Цитокины оказывают сильное влияние на выработку друг друга: они могут включать их выработку, вызванную другими агентами, значительно реже ингибирут ее. Иммуноцитокины не оказывают непосредственного стимулирующего действия на клетку, но приводят к усилению ответа на второй сигнал [181]. Это явление получило название «предстимуляция» или «прайминг». Этап цитокин-зависимой предстимуляции включает в себя изменение компонентов вторичных мессенджеров, что приводит к изменению функциональной 33 активности клетки. Процесс активации фагоцитарной клетки можно представить этапами: резидентная, предстимулированная (примированная), активированная клетка. Здесь важны биохимические, биофизические и иммунологические процессы, происходящие в клетке. Так, к ранним активационным событиям относятся повышение концентрации ионов кальция, повышении ктивности фосфолипазы D, метилирование фосфолипидов, значительно усиливается генерация активных форм кислорода. К более поздним и иммунологически значимым событиям относятся: изменение числа и аффинности рецепторов, изменение числа молекул 2 класса гистосовместимости, экспрессированных на поверхности клеток и др. Были исследованы основные характеристики клеток при переходе из резидентного состояния в активированное. Резидентные клетки имеют фенотип Ia-, LFA-1-, TFR+. Примированные клетки имеют слабую пролиферативную способность, выполняют функцию селективного связывания с опухолевыми клетками, антигенную презентацию, невысокий уровень продукции супероксиданиона. Маркеры примированных макрофагов – Ia+, LFA-1+ TFR-. Примированные макрофаги нецитотоксичны, но высоко чувствительны к любому воздействию и под влиянием стимулятора становятся эффекторными клетками, причем этот процесс является обратимым . Wolf M. предположили, что один из механизмов предстимуляции заключается в транслокации протеинкиназы С в плазматическую мембрану, что приводит к большему аффинитету к активирующим веществам [182]. Последующая активация вызывает образование диацилглицерола и повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция, которые воздействуют на протеинкиназу и приводят в большей, чем обычно активации клетки [183]. Большинство работ по изучению предстимуляции иммуноцитокинами фагоцитарных Предстимуляция клеток касается цитокинами свободно-радикальных фагоцитарных клеток процессов. характеризуется сокращением латентного периода генерации АФК, увеличением скорости и повышением максимального уровня оксидазной активности [184,185]. Кроме 34 того, обнаружено, что иммуноцитокины не просто повышают общее количество генерируемых радикалов, но вызывают перераспределение направления их продукции: если в контрольных клетках при последующей активации внутрь клетки продуцируется около 35%, то в предстимулированной –60-76%, что приводит к повышению эффективности киллинга поглощенных бактерий. Отмена эффекта предстимуляции под действием циклогексимида и других ингибиторов синтеза белка свидетельствует также об участии в этом процессе экспрессии рецепторных структур, синтезе цитокинов, возможно, с аутокринным действием [186,187,188]. По данным литературы, в ряде случаев предобработка макрофагов иммуноцитокинами, например ИЛ-4, ведет не к активации, а к снижению кислородного взрыва, причем эффект проявляется после предварительной инкубации и в ответ на стимуляцию ФМЛП, действующим по рецепторзависимому механизму [189]. В результате предстимуляции изменяется синтез и продукция другого высокоактивного радикала – оксида азота (NO.), причем разные цитокины могут иметь противоположные эффекты. Так ИЛ-1, ИФН-γ, ФНО-α активируют NO-синтазу (iNOS). ИЛ-4,8, 10 ингибируют iNOS. Особенно хорошо изучен механизм предстимулирующего действия ИФН-γ, демострирующий изменение компонентов вторичных мессенджеров, происходящее во время прайминга. Так, сигнальные каскады, приводящие к активации синтеза iNOS специфичны для каждой клетки, но включают пути с участием тирозинкиназ и общего транскрипционного фактоора NF-kb. В трансдукции сигнала участвуют Janus киназы, а также белки STAT - сигнальные трансдукторы и активаторы транскрипции. После взаимодействия ИФН-γ с тирозинкиназным рецептором активируются Janus киназы, происходит транслокация STAT белков к рецептору и после фосфорилирования STAT белки взаимодействуют с регуляторными элементами в ДНК и активируют транскрипцию гена iNOS. Вероятно, именно эффектом предстимуляции, затрагивающим такие 35 эффекторные функции как генерация радикалов, синтез цитокинов, киллинг инфектов, можно объяснить положительное влияние на исход гнойновоспалительных процессов ИЛ-1,6, ИФН-γ, ФНО-α,β, а также их комплексов [190,191]. Исходя из литературных данных, перспективным направлением дальнейших научных комплексов иммунопрепаратов, регуляции функций разработок защитных будет создание затрагивающих клеток. При многокомпонентных различные этом нужно механизмы учитывать патофизиологические особенности конкретных нозологических форм, свойства инфекционного агента и локализацию патологического процесса. Основные иммуноцитокины, задействованные в антибактериальной защите организма. Значительный прогресс в изучении клеточных и молекулярных основ развития и функционирования иммунной системы позволил существенно изменить представления о роли иммунных механизмов в патогенезе многих заболеваний, в том числе бактериальных инфекций. Иммуноцитокины регулируют большинство межклеточных взаимодействий в норме и при патологии. Эффекты, вызываемые цитокинами, чрезвычайно сходны с симптомами, появляющимися у больных с острыми и хроническими заболеваниями инфекционного происхождения. Это свидетельствует о том, что цитокины являются ключевыми факторами, регулирующими системные патофизиологические события: активность нейронов ЦНС, проницаемость сосудов, гемопоэз, уровень белков острой фазы в крови, синтез и выброс в кровоток других иммуноцитокинов, утилизация липидов и др. [192,193]. При местно протекающем инфекционном воспалении цитокины являются активаторами макрофагов, гранулоцитов, стимулируют выброс гистамина, усиливают продукцию факторов свертываемости крови эндотелиоцитами сосудов, активируют систему остеокластов, способствуют ранозаживлению (таблица 3). Дефицит иммуноцитокинов способствует развитию ряда заболеваний, а их нормальное содержание в организме усиливает резистентность хозяина при инфекциях. Биологические эффекты иммуноцитокинов направлены не только 36 на клетки иммунной системы, но и на клеточные элементы, участвующие в процессах регенерации поврежденных тканей [194,195,196]. Ниже представлены краткие сведения об основных группах цитокинов, участвующих в противобактериальной защите. Интерлейкины. Интерлейкины (ИЛ) – семейство биологически активных гормоноподобных белковых молекул, различных по структуре и функциям, которые участвуют в регуляции иммунитета и воспалительных процессов. Таблица 3 - Роль иммуноцитокинов в инфекционно-воспалительной реакции организма. Эффекты Цитокины ФНО Интерлейкины Системные: Лихорадка Сомногенность Потеря аппетита Утрата массы тела Септический шок Нейтрофиллез Боль Местные: Хемотаксис Микробицидно сть Фагоцитоз Адгезия Дегрануляция Активация синтеза гистамина Усиление свертываемост и крови Формирование рубцовой ткани ИФН КСФ 1 2 3 4 5 6 8 α Β α β γ Г- М- ГМ- + + + + + _ - - - - + - - + + + + + + - - - + _ _ - + _ _ - + _ _ - + + + - + - + - + + + - + + + + + + + + + + + + - - - - + - + - +\+ - - - - - + + + + - + + + + + + + + + + + + + - + + + - + + + - - - - +\- - - + - - - - - - - - + + + + - - - - - - + + - - - - - - + - - - - - - - + - +\- - - - - - - - - Синтез интерлейкинов активируется при различных иммунных реакциях, 37 в том числе и при инфекционных процессах. Наиболее изучена роль ИЛ-1 в противобактериальной защите организма. В 1979г. название «интерлейкин-1» было дано цитокину макрофагального происхождения для обозначения его действия как лимфоцитактивирующего фактора, усиливающего функции Т- и В-лимфоцитов. Существует два вида ИЛ-1 – α и β. Человеческий ген для ИЛ-1 α кодирует белок ММ 30606Д, рI 5.0, а ген для ИЛ-1 β - кодирует белок с ММ 30749Д, рI 7.0 [197]. Исследования, проведенные в течение следующего десятилетия, подтвердили, что ИЛ-1 способен стимулировать функции многих типов лейкоцитов (Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток, моноцитов, нейтрофилов). Столь широкий спектр биологических функций сводится к одному: ИЛ-1 является одним из главных медиаторов, ответственных за развитие местной воспалительной реакции и острофазового ответа на уровне организма. Среди множества веществ, вызывающих продукцию ИЛ-1, наиболее сильными индукторами являются компоненты выраженном инфекционном клеточных процессе, стенок бактерий. сопровождающемся При изменением показателей острофазового ответа, ИЛ-1 появляется в плазме крови. Повышение его концентрации коррелирует с подъемом температуры тела и достигает наивысшего значения у лихорадящих септических больных [198]. Биологический смысл существования ИЛ-1 заключается в выполнении им роли медиатора, обеспечивающего взаимодействие различных защитных противоинфекционных механизмов на уровне целостного организма. ИЛ-1 продуцируется в очаге воспаления и вызывает целый комплекс изменений, действуя на различные типы клеток как местно, так и системно. Местное действие ИЛ-1 направлено на активацию Т-, В-лимфоцитов, макрофагов, NKклеток и других клеточных элементов, стимулирующих функции соединительной ткани и эндотелия. Системные проявления биологической активности ИЛ-1 также направлены на усиление защитных механизмов. Например, подъем температуры тела способствует более эффективной активации иммунокомпетентных клеток 38 и препятствует размножению бактерий. Блокирование репликации бактерий достигается также и изменением ионного состава плазмы. Быстрая мобилизация защитных сил обеспечивается и за счет возникающего под действием ИЛ-1 лейкоцитоза и стимуляции гемопоэза. Таким образом, ИЛ-1 вызывает активизацию защитных механизмов, характеризующих острофазовый ответ организма на инфекционный агент. Однако, несмотря на столь широкий спектр действия, введение в биологическом эксперименте животным одного ИЛ-1 не в состоянии воспроизвести картину острофазового воспалительного ответа в полном объеме. Это достигается только при совместном действии ИЛ-1 с другими цитокинами. Интерлейкин-2 (ИЛ-2) – называют центральным Т-клеточным лимфокином. Стимулирует пролиферацию 1 и 2 типов Т-хелперов, потенцирует продукцию ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО. Покоящиеся лимфоциты не содержат в цитоплазме и спонтанно не продуцируют ИЛ-2. Активация Т-лимфоцитов ведет к продукции ИЛ-2 и экспрессии его рецепторов, которые представлены на Тклетках, моноцитах, макрофагах, В-клетках, NK-клетках. У всех субклассов лимфоцитов и у макрофагов биологическое действие ИЛ-2 осуществляется посредством связывания со специфическими рецепторами, общими для всех клеток [199]. Кроме митогенного эффекта, ведущего к клональной экспансии активированных антигеном лимфоцитов, ИЛ-2 также потенцирует продукцию ряда цитокинов (ИЛ-1, ИФН-γ, ФНО-α), причем все эти медиаторы ведут к усилению иммунного ответа на инфекционный агент. При инфекционных и токсических процессах у больных выявлено снижение содержание ИЛ-2 в крови на 3-10 день соответственно на 32 и 48% с одновременным понижением количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-супрессоров [200]. Выявленный дефицит ИЛ-2 при целом ряде патологий является патогенетическим обоснованием успешного применения ИЛ-2 в клинической практике. Таким образом, ИЛ-2 является ключевым фактором в развитии иммунного ответа и его действие приводит к развитию плейотропного ответа с участием нескольких субпопуляций клеток иммунной системы. К группе основных 39 иммуноцитокинов, задействованных в противобактериальной защите, относится и ИЛ-6. По многообразию клеточных источников продукции и количеству мишеней биологического действия ИЛ-6 может считаться типичным интерлейкином, осуществляющим связь между различными типами клеток, участвующих в реализации воспалительной реакции организма. ИЛ-6 в норме секретируется многими типами клеток - Т-лимфоциты, фибробласты, моноциты, эндотелиальные и другие клетки. Продукция ИЛ-6 индуцируется под влиянием бактерий и их продуктов жизнедеятельности. Другие цитокины (ИЛ-1, ИФН, ФНО), продуцируемые клетками под действием тех же индукторов, способны еще более усиливать секрецию ИЛ-6. Действие ИЛ-6 может осуществляться как местно, так и системно при его попадании в циркуляцию (таблица 4). Интерсным свойством ИЛ-6 является и то, что он подавляет выработку ИЛ-1 и ФНОα. Эта особенность ИЛ-6 определяет его двойственную роль в развитии воспаления – являясь по своим эффектам типичным провоспалительным цитокином, он оказывает и противовоспалительное действие, т.е. как бы завершает формирование воспалительного процесса. Таблица 4 - Спектр биологического действия интерлейкина-6. Клетки-продуценты Т и В лимфоциты Клетки-мишени Аутокринное действие Макрофаги Т- и В-лимфоциты Фибробласты Аутокринное действие Лимфоциты Костный мозг гепатоциты Т и В-лимфоциты Кератиноциты 40 Биологические эффекты Пролиферация Т-лф, Продукция ИЛ-1,2 Дифференцировка В-лф в АОК Пролиферация Т-лф, Продукция ИЛ-1,2 Дифференцировка В-лф в АОК Экспрессия антигенов 1 класса гистосовместимости Усиление гранулопоэза Выброс в кровоток белков острой фазы Продукция провоспалительных цитокинов Дифферецировка лимфоцитов Еще одним интерлейкином из группы провоспалительных является ИЛ-8. Это индуцибельный белок, с ММ 8.8Д, состоящий из 99 аминокислот. Продуцируется макрофагами, лимфоцитами, фибробластами, эндотелиоцитами. ИЛ-8 является хемоаттрактантом, способствует усилению адгезивных свойств нейтрофилов, генерации воспалительной реакции АФК. и ИЛ-8 его является содержание мощным повышено индуктором при многих инфекционных заболеваниях, особенно высоко содержание ИЛ-8 в плазме больных с генерализованной стафилококковой инфекцией. Синтез ИЛ-8 индуцируется другими цитокинами – ИЛ-1α, ИЛ-1β, ИЛ-2,ИЛ-6, ФНО [201]. При хроническом воспалении ИЛ-8 наряду со всей группой провоспалительных цитокинов может играть роль одного из патогенетических звеньев . Интерфероны. Интерфероны (ИФН) – это гетерогенная гликопротеидов, продуцируемых в организме в ответ на группа вторжение микроорганизмов и обладающих способностью активировать цитотоксичность NK клеток, их предшественников, мононуклеарных фагоцитов, а также участвовать в цитолизе клеток-мишеней. Известно три типа ИФН – α, β, γ. Совместное действие ИФН α, β, γ более эффективно, чем действие любого из них. ИФН способствуют дифференцировке NK клеток в функционально активные с маркерами Qa-5, Ly-5 и индуцируют экспрессию Ia и DR антигенов на макрофагах, тем самым предстимулируя их для противомикробной и противоопухолевой активности [202,203]. ИФН γ повышает бактерицидную активность лейкоцитов и по кислородзависимому пути, то есть увеличивает продукцию АФК; активирует NOS, повышая содержание в плазме оксида азота. Кроме того, группа ИФН усиливает экспрессию Fc и С3 рецепторов на нейтрофилах. Рецептор макрофагов к С3 компоненту комплемента обычно иммобилизован в плазматической мембране клетки и не способствует осуществлению фагоцитоза даже при связывании с фагоцитируемыми частицами. ИФН γ и другие медиаторы воспаления (ИЛ-1,6,8, ФНО α), секреция которых индуцируется микробной инфекцией, приводят к мобилизации С3 41 рецептора. Факторы некроза опухоли. Факторы некроза опухоли (ФНО α и β) первоначально открыты как вещества, обладающие способностью вызывать некроз опухолевых клеток. Продуцируются в основном моноцитами и лимфоцитами. Дальнейшие исследования выявили, что ФНО обладают системным воздействием на организм при бактериальной инфекции и являются одним из основных провоспалительных медиаторов [204,205] . В системе in vivo для продукции ФНО необходимо два сигнала. Первый сигнал приводит к стимуляции ретикулоэндотелиальной системы, тогда как второй – к синтезу и секреции ФНО. В качестве первого сигнала служат грамположительные и грамотрицательные бактерии, а в качестве второго сигнала различные бактериальные продукты (токсины, ЛПС, пептидогликан и др.). Противоопухолевая активность ФНО α и β характеризуется отсутствием выраженной видовой специфичности и селективной токсичностью в отношении опухолевых клеток. Получено достаточно доказательств усиления интерфероном действия ФНО. Один из возможных механизмов кооперативного действия ФНО и ИФН является способность последнего регулировать экспрессию рецепторов ФНО. Усиление эффекта ФНО интерферонами может быть также связана с усилением экспрессии генов гистосовместимости, которое вызывают оба медиатора. Индуцированная экспрессия антигенов большого комплекса гистосовместимости 1 класса, вызванная ФНО α и ИФН γ в эндотелиальных клетках и фибробластах, может приводить к усилению распознавания. ФНО участвует в активации Т-лимфоцитов, видоспецифично усиливает пролиферацию преактивированных лектинами или анттигенами Т-лимфоцитов, увеличивая экспрессию рецептора ИЛ-2. Для действия ФНО не требуется синтеза ИЛ-1,2,6,8, хотя под его влиянием могут синтезироваться ИЛ-1,6 и происходит усиление действия ИЛ42 1,2 на пролиферацию Т, В-лимфоцитов. ФНО α так же, как ИЛ-1,6,8 является хемоаттрактантом для моноцитов и полиморфно-ядерных лейкоцитов, эндотелиоциты под действием этих иммуноцитокинов экспрессируют ген хемотаксического фактора, благодаря которому происходит выход нейтрофилов из циркуляции. Кроме того, ФНО является одним из наиболее сильных предстимулирующих факторов, действие которого распространяется и на окислительный метаболизм: под действием ФНО продукция супероксид аниона нейтрофилами увеличивается в 2-3 раза [206]. Таким образом, ФНО α и β оказывают системное воздействие на организм и активно участвуют в противоинфекционной защите. Вероятно, основным механизмом действия иммуноцитокинов на клеткимишени является предстимуляция или прайминг, некоторые особенности которого будут рассмотрены ниже. Взаимодействие «иммуноцитокин- бактериальная клетка» в инфекционном процессе. Известно, что любые инфекционные агенты и бактериальные антигены (липополисахарид, токсины, пептидогликан, мурамилпептид, липотейхоевые кислоты) попадающие в макроорганизм, изменяют нормальное функционирование цитокиновой сети, вызывая в клетках-мишенях выработку определенного набора цитокинов, который, в свою очередь, активирует клеточные популяции, участвующие в формировании иммунитета [207]. В процессе острой бактериальной инфекции происходит индукция таких эндогенных иммуноцитокинов, как ИЛ-1,6,8; ФНО-α,β; ИФН-α,β,γ и др. [208]. Кроме того, процессы адгезии и инвазии бактериальных клеток индуцируют продукцию ИЛ-6,8, ГМ-КСФ и др. Так инвазия S.aureus в клетки эндотелия пупочной вены человека стимулирует высвобождение ИЛ-1β и ИЛ-6. В таблице 5 представлены данные об индукции синтеза цитокинов при инфекции. Некоторые цитокины обладают прямой антимикробной активностью, и стимулируют кислородный взрыв в нейтрофилах, стимулируют тем самым уничтожение бактерий. 43 Таблица 5 - Биологические эффекты цитокинов, связанные с бактериальными клетками. Названия цитокинов Индукция синтеза цитокинов бактериальными продуктами 1.Интерлейкины: ИЛ-1 ИЛ-2 ИЛ-3 ИЛ-4 ИЛ-5 ИЛ-6 ИЛ-7 ИЛ-8 ИЛ-9 ИЛ-10 ИЛ-11 ИЛ-12 ИЛ-13 2.Факторы некроза опухолей: ФНОα ФНОβ 3.Интерфероны: ИФНα ИФНβ ИФНγ 4.Колониестимулирующие факторы: ГМ-КСФ Г-КСФ М-КСФ Антимикробная активность Индукция цитокинами кислородного взрыва при инфекции + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + В экспериментах in vitro показано, что ФНО-α приводит к значительному повышению фагоцитарной активности лейкоцитов и, главное, повышению эффективности внутриклеточного киллинга бактерий S.aureus лейкоцитами [209]. Факторы некроза опухоли играют важную роль в системе неспецифической защиты организма от бактериальных агентов. При этом важно знать и использовать только физиологические концентрации ФНО, так 44 как при высоких концентрациях препараты рекомбинантного ФНОβ проявляют себя как токсический агент: происходит развитие гипотермической реакции, повышается внутрисосудистая свертываемость крови, снижается количество циркулирующих лейкоцитов. При сравнительном изучении действия интерферонов – ИФНα и ИФНγ на инфекционный процесс, вызванный грамположительными (S.aureus) и грамотрицательными (E.coli) бактериями, обнаружено, что интерфероны могут иметь противоположный эффект в зависимости от природы этиологического фактора: при стафилококковой инфекции эффективен только ИФН γ. На лейкоцитах больных СПИД продемонстрировано отсутствие стимулирующего эффекта ИЛ-15 при вторичных инфекциях, вызванных S.aureus, C.albicans, M.tuberculosis. В тоже время макрофаг-стимулирующий фактор имел стимулирующий эффект на функциональную активность фагоцитов как в норме, так и при инфекционном процессе, вызванном стафилококком. ИЛ-1β иммунитета, является ключевым обеспечивающим медиатором активацию противоинфекционного воспалительной реакции и иммунного ответа, направленных на элиминацию патогена. Изучено местное иммуностимулирующее действие ИЛ-1β. Введение препарата ИЛ-1β непосредственно в очаг гнойного воспаления у больных с абсцессами легких резидентных к обычной терапии позволило достичь значительных клинических эффектов при отсутствии системной токсичности [210]. После применения ИЛ-1β наблюдали очищение полости абсцесса от инфекции, постепенное уменьшение лейкоцитарной инфильтрации и снижение местной воспалительной реакции. Подобный эффект объясняется тем, что цитокин повышает сниженную функциональную активность лейкоцитов очага воспаления, восстанавливается миграционная способность нейтрофилов. После завершения курса ИЛ-1β все показатели нейтрофилов вновь снижались, очевидно, что эффекты ИЛ-1β кратковременны. В биологическом эксперименте 45 на мышах получены данные, доказывающие защитную роль ИЛ-1α. Иммуноцитокин вводили подкожно в дозе 1.5мкг\мл в течение 4 дней, а затем заражали бактериальной культурой S.aureus. LD50 для здоровых мышей увеличилась по сравнению с контролем в 200 раз, у нейтропенических мышей – в 40000 раз. Число лейкоцитов у экспериментальных животных при действии ИЛ-1 α увеличилось в 30 раз. ИЛ-1β подобным профилактическим эффектом не обладал. Таким образом, в процессе адгезии и инвазии бактерий индуцируются синтез и выброс цитокинов. Подобные явления призваны обеспечить сопротивляемость организма. Бактерии, со своей стороны, также используют разные стратегии выживания, чтобы избежать или ослабить действие иммунной системы [211,212,213]. К этим стратегиям относятся антигенная мимикрия, общая иммуносупрессия, синтез факторов инактивирующих некоторые механизмы иммунитета. В дополнение сложность и к выше изложенным многокомпонентность данным, системы демонстрирующим цитокины-бактериальная инфекция, нельзя не привести работы Романовой Ю.М. с соавт., в которых показано, что некоторые микроорганизмы могут напрямую использовать определенные иммуноцитокины как ростовые факторы и влиять на способность иммуноцитов продуцировать определенные цитокины. Так, показано, что ФНОα стимулуровал рост M.tuberculosis в макрофагах и моноцитах человека. ИЛ-6 усиливает рост M.avium в макрофагах независимо от того, был он добавлен до или после поглощения бактерий макрофагами. А обработка макрофагов КСФ-1 или ИЛ-3 вызывает усиление роста Listera monocytogenes. ИЛ-1β (в концентрации 10-100нг\мл) при добавлении в культуральную среду усиливает рост E.coli. Показано изменение скорости внутриклеточного роста S.aureus в зависимости от степени активации человеческих моноцитов различными концентрациями провоспалительных цитокинов. 46 Таблица 6 - Подавление синтеза цитокинов бактериальными продуктами. Микроорганизм Ингибируемый процесс Ингибируется продукция ИЛ-2,4,5, ИФНγ Ингибируется экспрессия иРНК для ИЛ-2,4 Ингибируется продукция ФНО-α Ингибируется продукция ФНО-α Ингибируется продукция ФНО-α Ингибируется продукция ИЛ-1 α ,β Ингибируется продукция ФНО-α Ингибируется продукция ИЛ-1 α ,β, ИФНγ, ФНО-α Ингибируется продукция ИЛ-2 Actinomyces actinomycemcopmitans Escherichia coli Yersinia enterocolitica Brucella suis Vibrio Cholerae Staphylococcus aureus Bacillus antracis Pseudomonas aeroginosa Salmonella typhimurium Действующий компонент Белок 14кД Белок 8кД Yop B Белок 45-50кД Холерный токсин Белок 12кД Сибиреязвенный токсин АДФ-рибозилирующий токсин 3оксодеканоилгомосеринлактон Неизвестно В настоящее время происходит некоторое смещение акцентов в устоявшемся понимании взаимоотношений в системе «инфекционный агентиндукция цитокинов в организме». Если раньше считалось, что единственным контролирующим фактором биологии цитокинов являются клетки хозяина при стимуляции их бактериями, то теперь обнаружено, что бактерии сами или опосредованно через модификацию специально экспортируемых молекул, или при взаимодействии с клетками-продуцентами, регулируют выработку определенного набора цитокинов с целью активации собственного роста и размножения. Кроме того, многие бактерии синтезируют молекулы, способные подавлять выход цитокинов из клеток-продуцентов (таблица 6). Однако, из клинической практики хорошо известно положительное влияние многих рекомбинантных иммуноцитокинов и их комплексов, а также естественных комплексов цитокинов на процессы воспаления различной локализации, ранозаживление и регенерацию тканей. Препарат, разработанный на кафедре иммунологии РГМУ - «суперлимф», состоящий из целого комплекса иммунопептидов, обладает прямым антимикробным действием в 47 отношении стрептококковой флоры. Данные клинического испытания препарата свидетельствуют о его высокой эффективности при паратонзиллитах и абсцессах легких. Так называемый «цитокиновый коктейль», разработанный в НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи – «лейкинферон», также эффективен при различных гнойно-воспалительных процессах. При добавлении «лейкинферона » к растущей вегетативной культуре сальмонелл, обнаружено подавление роста бактериальных клеток, в отличие от действия колоние-стимулирующего фактора и ФНО-α, которые приводили к увеличению скорости роста бактерий в 2-4 раза, достигая наибольшего значения через 4 часа инкубации [214]. Разнонаправленность эффектов цитокинов может быть, по-видимому, объяснена тем, что связывание инвазивными бактериями может способствовать их поглощению макрофагами, что в свою очередь, должно привести к более эффективному проявлению защитных свойств макрооорганизма. Внутри макрофагов цитокины индуцируют кислородный взрыв, и в ответ, в бактериях индуцируются гены (pgi), ответственные за синтез антиоксидантных ферментов. Хорошо известно, что цитокины приводят к повышению образования АФК по рецептор-зависимому механизму, после специфического или неспецифического связывания цитокинов с мембранными рецепторами. Причем подобным эффектом обладают как отдельные рекомбинантные иммуноцитокины, так и нативные их комплексы (естественный комплекс цитокинов, суперлимф). Индукция выработки антиоксидантных ферментов приводит к большей резистентности бактерий к АФК, но не к активации их роста. Таким образом, современные знания о системе иммуноцитокиов свидетельстуют об их ключевом значении в противоинфекционной защите организма. В ответ на повреждение или проникновение патогена в очаге воспаления формируются эндогенные сигналы в виде синтезированных иммуноцитокинов, которые включают в защиту все системы организма. Механизмы воздействия цитокинов на клетки могут быть противоположными в зависимости от типа задействованных клеток и характера процесса. 48 В связи с вышесказанным следует ожидать, что иммуноцитокины будут отражать, с одной стороны, степень развития патологического процесса, а с другой стороны, служить прогностическим критерием и терапевтическим средством. Проблема актуальна и требует дальнейших исследований патофизиологических закономерностей, так как только на основе этих знаний можно применять отдельные цитокины и их комплексы в терапии различных нозологических форм, избегая появления побочных эффектов. Особенности иммунопатогенеза инфекционных заболеваний, вызванных Staphylococcus aureus. Распространение стафилококковых инфекций в современных условиях и его причины. Стафилококковые инфекции продолжают оставаться насущной проблемой в связи с их широкой распространенностью, рецидивирующим течением, тенденцией к хронизации и недостаточной эффективностью традиционной антибиотикотерапии. Вся история медицины, по сути дела, борьба с инфекцией и бактерии рода Staphylococcus являются наиболее частыми возбудителями гнойно-воспалительных процессов любой локализации, а также основным этиологическим агентом внутрибольничных инфекций [215,216,217]. Стафилококковые заболевания отличаются исключительным полиморфизмом клинических проявлений – возможны поражения кожи, слизистых оболочек, внутренних органов, нервной системы (таблица 7). На долю внегоспитальных стафилококковых процессов приходится около 35% от всех случаев заражения S.aureus. Развитие нозокомиальных инфекционных осложнений в остальных 65 % случаев может свести на нет результаты терапии и служит основным осложняющим лечение фактором. В спектре возбудителей хирургических инфекций мягких тканей доминирует S.aureus – 43,2%, при этом при острых лактационных маститах золотистый стафилококк практически единственный этиологический агент (высевается в 85-95% случаев). При воспалительных заболеваниях 49 носоглотки и ротоглотки стафилококки продолжают занимать одно из ведущих мест среди этиологических факторов: частота выделения S.aureus у детей с хроничесим тонзиллитом –22%, в то время как все представители рода Streptococcus высеваются в 10,4% случаев. Особые проблемы связаны с системной воспалительной реакцией (сепсисом) стафилококкового генеза: в настоящее время не менее 55-70% умерших в поздние периоды ожоговой болезни погибают от сепсиса (возбудитель - S.aureus в 46%), в хирургической практике широкое использование длительной катетеризации сосудов, имплантантов (кава-фильтры, искусственные клапаны) обернулось возросшим числом ангиогенного сепсиса (возбудитель - S.aureus в 34%). В последние годы произошли определенные изменения в микробиологической структуре сепсиса: 15-20 лет тому назад в этиологии доминировали грамотрицательные бактерии и золотистый стафилококк, сейчас возросла роль энтерококков, грибов, в то время как процент стафилококкового сепсиса остался практически таким же –39-45%. В чем же причины столь высокой поражающей способности этих бактерий? Таблица 7 - Частота высеваемости штаммов Staphylococcus aureus при различных гнойно-воспалительных заболеваниях (по данным литературы). Нозология Тонзиллит Острый отит Хронический отит Внутрибольничные пневмонии Инфекции мягких тканей Сепсис: Общий процент (независимо от локализации первичного очага) Ангиогенный Уросепсис Частота высеваемости штаммов Staphylococcus aureus (%) 22-34% 38% 19% Источник Литературы 19,40 3 463 60-70% 61,463 43% 1,69,105,200,201,202,217 20% 34% 13% 19% 15,73,133,442 174 174 32 50 Причины сохранения большого числа стафилококковых заболеваний и\или повышения их относительного распространения, несомненно, весьма сложны и многообразны. Они связаны как с изменением иммунной реактивности макроорганизма, так и с биологическими свойствами возбудителей, условиями циркуляции микробов и некоторых особенностей патогенеза (таблица 8). Несмотря на интенсивное развитие фармакологии и синтез новых антибиотических препаратов, снижение макроорганизма и подавление жизнедеятельности являющейся активным конкурентом для иммунитета сапрофитной патогенных флоры, стафилококков, приобретают решающее значение. Таблица 8 - Факторы, способствующие нарастанию абсолютного и относительного числа стафилококковых заболеваний. Факторы макроорганизма Увеличение контингента лиц с пониженной сопротивляемостью Неосмотрительное и бесконтрольное употребление антибактериальных препаратов Подавление жизнедеятельности сапрофитной флоры Повышение процента бактерионосителей Факторы микроорганизма Селекция антибиотикорезистентных штаммов Селекция штаммов с высокими персистентными характеристиками Внутрибольничная циркуляция полирезистентных и высоковирулентных стафилококков Высокая адгезивная способность стафилококков к материалам, употребляемым в качестве имплантантов (катетеры, клапаны и др.) Введение в практику каждого нового антибиотика, действующего на стафилококки, приносит временный успех. В дальнейшем, через довольно короткие сроки, появляются высоковирулентные штаммы этих микробов, устойчивые к этому новому препарату. В настоящее время в разных регионах мира отмечается возрастание числа случаев гнойно-воспалительных процессов, вызванных метициллинрезистентными штаммами S.aureus [218,219].Стоит обратить внимание и на данные по распространенности данного патогена среди 51 здоровых детей, повышению процента бактерионосителей. Колонизация метициллинрезистентными штаммами S.aureus различных экологических ниш является фактором риска развития стафилококковой инфекции у носителя и играет существенную роль в эпидемиологии нозокомиальных и внебольничных инфекций [220]. По современным представлениям основной причиной низкой чувствительности стафилококков к защитному действию иммунной системы является их ингибирующие эффективно адаптационная продукцию защищаться способность и/или активность продуцировать факторов от повреждающего действия вещества, иммунитета и активных форм кислорода, продуцируемых фагоцитами. У штаммов S.aureus выявлены антикомплементарная, антилизоцимная и антиинтрефероновая активности. Известно, что первичными бактерицидными факторами, выделяемыми фагоцитами, является перекись водорода и продукты ее свободнорадикального разложения, такие как гипохлорит и гидроксильный радикал. Стафилококки приспосабливаются выживать в среде с повышенной концентрацией перекиси водорода путем индукции генов раннего ответа на окислительное повреждение Среди [221]. белковых продуктов этих генов - фермент каталаза, разлагающий перекись водорода до нейтральных продуктов - воды и кислорода. Генетически модифицированные бактерии, утратившие гены, кодирующие белок каталазы, оказывались исключительно чувствительными к бактерицидному действию перекиси водорода. Выявлены штаммы, продуцирующие супероксидисмутазу. Вооружившись этим ферментов стафилококк оказывается защищенным и от действия супероксид аниона. Таким образом, свойства возбудителя, характер инфекционного процесса, особенности взаимоотношения макроорганизм–стафилококк, свидетельствуют о необходимости поиска эффективных путей регуляции патофизиологических процессов, воздействующих как на макро-, так и на микроуровнях. Факторы вирулентности Staphylococcus aureus. Сложность патогенеза 52 стафилококковых разнообразием инфекций биологических обусловлена, во-первых, особенностей чрезвычайным возбудителя, во-вторых, характером защитных реакций организма. Стафилококки проникают в человеческий организм преимущественно через слизистые оболочки и кожу при нарушении их целостности. Преобладают гематогенный и лимфогенный пути распространения инфекции. Излюбленной локализацией стафилококковых колоний являются эндокард, мозговые оболочки, почки. Основным фактором, способствующим развитию стафилококкового заболевания является ослабление иммунитета пациента в связи с различными заболеваниями. S.aureus и S.epidermidis являются одними из наиболее часто встречающихся и грозных возбудителей внутрибольничных инфекций. Особенно опасно сочетание стафилококка в ассоциации с вирусами и грибковой инфекцией, так как в этих условиях бактерии легче инвазируются в организм и более резко проявляют свое патогенное действие. Клинические формы стафилококковых инфекций разнообразны и могут быть классифицированы в зависимости от распространенности процесса (местная и генерализованная инфекция), вида пораженных тканей (инфекции кожных покровов, инфекции мягких тканей, стафилококковый эндокардит, Патогенетические особенности урогенитальные каждого инфекции процесса будут и др.). различны в зависимости от свойств возбудителя, характера инфекционного процесса, состояния иммунореактивности больного. Развитие, течение и исход патологического процесса связаны с состоянием иммунной системы, со степенью реактивности, продукцией медиаторов воспаления, к которым можно отнести свободные радикалы, иммуноцитокины и другие активные субстанции. Однако во многом характер инфекционного процесса определяется и способностью микроорганизмов инактивировать иммунную защиту человека [222,223,224]. Наиболее способность общим качественным микроорганизма определением, взаимодействовать с характеризующим восприимчивым макроорганизмом с развитием инфекционного процесса является патогенность. 53 В качестве количественной меры патогенности традиционно используется понятие «вирулентости», отражающее интенсивность альтерирующего действия инфекта в отношении организма хозяина. В эксперименте критерием вирулентности микроорганизмов чаще всего служит величина LD50. В клинике критериями вирулентности микроорганизмов служат тяжесть инфекционных процессов и интенсивность отдельных симптомов и синдромов, что зависит от набора токсинов, ферментов, адгезивных и инвазивных свойств бактерий. Другой стороной патогенности микроорганизмов является способность не только инициировать развитие инфекционного процесса, но и поддерживать его в течение относительно длительного периода времени (персистенция). Регистрируемое в настоящее время изменение характера стафилококковых инфекций в сторону увеличения доли затяжных и хронических форм определило повышенный интерес к изучению новой группы биологических характеристик – факторов персистенции. Количественная характеристика феномена персистенции в биологическом эксперименте проводится с использованием таких лабораторных параметров как процент животных, у которых удается реизолировать использованные для заражения бактерии на 2128 сутки инфекционного процесса или максимальной длительности бактериовыделения из инфицированных субстратов [225,226]. Клиническими критериями персистенции хронизации, возбудителей формирование заболевания реконвалесцентного служит частота бактерионосительства, продолжительность выделения патогена из клинического материала. С учетом специфики изучаемой проблемы наиболее подробно в этой главе мы проанализируем свойства стафилококков, угнетающие иммунитет человека, не касаясь токсических и инвазивно-адгезивных свойств, хорошо описанных в литературе. Все факторы Staphylococcus aureus, угнетающие иммунитет можно разделить на две основные группы: факторы, воздействующие на кислороднезависимые процессы и на свободно-радикальные процессы. Факторы Staphylococcus aureus, 54 угнетающие кислороднезависимые механизмы защиты. Стафилококки располагают целым рядом секретируемых бактериальных субстанций, инактивирующих иммунную защиту организма. В целях сохранения возбудителя, находящегося в организме, от бактерицидных факторов сыворотки или фагоцитов, микробная клетка располагает группой секреторных продуктов, направленных на инактивацию механизмов иммунитета. Обнаружены штаммы, индуцирующие депрессию эритроидного и лимфоидного ростков кроветворения. Среди специализированных бактериальных субстанций можно отметить трипсинопобные ферменты, расщепляющие IgA. Продукция данных ферментов бактериями типична для патогенов, инфицирующих слизистые оболочки. Кроме трипсиноподобных ферментов у стафилококков обнаружена способность расщеплять карнозин. Большое количество карнозина, обладающего антимикробным свойством находится в слизистой оболочке передних носовых ходов. У 78% штаммов S.aureus обнаружена антикарнозиновая активность, за счет которой бактерии поражают слизистые оболочки и вызывают гнойно-воспалительные процессы ЛОР-органов. Способность бактерий специфически инактивировать лизоцим хозяина определена Бухариным О.В. с соавт. как антилизоцимная активность (АЛА). Этот признак встречается практически у всех длительно персистирующих в организме носителей штаммов Staphylococcus aureus. Экспериментальным путем на животных, культуре ткани и методом популяционного анализа доказано, что АЛА можно рассматривать как маркер персистенции бактерий, способных к внутриклеточному паразитированию. Обнаружена зависимость между степенью АЛА стафилококков и интенсивностью их размножения внутри эпитеолиоцитов, а также длительностью персистирования: от резидентных бактерионосителей значительно чаще выделялись штаммы с высокой АЛА. Эти данные подтверждены и экспериментально – клон стафилококка с высоким уровнем АЛА вызывал затяжную форму инфекции. Доказано и внутриклеточное выживание стафилококков с высоким уровнем АЛА в эпителии носоглотки хозяина. 55 К секретируемым факторам, обеспечивающим персистирование микробной клетки, следует отнести и антиинтерфероновую активность (АИА). АИА характеризует способность бактерий инактивировать бактерицидный компонент препарата лейкоцитарного интерферона человека. Частота выявления этого признака стафилококков находится в тесной зависимости от источника выделения микроорганизма: штаммы, выделенные от больных с вяло-текущими и хроническими инфекциями обладали данным признаком в 90100% случаев, тогда как штаммы, изолированные от здоровых лиц – в 1-16%. Кроме АИА стафилококки обладают и способностью к деградации комплемента. Антикомплементарная активность (АКА) выявляется только при наличии у Staphylococcus aureus внеклеточной протеазы. Последующее изучение АКА у стафилококков показало, что ее величина нарастала в ряду: окружающая среда-бактерионосители-больные. У штаммов Staphylococcus aureus АКА встречается в 89,4%, у Staphylococcus epidermidis - в 2,9 %, что позволило этот тест рекомендовать в качестве дополнительного дифференцирующего признака среди представителей рода Staphylococcus . Обнаружена антигистоновая активность стафилококков. Гистоны, как известно, принимают активное участие в структурно-функциональной организации хроматина и являются регуляторами иммунитета. Биологическое значение этого свойства у бактериальных клеток пока не совсем ясно, тем не менее к персистенции стафилококков может иметь непосредственное отношение. Задержку переваривающей фагосомно-лизосомного способности слияния ферментов и устойчивость к фаголизосом проявляют мукопептиды стафилококков. Кроме того, некоторые штаммы золотистых стафилококков обладают свойством связывать железо и таким образом нейтрализовать действие лактоферрина [227]. Нельзя не отметить и имуносупрессирующее действие протеина А, проявляющееся как в уклонении стафилококков от фагоцитоза, так и в супрессивном действии на Т-клеточный иммуните. Пептидогликан, составляющая 56 часть клеточной стенки стафилококка также обладает выраженным иммуносупрессивным действием на макроорганизм, в основном на Т-клеточное звено. Данные интересного биологического эксперимента представлены в работе Д.Г. Дерябина и И.А. Шагинян. Проведенное сравнение свойств штаммов S.aureus при острой и хронической инфекции показало, что при формировании длительной инфекции происходит утрата ряда ферментов и токсинов S.aureus. Аналогичные результаты получены при анализе свойств бактериальных культур на поздних сроках экспериментального инфекционного процесса. Вероятно, биологическая целесообразность подобного феномена заключается в снижении антигенного раздражения и соответственно ослаблении интенсивности вторичного иммунного ответа на патоген, без чего само формирование персистенции стафилококков вряд ли возможно. Совокупность перечисленных свойств стафилококков нередко ведет к тому, что гнойно-воспалительный процесс приобретает тенденцию к затяжному течению. Дисперсионный анализ показал выраженное влияние на длительность инфекционного процесса таких признаков S.aureus как антикомплементарная активность (24,4%), способность к инактивации интерферона (23,7%). В целом дисперсия длительности течения стафилококовой инфекции, в частности, мягких тканей, объясняемая наличием у возбудителя комплекса факторов персистенции, составила 66,6%. Обладая целым комплексом защитных свойств, стафилококк увеличивает время своей жизни в макроорганизме, однако для длительной персистенции микробу необходимо быть защищенным и от свободных радикалов. Роль антиоксидантных ферментов стафилококков в развитии и течении инфекционного процесса. Другой группой факторов, обеспечивающих персистенцию возбудителя в организме хозяина, является их устойчивость к защитному действию радикальной системы фагоцитов. АФК опасны для бактерий. Например, гидроксилрадикал способен быстро и необратимо окислять практически любое вещество биологического происхождения. Поэтому неудивительно, что микроорганизмы обладают целой системой 57 защиты от радикалов. У бактерий описаны, по крайней мере две системы, измеряющие концентрацию АФК. Рецептор одной из них – SoxRS измеряет уровень супероксиданиона. Другой рецептор – oxyR –измеряет уровень перекиси водорода. В обоих случаях сигнал перадается на геном, вызывая координированное изменение работы больших групп генов. В результате происходит мобилизация дополнительных ресурсов антиоксидантной защиты клетки. Невосприимчивость или меньшую чувствительность к АФК бактериям обеспечивают такие глутатионредуктаза, антиоксидантные ферменты глутатион-S-трансферазы как СОД, [228,229,230]. КАТ, Однако, некоторые авторы находят и другие защитные механизмы бактерий от АФК. Получены данные о том, что наличие типового антигена 1 у Shigella flexneri ведет к устойчивости бактерий к оксидантам [231]. В основном же бактерии защищаются от активных метаболитов с помощью антиоксидантных ферментов. У патогенных бактерий достаточно часто встречается способность инактивировать радикалы. Штаммы Shigella sonei обладают целым комплексом подобных ферментов: каталазой, супероксид дисмутазой, глутатионредуктазой. Каталазой обладают бактерии рода Micrococcus , пропионовокислые бактерии, метилтрофные дрожжи , E.coli, Candida boidinii, Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Penicilinum vital. О.М. Саямовым выявлены две фракции каталазы: внеклеточная и внутриклеточная Yersiniae pestis, от активности которых в равной степени зависит вирулентность бактерий [232]. Бактерии рода Staphylococcus обладают антиоксидантных ферментов. Еще в 1966 году мощным комплексом E. Kovacs и H.H. Mazarcan описали каталазу Staphylococcus aureus. Фермент состоит из термостабильных неспецифического коэнзима и апоэнзима. Каталаза – это фермент из группы гидропероксидаз, катализирующий окислительно-восстановительную реакцию, в ходе которой из двух молекул перекиси водорода образуется вода и кислород. Доказано, что существует прямая корреляционная связь между активностью стафилококковой каталазы и выживаемостью бактерий в ходе фагоцитоза. Стафилококковая каталаза играет важную роль и в межмикробных 58 взаимодействиях, в процессе формирования микробных биоценозов. Показано участие Н2О2-продуцирующих лактобактерий в поддержании резистентности экониш тела человека к заселению различными патогенами. С другой стороны, микробицидное действие перекиси водорода угнетается каталазой Staphylococcus aureus, что позволяет считать этот фермент одним из факторов, угнетающих защитное действие резидентной микрофлоры. Супероксид дисмутазной активностью также обладают штаммы Staphylococcus aureus наряду с другими микроорганизмами, такими как Streptococcus pneumoniae, Shigella sonei, E.coli, пропионовокислые бактерии, метилтрофные дрожжи, Aspergillus niger, Pseudomonas aeroginosa. Супероксид дисмутаза бактерий может содержать в активном центре Cu, Zn, Mn. M.O. Сlements с соавторами обнаружили у штамма SPW1 Staphylococcus aureus MnСОД и выявили прямую зависимость между активностью фермента и выживаемостью стафилококов в процессе фагоцитоза. Наиболее высокой персистентной характеристикой обладают штаммы с выраженной активностью каталазы, СОД и глутатионпероксидазы. Таким образом, бактерии становятся практически полностью защищены от действия АФК, которые продуцируют фагоцитарные клетки, что приводит к длительно текущим, хроническим инфекционным процессам. Изучение патогенетически значимых свойств микроорганизмов, направленных на инактивацию эффекторов противоинфекционого иммунитета и тем самым нарушающих процесс элиминации патогена из очага воспаления, может стать альтернативным подходом к прогнозированию длительности течения гнойно-воспалительных своевременного подключения заболеваний и дает иммунокорригирующих возможность препаратов. С патогенетической точки зрения воздействие на индукцию антиоксидантных ферментов бактерий и/или на их активность является одним из перспективных и наиболее значимых путей регуляции инфекционного процесса. Лишенные защитных ферментов бактерии становятся более уязвимыми для факторов иммунитета макроорганизма, легче инактивируются и элиминируются из очага 59 воспаления. Таким образом, поиск и применение препаратов, инактивирующих антиоксидантные ферменты микроорганизмов открывает новое направление в борьбе с патогенными бактериями. Современные направления и проблемы в терапии стафилококковых инфекций. Представление об инфекционном процессе как о взаимодействии микро- и макроорганизма стало банальным и разделяется практически всеми врачами. Выяснение новых закономерностей взаимосвязи микроб-человек и общебиологических механизмов ответа на повреждение позволило найти новые пути терапии инфекционных заболеваний. Однако антибактериальная терапия и сейчас является основой в современной практической медицине. К сожалению, современные фармакологические агенты, оказывая благотворное влияние на восстановление функционального состояния отдельных органов и тканей, неоднозначно влияют на иммунную систему [233,234,235,236]. Ниже рассмотрены некоторые аспекты и проблемы современных методов терапии стафилококковых инфекций. Антибактериальная терапия. Открытие и внедрение антибиотиков в широкую клиническую практику явилось величайшим событием в истории человечества. Антибактериальные препараты стали рассматривать как неотъемлемую часть стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями. Известно, что антибиотики являются ингибиторами синтеза нуклеиновых кислот и белка, подавляют метаболизм нуклеотидов, аминокислот, липидов и углеводов, а также активно влияют на функции цитоплазматической мембраны [237]. Адекватная антимикробная терапия является одним из важнейших направлений в лечении стафилококковых инфекций. Несколько десятилетий тому назад, когда эра антибиотиков только начиналась, в медицине существовало убеждение в том, что наконец наступила победа над инфекционными агентами и что в конце 20 века инфекции будут окончательно побеждены. Однако и сегодня инфекционные процессы представляют одну из самых сложных проблем современной медицины. Клинические наблюдения 60 последнего десятилетия свидетельствуют о значительном снижении эффективности антибиотиков, широко применяемых в терапевтической и хирургической практике. Создание новых поколений антимикробных средств широкого спектра действия с высокой антимикробной активностью не сопровождается заметным снижением летальности при септическом шоке, сепсисе с синдромом полиорганной недостаточности и других грозных осложнений гнойных процессов. Стафилококковые инфекции остаются важнейшей клинической проблемой и это связано с повсеместным распространением полирезистентных штаммов. По данным Ахметовой Л.И. и соавт., количество метициллинрезистентных штаммов в пробах крови составляет 50 %, в отделяемом из урогенитального тракта –26%, зева –44%, кишечника –32% [238]. В разных регионах мира отмечается нарастание числа случаев гнойно-воспалительных метициллинрезистентными процессов, штамами S.aureus. вызванных Анализ изменения антибиотикочувствительности стафилококков за последние годы (1994-2002) показал, что выявлены культуры, устойчивые к ципрофлоксацину и рифампицину. Появились сообщения о выделении штаммов S.aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину, что делает терапию стафилококковых инфекций в определенных случаях весьма проблематично. Современная медицинская практика такова, что гликопептиды (ванкомицин) применяют, как правило, когда уже имеется устойчивость возбудителей к другим лекарственным препаратам. Вот почему даже спорадическое появление гликопептидрезистентных возбудителей крайне нежелательно, ибо лечение таких больных оказывается весьма затруднительным. Высокий процент выделения полирезистентных штаммов стафилококков может быть обусловлен внутригоспитальным инфицированием [239]. Штаммы стафилококков, выделенные при вспышках внутрибольничных инфекций, как правило, обладают целым комплексом выраженных персистентных свойс. Заболевания, вызванные бактериями с подобной характеристикой не поддаются лечению традицинными антибактериальными препаратами, 61 так как возбудители нозокомиальных инфекций антибиотикорезистентны. Хотя вклад антибактериальной терапии в снижении летальности больных перитонитом и сепсисом не превышает 20%, неадекватная и несвоевременная антибактериальная терапия существенно ухудшает результаты лечения больных даже после своевременного и грамотного оперативного пособия. Необходимость антибактериальной и иммунокорригирующей терапии в комплексном лечении гнойно-воспалительных заболеваний стафилококковой этиологии не оспаривается клиницистами. Однако до настоящего времени выбору антибиотиков или их комбинаций с учетом их влияния на иммунную систему, а также определению оптимальных комбинаций антибактериальных и иммунокорригирующих средств в клинике не уделяется должного внимания. Брискиным Б.С. с соавторами было изучено влияние различных антибиотиков на иммунонейроэндокринный статус больных перитонитом. При сравнении показателей Т-клеточного звена иммунитета больных, получавших различные антибиотики, установлено, что в группе больных, получавших имипенем в форме монотерапии, количество Т-лимфоцитов существенно выше и приближается к показателям у здоровых лиц. В группе, получавшей нетилмицин иммунодепрессивное действие проявлялось преимущественно на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови. Так, коэффициент завершенности фагоцитоза, характеризующий переваривающую активность нейтрофилов на третьи сутки составил 0,64, тогда как в группах, получавших цефтриаксон и импенеп он был достоверно выше. Кроме того, такие широко используемые антибиотики как бензилпенициллин, стрептомицин усиливают иммуносупрессорное действие стафилококка. Выходом в сложившемся положении, по-видимому, будет комплексное лечение, включающее препараты, воздействующие на различные звенья патогенеза. Следует назначать иммуноактивный препарат, в зависимости от воздействия антибиотиков на различные звенья иммунитета. При выраженном угнетении Т-клеточного звена предпочтение нужно отдавать цефалоспоринам, либо сочетать антибактериальную 62 терапию с препаратами иммунозаместительного действия, антибактериальную терапию аминогликозидами сочетать с препаратами, стимулирующими фагоцитарную активность нейтрофилов. Другим перспективным способом фармакотерапии является экстракорпоральная обработка эритроцитов лекарственными препаратами. В зависимости от химической природы происходит сорбция на мембране и встраивание молекул лекарства в билипидный слой мембраны клеток. После экстракорпоральной обработки антибиотиками эритроциты приобретают выраженные иммуностимулирующие свойства и оказывают положительное влияние на разрешение инфекционного процесса. Таким образом, качество воздействия антибиотиков зависит не только от химической структуры препарата и их активности, но и от состояния организма, тяжести воспалительного/инфекционного процесса, а также от способа применения антибиотиков. Сейчас можно говорить не только о широком распространении полирезистентных штаммов, что требует особой стратегии при лечении стафилококковых инфекций, но и выраженном действии антибиотиков на иммунную систему. Для решения подобных проблем необходим поиск новых подходов в антибактериальной терапии и подключение в комплексную терапию иммуномодуляторов. Иммуноцитокины в лечении стафилококковых инфекций. Одной из наук, достижения которой широко внедрены в практику современной медицины, является иммунология. Иммунологические разработки и методы исследования являются неотъемлемой частью диагностики, прогнозирования и оценки эффективности лечения во всех областях практической медицины. Особое значение приобретают иммунологические подходы в профилактике и лечении гнойно-септических заболеваний, в частности стафилококкового генеза. В настоящее время иммунофармакология цитокинов находится в начале своего развития. Поскольку патологические процессы, в том числе инфекции, всегда сопровождаются дисбалансом продукции цитокинов, в первую очередь на уровне поврежденного органа, то наиболее адекватным методом лечения 63 представляется иммунотерапия препаратами, корригирующими цитокиновый статус. Доказана ключевая противоинфекционной и роль цитокинов противоопухолевой в осуществлении защиты, регуляции регенеративных процессов, что открывает перспективы их применения в качестве иммунофармакологических Локальную и патогенетически общую средств иммунокоррекцию обоснованный метод направленного можно лечения действия. рассматривать больных с как гнойно- воспалительными заболеваниями различной локализации. Однако и сегодня у клиницистов и экспериментаторов возникает много вопросов о способе применения и эффективности препаратов иммуноцитокинов в качестве терапевтических средств. Для эффективного применения иммуноцитокинов необходимо выработать технику доставки к очагу воспаления, научнообоснованные схемы использования иммуномодуляторов с учетом текущего иммунного статуса организма больного. Первые попытки применения иммуноцитокинов выявили наряду с выраженными клиническими признаками улучшения, наличие побочных эффектов. Механизм возникновения последних, с нашей точки зрения, связан с тем, что многие клетки организма имеют рецепторы для цитокинов, поэтому запускается каскад клеточных реакций, иногда приводящий к нежелательным последствиям. Но уже сейчас есть определенные успехи в разработке и применении препаратов иммуноцитокинов их комплексов (рекомбинантных и естественных). Применение препаратов иммуноцитокинов дало хорошие результаты при лечении гнойно-воспалительных процессов стафилококковой этиологии в хирургии. Как правило, хирургическая операция вызывает выраженный в той или иной степени иммунодефицит. Проявление воздействия повреждающего фактора на иммунную систему в частности и на весь организм в целом будет зависеть не только от силы и продолжительности этого воздействия, но и общего состояния организма, уровня его метаболизма и исходной иммунореактивности. Практически все компоненты хирургической операции – анестезия, операционная рана, кровопотеря, переливание аллогенной крови и 64 т.д. оказывают отрицательное воздействие на параметры иммунной системы. Немаловажную роль играют и свойства микроорганизма, вызвавшего гнойновоспалительный процесс (наличие антиоксидантных свойств, персистентные характеристики). Поэтому для лечения и профилактики инфекционных осложнений целесообразно применение иммунотропных лекарственных средств, к которым относятся и препараты иммуноцитокинов. Один из подобных препаратов, который сейчас применяют в хирургический практике является - «Беталейкин» [240]. Беталейкин- это лекарственная форма рекомбинантного ИЛ-1β, разрешенного к медицинскому применению. Препарат показал высокую эффективность у 75% больных с перитонитами, абсцессами легких, гнойно-воспалительными процессами в малом тазу, сепсисом, развившемся на фоне тяжелой механической травмы. После курса лечения наблюдалось улучшение общего состояния больных, нормализация температуры, уменьшение ЧСС, снижение летальности. При этом происходила стимуляция очищения гнойных ран и ускорение регенеративных процессов. При оценке иммунного статуса больных, получавших беталейкин, было выявлено повышение уровня Т-, В-лимфоцитов, препарат в несколько раз увеличивал происходило функциональную активность существенное усиление рекомбинантный препарат Т-лимфоцитов. функциональной Одновременно активности нейтрофилов. Другой – ИЛ-2 (реальдирон) также применялся для лечения хирургических инфекций. Уже в первый день после операции у больных, получавших препарат, усиливалась функция NK-клеток и увеличивалось количество клеток, несущих маркеры естественных киллеров. Параллельно с этим нарастало число активированных Т-лимфоцитов. В клинической практике нашел применение и другой препарат ИЛ-2 – дрожжевой рекомбинантный человеческий ИЛ-2 (ронколейкин). Отмечен положительный иммуномодулирующий эффект у больных с тяжелыми проявлениями синдрома эндогенной интоксикации и признаками полиорганной интоксикации, что сопровождалось повышением уровня Т-лимфоцитов, иммуноглобулинов А,М,G 65 [210]. Иммуномодулирующий эффект у больных сепсисом и полиорганной недостаточностью получен при применении гемофильтрации, позволявшей элиминировать значительные количества ФНО и ИЛ-1 [241]. На кафедре иммунологии РГМУ разработан способ получения естественного комплекса цитокинов (ЕКЦ) из культур активированных мононуклеарных клеток периферической крови человека и животных, оказывающих иммуностимулирующее действие на клетки фагоцитарной системы in vitro и in vivo [242]. При добавлении непосредственно в систему эффектор-мишень ЕКЦ оказывает иммуномодулирующее воздействие на цитотоксическую активность предварительная обработка естественных киллеров клеток-эффектров человека, ЕКЦ а оказывает иммуномодулирующее действие на цитотоксическую активность этих клеток [243]. Из естественных комплексов цитокинов в хирургической практике получили распространение два основных препарата: «суперлимф» [187], разработанный на кафедре разработанный НИИЭМ лекарственной формой иммунологии им. Н.Ф. цитокинов, РГМУ Гамалеи. и «лейкинферон», Лейкинферон продуцируемой является лейкоцитами периферической крови человека. Помимо ИФН-α, лейкинферн содержит ИЛ-1, ФНО- α. Препарат хорошо зарекомендовал себя при хирургических инфекциях, в частности при перитоните [244]. Анализ клинических данных показал, что у больных, получавших лейкинферон, были менее выражены перитонеальные симптомы, быстрее восстанавливались все параметры иммунной системы: уровень Т-лимфоцитов, уровень Т-хелперов, фагоцитарные реакции. «Суперлимф» с успехом применялся для лечения абсцессов мягких тканей, абсцессов легких, паратонзиллитах, гайморитах. Особо эффективен он оказался при локальном применении, так как цитокины – это короткоживущие продукты короткодистантного действия и эффективны при условии их высокой локальной концентрации. Локальное применение суперлимфа при гнойновоспалительных процессах легких позволило в 1.9 раза снизить вероятность 66 формирования остаточных полостей в легком и ускорило процесс образования соединительно-тканного рубца. Установлена высокая клиническая эффективность местной монотерапии суперлимфа у больных острыми гайморитами в сравнении с лейкинфероном. Кроме того, применение локальной цитокинотерапии у больных c гнойно-воспалительными заболеваниями легких и ЛОР-органов способствует устранению дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-1,4,6,ФНО-α), восстановлению функциональной активности лимфоцитов и нейтрофилов (фагоцитарной, метаболической, апоптической). В последние годы на основе цитокинов разрабатываются различные схемы, применяемые в лечении хронических воспалительных процессов [245,246)]. На кафедре иммунологии РГМУ разработана оригинальная методика аутоцитокинотерапии, основанная на местном применении естественной композиции цитокинов, секретируемых лимфоцитами периферической крови человека [247]. Положительный эффект представленной методики доказан при воспалительных процессах десны [248]. Получены доказательства, что активация клеточной иммунной системы, реализованная через иммуноцитокины, может играть и отрицательную роль в патогенезе гнойно-воспалительных заболеваний. Иммуностимуляторы не всегда эффективны при развитии осложнений гноный процессов: их действие развивается в течение 2-3 суток и они слабо стимулируют иммунную систему в условиях эндогенной интоксикации. Ряд авторов, считая ФНО одним из вероятных медиаторов воспаления, «повинных» в осложнениях гнойных процессов, показали, что чрезмерная стимуляция нейтрофилов может привести к прогрессированию деструкции поврежденных органов. Направленная иммунотерапия в хирургической практике остается сферой, в которой до сих пор много неясного и противоречивого. Известно, что развитие системной воспалительной реакции реализуется посредством запуска цитокиновой цепи, где ведущую роль играют провоспалительные цитокины: ИЛ-1,6,8; ИФН-γ, ФНО-α . Эта группа цитокинов наряду с запуском воспалительной реакции, как неспецифического механизма противоинфекционой защиты, обеспечивает 67 эффективность стимулирует репарации детоксикационной развитие в функции специфического поврежденных лимфоидного иммунного тканях. ответа аппарата, и Недостаточность процессы продукции провоспалительных цитокинов на фоне исходного иммунодефицита или их чрезмерное угнетение в результате включения механизмов негативного контроля системной воспалительной реакции (применение глюкокортикоидов) приводят к осложненному течению хирургической инфекции [249]. В тоже время при системной воспалительной реакции в крови определяются значительно превосходящие нормы концентрации медиаторов. Сепсис образно назвали «медиаторной бурей». Смена патофизиологического понимания сепсиса повлекла за собой как расширение диагностических границ заболевания, так и изменение терапевтического подхода, в который, помимо методов и средств антимикробного воздействия, включили и модуляцию системной реакции (нейтрализация и\или аттенуация септических медиаторов). К 1995 году были опубликованы результаты мультицентровых клинических испытаний по четырем различным методам противодействия провоспалительным медиаторам (антимедиаторный подход). Все они показали отсутствие каких-либо преимуществ такого лечения и антимедиаторный подход не оправдал всеобщих ожиданий. Препарат человеческих моноклональных специфических антилипид А-IgM-антител вообще был снят с европейского и севереамериканского рынка. Последующие работы в этой области продемонстрировали, что характер биологического ответа на повреждение определяется не просто выбросом в кровоток различных медиаторов, а соотношением про- и противоспалительных цитокинов. Необходимо отметить, что персистирующее высокое содержание антивоспалительных цитокинов предполагает неблагоприятный исход, также как и длительное повышение концентрации провоспалительных медиаторов. Кроме того, течение системной воспалительной реакции в значительной мере модулируется темпами индукции оксида азота, коррелирующего с развитием септического шок. С другой стороны, известно, что Г-КСФ был эффективен при гнойно-септических 68 процессах, а Беталейкин с успехом использовали как иммунопротектор при этой же нозологии. Таким образом, в литературе на сегодняшний момент данные применению цитокинов при неоднозначны. Выходом по воспалительных процессах противоречивы и из сложившегося положения может стать разработанный в институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН метод экстракорпоральной иммунотерапии. Лечение больных с сепсисом осуществлялось в соответствии с современными принципами (санация очага инфекции, антибактериальная терапия, интенсивная терапия с коррекцией полиорганных нарушений) было дополнено проведением экстракорпоральной иммунотерапии. Показанием к подобной процедуре служило отсутствие клинического эффекта интенсивной терапии. Через 2-3 суток после проведения экстракорпоральной иммунотерапии в большинстве случаев регистрировали положительную динамику: купирование или снижение лихорадки, нормализация проявлений энцефалопатии, Положительная клиническая показателей гемодинамики, разрешение пареза динамика и исчезновение кишечника регрессия [250]. эндотоксикоза сопровождалась коррекцией иммунных нарушений. Принципиальное отличие и главное преимущество экстракорпоральной иммунотерапии перед другими вариантами цитокинотерапии заключается в том, что воздействие на клетки иммунной системы больного цитокинами осуществляется вне организма, что сводит к минимуму возможности системных побочных эффектов. Такой подход позволяет даже у больных с тяжелей или крайне тяжелой степенью выраженности эндотоксикоза сгладить иммунодепрессивное действие токсических метаболитов на клетки и достичь более выраженной коррекции их функциональной активности. Кроме того, реинфузия больному даже относительно небольшой части аутологичных клеток с восстановлением их свойств ex vivo очень часто стимулирует эндогенную активацию иммунной системы и служит пусковым фактором последующей реинтеграции различных звеньев иммунной системы. Некоторые авторы рекомендуют использовать в 69 практике ИЛ-10 – мощный противоспалительный иммуноцитоки. ИЛ-10 предотвращает активацию макрофагов, блокирует запуск каскадных реакций провоспалительных цитокинов, перекисное окисление липидов, тем самым предотвращая деструкцию тканей поврежденных органов. Таким образом, эффективность цитокинотерапии зависит от многих факторов: тяжести процесса, системного характера заболевания, присутствия микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности, исходного цитокинового профиля больного, иммуноцитокинов в качественного лечебном и количественного препарате, метода сочетания воздействия и др. Индивидуальное сочетание всех характеристик в каждом конкретном случае будет определяющим в вопросе эффективности терапии. Применение препаратов иммуноцитокинов - не панацея от болезней, а необходимый компонент комплексного лечения различных заболеваний при выявленной вторичной применения иммунной недостаточности. цитокинов в качестве Несомненно, терапевтических одна: проблема средств требует дальнейшего комплексного изучения и открывает новую перспективное направление в лечении инфекционных заболеваний.Антиоксиданты в лечении стафилококковых инфекций. При многих патологических процессах наблюдается дисбаланс про- и антиоксидантной систем. При различных формах стафилококовых инфекций может быть как всплеск, так и спад активности антиоксидантных ферментов. По всей видимости, различное состояние антиоксидантной системы связано с глубиной поражения и интенсивностью инфекционного процесса. Так, в острый период при локальных и генерализованных воспалительных процессах в большинстве исследований описан подъем активности каталазы, СОД эритроцитов. На третьи-пятые сутки активное радикалообразование сочетается с крайне низкими показателями антиоксидантной системы. Особенно актуальна хронических вяло-текущих инфекций и при проблема в области распространенных формах инфекционного процесса, при которых в организме длительное время сохраняется повышенный радикальный статус. Дефицит антиоксидантов может 70 привести к повреждению радикалами собственных клеток и тканей, что является одним из пусковых механизмов в этиологии аутоиммунных заболеваний и канцерогенеза распространенным метаболических [251,252,253]. перитонитом процессах Например, формируются организма, у глубокие сопровождающиеся больных с сдвиги в нарушением функционирования всех его защитных систем и механизмов, в том числе и антиоксидантной системы [254]. Это необходимо учитывать при постановке окончательного диагноза и проведении мероприятий хирургического, терапевтического и профилактического характера. Кроме того, в случае системной воспалительной реакции на фоне уже сниженного антиоксидантного статуса, при проведении экстракорпоральных методов детоксикации, из крови извлекаются не только токсические вещества и прооксиданты, но и естественные антиоксиданты низкомолекулярной массы, такие как α- токоферол, аскорбиновая кислота и др. [25,256]. Для восполнения сниженного уровня защитных ферментов применяют фармакологические препараты антиоксидантов. По механизму действия и структуре все антиоксиданты, применяемые в клинической практике, можно разделить на ферментные и неферментные. К ферментным относятся супероксид дисмутаза, глутатион-пероксидаза и каталаза. Важным терапевтическим действием СОД является ее противоспалительный и антигипоксический эффекты. Установлено, что на фоне введения СОД происходит снижение уровня хромосомных аббераций у больных системной Терапевтический красной эффект СОД волчанкой, геморрагическим обусловлен не только васкулитом. восполнением восстановительных эквивалентов (например, SH-групп) и детоксикацией организма, но и действием на уровне транскрипции генов. Активные формы кислорода, наряду с антигенами бактериального и вирусного происхождения, цитокинами, активаторами кальциевых каналов стимулируют группу белков ядерного фактора, ответственных за транскрипцию генов, участвующих в воспалении и кодирующих синтез так называемых реактантов острой фазы. 71 СОД блокирует активацию ядерного фактора, тем самым останавливая транскрипцию генов, ответственных за реализацию воспалительного ответа. К сожалению, СОД может легко инактивироваться в очагах воспаления, так как при рН 5.9-6.0 фермент теряет свою активность. Каталаза способна ослабить токсичность, связанную либо с пероксидом водорода, либо с радикалами, производными от перекиси водорода. Это наблюдается как в модельных системах, так и в суспензиях фагоцитирующих клеток, которые продуцируют перекись водорода и повреждают эритроциты, бактерии, опухолевые клетки. Применение каталазы в качестве лечебного средства ограничивается малым временем жизни фермента в организме и антигенными свойствами этого белка. Многие современные антиоксидантные препараты оказались эффективными за счет повышения содержания сульфгидрильных групп, входящих в состав глутатионпероксидаз [257]. К этой группе антиоксидантов относится и тиосульфат натрия. Тиосульфат натрия – нуклеофильное соединение, тормозит накопление перекисей, снижает интенсивность окисления ненасыщенных жирных кислот. В хирургической практике тиосульфат применялся для лечения гнойных ран (сочетанное местное и внутреннее введение). Авторы отметили противовоспалительное, дезинтоксикационное действие препарата. Гнойные раны быстрее очищались и эпителизировались. Имеется сравнительно большое число химических веществ, препятствующих перекисному окислению липидов и другим радикальным процессам и широко применяющихся в клинической практике. Неферментные антиоксиданты делят жирорастворимым на жирорастворимые относятся каротиноиды, и водорастворимые. токоферолы и хиноны. К В клинической практике наиболее часто применяется α-токоферол или витамин Е. Токоферол существенно ослабляет выраженность процессов перекисного окисления липидов в мембранах различных клеток. Инъекции токоферола ацетата повышают гликозаминогликанов, иммуносупрессирующих резистентность индуцирующих свойств. эритроцитов появление к у Полиненасыщенные 72 этих действию клеток фосфолипиды, входящие в состав токоферолов, оказывают также замещающее действие: включаются в состав билипидного бислоя мембран клеток, вытесняя из них молекулы фосфолипидов, измененные под влиянием свободно-радикальных процессов, а также освобождают мембрану от избытка содержащегося в них холестерина. Известно, что при целом ряде заболеваний содержание токоферола в плазме крови понижено. При стафилококковом перитоните индекс потребности в α-токофероле повышен, а индекс обеспеченности им плазмы и эритроцитов значительно снижен (более чем в три раза). Прокопенко Л.Г. и соавт. изучили иммуномодулирующее действие стафилококковой инфекци. В биологическом токоферола при эксперименте мышей инфицировали живой культурой S.aureus и проводили лечение антибиотиками без и в сочетании с токоферолом. В группе контрольных мышей (неинфицированных) токоферол не оказывал влияния ни на развитие Т-зависимого, ни Инфицирование реакции на на развитие стафилококком эритроциты Т-независимого подавляло барана. развитие Инъекции иммунного ответа. иммунологической инфицированным мышам токоферола нормализовали эти процессы и усиливали развитие Т-зависимого ответа у мышей, получавших антибиотики. Таким образом, токоферол позволяет существенно ослабить иммуносупрессорное действие антибиотиков. При инфекционных процессах различной этиологии наиболее выраженный терапевтический эффект наблюдался при комбинированном применении αтокоферола и селена, что вероятно, связано с одновременным воздействием препаратов на различные звенья антиоксидантной системы: α-токоферол пополняет истощенный пул неферментных антиоксидантов, а селен способствует активации и индукции селензависимых глутатионпероксидаз. Препараты других двух жирорастворимых антиоксидантов – каротиноиды и хиноны (Коэнзим Q), уже давно зарекомендовали себя в терапии самых различных групп заболеваний, в том числе стафилококковых инфекций. Среди водорастворимых антиоксидантов наиболее изучены аскорбиновая кислота. Аскорбиновая кислота – весьма распространеный естественный 73 двухвалентный донор электронов. Защитный эффект аскорбата основан на ом, что образующиеся в результате его окисления промежуточные радикалы и молекулы химически гораздо менее активны, чем гидроксилрадика. Большое внимание при исследовании антиоксидантов в клинической практике уделяется и хелатирующим соединениям и металлосвязывающим белкам (трансферрин, церулоплазмин, ферритин, альбумин, гаптоглобин, а также белки, связывающие гем и гемсодержащие белки). Церулоплазмин и трансферрин образуют антиоксидантную систему сыворотки крови. Их действие основано на окислении ионов Fe2+ и связывани Fe3+, а также на взаимодействии этих белков с кислородными радикалами. Хелаторы железа связывают избыток ионизированного Fe, уменьшая пул потенциально опасного, слабо связанного железа в наиболее чувствительных к действию радикалов местах. К хелаторам относятся диэтилтриаминпентауксусная этилендиаминтетрауксусная кислота, фенантролин, кислота, дезферроксамин. Клинически разрешенный препарат дезферроксиамин («Desferal») оказался чрезвычайно эффективным при экспериментальном моделировании различных типов патологических процессов: ингибирует экспериментальный воспалительный процесс инфекционно-аллергической этиологии. На моделях in vitro дезферроксамин снимает эффект повреждения гиалуроновой кислоты в системе ксантин-ксантиноксидаза, ингибирует гемолиз, вызванный дивицином. Комплексы меди с аминокислотами и другими органическими соединениями (купренил) используют для ослабления радикальных поражений, основываясь на их способности вызывать дисмутацию супероксидных радикалов. Положительный эффект в данном случае наблюдают при воспалительных, фиброзных процессах. «Ловушки» гидроксильных радикалов – этанол, маннитол, диметилсульфоксид, бензоат натрия, тиомочевина степень повреждения, обусловленную секрецией АФК из снижают лейкоцитов «воспаления»: при хронических инфекциях, радиационном поражении, травме, аутоиммунных состояниях, васкулитах, системной красной волчанке. Весьма перспективным в настоящее время представляются вещества, способные 74 нормализовать повышенную продукцию АФК фагоцитами. К таким соединениям относятся дапсон (производное сульфоновой кислоты), которое обладает выраженными противоспалительными свойствами [258]. Дапсон не является «ловушкой» радикалов, но ослабляет «дыхательный взрыв» фагоцитов. При этом наблюдается ингибирование окислительных повреждений эндотелиальных клеток. Так как патогенез многих заболеваний инфекционного генеза связан с повышенным синтезом оксида азота, то в современной науке идет направленный поиск фармакологических средств, воздействующих на концентрацию NО в организме. Одним из таких антирадикальных препаратов является Плаферон-ЛБ. Под влияние Плаферона-ЛБ активность каталазы сыворотки крови возрастала на 9% (р>0.05), СОД на 40%(р<0.05), а содержание оксида азота по данным ЭПР-метода достоверно уменьшалось. Многочисленные данные клинических исследований свидетельствуют: у больных, получавших антиоксидантные препараты ведущие патологические симптомы купировались быстрее и сокращались сроки восстановительного периода. Широкий спектр терапевтического действия, низкая токсичность, высокая эффективность делают препараты антиоксидантов перспективными в качестве лекарств-протекторов патологических процессов, протекающих при участии свободных радикалов. В клинических условиях важно как можно раньше модифицировать метаболизм свободных радикалов, возвратив его к уровню, характерному для данного типа клеток. В процессе стафилококковой инфекции, особенно генерализованных процессах и при длительных персистирующих инфекциях, защитная роль радикалов трансформируется в токсическую. Все вышесказанное позволяет сделать вывод, что при различных формах стафилококковых инфекций необходимо подключение в комплексную терапию препаратов антиоксидантов. Однако для оптимизации терапевтического действия препаратов необходимо учитывать свободнорадикальный статус больного в динамике, стадию заболевания индивидуально подбирать вид и концентрацию лечебного препарата. 75 и Глава 2 Выбор и обоснование принятого направления исследований и способов решения поставленных задач Для достижения поставленной цели и задач посчитали целесообразным исследование свободно-радикальных процессов у пациентов с бактериальной (на примере стафилококковой инфекции) инфекцией разной степени тяжести и разной локализации. В зависимости от локализации, распространенности и тяжести течения заболевания больные были разбиты на 3 основные группы: 1 Ангины (фолликулярная, лакунарная) 2 Хирургические инфекции (постинъекционные ягодичные абсцессы, лактационные маститы, одонтогенные околочелюстные флегмоны) 3 Генерализованная инфекция (системная воспалительная реакция, тяжелый сепсис). 1 группа больных (с фолликулярной и лакунарной ангиной). Больные наблюдались в РЦИБ г.Нальчика. Обследовано 75 больных средней степени тяжести с фолликулярной и лакунарной ангинами, в возрасте от 16 до 65 лет (таблица 8), из них 45 мужчин и 30 женщин. Таблица 8 - Распределение больных первой группы по полу, возрасту и степени тяжести. Возраст Больные с фолликулярной ангиной Муж Жен Больные с лакунарной ангиной Всего Муж Жен Муж Жен От 16 до 40 19 (25.4%) 12 (16.0%) 10 (13.4%) 7 (9.3%) 29 (38.6%) 19 (25.4%) От 40 до 65 7 (9.3%) 2 (2.6%) 9 (12.0%) 9 (12.0%) 16 (21.3%) 11 (14.7%) Всего 26 (34.7%) 14 (18.6%) 19 (25.4%) 16 (21.3%) 45 (60%) 30 (40%) 76 Больные поступали в стационар в экстренном порядке, где проводилось клиническое и лабораторное обследование. Начало болезни у всех больных было острое: появлялся озноб, общая слабость, головная боль, боль при глотании (см. таблица 9). Температура тела у 20% (8 человек) больных с фолликулярной ангиной и у 5.7% (2 человека) больных с лакунарной ангиной была фебрильной 37.638.00С; у 75% (30 человек) больных с фолликулярной ангиной и у 82% (28 человек) больных с лакунарной ангиной достигала 38.1-39.00С; у 5% (2 человека) больных с фолликулярной ангиной и у 12.3% (3 человека) больных с лакунарной ангиной достигала 39.1-40.00С. Средняя длительность лихорадки составляла 4±1 дней. При осмотре ротоглотки у больных с лакунарной ангиной выявлена гиперемия небных дужек в 100%, язычка в 100%, миндалин в 100 %, мягкого неба в 85.7 % (см. таблицу 9), в лакунах обнаружен гной в 55% и в 45 % на выпуклой поверхности миндалин наблюдались казеозные пробки. При фолликулярной ангине выявлена гиперемия небных дужек в 100%, язычка в 100%, миндалин в 100 %, мягкого неба в 62.5 % (таблица10), на миндалинах выявлены белого цвета фолликулы в криптах, размером 2-3 мм в диаметре, несколько возвышающиеся над поверхностью ткани и не удаляющиеся шпателем. В острый период у 50% больных с фолликулярной ангиной и у 85.7% больных с лакунарной ангиной выявлено увеличение подчелюстных и переднешейных лимфоузлов. В острый период у 15% и 7.5 % больных с фолликулярной ангиной наблюдалась спленомегалия и гепатомегалия соответственно. В группе больных с лакунарной ангиной спленомегалия и гапатомегалия выявлены в 28.5% случаев. При поступлении патологические изменения со стороны сердечно-сосудистой лакунарной ангиной системы проявлялись 77 у больных тахикардией фолликуллярной (37.5% и и 57.1%, соответственно), приглушенностью или ослаблением сердечных тонов (37.5% и 48.5%, соответственно) и гипотонией (25.0% и 37.1%, соответственно). Таблица 9 - Частота жалоб при поступлении в стационар у наблюдаемых больных с ангинами. Жалобы Общая слабость Отсутствие аппетита Головная боль Тошнота Боль в горле Повышение температуры: 37.6-38.00С 38.1-39.00С 39.1-40.00С Боли в суставах Частое мочеиспускание Боль в пояснице Больные с фолликулярной ангиной Абсол.число % 38 95 15 37.5 36 90 21 52.5 40 100 8 30 2 3 - Больные с лакунарной ангиной Абсол.число % 35 100 26 74.2 35 100 30 85.7 35 100 20 75 5 7.5 - 2 28 3 14 1 1 5.7 82 12.3 40 2.8 2.8 В периферической крови в остром периоде у больных фолликулярной и лакунарной ангиной наблюдается лейкоцитоз (9-16 .106кл\л), повышенные значения СОЭ (16-25мм\ч), сдвиг лейкоцитарной формулы влево (таблица 11). В 67% случаев нарушения гемограммы исчезают на 5-6 сутки, значения СОЭ остаются повышенными на 7 сутки в 7.5 % больных с фолликулярной ангиной и в 25.7 % случаев у больных с лакунарной ангиной (таблица 11). Дополнительно на 2, 5, 7 сутки пребывания в стационаре у больных оценивали показатели свободно-радикальных показателей антиоксидантной процессов системы. и При активность некоторых микробиологическом исследовании флоры зева обнаружен рост патологических стафилококков S.aureus: в 72% случаев при сочетанном росте со стрептококковой флорой, в 4.6.% при сочетанном росте с E.coli, в 3.0% с K.pneumoniae, в 1.4% с бактериями рода Proteus и в 1% с Сandida albicans. В 18% случаев S.aureus высеян в виде монокультуры. 78 Все выделенные штаммы S.aureus были исследованы с целью качественной и количественной оценки персистентных характеристик бактерий Таблица 10 - Частота основных объективных симптомов у больных ангинами в динамике в инфекционного процесса (%). Больные с фолликулярной ангиной Показатель Данные объективного исследования больного: Размер миндалин: Увеличение 1 степени Увеличение 2 степени Увеличение 3 степени Выраженность отека дужек, язычка: Слабовыраженный Умеренный Интенсивный Гиперемия ротовой части глотки, миндалин: Незначительная Умеренная Выраженная Гнойный налет в криптах: Содержимое лакун: Слизистое\отсутствует Слизисто-гнойное Наличие казеозных пробок Показатели состояния сердечно-сосудистой системы: Тахикардия Приглушенность или ослабление сердечных тонов Гипотония Регионарной лимфаденит Спленомегалия Гепатомегалия Дизурия Больные с лакунарной ангиной Сутки пребывания в стационаре 1 2 5 7 1 2 5 7 7.5 92.5 22.5 77.5 5 95 - 92.5 7.5 - 13.3 86.7 14.3 85.7 5.8 94.2 - 85.7 14.3 - 100 85 15 37.5 62.5 - 100 - 100 51.5 48.5 28.5 71.5 - 100 - 100 100 15 85 100 75 25 62.5 100 - 100 - 14.3 85.7 - 28.5 78.5 - 94.3 5.7 - 100 - 100 - 100 - 100 - 55 45 85.7 14.3 85.7 14.3 - 100 - 37.5 37.5 30.0 25.0 15.0 7.5 2.5 57.1 48.5 42.8 28.0 8.5 2.8 25.0 50.0 2.5 7.5 - 15.0 25.0 - - - 37.1 85.7 8.5 28.0 2.8 8.5 57.1 - 8.5 - - 79 Таблица 11 - Данные лабораторных показателей крови больных с ангинами в динамике инфекционного процесса (х±m). Больные с фолликулярной ангиной Показатель Количество эритроцитов (.1012) Уровень гемоглобина (г\л) Количество лейкоцитов (.106) Эозинофилы % Палочкоядерные % Сегментоядерные % Лимфоциты % Моноциты % СОЭ (мм\час) Больные с лакунарной ангиной Сутки пребывания в стационаре 1 2 5 7 1 2 5 7 5.4 ±0.2 5.0 ±0.1 5.2 ±0.3 5.1 ±0.3 5.4 ±0.2 5.2 ±0.1 5.0 ±0.2 5.1 ±0.3 135 ±15 145 ±15 140 ±10 140 ±10 135 ±15 130 ±15 13.5 ±0.5 9.5 ±0.8 8.0 ±0.3 2 12±1 61±1 21±1 4 23±1 2 7±1 62±1 25±1 4 16±2 2 5±1 63±1 25±1 5 15±1 9.5 ±0.2 2 11±1 60±1 23±1 4 20±1 10.0 ±0.3 7.5 ±0.3 2 11±1 60±1 23±1 4 18±2 2 6±1 62±1 25±1 5 15±3 7.0 ±0.4 2 5±1 61±1 25±1 5 12±1 130 ±15 16.5 ±1.3 2 13±1 59±1 21±1 4 25±3 140 ±10 Всем больным назначался комплекс лечебных мероприятий: в острый период антибактериальная терапия широкого спектра действия, а затем препараты антибиотиков с учетом чувствительности микрофлоры (ципролет 500мг\2 раза в сутки, клафоран 1г\3 раза в сутки, апмициллин 0.5мг\4 раза в сутки, бисептол 480мг\2раза в сутки) детоксикационная терапия, включающая коллоидные и кристаллические растворы (раствор глюкозы, солевые растворы, гемодез, реополиглюкин), десенсибилизирующая терапия (димедрол, супрастин), местная терапия, включающая полоскания и местную обработку миндалин дезинфицирующими препаратами (раствор фурацилина, метиленовой сини), витаминотерапия, физиотерапия и симптоматическое лечение. Контрольную группу составили 30 здоровых доноров Республиканской станции переливания крови. Группа здоровых доноров была сопоставлена по полу, возрасту и сопутствующим заболеваниям с исследуемой группой больных. 2 группа больных (с хирургическими инфекциями мягких тканей). Больные наблюдались в отделении 80 челюстно-лицевой хирургии РКБ, отделении хирургии ГКБ г. Нальчика. Обследовано 90 больных средней степени тяжести в возрасте от 16 до 68 лет. Из них 48 мужчин и 56 женщины. В зависимости от локализации воспалительного процесса и его тяжести больные были подразделены на три подгруппы: 56 пациентов были госпитализированы в связи с одонтогенными околочелюстными флегмонами в отделение челюстнолицевой хирургии Республиканской клинической больницы г. Нальчика (первая подгруппа); 16 больных наблюдались в отделении хирургии Городской клинической больницы г. Нальчика и 4-й городской клинической больницы г. Москвы в связи с ягодичными абсцессами (вторая подгруппа) и 18 женщин находились на лечении в этих же отделениях по поводу гнойных маститов (третья подгруппа). Таблица 12 - Распределение больных второй группы по полу, возрасту и локализации патологического процесса. Возраст От 16 до 40 От 40 до 68 Всего Одонтогенные околочелюстные флегмоны Муж Жен 19 16 (21%*) (17.7%) 11 10 (12 (11.1%) .2%) 30 26 (33.4%) (28.9%) Первая подгруппа. Ягодичные абсцессы Муж 3 (3.3%) 1 (1.1%) 4 (4.4%) Гнойные маститы Жен 8 (8.9%) 4 (4.4%) 12 (13.3%) Обследовано 56 Муж Всего - Жен 18 (20%) - - - 18 (20%) больных с Муж 22 24.4% 12 13.3%) 34 37.7% Жен 24 26.6% 14 15.6% 56 62.3% одонтогенными флегмонами в возрасте от 17 до 66 лет, из них мужчин 30, женщин 26 (таблица13). В зависимости от распространенности воспалительного процесса пациенты были разделены на 3 дополнительные группы: в первую вошли 32 человека, у которых патологический процесс затрагивал одно клетчаточное пространство, во вторую – 15 пациентов с поражением двух клетчаточных пространств и у 9 больных воспалительный процесс затрагивал три и более клетчаточных пространства (таблица 13). 81 Таблица 13 - Общая характеристика больных с одонтогенными флегмонами. Распространенность Группа больных 1 воспалительного процесса Одно клетчаточное пространство Локализация воспалительного процесса (области) Количество человек Поднижнечелюстная, Подподбородочная, Околоушно-челюстная область 2 3 Два клетчаточных пространства Три и более клетчаточных пространства Поднижнечелюстнаяподподбородочная; лет 18-44 32 (57.1%)* Поднижнечелюстная и щечная; Количество Возраст, 17-56 Мужчин Женщин 24 8 (42.8%) (14.2%) 8 7 (14.2%) (12.5%) 5 4 (8.9%) (7.1%) 15 (26.7%) Поднижнечелюстная и крыловидно-челюстное пространство Поднижнечелюстная с двух сторон и подбородочная области; Поднижнечелюстная, 9 (16.0%) крыловидно-челюстное и ушножевательные области. * - в таблице приведены % от общего количества больных с флегмонами (56 человек) 82 17-55 Больные поступали в стационар в экстренном порядке, на 2-3 сутки после начала болезни. Состояние больных на момент поступления в стационар расценивалось как удовлетворительное и средней тяжести. Сопутствующей патологии внутренних органов не отмечалось, алкоголизм и наркоманию больные отрицали. Начало болезни у всех больных было острое: появлялась боль в области воспалительного процесса, наблюдалось изменение конфигурации лица за счет отека и инфильтрата, кожа над инфильтратом была гиперемирована, напряжена, затем появлялся озноб, общая слабость, головная боль. От момента начала болезни до поступления в стационар выраженность симптомов воспаления увеличивалась. Степень нарушения глотания, жевания и открывания рта зависела от локализации и распространенности воспалительного процесса. У 69% больных наблюдалось ограничение открывания рта, болезненное глотание (таблица14). Температура тела у 28% (16 человек) больных достигала 37.1-38.00С, у 37% (21 человек) 38.1-39.00С, у 35% (19 больных) была 39.1-400С. Таблица 14 - Частота жалоб при поступлении в стационар у наблюдаемых больных с одонтогенными флегмонами челюстно-лицевой области. Жалобы Общая слабость Головная боль Тошнота Боль в области воспаления Ограничение открывания рта Боль при глотании Группа больных 1* 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Абсол. число 10 9 9 2 7 9 3 8 32 15 9 16 12 9 2 12 9 84 % от числа больных в группе 31.3 60 100 6.25 46.7 100 20 88.9 100 100 100 50 80 100 6.2 80 100 Повышение температуры: 37.1-38.00С 38.1-39.00С 39.1-40.00С 1 37.1-38.00С 38.1-39.00С 39.1-40.00С 2 37.1-38.00С 38.1-39.00С 39.1-40.00С 3 16 50 14 43.7 2 6.3 - - 5 33.4 10 66.6 - - 2 22.2 7 77.8 Таблица 15 - Частота основных объективных симптомов у больных с одонтогенными флегмонами челюстно-лицевой области в динамике в инфекционного процесса (%) (больные с флегмонами одного клетчаточного пространства). Показатель Данные объективного исследования больного: Выраженность гноетечения: Слабовыраженное Умеренное Обильное Выраженность отека: Слабовыраженный Умеренный Интенсивный Гиперемия: Незначительная Умеренная Выраженная Размеры инфильтрата*: Незначительные Умеренные Выраженные Показатели ранозаживления: Очищение раны от некротизированных тканей Грануляция раны Эпителизация раны Регионарный лифмаденит: Сутки пребывания в стационаре 1 2 5 7 14 100 - 6.3 93.7 - 37.5 62.5 - 93.7 6.3 - Отсутств. 18.8 81.2 31.2 68.8 81.2 18.8 - 93.7 6.3 - Отсутств. 18.8 81.2 33.8 56.2 68.8 31.2 - 81.2 18.8 - Отсутств. 31.2 68.8 33.8 56.2 37.5 62.5 - 81.2 18.8 - Отсутств. - - 87.5 100 - - - 81.2 - 93.7 6.3 93.7 62.5 62.5 31.2 12.5 - 85 Таблица 16 - Частота основных объективных симптомов у больных с одонтогенными флегмонами челюстно-лицевой области в динамике в инфекционного процесса (%) (больные с флегмонами двух клетчаточных пространств). Сутки пребывания в стационаре Показатель 1 2 5 7 14 Слабовыраженное - - 33.3 86.7 Умеренное 6.6 26.6 66.7 13.3 Обильное 93.4 73.4 - - Слабовыраженный - - 86.7 93.4 Умеренный 6.6 33.3 13.3 6.6 Интенсивный 93.4 66.7 - - Незначительная - - 64.3 82.2 Умеренная 6.6 46.6 35.7 17.8 Выраженная 93.4 53.4 - - Незначительные - - 28.6 82.2 Умеренные 10.8 55.4 71.4 17.8 Выраженные 89.2 44.6 - - Очищение раны от некротизированных тканей - - 85.7 100 - Грануляция раны - - 73.4 93.4 - Эпителизация раны - - - 14.2 96.4 Регионарный лифмаденит: 86.7 86.7 33.4 13.4 - Данные объективного исследования больного: Выраженность гноетечения: Отсутств. Выраженность отека: Отсутств. Гиперемия: Отсутств. Размеры инфильтрата*: Отсутств. Показатели ранозаживления: 86 Таблица 17 - Частота основных объективных симптомов у больных с одонтогенными флегмонами челюстно-лицевой области в динамике в инфекционного процесса (%) (больные с флегмонами трех клетчаточных пространств). Показатель Сутки пребывания в стационаре 1 2 Данные объективного исследования больного: Выраженность гноетечения: Слабовыраженное Умеренное 11.1 Обильное 100 88.9 Выраженность отека: Слабовыраженный Умеренный 11.1 Интенсивный 100 88.9 Гиперемия: Незначительная Умеренная 33.4 Выраженная 100 55.6 Размеры инфильтрата*: Незначительные Умеренные 10.8 55.4 Выраженные 89.2 44.6 Показатели ранозаживления: Очищение раны от некротизированных тканей Грануляция раны Эпителизация раны Регионарный лифмаденит: 100 100 * - размеры инфильтрата считались незначительными – умеренными выраженными – 5 7 14 33.3 66.7 - 88.9 11.1 - Отсутств. 33.3 66.7 - 88.9 11.1 - Отсутств. 55.6 33.4 - 88.9 11.1 - Отсутств. 28.6 71.4 - 82.2 17.8 - Отсутств. 77.8 88.9 - 77.8 - 88.9 - 77.8 55.6 33.4 11.1 Средняя длительность лихорадки составляла 7±2 дней. У большинства больных (89% или 50 человек) наблюдался регионарный лимфаденит (подчелюстные, передне-шейные, задне-шейные лимфоузлы). В стационаре проводилось клиническое, лабораторное и рентгенологическое обследование больных. Фиксировалась локализация и распространенность воспалительного процесса, определялся источник инфекции («причинный зуб»). Первичный очаг 87 воспаления локализовался на нижней челюсти у 41 больного и на верхней челюсти у 15 больных. Местно определялся болезненный инфильтрат с довольно четкими границами и перифокальным отеком, как правило, отчетливо определялся симптом флюктуации. Выраженность общей и местной симптоматики у больных зависела от распространенности воспалительного процесса (таблицы 15,16,17). Под общим обезболиванием, наружным доступом, вскрывали гнойный очаг, проводили некрэктомию и ревизию клетчаточных пространств, дренировали рану, по показаниям удаляли «причинный зуб». В периферической крови в остром периоде у больных с одонтогенными флегмонами челюстно-лицевой области наблюдается лейкоцитоз (12-18 .106кл\л), повышенные значения СОЭ (17-28мм\ч), сдвиг лейкоцитарной формулы влево. В 70% случаев нарушения гемограммы исчезают на 7-8 сутки, значения СОЭ остаются повышенными на 10 сутки в 7.5 % (таб.18). Дополнительно на 1, 2, 5, 7, 14 сутки пребывания в стационаре у больных оценивали показатели свободно-радикальных процессов и активность некоторых показателей антиоксидантной системы. При микробиологическом исследовании гнойного отделяемого во всех случаях был высеян S.aureus: в виде монокультуры в 37% случаев, в комбинации со стрептококками в 6%, в грамотрицательными бактериями в 55% и в 2% Сandida albicans. Все выделенные штаммы S.aureus были исследованы с целью качественной и количественной оценки персистентных характеристик бактерий. Всем больным назначался комплекс общих лечебных мероприятий: в острый период антибактериальная терапия широкого спектра действия, а затем препараты антибиотиков с учетом чувствительности микрофлоры, детоксикационная терапия, включающая коллоидные и кристаллические растворы (раствор глюкозы, солевые растворы, гемодез, реополиглюкин), десенсибилизирующая терапия (димедрол, супрастин), витаминотерапия, физиотерапия и симптоматическое лечение. При местном лечении у больных после вскрытия флегмоны, во время ежедневных перевязок, менялись дренажи, 88 раневая поверхность орошалась растворами антисептиков (3% перекись водорода, фурацилина 1:5000, хлоргексидина 0.06%). Накладывались ранние вторичные швы. Контрольную группу составили 30 доноров. Таблица 18 - Данные лабораторных показателей крови больных одонтогенными флегмонами в динамике инфекционного процесса (х±m). Показатель Группа больны х* Сутки пребывания в стационаре 1 2 4.9±0. 5 4.9±0. 5 4.9±0. 5 5 7 14 5.0± 5.1±0. 5.4±1.2 5.4±0.2 0.3 7 Количество 5.0± 5.1±0. 2 5.3±1.2 5.2±0.2 эритроцитов 0.3 7 (.1012) 5.0± 5.0±0. 3 5.0±1.0 5.3±0.2 0.3 7 132± 1 135±6 132±6 132±5 135±5 5 Уровень 130± гемоглобина (г\л) 2 135±5 130±4 130±6 134±3 6 120± 3 125±3 120±2 130±6 130±6 6 16±2 7.5± 7.6±0. 1 15±3 6.5±1.3 0.3 4 Количество 18±3 10.5 8.0±0. лейкоцитов (.106) 2 17±3 7.5±1.3 ±0.3 5 22±3 17.5 12.0± 3 22±3 10.5±1.3 ±0.3 0.4 Эозинофилы % 1,2,3 2 2 2 2 2 1 8±2 8±1 5±1 5±2 4±1 Палочкоядерные 2 12±2 12±1 10±1 6±2 5±1 % 3 14±2 12±1 10±1 9±2 7±1 1 62±1 61±1 63±1 63±1 64±1 Сегментоядерные 2 60±1 60±1 61±1 63±1 63±1 % 3 60±1 61±1 61±1 62±1 62±1 1 23±1 23±1 25±1 25±1 25±1 Лимфоциты % 2 22±1 22±1 23±1 23±1 24±1 3 20±1 21±1 23±1 23±1 24±1 1 5±1 5±1 5±1 5±1 5±1 Моноциты % 2 4±1 4±1 5±1 5±1 5±1 3 4±1 4±1 4±1 4±1 5±1 1 18±4 18±2 14±3 14±1 11±3 СОЭ (мм\час) 2 22±4 21±2 15±2 14±2 11±2 3 26±4 24±3 16±3 14±3 12±3 * - группы больных с различной распространенностью воспалительного пространства (1флегмона одноклетчаточного пространства, 2 – флегмона двухклетчаточного пространства, 3 – флегмона трех и более клетчаточных пространств 1 89 с Вторая подгруппа. Обследовано 16 больных с ягодичными постинъекциоными абсцессами в возрасте от 17 до 66 лет, из них мужчин 4, женщин 12 (таблица 12). Таблица 19 - Частота жалоб при поступлении в стационар у наблюдаемых больных с постинъекционными ягодичными абсцессами. Жалобы Общая слабость Головная боль Тошнота Боль в области воспаления Повышение температуры: 37.1-38.00С 38.1-39.00С 39.1-40.00С Абсол. Число 10 8 5 16 % 62.5 50 33.4 100 7 9 - 43.8 56.2 9 Больные поступали в стационар в экстренном порядке. Начало болезни у всех больных было острое: появлялась боль в области воспалительного процесса, припухлость за счет отека и инфильтрата, кожа над инфильтратом гиперемирована, напряжена, затем появлялся озноб, общая слабость, головная боль. Температура тела у 43.8% (7 человек) больных достигала 37.1-38.0 0С и у 56.2% (9 человек) больных достигала 38.1-39.0 0С. Средняя длительность лихорадки составляла 4 ±1 дня. Проводилось клиническое, лабораторное обследование больных. Состояние больных на момент поступления расценивалось как удовлетворительное и средней тяжести. Под общим обезболиванием, вскрывали гнойный очаг, проводили некрэктомию и дренировали рану. В периферической крови в остром периоде у больных с постинъекционными ягодичными абсцессами наблюдается лейкоцитоз (12-18 . 106кл\л), повышенные значения СОЭ (16-18мм\ч), сдвиг лейкоцитарной формулы влево. В 82% случаев нарушения гемограммы исчезают на 7-8 сутки, значения СОЭ остаются повышенными на 10 сутки в 5 % (таб.21). Дополнительно на 2, 5, 7 сутки пребывания в стационаре у больных оценивали 90 показатели свободно-радикальных процессов и активность некоторых показателей антиоксидантной системы. Таблица 20 - Частота основных объективных симптомов у больных с постинъекционными ягодичными абсцессами в динамике в инфекционного процесса (%). Сутки пребывания в стационаре Показатель Данные объективного исследования больного: Выраженность гноетечения: Слабовыраженное Умеренное Обильное Выраженность отека: Слабовыраженный Умеренный Интенсивный Гиперемия: Незначительная Умеренная Выраженная Размеры инфильтрата: Незначительные Умеренные Выраженные Показатели ранозаживления: Очищение раны от некротизированных тканей Грануляция раны Эпителизация раны 1 2 5 7 37.5 62.5 50 50 76.6 33.4 - Отсутств. 37.5 62.5 87.5 12.5 93.7 6.3 - Отсутств. 12.5 87.5 81.2 18.8 87.5 12.5 - Отсутств. 18.8 81.2 50 50 93.7 6.3 - Отсутств. - 62.5 100 - - - 62.5 - 100 100 12.5 12.5 6.3 - Регтонарный лимфаденит 91 Таблица 21 - Данные лабораторных показателей крови больных с постинъекционными ягодичными абсцессами в динамике инфекционного процесса (х±m). Сутки пребывания в стационаре Показатель Количество эритроцитов (.1012) Уровень гемоглобина (г\л) Количество лейкоцитов (.106) Эозинофилы % Палочкоядерные % Сегментоядерные % Лимфоциты % Моноциты % СОЭ (мм\час) 1 2 5 7 5.4±0.2 5.0±0.1 5.2±0.3 5.1±0.3 135±15 145±15 140±10 140±10 10.5 ±0.2 2 10±1 60±1 24±1 4 16±1 10.0 ±0.3 7.5 ±0.3 2 8±1 61±1 25±1 4 14±2 2 6±1 62±1 25±1 5 14±1 6.0 ±0.4 2 5±1 63±1 26±1 6 12±1 При микробиологическом исследовании гнойного отделяемого во всех случаях был высеян S.aureus в виде монокультуры в 47% случаев, в комбинации со стрептококками в 4%, в грамотрицательными бактериями в 49%. Все выделенные штаммы S.aureus были исследованы с целью качественной и количественной оценки персистентных характеристик бактерий. Всем больным назначался комплекс общих лечебных мероприятий: антибактериальная терапия (с учетом детоксикационно-десенсибилизирующая чувствительности терапия, микрофлоры), витаминотерапия. Контрольную группу составили 30 доноров. Третья подгруппа. Обследовано 18 больных с гнойными лактационными маститами, в возрасте от 18 до 39 лет (таблица 22). Больные поступали в стационар в экстренном порядке. В 67% случаев (12 человек) гнойный мастит развивался на 2-3 неделе жизни ребенка. В патогенезе заболевания играли роль закрытые травмы груди (выжимание молока) и/или застой молока. Начало болезни у всех больных было острое: 92 появлялся озноб, повышение температуры, боль в молочной железе. При осмотре хирургом отмечено изменение конфигурации и размеров молочной железы за счет отека и инфильтрата, кожа над инфильтратом гиперемирована и напряжена, воспалительный инфильтрат болезненен на ощупь, определяется флюктуация, затем появлялась общая слабость, головная боль. В 55 % случаев (10 больных) обнаружен регионарный лимфаденит (подмышечные лимфоузлы). Температура тела у 94% (17 человек) больных достигала 38.1-39.0 0С, у 6% (1 женщина) 39.70С. Средняя длительность лихорадки составляла 4 ±1 дня. Проводилось клиническое, лабораторное обследование больных. Состояние больных на момент поступления расценивалось как удовлетворительное и средней тяжести. Под общим обезболиванием вскрывали гнойный очаг, проводили эвакуацию гноя и некрэктомию, дренировали рану. Таблица 22 - Частота жалоб при поступлении в стационар у наблюдаемых больных с лактационными маститами Жалобы Общая слабость Отсутствие аппетита Головная боль Тошнота Боль в области воспаления Повышение температуры: 37.1-38.00С 38.1-39.0 0С 39.1-40.00С Абсол. число 18 18 18 9 18 % 100 100 100 50 100 17 1 94 6 Таблица 23 - Частота основных объективных симптомов у больных с лактациоными маститами в динамике инфекционного процесса (%). Показатель Данные объективного исследования больного: Выраженность гноетечения: Слабовыраженное Умеренное Обильное Сутки пребывания в стационаре 1 2 5 7 10 11.1 72.3 12.2 77.8 94.5 5.5 Отсутств. 93 Выраженность отека: Слабовыраженный Умеренный Интенсивный Гиперемия: Незначительная Умеренная Выраженная Размеры инфильтрата: Незначительные Умеренные Выраженные Показатели ранозаживления: Очищение раны от некротизированных тканей Грануляция раны Эпителизация раны Регионарный лимфаденит 88.9 17.7 - - 5.5 94.5 11.1 88.9 6.6 83.4 - 66.7 33.3 - Отсутств. 6.6 83.4 22.2 77.8 61.2 48.8 - 83.4 6.6 - Отсутств. 5.5 94.5 6.6 83.4 11.1 88.9 - 100 - Отсутств. - 11.1 83.4 100 - 100 100 88.9 61.2 100 77.8 33.3 100 - В периферической крови в остром периоде у больных с лактационными маститами наблюдается лейкоцитоз (12-20 .106кл\л), повышенные значения СОЭ (16-28мм\ч), сдвиг лейкоцитарной формулы влево. В 76% случаев нарушения гемограммы исчезают на 6-8 сутки, значения СОЭ остаются повышенными на 10 сутки в 9 % (таблица 24). Дополнительно на 1, 2, 5, 7, 10 сутки пребывания в стационаре у больных оценивали показатели свободно-радикальных процессов и активность некоторых показателей антиоксидантной системы.При микробиологическом исследовании гнойного отделяемого в 100% случаев был высеян S.aureus в виде монокультуры. Все выделенные штаммы S.aureus были исследованы с целью качественной и количественной оценки персистентных характеристик бактерий. Всем больным назначался комплекс лечебных мероприятий: в острый период антибактериальная терапия широкого спектра действия, а затем препараты антибиотиков с учетом чувствительности микрофлоры, детоксикационная терапия, включающая коллоидные и кристаллические растворы (раствор глюкозы, солевые растворы, гемодез, реополиглюкин), десенсибилизирующая терапия (димедрол, супрастин),витаминотерапия, и симптоматическое лечение. 94 Таблица 24 - Данные лабораторных показателей крови больных с лактационными маститами в динамике инфекционного процесса (х±m). Показатель Сутки пребывания в стационаре 1 2 5 7 10 4.4±1.2 4.9±0.5 5.0±0.3 5.1±0.7 5.2±0.2 115±15 115±15 132±10 140±10 140±10 18±6 14±3 7.5±0.3 7.0±0.4 6.5±1.3 2 2 2 2 2 Палочкоядерные % 14±2 10±1 11±1 6±2 4±1 Сегментоядерные % 60±1 61±1 62±1 63±1 64±1 Лимфоциты % 20±1 4 23±1 4 24±1 5 25±1 25±1 5 5 19±2 16±3 14±1 12±3 Количество эритроцитов (.1012) Уровень гемоглобина (г\л) Количество лейкоцитов (.106) Эозинофилы % Моноциты % СОЭ (мм\час) 24±4 3 группа (с генерализованной стафилококковой инфекцией). Больные наблюдались в отделениях реанимации и хирургии городской клинической больницы г.Нальчика и Республиканском Центре Инфекционных болезней г. Нальчика. Обследовано 22 больных в возрасте от 16 до 56 лет с сепсисом стафилококковой этиологии, из них 10 мужчин и 12 женщин. В начале 90-х годов уточнение представлений о механизмах генерализации инфекционного процесса привело к введению в клиническую практику унифицированных диагностических признаков септических состояний. Так как новая терминология сепсиса в настоящее время принята большинством специалистов 259,260,261,262, то в настоящей работе все больные ретроспективно разделены на 2 подгруппы согласно новой классификации: первую подгруппу составили 15 человек с системной воспалительной реакцией (сепсис), вторую подгруппу 7 больных с тяжелым сепсисом. Клинико-лабораторные показатели согласно которым произведено разделение групп больных представлены в таблицах 26 и 30. 95 Таблица 25 - Распределение больных третьей группы по полу, возрасту и степени тяжести. Возраст От 16 до 40 От 40 до 56 Всего: Сепсис Тяжелый сепсис Всего муж Жен муж Жен Муж Жен 4 18.2%* 2 9.1% 6 6 4 18.2% 5 22.7% 99 440.9% 4 3 13.6% 1 4.5% 2 9.1% 1 4.5% 7 31.8% 3 13.6% 6 27.2% 6 27.2% 4 3 10 12 27.2% 18.2% 13.6% 45.4% 54.5% * - в таблице представлены проценты от общего числа больных третьей группы. Таблица 26 - Клинико-лабораторные признаки системной воспалительной реакции у больных с сепсисом (при поступлении) согласно классификации R.C.Bone. Признак 1.Температура тела выше 380С или ниже 360С 2.Частота сердечных сокращений более 90 ударов в минуту 3. Частота дыханий более 20 в минуту 4. Лейкоциты периферической крови более 12х109/л или ниже 4 х109/л 5. Число незрелых форм более 10% Абсол.число больных 15 (выше380С) 14 100 93.3 12 15 80 100 13 86.7 % У больных первой подгруппы о наличии сепсиса свидетельствовали очаг инфекта и синдром системного воспалительного ответа. В 35% случаев (5 человек) у больных с системной воспалительной реакцией ранее отмечались «беспричинные» однодневные подъемы температуры до фебрильных цифр с ознобом и последующим обильным потоотделением 1-2 раза в неделю в течение 2 месяцев, в 20% случаев (3 человека) в течение длительного времени (1-2месяца) наблюдались лихорадочные волны с апирексиями между ними, во время которых самочувствие больного оставалось вполне удовлетворительным. 96 Затем волны учащались, периоды апирексии сокращались и температурная кривая приобретала постоянный характер. В остальных случаях (7 человек) начало болезни было острое, системная воспалительная реакция развивалась в течение 2-5 дней. «Воротами» инфекции в этой подгруппе больных служили: у 6 человек (40%) поражения кожи и подкожной клетчатки (карбункул, фурункул, панариций ногтевой фаланги), у 2 человек (13.3%) гнойновоспалительные процессы в уро-генитальных органах (эндометрит), у 7 (46.7%) сепсис гнойно-воспалительные процессы в брюшной области (панкреонекроз, гнойный аппендицит). При поступлении у трех (20%) больных с системной воспалительной реакцией температура 38.1-39.00С, у девяти больных -39.140.00С и у трех выше 40.10С. Повышению температуры предшествовал сильный озноб, температурная кривая указывала на перемежающую лихорадку. Длительность лихорадки составила 12±2 дня. У 14 (93%) больных наблюдалось учащение пульса свыше 120 уд\мин, у 12 больных (80%) одышка, не связанная с поражением органов дыхания, у всех больных отмечался упадок сил, слабость (таблица 27). У трех больных (20%) были наиболее выражены диспепсические явления (тошнота, рвота, отсутствие аппетита). Таблица 27 - Частота жалоб при поступлении в стационар у наблюдаемых больных с системной воспалительной реакцией. Жалобы Общая слабость Отсутствие аппетита Головная боль Тошнота Вздутие живота Рвота Сердцебиение Одышка Повышение температуры: 37.1-38.00С 38.1-39.0 0С 39.1-40.00С выше 40.10С Боль в области воспаления Нарушение сна 97 Абсол. число 15 15 15 15 3 3 14 12 % 100 100 100 100 20 20 93 80 3 9 3 15 10 20 60 20 100 66.7 Таблица 28 - Частота основных объективных симптомов у больных с системной воспалительной реакцией в динамике инфекционного процесса (%). Показатель Данные объективного исследования больного: Бледность кожных покровов Сыпь Лимфаденит Тахикардия Брадикардия Гипотония Гипертония Приглушенность сердечных тонов Систолический шум Расширение границ сердца Везикулярное дыхание Жесткое дыхание Хрипы: Сухие Влажные Притупление сравнительной перкуссии при сравнительной перкуссии легких Тахипноэ Брадипноэ Болезненность при пальпации живота Симптомы раздражения брюшины Вздутие живота Спленомегалия Гепатомегалия Положительный симптом Пастернацкого Дизурия Периферические отеки Диарея Лихорадка: 37.1-38.00С 38.1-39.0 0С 39.1-40.00С выше 40.10С Состояние ЦНС: В полном сознании Спутанное сознание Сутки пребывания в стационаре 1 2 7 14 30 100 40 100 100 - 100 40 100 100 - 100 40 80 100 - 100 20 20 - - 73.3 73.3 73.3 20 - 73.3 80 20 73.3 80 20 73.3 80 20 20 100 - 100 - 20 20 20 - - - - - - - 100 - 100 - 80 - 20 - - 60 60 20 - - 46.6 46.6 20 - - 46.6 50 80 46.6 50 80 20 20 46.6 - - - - - - - 20 20 - - - 20 60 20 20 80 - 100 - - - 100 100 100 100 100 98 Таблица 29 - Данные лабораторных показателей крови больных с системной воспалительной реакцией в динамике инфекционного процесса (х±m). Сутки пребывания в стационаре Показатель Количество эритроцитов (.1012) Уровень гемоглобина (г\л) 1 2 7 14 30 4.0±1.2 3.9±0.5 4.2±0.3 4.3±0.7 4.8±0.2 120±10 125±10 100±15 Количество лейкоцитов (.106) 100±10 18±6 Эозинофилы % Палочкоядерные % Сегментоядерные % Лимфоциты % Моноциты % СОЭ (мм\час) 130±10 9.0±0.4 18±3 10.0±0.5 8.5±1.5 2 2 19±2 17±1 2 16±1 2 9±2 2 5±1 59±1 17±1 3 30±10 61±1 17±1 4 31±6 62±1 19±1 5 24±3 63±1 22±1 5 18±1 64±1 24±1 5 12±3 В периферической крови в остром периоде у больных с системной воспалительной реакцией наблюдался лейкоцитоз (12-24 х109/л), повышенные значения СОЭ (20-40мм\ч), сдвиг лейкоцитарной формулы влево (таб.29). Дополнительно на 1, 2, 5, 14, 30 сутки пребывания в стационаре у больных оценивали показатели свободно-радикальных процессов и активность некоторых показателей антиоксидантной системы. При микробиологическом исследовании гнойного отделяемого в 100% случаев был высеян S.aureus в виде монокультуры. Все выделенные штаммы S.aureus были исследованы с целью качественной и количественной оценки персистентных характеристик бактерий.Для лечения больных с сепсисом, помимо хирургической санации первичного очага инфекции применялась комплексная терапия: этиотропная антибиотикотерапия, инфузионная терапия, иммунотерапия (диуцифон, пентоксифиллин).Контрольную группу составили 15 здоровых доноров. Пациенты второй подгруппы характеризовались синдромом системного воспалительного ответа в сочетании с проявлениями дисфункции органов, 99 перфузионными нарушениями, артериальной гипотензией и были, согласно классификации R. Bone, отнесены к группе больных с тяжелым сепсисом . В 85.7% случаев (6 человек) начало болезни было острое, в 14.3% (1 человек) подъемы температуры до 380С –390С наблюдались в течение 2 месяцев, с перерывами в 1-2 недели. Таблица 30 - Клинико-лабораторные признаки синдрома моноорганной или полиорганной дисфункции у больных тяжелым сепсисом согласно классификации R.C.Bone. Дисфункция Признаки 1.продукты деградации фибриногена более 1\40, Dдимеры более 2; 2.Протромбиновый индекс менее 70%, тромбоцитов менее 150 х109\л, фибриногена менее 2г\л. 2.Нарушение 1.РаО2 менее 71мм рт.ст.* газообменной 2. билатеральные легочные функции легких инфильтраты на легочной рентгенограмме 3.РаО2/Fi О2 менее 300 4. необходимость ИВЛ с положительным давлением конца выдоха более 5 см вод.ст. 3. Почечная 1.креатинин крови более 0.176 дисфункция ммоль\л 2.натрий мочи менее 40 ммоль\л темп диуреза менее 30мл\ч 4. Печеночная 1.билирубин крови более дисфункция 34мкмоль\л 2. увеличение уровня АСТ, АЛТ, щелочной фосфатазы в 2 раза и более от нормы 5.Дисфункция ЦНС Менее 15 баллов по шкале Глазго 6.Гастроинтестинальн 1.кровотечение из острых язв ая недостаточность («стресс-язвы») желудка 2. илеус длительностью более 3 суток 3.диарея (жидкий стул более 4 раз в сутки) * -исключая лиц с хроническими заболеваниями легких Частота встречаемости у больных Абсол. число % 1.Дисфункция в системе гемостаза 100 1 14.3 1 14.3 3 42.8 - - - - 3 42.8 «Воротами» инфекции воспалительные процессы служили: в в брюшной 71.4% (5 области человека) (перитонит), гнойнов 28.6% (2 человек) – поражение кожи и подкожной клетчатки (фурункулез) и фаланги пальца (панариций).В острый период у всех больных второй подгруппы отмечены клинико-лабораторные признаки моно- или полиорганной недостаточности (таб.31). К моменту поступления в клинику у 2 (28.5%) больных имелась постоянная лихорадка 38.10С-39.00С, у 5 больных (71.4%) температура 39.1-40.00С. У 3 больных был выражен нефротического синдрома (отеки, дизурия, положительный симптом Пастернацкого, креатинин, протеинурия). Селезенка пальпировалась у всех больных. Гепатомегалия также была выражена у 100% больных. Состояние сердечно-сосудистой системы характеризовалось выраженной тахикардией (120-140 ударов\минуту) (100%), систолическим шумом (100%) и расширением границ сердца (28.5%). Артериальное давление у всех больного пониженное –80-90\40-50. Диарея (более 4 раз в сутки) была выражена у одного больного (14.2%). Болезненность пальпации живота и симптом раздражения брюшины больных с «входными воротами» инфекции были выражены у –гнойно-воспалительным процессом в брюшной полости (71.4%). Изменения со стороны ЦНС наблюдались у четверых больных (57.2%) и проявлялись состоянием полузабытья, бредом, беспокойностью. В периферической крови в остром периоде у больных с тяжелым сепсисом наблюдается лейкоцитоз (15-28х109\л) или лейкопения (3.0-3.5 х109\л), со сдвигом формулы влево до юных форм, СОЭ достигает 60±15 (таб.32). У трех больных выявлена анемия: гемоглобин 70±15, эритроциты 3.2±0.3 х1012. Дополнительно на 1, 2, 5, 14, 30 сутки пребывания в стационаре у больных оценивали показатели свободнорадикальных процессов и активность некоторых показателей антиоксидантной системы. При микробиологическом исследовании крови в 100% случаев был высеян S.aureus в виде монокультуры. Все выделенные штаммы S.aureus были исследованы с целью качественной и количественной оценки персистентных характеристик бактерий. Для лечения 101 больных с сепсисом, помимо хирургической санации первичного очага инфекции применялась комплексная терапия: глюкокортикостероиды, устранение гиповолемии и дезинтоксикационная терапия, включающая коллоидные и кристаллические растворы (раствор глюкозы, солевые растворы, гемодез, реополиглюкин) и переливание свежезамороженной плазмы, десенсибилизирующая терапия (димедрол, супрастин), восстановление периферической микроциркуляции, ликвидация гипоксии, этиотропная антибиотикотерапия, коррекция кислотнощелочного состояния и свертыво-противосвертывающей системы, иммунотерапия (диуцифон, пентоксифиллин), симптоматическая терапия, а также использовались методы экстракорпоральной детоксикации. Контрольную группу составили 15 здоровых доноров. Таблица 31 - Частота основных объективных симптомов у больных с системной воспалительной реакцией в динамике в инфекционного процесса (%). Показатель Данные объективного исследования больного: Бледность кожных покровов Сыпь Лимфаденит Тахикардия Брадикардия Гипотония Гипертония Приглушенность сердечных тонов Систолический шум Расширение границ сердца Везикулярное дыхание Жесткое дыхание Хрипы: Сухие Влажные Притупление сравнительной перкуссии при сравнительной перкуссии легких Тахипноэ Брадипноэ Болезненность при пальпации живота Сутки пребывания в стационаре 1 2 7 14 30 100 14.2 100 100 100 - 100 14.2 100 100 100 - 100 14.2 57.1 100 100 - 100 28.5 28.5 57.1 - 28.5 - 100 100 85.7 57.1 28.5 100 28.5 85.8 14.2 100 28.5 85.8 14.2 85.7 28.5 85.8 14.2 57.1 14.2 85.8 14.2 28.5 100 - 14.2 14.2 14.2 - - - - 14.2 14.2 14.2 100 71.4 100 71.4 85.8 71.4 20 - - 102 Симптомы раздражения брюшины Вздутие живота Спленомегалия Гепатомегалия Положительный симптом Пастернацкого Дизурия Периферические отеки Диарея Лихорадка: 37.1-38.00С 38.1-39.0 0С 39.1-40.00С выше 40.10С Состояние ЦНС: В полном сознании Спутанное сознание 71.4 71.4 14.2 - - 28.5 100 100 28.5 28.5 100 100 85.8 85.8 14.2 14.2 - 42.8 42.8 - - - 42.8 42.8 42.8 42.8 14.2 14.2 42.8 - - - 28.5 71.4 42.8 57.2 42.8 57.2 - 100 - - 42.8 57.2 57.2 42.8 100 100 100 Таблица 32 - Данные лабораторных показателей больных с тяжелым сепсисом в динамике инфекционного процесса (х±m). Сутки пребывания в стационаре Показатель Количество эритроцитов (.1012) Уровень гемоглобина (г\л) Количество лейкоцитов (.106) Эозинофилы % Палочкоядерные % Сегментоядерные % Лимфоциты % Моноциты % СОЭ (мм\час) 1 2 7 14 30 3.5±1.2 3.2±0.5 3.7±0.5 4.2±0.7 4.5±0.2 80±15 80±10 90±10 95±10 110±10 18.0±1.0 18±0.8 14.0±0.5 12.0±1.0 9.5±1.0 2 22±2 57±1 16±1 3 33±7 2 20±1 60±1 17±1 3 32±6 2 15±1 62±1 20±1 4 24±3 2 11±2 62±1 22±1 5 18±1 2 6±1 64±1 25±1 5 12±3 Характеристика группы здоровых доноров. Группа состояла из 65 доноров Республиканской станции переливания крови г.Нальчика и была сопоставлена по полу, возрасту с группами больных (таб.33). Лица, имеющие сопутствующие заболевания и отклонения в анализах крови, были исключены из группы доноров. 103 Таблица 33 - Распределение группы доноров по полу и возрасту. Возраст Мужчин Женщин От 16 до 40 21 32.3%* 15 23.0% 36 55.3% 19 29.3% 10 15.4% 29 44.7% От 40 до 56 Всего: * - в таблице приведены процентные значения от общего количества доноров Лабораторные методы исследования Выделение исследуемых компонентов крови больных и здоровых доноров Выделение клеток. Выделение нейтрофилов из периферической крови человека. Для выделения нейтрофилов использовали венозную кровь, взятую утром натощак путем пункции локтевой вены больных и доноров в строго асептических условиях. Кровь собирали в стерильные силиконизированные пробирки, содержащие 1.0мл антикоагулянта - раствора гепарина («Richter» Венгрия) (25 единиц на 1.0мл крови). Количество используемой крови на одно исследование составляло от 5 до 10 мл. Нейтрофилы выделяли по стандартной методике на двойном градиенте плотности. Для этого в силиконизированные пробирки поэтапно наслаивали равные объемы растворов фиколл-верографина (удельная плотность 1.199 гр\см3 и 1,080 гр\см3) и периферическую кровь. Затем пробирки центрифугировали в течение 40 минут при 800g в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования нейтрофилы концентрировались в интерфазном кольце. Взвесь нейтрофилов пререносили в силиконизированные пробирки и дважды отмывали раствором Хенкса (рН 7.4). Режим центрифугирования 10 минут при 400g. Подсчитывали и доводили до рабочей концентрации. Выделение лейкоцитов из периферической крови человека. Для выделения лейкоцитов использовали венозную кровь, взятую как описано выше. Количество используемой крови на одно исследование также составляло 104 от 5 до 10 мл. Кровь наслаивали на равный объем градиента плотности фиколлверографина (удельная плотность 1.199гр\см3) и центрифугировали 40минут при 400g. Взвесь лейкоцитов концентрировалась в интерфазном кольце. Клетки собирали в силиконизированную пробирку и дважды отмывали путем центрифугирования (10минут, 400g), подсчитывали и доводили до рабочей концентрации. Выделение плазмы крови. Для выделения плазмы использовали периферическую венозную кровь, взятую утром натощак в асептических условиях путом пункции локтевой вены. Кровь собирали в стерильные силиконизированные пробирки, содержащие 1.0мл антикоагулянта - раствора гепарина («Richter» Венгрия) (25 единиц на 1.0мл крови). Немедленно перемешивали с антикоагулянтом, не допуская образования воздушных пузырей. Для приготовления плазмы стабилизированную кровь центрифугировали 5-7 минут при 400g и собирали супернатант. Приготовление экстрактов нейтрофилов периферической крови больных и здоровых доноров. К осадку нейтрофилов дважды отмытых в растворе Хенкса добавляли 0.4мл 0.5% тритона Х-100 («Sigma»,USA) и интенсивно перемешивали в течение 1-2 минут. Затем пробирки оставляли на 60 минут при температуре 6-10 0С. К 1 мл лизата добавляли 1.75 ледяной дистиллированной воды и 0.8мл смеси этанол-хлороформ (в отношении 3:5). После интенсивного встряхивания в течение 1 минуты смесь центрифугировали 15 минут при 900g. Каталазную и супероксид дисмутазную активности определяли в прозрачной водно-этаноловой фазе. Определение радикалобразующей способности нейтрофилов. Измерение хемилюминесценции (ХЛ). Для изучения продукции активных кислородных метаболитов традиционно используется хемилюминесцентный анализ [261]. Измерение хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов производили на хемилюминометре ПХЛ-1, а также на LKB Luminometer (model 1251, Sweden) в термостатированных при 37 0 С стеклянных кюветах при постоянном перемешивании. Образец содержал 5х105клеток в 1 мл раствора Хенкса, 2х10 –5 105 люминола (или люцигенина). В качестве показателя степени активации фагоцитов принимали изменение амплитуды ХЛ ответа (I отн.ед.). Индекс предстимуляции иммуноцитокинами рассчитывали как отношение амплитуд ХЛ ответов стимулированных и контрольных клеток. Измерение продукции супероксидрадикала нейтрофилами. Для измерения концентрации супероксидрадикала, генерируемого нейтрофилами, использовали метод, основанный на реакции восстановления супероксидом цитохрома с 262. В работе исследовали спонтанную и индуцированную продукцию супероксидрадикала. В инкубационную смесь объемом 1 мл и содержащую 100 мкл суспензии нейтрофилов (106\мл) в растворе Хенкса (рН 7.4) и 50мкл цитохрома с (12.5мг\мл), добавляли 10мкл ФМА (10-6М). Спонтанную продукцию супероксидного радикала измеряли путем добавления 10мкл диметилсульфоксида (99%) вместо ФМА. Для выяснения вклада в реакцию восстановления цитохрома с именно супероксидного радикала в реакционную смесь добавляли 10 мкл Cu-Zn-СОД (0.5мг\мл). Приготовленные таким образом пробы инкубировали при периодическом перемешивании в течение 1 часа при 37 0С. Затем суспензии центрифугировали 10 минут при 400 g, после чего измеряли оптическое поглощение супернатанта при 550нм (А550) и выражали в нМ/мин, с учетом показателя экстинкции восстановления цитохрома с (ε = 21мМ-1 см-1). Флюоресцентный метод измерения внутриклеточной продукции активных метаболитов кислорода. Внутриклеточную генерацию радикалов исследовали с помощью флуоресцентного красителя гидроэтидина. Гидроэтидин был любезно предоставлен В.И. Адексеевой (НИИ Органических полупродуктов и красителей). Матричные растворы флюорохрома были приготовлены в диметилформамиде и хранились при –180С. Нейтрофилы инкубировали в растворе Хенкса (без фенолового красного, pH 7.4), 15 минут с 10-4 М гидроэтидина, отмывали центрифугированием (5минут при 800g и +40C) в избытке раствора Хенкса и окончательно ресуспендировали до концентрации 106кл\мл. После 106 этого клетки стимулировали форболмиристатацетатом гидроэтидина в (ФМА) клетках 10-5М. Образование регистрировали, измеряя этидиума из интенсивность флуоресценции этидиума при длинах волн возб.=473нм, исп.=610нм на спектрофлуориметре MPF-44 (Perkin-Elmer) в сантиметровых кварцевых кюветах, термостатированных при 37оС и постоянном перемешивании. Для рассчета изменения генерации АФК под действием изучаемых препаратов был введен параметр F: I0-Ik F= ----------------Х100%, где Ik I0-интенсивность люминесценции этидиума в опыте; Ik-интенсивность люминесценции этидиума в контроле. Определение концентрации нитратов-нитритов в плазме крови больных и здоровых доноров. Общую концентрацию нитратов и нитритов в плазме крови больных и здоровых доноров (мкМ) определяли спектрофотометрически с использованием реактива Гриса (Nitrate\Nitrite Colorimetric Assay Kit) (Cayman, USA). Для этого в каждую пробу добавляли разбавленную в два раза буфером (Аssay buffer) плазму крови, и 10мкл энзимного кофактора и 10 мкл нитрат редуктазы. Инкубировали 1 час при комнатной температуре и вносили 50 мкл реактива Гриса R1 и 50 мкл реактива Гриса R2. Инкубировали 10 минут при комнатной температуре, измеряли оптическую плотность при 540нм. Методы определения активности компонентов антиоксидантной системы нейтрофилов и плазмы крови больных и доноров. Определение супероксид дисмутазной активности экстрактов нейтрофилов. Для определения супероксид дисмутазной активности экстрактов нейтрофилов периферической крови у больных и здоровых доноров использовали метод, предложенный A. Misra и I. Fridovich, основанный на образовании адренохрома при автоокислении адреналина 263. Стандартные определения проводили в 3 мл 0.05М Na107 карбонатного буфера (рН 10.2), содержащего 10-4 М ЭДТА («Sigma»,USA), 50 мкл исследуемого образца или раствора коммерческой СОД («Sigma»,USA) в сантиметровой кювете, термостатируемой при 250С. Реакцию начинали добавлением 50 мкл 10-2М раствора адреналина («Sigma»,USA). Пробы непрерывно спектрофотометрировали при 480нм в течении 3 минут при комнатной температуре. Активность СОД (ед.акт.\мг белка) экстрактов нейтрофилов больных и здоровых доноров оценивали по калибровочной кривой, полученной с использованием коммерческого препарата СОД, с учетом разведений всех образцов. Определение каталазной активности экстрактов нейтрофилов периферической крови больных и доноров. \Каталазную активность (ед\г мин) экстрактов нейтрофилов определяли йодометрическим методом 264. К 0.2мл экстрактов нейтрофилов добавляли 1 мл свежеприготовленного 0.0125М раствора Н2О2 и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Реакцию разложения Н2О2 каталазой останавливали добавлением 20мкл 2Н раствора HCl. Затем добавляли 0.5мл свежеприготовленного 0.025М раствора KI, тщательно перемешивали и центрифугировали в течение 15 минут при 3000g после чего измеряли оптическую плотность не позднее чем через 10 минут после центрифугирования. Активность каталазы экстрактов нейтрофилов больных и здоровых доноров оценивали по калибровочной кривой, полученной с использованием коммерческого препарата каталазы («Sigma»,USA). Определение Антиоксидантную антиоксидантной активность плазмы активности крови плазмы определяли по крови. методике Клебанова Г. Для этого 100мкл желточной суспензии добавляли к 100 мкл плазмы и 100 мкл FeSO4, доводя общий объем пробы до 1мл. Смесь инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Затем в пробирку вносили 0.5мл 20% трихлоруксусной кислоты и 0.1мл 10-2М раствора ионола в спирте. Пробы центрифугировали 10 минут при 1500g и отбирают супернатант. К 0.7 мл супернатанта добавляют 0.6мл 0.5% тиобарбитуровой кислоты и грели на водяной бане при 1000С 30 минут, после чего измеряли 108 светопоглощение при А532. Антиоксидантную активность выражали в виде процента от контроля (проба без плазмы): Аопыт – Аопыт спонт. ----------------------------х100%,где Аконтроль-Аконтроль спонт Аопыт - опытная проба Аопыт спонт – опытная проба без FeSO4 Аконтроль – контрольная проба Аконтроль спонт- -контрольная проба без FeSO4. Определение фагоцитарной активности здоровых доноров. Фагоцитарную активность стандартным методом в отношении бактерий нейтрофилов больных и нейтрофилов оценивали Staphylococcus aureus , выделенных у каждого больного [265]. Для этого смешивали 1 мл суспензии нейтрофилов и 1 мл взвеси бактерий (107 кл) в растворе Хенкса (рН 7.4). Смесь инкубировали при помешивании 30 мин при 37 0С. Приготавливали мазки на стекле, фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимзе. В мазках на 100 клеток подситывали количество фагоцитирующих макрофагов. Полученные данные выражали в виде фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа. Определение эффективности внутриклеточного киллинга нейтрофилами бактерий. Оценку эффективности внутриклеточного киллинга оценивали по методу Nilsen 266. После постановки фагоцитарной реакции (см. выше) взвесь центрифугировали 10 минут при 1500g, отбирали осадок, добавляли трехкратный объем Н2О и производили высев по методу Гольда на чашку Петри с мясо-пептонным агаром. Число выживших после фагоцитоза бактерий определяли по количеству колоний в секторах через 24 часа. Статистическая обработка полученных результатов. При математической обработке результатов исследований были использованы следующие методы: расчет средних значений и доверительный интервал, рассчитанные по данным n 109 измерений. Доверительный интервал оценивали с использованием критерия Стъюдента для р<0.05. Статистическую обработку и расчет корреляционного коэффициента проводили с использованием программы Microsoft Excel. 110 Глава 3 Оценка свободно-радикального статуса крови больных со стафилококковой инфекцией разной степени тяжести (локальные инфекции – абсцессы, флегмоны; синдром системного воспалительного ответа (ССВО), тяжелый сепсис) в динамике инфекционного заболевания (1, 2, 5, 7, 10, 14, 30 сутки): определение радикалообразующей активности нейтрофилов (ХЛ), измерение супероксид радикала нейтрофилами (реакция восстановления супероксидом цитохрома с), исследование уровня оксида азота (с помощью реактива Гриса), определение внутриклеточной составляющей красителей, кислородных изучение радикалов активности методом флуоресцентных антиоксидантных ферментов лейкоцитов Исследование фолликулярной и антибактериального свободно-радикального статуса лакунарной Биохимическими и, в ангиной. частности фагоцитов антистафилококкового больных маркерами иммунитета, являются некоторые параметры свободно-радикальных процессов в крови больного, такие как продукция свободных радикалов кислорода и азота фагоцитирующими клетками, активность основных антиокислительных ферментов в лейкоцитах, антиокислительная емкость плазмы. В настоящей части работы изучали свободно-радикальный статус фагоцитов больных инфекционными заболеваниями, вызванными одним возбудителем - S.aureus, но различными по локализации и тяжести течения. В динамике инфекционного процесса оценивали активность параметров свободно-радикального статуса (радикал-формирующую способность нейтрофилов и активность антиоксидантной системы) наряду с оценкой эффективности фагоцитарных функций нейтрофилов больных. Нейтрофилы больных фолликулярной и лакунарной ангиной в острой фазе воспалительного внеклеточно процесса продуцировали (момент значительно поступления превосходящие в стационар) нормальные количества супероксидного анион-радикала и оксида азота (рисунок 1). Об этом 111 судили по степени внеклеточного восстановления белка – цитохрома с, который специфически реагирует с супероксидом, и по суммарному уровню нитратов\нитритов в плазме крови. У больных с лакунарной ангиной оба показателя радикал-формирующей способности нейтрофилов достоверно выше, по сравнению с показателями больных с фолликулярной ангиной (p<0,05), что говорит о большей активности воспалительного процесса в первом случае. К пятому и, особенно к седьмому дню количество супероксидных радикалов понижается, но не сравнивается с показателями здоровых доноров (p<0,01) (таблица 34). Динамика изменений плазменной концентрации нитратов/нитритов совпадает с изменением уровня супероксид аниона в разные периоды инфекционного заболевания. Количество нитратов/нитритов перед выпиской больного из стационара также достоверно выше показателей доноров (р<0,01) (таблица 34). Таким образом, обнаружено, что уровень показателей радикал- формирующей способности нейтрофилов наиболее высокий в остром периоде воспалительного процесса. У больных с лакунарной ангиной в отличие от больных с фолликулярной ангиной параметры свободно-радикального статуса фагоцитов на 7 сутки (перед выпиской) не приходят в норму (р<0,01). Активные формы кислорода (АФК) и оксид азота (NO) являются мощным бактерицидным фактором. Для нас представляло интерес изучение фагоцитарной активности нейтрофилов. Обнаружено, что количество фагоцитирующих клеток и эффективность внутриклеточного киллинга снижены в обеих подгруппах больных по сравнению с здоровыми донорами (р<0,05). Так как свободные радикалы продуцируются благодаря различным ферментным системам и могут генерироваться как внеклеточно, так и внутриклеточно, на следующем этапе мы оценили активность внутриклеточной генерации АФК. Для регистрации внутриклеточной продукции свободных радикалов был использован слабо флуоресцирующий краситель гидроэтидин, который окисляется внутри цитоплазмы перекисью водорода и другими 112 активными формами кислорода, давая при этом сильно флуоресцирующее соединение. Было обнаружено, что доля внутриклеточной концентрации кислородных радикалов значительно снижена в нейтрофилах больных по сравнению со здоровыми донорами (рисунок 2). лакунарная ангина фолликулярная ангина здоровые доноры Рисунок 1- Показатели радикалформирующей способности нейтрофилов больных восстановление ЦХ с, (нМ/мин) количество нитратов/нитритов в плазме крови, (мкМ/мл) фолликулярной и лакунарной ангиной в острой фазе инфекционного процесса. Так как свободные радикалы продуцируются благодаря различным ферментным системам и могут генерироваться как внеклеточно, так и внутриклеточно, на следующем этапе мы оценили активность внутриклеточной генерации АФК. Для регистрации внутриклеточной продукции свободных радикалов был использован слабо флуоресцирующий краситель гидроэтидин, который окисляется внутри цитоплазмы перекисью водорода и другими активными формами кислорода, давая при этом сильно флуоресцирующее соединение. 113 Было обнаружено, что доля внутриклеточной концентрации кислородных радикалов значительно снижена в нейтрофилах больных по сравнению со здоровыми донорами (рисунок 2). Таблица 34 - Радикалообразующая способность нейтрофилов больных с фолликулярной и лакунарной ангиной в динамике инфекционного заболевания (x±m). Нейтрофилы периферическ ой крови Число пациентов Концентрация нитратов и нитритов в 1 мл плазмы, (мкМ) 1 2 5 7 Восстановление цитохрома с, (нМ\мин) 1* 2 5 7 Больные с 6,2 6,0 5,5 2,2 55,0 50,0 35,0 26,0 фолликулярно 40 1 1 1 2 1 1 1,2 ±0,5 ±0,3 ±0,2 ±0,5 ±10,5 ±8,5 ±4,5 ±5,51 й ангиной Больные с 7,5 7,0 5,5 3,5 75,0 55,0 42,0 39,0 лакунарной 35 ±0,51 ±0,31 ±0,11,2 ±0,41,2 ±7,51 ±9,51,2 ±5,51,2 ±4,51,2 ангиной Здоровые 1,3 10,0 30 доноры ±0,5 ±2,5 *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). Особенно заметен спад генерации внутриклеточных радикалов в первые два дня пребывания больных в стационаре (период разгара воспалительного процесса). Как и в случае с исследования внеклеточной генерации радикалов, у больных с лакунарной ангиной показатели изменены сильнее (рис.2). К седьмому дню лечения в стационаре доля внутриклеточных радикалов в нейтрофилах больных лакунарной ангиной ниже нормы на 15%, в нейтрофилах больных с фолликулярной ангиной ниже нормы на 12 %. Из полученных данных мы заключили, что в активной фазе инфекционного процесса в миндалинах происходит мощный выброс радикалов нейтрофилами (продукция супероксиданион радикала, повышенный выброс внеклеточных кислородных радикалов, повышение концентрации нитратов/нитритов в плазме). внутриклеточного уничтожения инфекта. 114 Рисунок 2 - Внутриклеточная продукция активных форм кислорода нейтрофилами больных фолликулярной и лакунарной ангиной в динамике инфекционного процесса, (Rin\RΣ, (%)). Однако при этом смещается равновесие между внеклеточной и внутриклеточной продукцией микробицидных радикалов в сторону внеклеточного выброса, что сказывается на эффективности. С другой стороны, гиперпродукция свободных радикалов во внеклеточное пространство неизбежно должна была привести к адаптационному повышению активности антиоксидантных ферментов и, как результат, к увеличению общей антиоксидантной емкости плазмы крови. Действительно, в группе больных с лакунарной ангиной на пике воспаления (при поступлении в стационар) были обнаружены повышенные по сравнению с нормой показатели активности каталазы и супероксид дисмутазы, также была увеличена антиоксидантная емкость плазмы (таблицы 36,37). На фоне начатого лечения больных с лакунарной ангиной (вторые сутки) активность обоих ферментов и антиокислительная емкость плазмы резко падали ниже уровня нормы. Затем на пятые-седьмые сутки происходила постепенная нормализация всех измеряемых антиоксидантных параметров. Для другой группы больных (с фолликулярной ангиной) не было выявлено достоверного увеличения вышеуказанных показателей. Однако отмечалась характерная динамика антиоксидантов нейтрофилов и плазмы, зависящая от времени пребывания в стационаре (таблицы 35,36). 115 Таблица 35 - Показатели активности антиоксидантных ферментов у больныхс фолликулярной и лакунарной ангиной в динамике инфекционного заболевания (x±m). Число пацие нтов Группа Больные с фолликулярной ангиной Больные с лакунарной ангиной Здоровые доноры Каталаза, ед\г мин СОД, ед\г белка 1* 2 5 7 1 2 5 7 40 3,7 ±0,5 3,4 ±0,3 3,5 ±0,4 3,4 ±0,2 1,3 ±0,1 0,9 ±0,2 1,0 ±0,2 1,3 ±0,1 35 4,31 ±0,1 3,72 ±0,2 3,5 ±0,4 1,51 ±0,1 0,91,2 ±0,1 1,0 ±0,1 1,2 ±0,1 3,11, 2 ±0,1 3,5 1,2 30 ±0,3 ±0,1 *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). - Таблица 36 - Антиоксидантная емкость плазмы крови больных фолликулярной и лакунарной ангиной в динамике инфекционного заболевания (x±m). Группа Число пациентов Антиоксидантная емкость плазмы,% 1* 2 5 7 Больные с фолликулярно 40 58,0±2,5 48,5±1,51 50,0±1,01 57,0±2,5 й ангиной Больные с лакунарной 35 63,5±1,01 45,0±1,01,2 58,0±1,5 55,0±1,0 ангиной Здоровые 30 58,0±1,5 доноры *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). Итак, свободно-радикальный статус больных с ангиной характеризуется повышенным внеклеточным выбросом радикалов в острый период воспалительного процесса, на фоне подъема (в первые сутки), а затем резкого спада активности антиоксидантной системы. Активность антирадикальных ферментов нормализуется к седьмым суткам, в отличие от показателей 116 радикал-формирующей способности нейтрофилов (они остаются слегка повышенными и перед выпиской из стационара). Доля внутриклеточных АФК у больных ангиной в острый период снижена более чем в два раза, что приводит к неэффективному внутриклеточному перевариванию бактерий и является предпосылкой их длительной персистенции в организме. Все исследованные параметры свободно-радикального статуса фагоцитов достоверно больше изменены в группе больных с лакунарной ангиной и являются одними из показателей тяжести течения инфекционного процесса. Изучение свободнорадикального статуса фагоцитов больных с хирургическими инфекциями мягких тканей. Больные с хирургическими инфекциями мягких тканей были разделены на три подгруппы по локализации гнойного процесса и степени тяжести (ягодичные абсцессы, одонтогенные околочелюстные флегмоны, гнойные маститы). Рисунок 3 - Показатели радикалформирующей способности нейтрофилов больныхс флегмонами челюстно-лицевой области. 117 Подгруппа больных с одонтогенными околочелюстными флегмонами. Больные с одонтогенными околочелюстными флегмонами были подразделены в свою очередь на подгруппы в зависимости от глубины поражения мягких тканей: флегмоны одного клетчаточного пространства, двух клетчаточных пространств, трех и более клетчаточных пространств. В зависимости от распространенности гнойно-воспалительного процесса изменялась интенсивность радикалообразования. Впервые сутки наблюдения фагоциты больных продуцировали внеклеточно превышающие норму количества супероксидноганиона-радикала и оксида азота (рисунок 3). Таблица 37 -Радикалообразующая способность нейтрофилов больных с одонтогенными околочелюстными флегмонами в динамике инфекционного процесса (x±m). Нейтрофилы Число периферичес боль кой крови -ных Флегмоны 1 клетчаточного пространств Флегмоны 2 клетчаточных пространств Флегмоны 3 и более клетчаточных пространств Здоровые доноры 32 Восстановление цитохрома с, нМ\мин 1* 2 5 7,5± 0,21 6,5±0 ,11,3 5,8± 0,31,,3 7 14 4,2±0 ,21,3 2,5± 0,42,3 Концентрация нитратов\нитритов в 1мл плазмы, (мкМ) 1* 2 5 7 14 60,0± 2,21 51,0± 6,21 49,0± 5,51 25,0 ±3,0 1,3 15 8,3± 0,21 7,5±0 ,51,4 6,7± 0,31 5,0±0 ,41,3 3,0± 0,21,3 78,±3 ,01 68,±3 ,01,3 70,±1 ,21 40,± 5,51, 3 9 9,0± 0,51 8,7±0 ,21 7,3±0,2 1,3 6,4±0 ,31 4,5± 0,21,4 85,0± 0,51 75,0± 2,51,2 60,0± 0,21,4 37,0 ±6,0 1,3 30 1,3 ±0,5 - - - - 10 ±2,5 - - - 16,0 ±3, 52,4 20, ±2, 21,3 27,0 ±4, 21 - *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01, 2- p<0,05 – относительно показателей здоровых доноров 3p<0,01, 4- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). В группе больных с флегмонами с распространенностью гнойновоспалительного процесса на 3 и более клетчаточных пространства количество супероксид аниона, продуцируемого нейтрофилами и количество нитрат\нитритов в плазме достоверно превосходило таковые значения у больных с флегмонами с распространенностью гнойно-воспалительного процесса на 1 и 2 клетчаточных пространства (р<0,01) (таблица 37). Из 118 полученных данных мы заключили, что в активной фазе гнойно- воспалительного процесса происходит мощный выброс свободных радикалов кислорода и микроорганизмы азота, которые могут инактивировать и уничтожать во внеклеточном пространстве. При этом смещается равновесие вне\внутриклеточная продукция микробицидных радикалов в сторону внеклеточного процесса. В результате образующегося внутриклеточного дефицита радикалов страдает завершенность фагоцитоза и создаются условия для длительной персистенции бактерий внутри фагоцитов. Дисбаланс между вне- и внутриклеточным пулами радикалов более выражен при флегмонах 2 и 3 клетчаточных пространств, что сказывается на активности и эффективности функционирования всей системы неспецифической защиты организма. Рисунок 4 - Внутриклеточная продукция активных форм кислорода нейтрофилами больных с одонтогенными околочелюстными флегмонами в динамике инфекционного процесса, (Rin\RΣ, (%)). Для выявления соотношения в системе «прооксиданты-антиоксиданты», отражающего в конечном итоге степень окислительного стресса и состояние защитных сил организма, исследовали уровень антиоксидантных ферментов лейкоцитов и антиокислительную емкость плазмы крови больных. У пациентов всех подгрупп при поступлении в стационар и после проведения оперативного вмешательства выявлено статистически достоверное увеличение активности каталазы, супероксид дисмутазы (антиоксидантные увеличена антиоксидантная емкость плазмы (таблица 38). 119 ферменты), также Таблица 38 - Показатели антиоксидантной системы у больных с одонтогенными околочелюстными флегмонами (x±m). Показатель Группа Сутки пребывания в стационаре больных 1 2 5 7 14 * Каталаза, ед\г 1 4,5±0,11 3,5±0,1 3,4±0,2 3,2±0,4 3,4±0,3 мин 2 4,8±0,11 3,0±0,11,2 2,9±0,21 3,0±0,21 3,5±0,4 3 4,9±0,21 2,8±0,11,2 2,9±0,11 3,0±0,11 3,0±0,11 СОД, ед в мг 1 2,5±0,21 1,0±0,1 1,2±0,1 1,2±0,2 1,3±0,1 белка 2 2,5±0,31 0,8±0,21,2 1,0±0,2 1,0±0,1 1,2±0,1 3 2,9±0,11 0,7±0,11,2 0,8±0,11 0,8±0,11 0,9±0,11 Антиоксидант 1 60±1,0 55±1,5 57±2,0 54±2,0 57±1,5 ная 2 64±2,01 51±2,01,2 56±1,02 55±1,5 57±1,0 активность 3 67,0±1,5 48,5±1,51,2 50,0±1,0 52,0±1,0 55,0±0,5 1 1 1 1 плазмы, % -1 группа больных с флегмонами 1 клетчаточного пространства; -2 группа больных с флегмонами 2 клетчаточного пространства; 3 группа больных с флегмонами 3 и более клетчаточных пространств 1p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). Контроль 3,5±0,2 1,2±0,1 58,0± 1,5 У больных с флегмонами одного клетчаточного пространства уже на 2 сутки происходила нормализация всех измеряемых показателей антиоксидантной системы. У больных с флегмонами двух, трех и более клетчаточных пространств, несмотря на интенсивно начатое лечение, на вторые сутки активность обоих ферментов и антиоксидантная емкость плазмы резко падали ниже нормального уровня (p<0,01). Затем в группе больных с флегмонами с поражением двух клетчаточных пространств на десятые– четырнадцатые сутки происходила постепенная нормализация всех измеряемых антиоксидантных параметров. В группе больных с поражением трех и более клетчаточных пространств нормализации активности антиоксидантной системы перед выпиской не происходит, хотя отмечается положительная динамика всех показателей (таблица 38). Таким образом, свободно-радикальный статус фагоцитов больных с флегмонами челюстно-лицевой области характеризуется, во-первых, выраженным дефицитом внутриклеточных радикалов, что приводит к неэффективному внутриклеточному киллингу патогенов и, во-вторых, дисбалансом в системе «прооксиданты-антиоксиданты», проявляющимся в 120 сниженном уровне защитных ферментов, наиболее выраженным на 2-5 сутки у больных с флегмонами двух и более клетчаточных пространств. К моменту выписки больных из стационара основные параметры радикал-формирующей способности нейтрофилов остаются повышенными вне зависимости от подгруппы больных. Наиболее угнетены были фагоцитарные и антиоксидантные показатели у больных с трех и более клетчаточными флегмонами, что необходимо учитывать при лечении больных этой подгруппы. Подгруппа больных с ягодичными абсцессами. У больных с ягодичными абсцессами в остром периоде заболевания оба показателя радикало- формирующей способности нейтрофилов поднимаются выше нормы в острый период (p<0,05) (таблица 39). Таблица 39 - Радикалообразующая способность нейтрофилов больных с ягодичными абсцессами в динамике инфекционного процесса (x±m). Нейтрофилы Число периферическо пациентов й крови Восстановление цитохрома с, (нМ\мин) 1* 2 5 7 4,2 3,0 1,5 1,2 ±0,51 ±0,31, ±0,22 ±0,5 Концентрация нитратов и нитритов в 1 мл плазмы, (мкМ) 1 2 5 7 45,0 32,0 25,0 14,0 ±10,5 ±8,51 ±4,51 ±5,5 Больные с 16 ягодичными 2 1 абсцессами Здоровые 30 1,3 10,0 доноры ±0,5 ±2,5 *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). - Рисунок 5 - Внутриклеточная продукция активных форм кислорода нейтрофилами больных с хирургическими инфекциями мягких тканей, (Rin\RΣ, (%)). 121 К пятому и особенно к седьмому дню количество супероксидных радикалов понижается и сравнивается с показателями здоровых доноров (р<0,05). Динамика изменений плазменной концентрации нитратов/нитритов совпадает с изменением уровня супероксид аниона в разные периоды инфекционного заболевания. Количество нитратов/нитритов перед выпиской больного из стационара также близко к показателям доноров (таблица 39). Таблица 40 - Показатели активности антиоксидантных ферментов у больных с ягодичными абсцессами в динамике инфекционного процесса, (x±m). Число пациент ов Группа Каталаза, ед\г мин 1 2 5 СОД, ед\г белка 7 1 2 5 7 Больные с 3,9 3,6 3,5 3,4 1,3 1,2 1,2 ягодичными 16 ±0,5 ±0,3 ±0,4 ±0,2 ±0,1 ±0,2 ±0,2 абсцессами Здоровые 3,5 1,2 30 доноры ±0,5 ±0,1 1p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров, 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 1,3 ±0,1 - Таблица 41 - Антиоксидантная емкость плазмы крови больных с ягодичными абсцессами в динамике инфекционного процесса (x±m). Группа Больные с ягодичными абсцессами Антиоксидантная емкость плазмы,% Число пациентов 1* 2 5 7 16 62,0±2,5 56,5±1,5 2 57,0±1,0 57,0±2,5 Здоровые доноры 30 58,0±1,5 * - дни пребывания в стационаре 1p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). При исследовании внутриклеточной концентрации - кислородных радикалов обнаружено, что и в группе больных с ягодичными абсцессами доля внутриклеточных радикалов снижена в нейтрофилах больных по сравнению со 122 здоровыми. Особенно заметен спад генерации внутриклеточных радикалов в течение первых двух дней пребывания больных в стационаре (период разгара воспалительного процесса). К седьмым суткам доля внутриклеточных АФК нормализуется (рисунок 5). Параметры активности антиоксидантной системы в первые сутки выше нормы (p<0,05), однако, последующего спада активности антиоксидантной системы не наблюдалось. Активность каталазы, супероксиддисмутазы приходят в норму уже на вторые сутки, в этот же период нормализуется антиокислительная емкость плазмы крови (таблицы 40,41). Итак, свободно-радикальный статус фагоцитов больных с ягодичными абсцессами характеризуется компенсированной реакцией организма на бактериальное раздражение: повышенный внеклеточный выброс радикалов в острый период воспалительного процесса происходит на фоне адаптационного подъема (в первые сутки) активности антиоксидантной системы, уровень которых нормализуется уже ко вторым суткам. Продукция супероксиданион радикала нейтрофилами и концентрация нитрат\нитритов в плазме крови приходят в норму на 7 сутки. Доля внутриклеточных АФК у больных этой подгруппы снижена более чем в два раза в острый период, но имеет положительную динамику и нормализуется к седьмым суткам. Подгруппа больных с гнойными маститами. Таблица 42 - Радикалообразующая способность нейтрофилов больных с гнойными маститами в динамике инфекционного процесса (x±m). Нейтрофил ы перифериче ской крови Больные с гнойными маститами Число пацие нтов Восстановление цитохрома с, нМ\мин 18 1* 9,3± 0,51 2 8,9± 0,21 5 7 7,5± 6,8 0,21,3 ± 0,3 1,4 14 4,5± 0,21, 4 Концентрация нитратов\нитритов в 1мл плазмы, (мкМ) 1* 2 5 7 95,0 85,4 64,7 45,2 ± ± ± ± 0,51 2,51,3 3,51,3 6,01,4 14 37,6 ± 2,51 Здоровые 30 1,3 10,0 доноры ±0,5 ±2,5 *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01, 2- p<0,05 – относительно показателей здоровых доноров 3p<0,01, 4- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 123 При исследовании подгруппы больных с гнойными маститами оценивали активность радикал-формируюшей активности нейтрофилов, как показатель интенсивности воспалительного процесса Количество супероксидного радикала внеклеточно секретируемого нейтрофилами в острый период инфекционного процесса увеличено по сравнению с нормой более чем в 9 раз (таблица 42). Плазменная концентрация нитратов\нитритов, как показатель содержания оксида азота увеличена более чем в 8 раз. В ходе стационарного лечения происходит снижение обеих величин радикалоообразования в организме больных, но и перед выпиской параметры остаются повышенными (p<0,01). Количество внутриклеточно генерируемых радикалов снижено во все периоды болезни, перед выпиской также не приходит в норму (p<0,01). В ответ на повышенное образование радикалов в первые сутки заболевания активности (на пике каталазы, воспалительного процесса) супероксиддисмутазы, и происходит суммарного подъем показателя активности антиоксидантной системы – антиокислительной емкости плазмы. Однако на вторые сутки обнаружен спад активности всех параметров антиоксидантной системы (таблица 43). Нормализации этих показателей к моменту выписки не происходит. Таблица 43 - Показатели антиоксидантной системы у больных с гнойными маститами (x±m). Показатель Число больных 18 Сутки пребывания в стационаре 2 5 7 14 2,5±0,11,3 2,6±0,21 2,9±0,11 3,0±0,12 Контроль (доноры) 3,5±0,2 1 Каталаза, 4,9±0,21 ед\г мин СОД, ед в мг 18 2,9±0,11 0,7±0,11,3 0,8±0,11 0,8±0,11 0,9±0,11 1,2±0,1 белка Антиоксида 18 67,0±1, 43,5±1,51 48,0±1,01 51,0±1,01 53,0±1, 58,0±1,5 ,3 ,4 ,4 нтная 51 51 активность плазмы, % *- дни пребывания в стационаре, 1-p<0,01, 2- p<0,05 – относительно показателей здоровых доноров 3p<0,01, 4- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 124 Таким образом, при исследовании свободно-радикального статуса фагоцитов больных с гнойными лактационными маститами обнаружено изменение уровня всех показателей: снижение активности антиоксидантной системы, фагоцитарной функции нейтрофилов на фоне вдвое сниженной величины внутриклеточной генерации радикалов. На 14 сутки нормализации ни одного из исследованных показателей не происходит. Свободнорадикальный статус фагоцитов больных с генерализованной стафилококковой инфекцией. Больные были разделены на две подгруппы согласно классификации Bone [267,268]. Состояние больных первой подгруппы оценивалось как синдром системного воспалительного ответа (сепсис, ССВО), состояние пациентов второй подгруппы расценивалось как тяжелый сепсис (при присоединении к синдрому системного воспалительного ответа органных дисфункций (см. характеристику больных)). Генерация радикалов фагоцитарными клетками играет защитную роль и направлена на уничтожение инфекционного агента и, как правило, повышается в острую фазу воспаления 269]. Действительно, в обеих подгруппах больных с генерализованной стафилококковой инфекцией, выявлено, что нейтрофилы в подгруппе больных с сепсисом продуцируют более чем в двенадцать раз превосходящие нормальные количества супероксидного аниона, в подгруппе больных с тяжелым сепсисом количество продуцируемого супероксид аниона превосходит нормальный показатель более чем в 15 раз. Уровень нитратов и нитритов в плазме крови выше нормы в 15 (подгруппа больных с сепсисом) и в 18 раз (подгруппа больных с тяжелым сепсисом) (р<0,001) (таблица 44). При сравнении показателей активности радикалформирующей способности нейтрофилов больных разных подгрупп обнаружено, что продукция супероксиданион радикала и оксида азота во второй подгруппе (тяжелый сепсис) достоверно выше (р<0,01). 125 Таблица 44 - Радикалообразующая способность нейтрофилов больных с генерализованной стафилококковой инфекцией в динамике инфекционного процесса (x±m). Нейтрофилы периферической крови Больные с ССВО Больные тяжелым сепсисом Здоровые доноры Число больных 15 Восстановление цитохрома с, (нМ\мин) 1 12,2 0,31 с 10 15 2 7 12,0 9,3 1 0,4 0,31,3 14 7,2 0,11,, 3 15,5 0,51 13,5 0, 21,3 11,5 0,11 9,5 0,21 ,4 ,,4 1,3 0,5 - - - Концентрация нитратов и нитритов в 1 мл плазмы, (мкМ) 30 1 2 7 14 30 5,1 0,31,3 150,0 10,01 125,0 13,01,3 112,0 11,01 79,0 7,01,3 50,0 14,01,4 6,3 0,31,,3 180,0 10,01 142,0 10,01,3 120,0 13,01 90,0 10,01,4 65,0 10,01,3 - 10,0 3,0 - - - - *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01, 2- p<0,05 – относительно показателей здоровых доноров 3p<0,01, 4- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 126 К седьмому-четырнадцатому дню показатели активности свободнорадикальных процессов у больных с сепсисом и тяжелым сепсисом снижаются только на 47% и 39%, соответственно. К тридцатому дню происходит: они остаются повышенными на 25% и 32% соответственно. Рисунок 6 - Внутриклеточная продукция активных форм кислорода нейтрофилами больных с генерализованной стафилококковой инфекцией в динамике инфекционного процесса, (Rin\RΣ, (%)). Таблица 45 - Показатели активности супероксид дисмутазы (ед/мг), каталазы (ед/г.мин) лейкоцитов и антиокислительной активности плазмы крови (%) у больных с генерализованной стафилококковой инфекцией (Xm). Показатель Группа больных 1 2 7 14 сутки пребывания в стационаре Каталаза, ед\г мин 30 Конт -роль 7,8 1,6 1,8 2,3 2,9 3,5 Сепсис 1 1 1,3 1 1,4 1,3 подгруппа 0,3 0,1 0,1 0,2 0,2 0,5 1,5 1,2 1,4 1,9 1,5 Сепсис 2 подгруппа 0,11 0,11,3 0,31 0,21 0,11 СОД, ед в 3,6 0,7 0,8 1,0 1,0 Сепсис 1 1,2 1 1,3 1 1 мг белка подгруппа 0,2 0,1 0,1 0,2 0,11 0,1 0,9 0,8 0,8 0,9 0,9 Сепсис 2 подгруппа 0,11 0,31 0,11 0,11 0,11 Антиокси79,0 41,5 43,0 44,0 50,0 Сепсис 1 1 1,3 1 1 дантная подгруппа 58,0 1,5 1,5 1,0 1,5 1,51,4 активность 30,0 26,5 23,0 27,5 30,0 1,5 Сепсис 2 плазмы, % подгруппа 5,51 5,01 5,51 5,51 5,51 *- дни пребывания в стационаре, 1-p<0,01, 2- p<0,05 – относительно показателей здоровых доноров 3p<0,01, 4- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 127 В острый период инфекционного процесса доля АФК, генерируемых внутриклеточно, у больных сепсисом составляет всего 2,9±0,5%, у больных с тяжелым сепсисом -2,5±0,5%, при показателе здоровых доноров - 35,5±1,5%. Подтверждением развивающегося оксидативного стресса у больных с генерализованной стафилококковой инфекцией служит изменение уровня антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксид дисмутазы). В первой подгруппе больных с генерализованной стафилококковой инфекцией на пике воспаления (при поступлении в стационар) были обнаружены повышенные по сравнению с нормой показатели активности КАТ и СОД, была увеличена также антиоксидантная емкость плазмы (таблица 45). На фоне интенсивно начатого лечения (вторые сутки) активность КАТ, СОД и антиоксидантная емкость плазмы больных с сепсисом резко падали ниже нормального уровня (р<0,01). Затем на пятые, седьмые и на четырнадцатые сутки происходило постепенное увеличение всех измеряемых антиоксидантных параметров, но к 30 суткам ни один из показателей состояния антиоксидантной системы не достигает нормальной величины (р<0,01). Обращают на себя внимание результаты, полученные при оценке антиоксидантных показателей больных с тяжелым сепсисом - резкий спад активности антирадикальной системы обнаружен уже при поступлении в стационар, что говорит о дисбалансе и декомпенсации защитных сил организма (р<0,01). Подобный спад активности антиоксидантной системы в острый период заболевания может быть рассмотрен как один из прогностических признаков особо тяжелого течения генерализованной инфекции. Повышенное образование внеклеточных радикалов сочетается со значительно сниженным внутриклеточным содержанием активных метаболитов кислорода и сниженной общей антиоксидантной емкостью организма, что приводит к неэффективному фагоцитозу стафилококков и повреждению собственных органов и тканей радикалами. На основании всего выше описанного следует, что у больных с различными формами генерализованной инфекции формируются глубокие сдвиги в метаболических процессах 128 организма, сопровождающиеся нарушением функционирования всех его защитных систем, включая фагоцитарную и антиоксидантную. Таким образом, стафилококковая инфекция, в особенности ее генерализованная форма, приводит к значительному дисбалансу свободных радикалов и их ингибиторов в крови. Более того, направление продукции свободных радикалов нейтрофилами становится преимущественно внеклеточным, что не способствует внутриклеточному киллингу, но приводит к воспалительному свободно-радикальному поражению клеток и тканей организма хозяина. Некоторые изменения параметров активности антиоксидантной системы (отсутствие подъема значений каталазы, супероксид дисмутазы и антиокислительной емкости плазмы в острый период) могут служить прогностическими критериями особо тяжелого течения гнойновоспалительного процесса. Подобное нарушение равновесия в системе «прооксиданты-антиоксиданты» необходимо учитывать и корректировать при проведении лечебных мероприятий и профилактике различных формах стафилококковой инфекции. 129 осложнений при Глава 4 Создание модели для поиска нарушения механизмов антимикробной защиты микроорганизма, основанной на изучении взаимодействия нейтрофилов и бактерий выделенных у одного пациента Для поиска индивидуальных причин нарушения механизмов врожденного иммунитета была создана модель in vitro, иммитирующая процесс фагоцитоза у исследуемых пациентов. Для чего из периферической крови выделялись нейтрофилы, для выделения бактериальных штаммов использовался различных материал в зависимости от локализации гнойного процесса (кровь, гнойное отделяемое, содержимое лакун миндалин, пунктат). Схематично модель для поиска нарушения механизмов фагоцитоза изображена на схеме 1. Выделенный от пациента штамм Нейтрофилы Оценка радикалпродуц ирующей активности нейтрофилов пациента фагоцитоз Определение выраженности факторов персистенции бактериального штамма Определение: 1.Эффективности внутриклеточного киллинга 2.Фагоцитарного индекса 3.Фагоцитарного числа Схема 1 - Модель для поиска нарушения механизмов фагоцитоза. 130 Глава 5 Оценка изменения эффективности фагоцитарных функций в динамике инфекционного заболевания в разные сроки инфекционного заболевания на фоне проводимой стандартной комплексной терапии При сравнении фагоцитарных показателей больных разных групп выявлено, что эти параметры неспецифического иммунитета достоверно ниже (р<0,05) (таблицы 46-50). Показатели фагоцитоза имели положительную динамику и к периоду реконвалесценции в группах больных с одонтогенными флегмонами 2 клетчаточного пространства, пациентов с ягодичными абсцессами были близки к норме. Таблица 46 - Фагоцитарная активность нейтрофилов больных с фолликулярной и лакунарной ангиной в динамике инфекционного заболевания (x±m). Нейтрофилы периферическо й крови Число пациентов % фагоцитировавших клеток 1* 2 5 7 % выживиших бактерий после фагоцитоза 1 2 5 7 Больные с 29,01 29,51 30,01 36,02 15,51 13,51 9,51 фолликулярно 40 ±1,0 ±1,5 ±2,0 ±1,0 ±1,0 ±1,0 ±1,0 й ангиной Больные с 24,01 29,01,2 29,01 34,02 17,51 15,51 10,51 лакунарной 35 ±1,5 ±1,5 ±2,0 ±2,0 ±0,7 ±1,0 ±1,0 ангиной Здоровые 38,0 5,0 30 доноры ±2,0 ±1,5 *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 7,52 ±0,5 8,5 ±1,0 - В группах больных с более тяжелыми распространенными гнойными заболеваниями эффективность внутриклеточного киллинга достоверно ниже нормы (р<0,05) (таблицы 46-50). Так как радикалы, продуцируемые нейтрофилами являются одним из основных механизмов борьбы с патогенами, представляло интерес изучение эффективности фагоцитоза. Обнаружено, что, несмотря на высокий уровень продукции супероксида нейтрофилами и высокое содержание оксида азота в плазме крови больных в острый период болезни, количество фагоцитирующих клеток и эффективность внутриклеточного 131 киллинга значительно снижены, особенно в группах больных с более глубокой распространенностью гнойно-воспалительного процесса (таблицы 46-50). При поиске причин функциональной недостаточности нейтрофилов было изучено распределение радикалов вне- и внутри клетки. Доля внутриклеточных активных форм кислорода оказалась снижена в нейтрофилах больных по сравнению со здоровыми (рисунок 4) (p<0,05). Таблица 47 - Фагоцитарные показатели нейтрофилов периферической крови больных с одонтогенными околочелюстными флегмонами (x±m). Нейтрофилы периферическо й крови Чис ло боль ных % фагоцитирующих клеток 1* 2 5 7 % выживших бактерий после фагоцитоза 14 1* 2 5 7 14 Флегмоны 1 30,5 32,0 35,0 17,0 13,0 8,5 35,0 37,0 11,0 6,0 клетчаточного 32 ±1,5 ±1,2 ±1,5 ±1,5 ±1,51 ±1,5 ±3,0 ±1,0 ±1,01 ±1,0 1 1 2 1 ,3 1 пространства Флегмоны 2 27,0 27,5 29,0 30,0 20,0 9,5 8,0 29,5 14,0 13,0 клетчаточных 15 ±1,0 ±1,3 ±1,5 ±1,0 ±1,0 ±1,0 ±1,5 1 1 1 ±2,0 ±1,0 ±1,5 1 1 1 1 1 1 1 пространств Флегмоны 3 и 21,0 22,5 24,0 27,4 28,0 24,0 16,0 13,5 10,0 более 22,0 9 ±2,0 ±2,0 ±1,0 ±1,51 ±1,0 ±3,0 ±1,01 ±1,6 ±1,5 1 клетчаточных ±1,5 1 1 1 ,4 1 1 ,3 1 1 пространств Здоровые 38,0 5,0 30 доноры ±2,5 ±0,6 *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01, 2- p<0,05 – относительно показателей здоровых доноров 3p<0,01, 4- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). Таблица 48 - Фагоцитарная активность нейтрофилов больных с ягодичными абсцессами в динамике инфекционного процесса (x±m). Нейтрофилы периферическо й крови Число пациентов % фагоцитировавших клеток 1* 2 5 7 % выживиших бактерий после фагоцитоза 1 2 5 7 Больные с 16 33,0 34,5 36,0 38,0 13,51 11,51 6,0 5,5 ягодичными ±1,01 ±1,5 ±2,0 ±1,0 ±1,0 ±1,0 ±1,02 ±0,5 абсцессами Здоровые 38,0 5,0 30 доноры ±2,0 ±0,6 *- дни пребывания в стационаре, 1-p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 132 Таблица 49 - Фагоцитарные показатели нейтрофилов периферической крови больных с гнойными маститами (x±m). Нейтрофилы Число периферическ пациентов ой крови Больные с гнойными маститами Здоровые доноры 9 30 % фагоцитирующих клеток % выживших бактерий после фагоцитоза 1* 2 5 7 14 1* 2 5 7 22,0 ±2,0 23,5 ±2,0 24,5 ±1,0 27,4 ±1,5 29,0 ±1,0 1 1 1 1 1 1 3 4 1 38,0 ±2,5 - - - - 5,0 ±0,6 - - - 29,0 21,0 17,0 12,5 ±3,0 ±1,51, ±1,01, ±1,6 14 12 ,0 ±1 ,51 - *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01, 2- p<0,05 – относительно показателей здоровых доноров 3p<0,01, 4- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). При генерализованной инфекции процент выживших бактерий после фагоцитоза в обеих группах схож: каждый четвертый-пятый микроорганизм продолжает персистировать внутриклеточно, защищенный от сывороточных бактерицидных компонентов крови человека (таблица 50). Несмотря на выявленную положительную динамику фагоцитарных параметров (% фагоцитирующих клеток и % бактерий, выживших после фагоцитоза), к 30 суткам нормализации измеряемых показателей не происходит (p<0.05) (таблица 50). Полученные результаты позволяют предположить, что снижена эффективность именно внутриклеточных бактерицидных механизмов. Известно, что процесс внутриклеточного уничтожения бактерий определяется кооперативным действием как лизосомальных ферментов, так и внутриклеточно генерируемых радикалов. В нейтрофилах больных генерализованной стафилококковой инфекции (в обеих подгруппах) доля внутриклеточных активных форм кислорода оказалась значительно снижена (рисунок 6). 133 Таблица 50 - Фагоцитарные показатели нейтрофилов периферической крови больных с генерализованной стафилококовой инфекцией (Xm). Нейтрофил % фагоцитирующих Число ы клеток пациен периферичес -тов 1* 2 7 14 30 кой крови Больные с 27,5 27,0 28,0 29,5 30,0 ССВО 15 ±1,5 ±0,2 ±0,51, ±2,0 ±1,0 Больные тяжелым сепсисом Доноры 10 1 1 19,0 ±1,0 21,5 ±1,3 1 4 24,0 ±1,51 1 1 1 27,5 ±2,0 29,0 ±1,0 1 1 % выживших бактерий после фагоцитоза 1* 2 7 14 30 12,5 ±1,5 10,0 ±1,0 27,0 22,0 17,0 14,5 ±1,0 ±1,01, ±1,51, ±1,0 12,0 ±1,5 20,0 16,0 ±1,5 ±1,51, 1 4 1 15,0 ±1,01 3 3 1 1 1 1 38,0 5,0 ±1,5 ±0,5 *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01, 2- p<0,05 – относительно показателей здоровых доноров 3p<0,01, 4- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 15 Таблица 51 - Показатели активности антиоксидантных ферментов у больных с фолликулярной и лакунарной ангиной в динамике инфекционного заболевания (x±m). Группа Больные с фолликулярной ангиной Больные с лакунарной ангиной Здоровые доноры Число пациен тов 40 Каталаза, ед\г мин СОД, ед\г белка 1* 2 5 7 1 2 5 7 3,7 ±0,5 3,4 ±0,3 3,5 ±0,4 3,4 ±0,2 1,3 ±0,1 0,9 ±0,2 1,0 ±0,2 1,3 ±0,1 4,31 3,11,2 3,72 3,5 1,51 0,91,2 1,0 1,2 ±0,1 ±0,1 ±0,2 ±0,4 ±0,1 ±0,1 ±0,1 ±0,1 3,5 1,2 30 ±0,3 ±0,1 *- дни пребывания в стационаре,1-p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 35 134 Глава 6 Изучение активности супероксид дисмутазы (СОД) и каталазы в экстрактах лейкоцитов, суммарной антиоксидантной активности плазмы крови Для выявления соотношения в системе «прооксиданты-антиоксиданты», отражающего в конечном итоге степень окислительного стресса и состояние защитных сил организма, исследовали уровень антиоксидантных ферментов лейкоцитов и антиокислительную емкость плазмы крови больных. У пациентов всех подгрупп с локальными инфекционными заболеваниями при поступлении в стационар и после проведения оперативного вмешательства выявлено статистически достоверное увеличение активности каталазы, супероксид дисмутазы (антиоксидантные ферменты), также увеличена антиоксидантная емкость плазмы. У больных с флегмонами одного клетчаточного пространства и абсцессами уже на 2 сутки происходила нормализация всех измеряемых показателей антиоксидантной системы. У больных с флегмонами двух, трех и более клетчаточных пространств, пациентов с фолиикулярной и лакунарной ангинами несмотря на интенсивно начатое лечение, на вторые сутки активность обоих ферментов и антиоксидантная емкость плазмы резко падали ниже нормального уровня (p<0,01). Нормализации активности антиоксидантной системы при локальной инфекции перед выпиской не происходит в группах пациентов с лакунарными ангинами с разлитыми флегмонами челюстно-лицевой области, хотя отмечается положительная динамика всех показателей (таблицы 51-56). Подтверждением развивающегося оксидативного стресса у больных с генерализованной стафилококковой инфекцией служит изменение уровня антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксид дисмутазы). В первой подгруппе больных с генерализованной стафилококковой инфекцией на пике воспаления (при поступлении в стационар) были 135 обнаружены повышенные по сравнению с нормой показатели активности КАТ и СОД, была увеличена также антиоксидантная емкость плазмы (таблица 57). Таблица 52 - Антиоксидантная емкость плазмы крови больных фолликулярной и лакунарной ангиной в динамике инфекционного заболевания (x±m). группа Антиоксидантная емкость плазмы,% Число пациентов 1* 2 5 7 40 58,0±2,5 48,5±1,51 50,0±1,01 57,0±2,5 35 63,5±1,01 45,0±1,01,2 58,0±1,5 55,0±1,0 30 58,0±1,5 - - - Больные с фолликулярно й ангиной Больные с лакунарной ангиной Здоровые доноры *- дни пребывания в стационаре 1p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). Таблица 53 - Показатели антиоксидантной системы у больных с одонтогенными околочелюстными флегмонами (x±m). Показатель Каталаза, ед\г мин СОД, ед в мг белка Антиоксидантна я активность плазмы, % Сутки пребывания в стационаре Группа больных * 1 2 5 7 14 1 2 3 4,5±0,11 4,8±0,11 4,9±0,21 3,5±0,1 3,0±0,11,2 2,8±0,11,2 3,4±0,2 2,9±0,21 2,9±0,11 3,2±0,4 3,0±0,21 3,0±0,11 3,4±0,3 3,5±0,4 3,0±0,11 3,5±0, 2 1 2 3 2,5±0,21 2,5±0,31 2,9±0,11 1,0±0,1 0,8±0,21,2 0,7±0,11,2 1,2±0,1 1,0±0,2 0,8±0,11 1,2±0,2 1,0±0,1 0,8±0,11 1,3±0,1 1,2±0,1 0,9±0,11 1,2±0, 1 1 2 3 60±1,0 64±2,01 67,0±1,5 55±1,5 51±2,01,2 48,5±1,51, 57±2,0 56±1,02 50,0±1,0 54±2,0 55±1,5 52,0±1,0 57±1,5 57±1,0 55,0±0,5 58,0± 1,5 1 2 1 1 1 группа больных с флегмонами 1 клетчаточного пространства; 2 группа больных с флегмонами 2 клетчаточного пространства; 3 группа больных с флегмонами 3 и более клетчаточных пространств 1p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 136 1 Контроль Таблица 54 - Показатели активности антиоксидантных ферментов у больных с ягодичными абсцессами в динамике инфекционного процесса, (x±m). Число пациент ов Группа Каталаза, ед\г мин 1 2 5 СОД, ед\г белка 7 1 2 5 7 Больные с 3,9 3,6 3,5 3,4 1,3 1,2 1,2 ягодичными 16 ±0,5 ±0,3 ±0,4 ±0,2 ±0,1 ±0,2 ±0,2 абсцессами Здоровые 3,5 1,2 30 доноры ±0,5 ±0,1 1p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров, 2p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 1,3 ±0,1 - Таблица 55 - Антиоксидантная емкость плазмы крови больных с ягодичными абсцессами в динамике инфекционного процесса (x±m). Группа Число пациентов Больные ягодичными абсцессами с 16 Антиоксидантная емкость плазмы,% 1* 2 5 7 62,0±2,5 56,5±1,5 2 57,0±1,0 57,0±2,5 Здоровые доноры 30 58,0±1,5 * - дни пребывания в стационаре 1p<0,01 – относительно показателей здоровых донор 2- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). Таблица 56 - Показатели антиоксидантной системы у больных с гнойными маститами (x±m). Показатель Число больных Каталаза, ед\г мин 18 СОД, ед в мг белка 18 1 4,9±0,2 1 2,9±0,1 1 Сутки пребывания в стационаре 2 5 7 14 2,5±0,11,3 2,6±0,21 2,9±0,11 3,0±0,1 0,7±0,11,3 0,8±0,11 0,8±0,11 0,9±0,1 2 1 Контроль (доноры) 3,5±0,2 1,2±0,1 Антиоксидант ная 18 67,0±1, 43,5±1,51 48,0±1,01 51,0±1,01 53,0±1, 58,0±1,5 ,3 ,4 ,4 активность 51 51 плазмы, % *- дни пребывания в стационаре, 1-p<0,01, 2- p<0,05 – относительно показателей здоровых доноров 3p<0,01, 4- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). 137 На фоне интенсивно начатого лечения (вторые сутки) активность КАТ, СОД и антиоксидантная емкость плазмы больных с сепсисом резко падали ниже нормального уровня (р<0,01). Затем на пятые, седьмые и на четырнадцатые сутки происходило постепенное увеличение всех измеряемых антиоксидантных параметров, но к 30 суткам ни один из показателей состояния антиоксидантной системы не достигает нормальной величины (р<0,01). Обращают на себя внимание результаты, полученные при оценке антиоксидантных показателей больных с тяжелым сепсисом - резкий спад активности антирадикальной системы обнаружен уже при поступлении в стационар, что говорит о дисбалансе и декомпенсации защитных сил организма (р<0,01). Таблица 57 - Показатели активности супероксид дисмутазы (ед/мг), каталазы (ед/г.мин) лейкоцитов и антиокислительной активности плазмы крови (%) у больных с генерализованной стафилококковой инфекцией (Xm). Показатель Каталаза, ед\г мин СОД, ед в мг белка Антиоксидантная активность плазмы, % Группа больных 1 Сепсис 1 подгруппа Сепсис 2 подгруппа Сепсис 1 подгруппа Сепсис 2 подгруппа Сепсис 1 подгруппа Сепсис 2 подгруппа 7,8 0,31 1,5 0,11 3,6 0,21 0,9 0,11 79,0 1,51 30,0 5,51 2 7 30 Конт -роль 2,9 0,21,3 1,5 0,11 1,0 0,11 0,9 0,11 50,0 1,51,4 30,0 5,51 3,5 0,5 14 сутки пребывания в стационаре 1,6 0,11,3 1,2 0,11,3 0,7 0,11,3 0,8 0,31 41,5 1,51,3 26,5 5,01 1,8 0,11 1,4 0,31 0,8 0,11 0,8 0,11 43,0 1,01 23,0 5,51 2,3 0,21,4 1,9 0,21 1,0 0,21 0,9 0,11 44,0 1,51 27,5 5,51 1,2 0,1 58,0 1,5 *- дни пребывания в стационаре, 1-p<0,01, 2- p<0,05 – относительно показателей здоровых доноров 3- p<0,01, 4- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки). Подобный спад активности антиоксидантной системы в острый период заболевания может быть рассмотрен как один из прогностических признаков особо тяжелого течения генерализованной инфекции. 138 Глава 7 Разработка клинических карт пациентов со стафилококковой инфекцией разной степени тяжести Для более полного учета изменения клинических показателей в динамике заболевания различной локализации были разработаны и апробированы клинические карты, использованные для учета статистически обработанной информации в главе 2. Примеры клинических карт. Таблица 58 - Частота основных объективных симптомов у больных ангинами в динамике инфекционного процесса (%). Больные с Больные с лакунарной фолликулярной ангиной ангиной Сутки пребывания в стационаре Показатель 1 2 Данные объективного исследования больного: Размер миндалин: Увеличение 1 степени Увеличение 2 степени Увеличение 3 степени Выраженность отека дужек, язычка: Слабовыраженный Умеренный Интенсивный Гиперемия ротовой части глотки, миндалин: Незначительная Умеренная Выраженная Гнойный налет в криптах: Содержимое лакун: Слизистое\отсутствует Слизисто-гнойное Наличие казеозных пробок Показатели состояния сердечнососудистой системы: Тахикардия Приглушенность или ослабление сердечных тонов Гипотония Регионарной лимфаденит Спленомегалия Гепатомегалия Дизурия 139 5 7 1 2 5 7 Таблица 59 - Частота основных объективных симптомов у больных с одонтогенными флегмонами челюстно-лицевой области в динамике в инфекционного процесса (%). Сутки пребывания в стационаре Показатель 1 2 5 7 14 Данные объективного исследования больного: Выраженность гноетечения: Слабовыраженное Умеренное Обильное Выраженность отека: Слабовыраженный Умеренный Интенсивный Гиперемия: Незначительная Умеренная Выраженная Размеры инфильтрата*: Незначительные Умеренные Выраженные Показатели ранозаживления: Очищение раны от некротизированных тканей Грануляция раны Эпителизация раны Регионарный лифмаденит: * - размеры инфильтрата считались незначительными – <10mm умеренными – 10-25mm выраженными - >25mm. Таблица 60 - Частота основных объективных симптомов у больных с постинъекционными ягодичными абсцессами в динамике в инфекционного процесса (%). Сутки пребывания в стационаре Показатель 1 2 Данные объективного исследования больного: Выраженность гноетечения: Слабовыраженное Умеренное Обильное 140 5 7 Выраженность отека: Слабовыраженный Умеренный Интенсивный Гиперемия: Незначительная Умеренная Выраженная Размеры инфильтрата: Незначительные Умеренные Выраженные Показатели ранозаживления: Очищение раны от некротизированных тканей Грануляция раны Эпителизация раны Регтонарный лимфаденит Таблица 61 - Частота основных объективных симптомов у больных с лактациоными маститами в динамике инфекционного процесса (%). Сутки пребывания в стационаре Показатель 1 2 Данные объективного исследования больного: Выраженность гноетечения: Слабовыраженное Умеренное Обильное Выраженность отека: Слабовыраженный Умеренный Интенсивный Гиперемия: Незначительная Умеренная Выраженная Размеры инфильтрата: Незначительные Умеренные Выраженные Показатели ранозаживления: Очищение раны от некротизированных тканей Грануляция раны Эпителизация раны Регионарный лимфаденит 141 5 7 10 Таблица 62 - Частота основных объективных симптомов у больных с системной воспалительной реакцией в динамике инфекционного процесса (%). Сутки пребывания в стационаре Показатель 1 2 Данные объективного исследования больного: Бледность кожных покровов Сыпь Лимфаденит Тахикардия Брадикардия Гипотония Гипертония Приглушенность сердечных тонов Систолический шум Расширение границ сердца Везикулярное дыхание Жесткое дыхание Хрипы: Сухие Влажные Притупление сравнительной перкуссии при сравнительной перкуссии легких Тахипноэ Брадипноэ Болезненность при пальпации живота Симптомы раздражения брюшины Вздутие живота Спленомегалия Гепатомегалия Положительный симптом Пастернацкого Дизурия Периферические отеки Диарея Лихорадка: 37.1-38.00С 38.1-39.0 0С 39.1-40.00С выше 40.10С Состояние ЦНС: В полном сознании Спутанное сознание 142 7 14 30 Заключение Исследование свободно-радикального статуса фагоцитов при бактериальной, и, в частности, при стафилококковой инфекции, имеет особое значение, так как закладывает основу для проведения грамотной патогенетически обоснованной терапии. Кроме того, определение оксидантного статуса организма необходимо проводить в динамике инфекционного процесса, так как полученные в разные периоды заболевания данные являются основанием для прогноза течения и характера патологического процесса и важны при назначении некоторых фармакологических препаратов. Например, применение некоторых иммуностимуляторов (пирогенал, продигиозан) нежелательно при повышенном оксидантном потенциале и может привести как обострению аллергических заболеваний, так и служить запуском аутоиммунных расстройств. При изучении свободно-радикального статуса больных различными формами стафилококковой инфекции мы учитывали и то, что любое инфекционное заболевание обусловлено иммунодефицитным состоянием, которое усугубляется при неблагоприятоном течении заболевания и выражается в снижении количества и подавлении функций Т-лимфоцитов [270], нарушении соотношения субпопуляций лимфоцитов, а также в подавлении факторов неспецифической антиинфекционной резистентности. Проведенные нами исследования показали существование значительных нарушений свободно-радикальных инфекционных заболеваниях. процессов Интегральное при стафилококковых взаимодействие макро- и микроорганизма носит динамический характер и воспалительная реакция в начале в виде локального ответа на инфекцию (группы больных с ангинами, ягодичными постинъекционными абсцессами, флегмонами, маститами), при сепсисе приводит к хаотическому нарушению всех механизмов противоинфекционной защиты и повреждению собственных органов и тканей. Примером компенсированного 143 подъема активности свободно- радикальных процессов являются результаты изучения состояния прооксидантной и антиоксидантной систем у больных с ягодичными абсцессами. Повышение внеклеточного выброса радикалов (активные формы кислорода и оксид азота) в острый период заболевания происходило параллельно с подъемом активности антиоксидантной системы. Показатели активности каталазы, супероксид дисмутазы и антиоксидантной активности плазмы нормализовались уже ко вторым суткам. Доля внутриклеточных радикалов и фагоцитарные показатели у больных этой группы в острый период снижены более чем в два раза, но имеют положительную динамику и нормализуются к моменту выписки из стационара. Таким образом, при этой форме локализованной стафилококковой инфекции происходит повышение продукции радикалов, что объясняется необходимостью быстрой внеклеточной инактивации бактерий путем окисления структур микроорганизмов. Для предотвращения опосредованной свободными радикалами самодеструкции клеток-фагоцитов и воспалительного повреждения подлежащих тканей происходит индукция генов, кодирующих ферменты антирадикальной защиты и регистируется повышенный уровень каталазы, супероксид дисмутазы и общей антиокислительной емкости плазмы. Однако при воспалительных одонтогенные более тяжелых заболеваниях флегмоны, по характеру (фолликулярная лактационный и и течению гнойно- лакунарная ангины, мастит, генерализованная стафилококовая инфекция) выявлены существенные нарушения состояния свободно-радикальной системы. При изучении свободно-радикального статуса фагоцитов при различных формах локализованной стафилококковой инфекции мы отдавали себе отчет, что, изучая нейрофильные или лейкоцитарные пулы клеток крови, нами исследуются местной последствия воспалительной реакции, то есть последствия локального повреждения. Но и по эти признаки оказались ценными в качестве, как диагностических, так и прогностических критериев оценки тяжести заболевания. Несмотря на то, что выброс АФК при абсцессах и 144 флегмонах ограничен небольшой областью, часть реактивных оксидантов неизбежно проникает в окружающую ткань и кровь, вызывая системные реакции. Кроме того, известно, что в случае образования больших количеств NO, последний реагирует с супероксидным радикалом, образуя другую активную форму кислорода – пероксинитрит (ONOO-). Токсичный сам по себе, пероксинитрит может неэнзиматически продуцировать высокореакционоспособные гидроксильные радикалы, включая тем самым, оксид азота в образование новых активных форм кислорода [271]. Повышенное содержание радикалов, сохраняющееся в течение 7-10 дней является существенным фактором риска развития и аутоиммунных заболевани. Защитным щитом для организма в этом случае служит антиоксидантная система [272]. Так., свободно-радикальный статус фагоцитов больных с ангиной характеризовался максимальным внеклеточным выбросом радикалов (оксид азота, АФК) нейтрофилами в острый период воспалительного процесса, на фоне подъема (в первые сутки), а затем резкого спада активности антиоксидантной системы (СОД и КАТ нейтрофилов периферической крови больных, антиокислительная емкость плазмы). Активность антиоксидантных ферментов нормализовалась к седьмым суткам, в отличие от показателей радикал-формирующей способности нейтрофилов (они остаются слегка повышенными и перед выпиской из стационара). Полученные данные согласуются с данными Тихомировой О.В., изучавшей активность антиоксидантной системы у детей с лакунарной ангиной и показавшей максимальный спад активности СОД в лимфоцитах на четвертые сутки и тенденцией к повышению перед выпиской [273]. Различные сроки спада активности антиоксидантной системы в таких элементах крови, как нейтрофил и лимфоцит, вероятно, связаны с тем, что нейтрофилы являются клетками первой защиты организма и изменения в их метаболизме осуществляет запуск биохимических функционирования каскадных и реакций, приводящих иммуннокомпетентных клеток к изменению (Т,В-лимфоциты). Фагоцитарные показатели больных с фолликулярной и лакунарной ангиной 145 снижены по сравнению с контролем. По гипотезе Рябиченко Е.В. с соавторами [274], возможно, внеклеточный выброс оксидантов задействует все энергетические ресурсы клеток, определяя их неполноценность и, как следствие, приводит к нарушению фагоцитоза. По нашему же предположению, причиной столь сильного снижения эффективности фагоцитоза является нарушение в перераспределении радикалов в клетке. Для проверки истинности подобной гипотезы мы применили метод оценки внутриклеточной продукции радикалов с помощью флуоресцентного красителя гидроэтидина. Было обнаружено, что доля внутриклеточных активных форм кислорода значительно снижена в нейтрофилах больных по сравнению со здоровыми, причем степень снижения внутриклеточных радикалов коррелировала со степенью тяжести инфекционного процесса. Из полученных данных мы заключили, что в активной фазе гнойно-воспалительного процесса происходит мощный выброс свободных радикалов кислорода и азота, которые могут инактивировать и уничтожать микроорганизмы во внеклеточном пространстве. При этом смещается равновесие вне\внутриклеточная продукция микробицидных радикалов в сторону внеклеточного процесса. В результате образующегося внутриклеточного дефицита радикалов страдает завершенность фагоцитоза и создаются условия для длительной персистенции бактерий внутри фагоцитов. Поглощенные фагоцитами стафилококки оказываются защищенными от бактерицидных факторов сыворотки крови, фракция внутриклеточных радикалов мала и не является помехой для внутриклеточного размножения стафилококков. Кроме того, наряду с повышенным внеклеточным образованием супероксид аниона и оксида азота обнаружено значительное (более чем в два раза) снижение доли внутриклеточных АФК, особенно в острый период внутриклеточному заболевания, что перевариванию и приводит бактерий к (снижены неэффективному все изучаемые фагоцитарные показатели), являясь предпосылкой их длительной персистенции в организме. Исследованные параметры свободно-радикального статуса достоверно больше изменены в группе больных с более тяжелыми гнойно146 воспалительными процессами и являлись одними из показателей тяжести течения инфекционного процесса. Наиболее драматичная картина по силе и характеру патогенетических изменений получена при изучении свободно-радикального статуса больных с генерализованной инфекцией. По мере расшифровки механизмов антиинфекционной защиты и накопления новых данных при рассмотрении проблемы сепсиса происходит постепенная трансформация понимания сути септического процесса: от ведущей и единственной роли инфекционного агента к признанию существенного значения реактивности организма. Вероятно, одним воспалительного Действительно, из пусковых ответа в механизмов является обеих в развитии гиперергическая подгруппах больных с системного стресс-реакция. генерализованной стафилококковой инфекцией, нейтрофилы продуцировали больше радикалов, но активность этих процессов не сравнима с таковой у больных с локализованной инфекцией: в подгруппе больных с сепсисом нейтрофилы продуцируют более чем в двенадцать раз превосходящие нормальные количества супероксидного аниона, в подгруппе больных с тяжелым сепсисом количество продуцируемого супероксид аниона превосходит нормальный показатель более чем в 15 раз; уровень нитратов и нитритов в плазме крови выше нормы в 15 (подгруппа больных с сепсисом) и в 18 раз (подгруппа больных с тяжелым сепсисом). Высокие концентрации оксида азота и активных форм кислорода, дополняя действие липидных медиаторов и протеаз, при генерализованной инфекции включаются в цепную реакцию, приводящую к гибели клеток, поражению тканей и вторичной активации нейтрофилов. При сравнении показателей нейтрофилов больных активности разных радикал-формирующей подгрупп обнаружено, что способности продукция супероксиданион радикала и оксида азота во второй подгруппе (тяжелый сепсис) достоверно выше (р<0,01). К седьмому-четырнадцатому дню показатели активности свободно-радикальных процессов у больных с сепсисом и тяжелым сепсисом снижаются незначительно и к моменту выписки из 147 стационара остаются повышенными. Выявленный подъем активности процессов генерации радикалов у больных с генерализованной инфекцией не приводит к быстрому и эффективному уничтожению патогенных бактерий. Процент выживших бактерий после фагоцитоза в обеих группах схож: каждый четвертый-пятый микроорганизм продолжает персистировать внутриклеточно, защищенный от сывороточных бактерицидных компонентов крови человека. Причиной столь низкой фагоцитарной эффективности генерализованной стафилококковой инфекции ( в обеих подгруппах) оказалось, как и в других группах, снижение количества внутриклеточных активных форм кислорода. Однако при генерализованной инфекции степень снижения количества внутриклеточных активных метаболитов кислорода оказалась максимальной: у больных сепсисом составляет всего 10% от показателя здоровых доноров, у больных с тяжелым сепсисом - 8% (p<0.001). Другим подтверждением развивающегося оксидативного стресса у больных с генерализованной стафилококковой инфекцией служит изменение уровня антиоксидантных ферментов (каталазы, также супероксид дисмутазы). Действительно, в первой подгруппе больных со стафилококковой инфекций на пике воспаления (при поступлении в стационар) были обнаружены повышенные по сравнению с нормой показатели активности КАТ и СОД, была увеличена также антиоксидантная емкость плазмы. На фоне интенсивно начатого лечения (вторые сутки) активность КАТ, СОД и антиоксидантная емкость плазмы больных с сепсисом резко падали ниже нормального уровня (р<0,01). Затем на пятые, седьмые и на четырнадцатые сутки происходило постепенное увеличение всех измеряемых антиоксидантных параметров, но к 30 суткам ни один из показателей состояния антиоксидантной системы не достигал нормальной величины (р<0,01). В группе больных с «тяжелым сепсисом» доказательством перехода фазы гипервоспаления в фазу «супрессии» являются значительно сниженные параметры активности КАТ и СОД и антиоксидантной емкости плазмы уже в первые сутки, что говорит об истощении антиоксидантного потенциала организма и декомпенсированной 148 стадии заболевания. Таким образом, стафилококковая инфекция, в особенности ее генерализованная форма, приводит к значительному дисбалансу свободных радикалов и их ингибиторов в крови. Более того, направление продукции свободных радикалов нейтрофилами становится преимущественно внеклеточным, что не способствует внутриклеточному киллингу и приводит к воспалительному организма свободно-радикальному хозяина. Некоторые поражению изменения клеток параметров и тканей активности антиоксидантной системы (отсутствие подъема значений каталазы, супероксид дисмутазы и антиокислительной емкости плазмы в острый период) могут служить прогностическими критериями особо тяжелого течения гнойновоспалительного процесса. Мы полагаем, что оптимальным является подход к оценке функционального состояния макрорганизма не с точки зрения «недостаточности» каких-либо органных функций – более грубых и часто неообратимых нарушений, а с точки зрения начальных проявлений отклонений от нормы,когда на клеточном уровне первоначально защитные функции радикалов превращаются в токсические для собственных органов и тканей. Нарушение равновесия в системе «прооксиданты-антиоксиданты» необходимо учитывать как в прогнозе течения заболевания, так и при проведении лечебных мероприятий и профилактике осложнений при различных формах стафилококковой инфекции. Такая стратегия позволит быстрее уловить перемены в состоянии больного, определить способность организма больного к самостоятельному поддержанию гомеостаза и оперативней вносить необходимые коррективы в терапию. Совокупность представленных данных указывает и на то, что, несмотря на бактерицидные свойства радикалов, на разных стадиях стафилококкового инфекционного процесса, ингибирование синтеза оксида азота и АФК может оказаться полезным. Таким образом, патогенетической основой неблагоприятного развития инфекционного процесса стафилококковой этиологии служит, во-первых, нарушение перераспределения внеклеточных и внутриклеточных радикалов с 149 формированием дефицита последних, последствием чего является нарушение процесса элиминации возбудителя из организма, и, во-вторых, снижение защиты собственных органов и тканей от внеклеточных радикалов за счет истощения активности антиоксидантной системы. 150 Список использованных источников 1 Ахметова Л.И., Розанова С.М., Перевалова Е.Ю. Распространенность и антибиотикочувствительность метициллинрезистентных стафилокок- ков//Клин.лаб.диагностика.-1998 г., №9.-С.10 2 Некрасова Н.И. Интерлейкинзависимый иммунодефицит при перитоните и его коррекция//Автореф.к.м.н.-М.-1998.-С. 30 3 Петренко тетрациклинов Ю.М., Титов вызывать инактивировать В.Ю., Владимиров метгемоглобинобразование каталазу под действием Ю.А. в Свойство эритроцитах излучения и видимого диапазона//Антибиотики и химиотер.-1995 г.-Т.40(6).-С.10-18 4 Wang Z.Q., Auer B., Stingl L., et al. Mice lacking ADPRT and poly(ADPnbosyl)ation develop normally but are susceptible to skin disease// Genes Deu.1995.-V. 9.-P.509-520 5 Ковальчук Л.В., Сайгитов Р.В. Хемокины – новое семейство цитокинов, регулирующих миграцию лейкоцитов//ЖМЭИ.-2000 г.-№1.-С.90-94 6 Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Актуальные проблемы оценки иммунной системы на современном этапе//Иммунология.-1990 г.-№5.-С.4-7 7 Курлаев П.П., Чернова О.А., Киргизова С.Б. Взаимодействие окситоцина, лазерного и электромагнитного излучения на персистентные свойства Staphylococcus aureus//ЖМЭИ.-2000 г.-№4.-С.62-64 8 Ерюхин И.А., Шляпников С.А. Хирургический сепсис (дискуссионные аспекты проблемы)//Хирургия.-2000 г.-№3.-С.44-47 9 Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета//Иммунология.-1995 г.-№3.-С.30-36 10 Масычева В.И., фадина В.А., Даниленко Е.Д. Активация фагоцитов рекомбинантным человеческим фактором некроза опухоли β//Антибиотики и химиотер.-2000 г.-Т.45,№6.-С.21-25 11 Пинегин Б.В., Андронова Т.М., Карсонова М.И., Хаитов Р.М. 151 Современные представления об иммунопрофилактике и иммунотерапии хирургических инфекций//Анестез.реанимат.-1999 г.-№3.-61-65 12 Винницкий Л.И. Проблемы клинического применения иммунокорректоров в хирургической клинике//Антибиотики и химиотер. 2000 г.-Т.45,№12.-С.12-16 13 Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Иванюшко Т.М., Буданова Е.В., Шабанова Н.А. Роль цитокинов в механизмах развития хронического воспаления в ткани парадонта//Иммунология.-2000.-№6.-С.24-28 14 Лазаренко активности Л.Н. Модуляция фагоцитарных интерферонами клеток при функциональной стафилококковой инфекции//Автореф.к.б.н.-Киев.- 1991 г.-С.17 15 Пинегин Б.В., Кулаков В.В. Ингибиторный анализ цитотоксического эффекта нейтрофилов периферической крови здоровых доноров//Иммунология.-1997 г.-№5.-С.27-29 16 Северин Е.С. Биохимические основы патологических процессов.- М.Медицина.- 2000 г.-267-290 17 Мао C.D., Thomas P.D., Lopaschuk G.D., Poznansky M.J. Superoxide dismutase (SOD)-catalase conjugates Role of hydrogen peroxide and the Fenton reaction in SOD toxicity// J Biol Chem.- 1993.-V. 268.-P.416 18 Павлова К.С., Шпакова А.П., Дронова В.М., Булычева Т.И., Ганковская Л.В., естественного Ковальчук комплекса Л.В. цитокинов Иммуномодулирующее на пролиферацию действие лимфоцитов и активность естественных киллеров человека in vitro//Иммунология.-2000 г. №2.-С.32-35 19 Larsson B.M., Larsson K., Malmberg P., Palmberg L. Gram-Positive bacteriae induce IL-6 and IL-8 production in human alveolar macrophages and epithelial cells//Inflammation.-1999.-V.23,№3.-P.217-231 20 Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E. Nitric oxide: Physiology, pathophysiology and pharmacology// Pharmacol Rev .- 1991.-V.43.-P.09-141 21 Авербах М.М. Иммунологические аспекты чувствительности и 152 резистентности к генерализованной стафилококковой инфекции/Автореф.д.м.н.-М.-1995 г.-С. 34 22 Безель А.В. Иммунодиагностика и некоторые иммунные аспекты стафилококкового хронического тонзиллита//Автореф. - Алма-аты.-1995.-С. 27 23 Дерябин Д.Г., Шагинян И.А. Вирулентность и персистенция стафилококков: фенотипические проявления и механизмы генетического контроля//ЖМЭИ.-2000 г.-№4,-Приложение -С.36-43 24 Михайлов С.П. Патогенетическое значение антилизоцимной активности возбудителя при сальмонеллезной инфекции//Автореф.дис.к.м.н.Челябинск.-1986 г.-С.25 25 Annane D., Sanguer S., Sebille V., Faye A. Compartmentalised inducible nitric-oxide syntase activity in septic shock// Lancet.-2000.-V.355.-P.1143-1148 26 Beck B.J., Tabatabai L.B., Mayfield J.E. A protein isolated from Brucella abortus is Cu-Zn superoxide dismutase//Biochemistry.-1990.-Vol.29.-P.372-376 27 Breland J.K., Remick D.G., Freeman P.T. The NO and superoxide anion interactions // Infect.and Immun.- 1995.-V.63.,№9.-p.3253-3258 28 Delinger L.C., Fiste P.L., Garis K.A. Regulation of inducible nitric oxide synthase expression by macrophage purinoreceptors and calcium// J.Biol.Chem.1996.-Vol.271.-P.337-342 29 Duranteau J., Chandel N.S., Kulisz A., et al. Intracellular signaling by reactive oxygen species during hypoxia in cardiomyocytes//J. Biol. Chem.- 1998 .-V. 273.-P.11619-11624 30 Folling F., Johansson A., Dahlgren C. Intracellular production of reactive oxygen species in human neutrophils following activation by the soluble stimuli FMLP, dioctanylglycerol and ionomycin//Cell.Biochem.Funct.-1991.-V.9.-P.27-37 31 Fridovich I. Endogenous oxidative DNA damage and Superoxide radical //J.Biol.Chem.-1997.-Vol.272.-P.18515-18517 32 Haslam E. Antimicrobial and antiviral effects// In Plant Polyphenols— Vegetable Tannins Revisisea.-2000.-P.202-246 33 Hausladen A., Fridovich I. Superoxide and peroxynitrite inactivate 153 aconitases but nitric oxide does not //J. Biol. Chem.- 1994.-V. 269.-P.29405 34 Goode H.F., Webster N.R. Free radicals and antioxidants in sepsis //Crit. Care Med.- 1993 .-V.21.-P.1770-1776 35 Issekutz T.B In vivo blood monocyte migration to acute inflammatory reactions, IL-1α, TNFα, IFNγ, C5a utilizes LFA-1,MAC-1 and VLA-U//J.Immunol.1995.-Vol.154.-P.6533-6540 36 Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E. Nitric oxide: Physiology, pathophysiology and pharmacology// Pharmacol Rev .- 1991.-V.43.-P.09-141 37 Романова Ю.М., Чегаева Е.В., Гинцбург А.Л.//Молекул.генетика.-1998 г.-№3.-С.3-8 38 Swanson, B. G. Tannins and polyphenols. In Encyclopedia of Food Science, Food Technology and Nutrition; Macrae, R., Robinson, R. K., Sadler, M. J.. Eds.; Academic Press: London, U.K., 1993.- Vol. 7.- P. 4513-4517 39 Alio J.L., Artola A., Serra A., Ayala M.J. Effect of topical antioxidant therapy on experimental infections keratitis// Cornea.-1995.-Vol.14.-P.175-179 40 Bone R.C.New classification of sepsis and organ failure //Chest.-1992.V.101.-P.1644-1655 41 Day B.J., Shawen S., Liochev S.I., Crapo J.D. A metalloporphyrin superoxide dismutase mimetic protects against paraquat-induced endothehal cell injury, in vitro//J Pharmacol Exp Ther.- 1995.-V. 275.-P.1227-1232 42 Geller D.A., Billiar T.R. Molecular biology of nitric oxide synthases//Cancer Metast.Rev.- 1998.-V. 17.-P.7-23 43 Ющук Н.Д., Фролов В.М., Пустовой Ю.Г., Петруня А.М. Принципы современной иммунокоррекции инфекциях//Патогенетические при основы затяжных лечения и острых рецидивирующих инфекционных заболеваний.-Сб.научных трудов под ред.Ющука Н.Д.-М.-1994 г.-Вып.3. С.320-325 44 Cakmakci M., Stern A., Schilling J. Randomized comparative trial of imipenem/cilastatin versus aminoglycoside plus amoxycillin plus clindamycin in the treatment of severe intra- and post-operative infection//Drugs Exp. Clin.Res.-1993 г. 154 Vol.19(5).-P.223-227 45 Козлов И.Г., Сайгитов Р.Т., Митясева С.А., Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. Миграционная активность in vitro нейтрофилов в периферической крови человека в норме и при патологии//ЖМЭИ.-2002 г.-№4.-С.43-47 46 Никитин А.В Направления адъювантной патогенетической терапии инфекционных и аутоиммунных заболеваний//Антибиотики и химиотер.-2000 г. Т.45,№12.-С.17-19 47 Павлова К.С., Шпакова А.П., Дронова В.М., Булычева Т.И., Ганковская Л.В., естественного Ковальчук комплекса Л.В. цитокинов Иммуномодулирующее на пролиферацию действие лимфоцитов и активность естественных киллеров человека in vitro//Иммунология.-2000 г. №2.-С.32-35 48 Хараева З.Ф. Микробиологические аспекты хирургической инфекции мягких тканей//Доклады АМАН.-2002.-Т.6, №1.-С.94-98 49 Хорева Апциаури Н.Э., Ганковская Л.В., Шуйкина Э.Е., Яровинский Т.О., М.В., Ковальчук Л.В. Генерация активных форм кислорода макрофагами мышей: влияние генотипа, иммуноцитокинов и инфицирования// Бюлл.экспер.биол.мед.-1994.-№4.-С.84-89 50 Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты//Вестник РАМН.-1998 г.-№7.-С.43-51 51 Павлюченко И.И., Быков М.И., Гуменюк С.Е. Состояние основных компонентов прооксидантно-антиоксидантной системы у хирургических больных с перитонитом// Int.J.Immunoreabil.-2001 г.-Том3,№3.-С.87-93 52 Рябиченко Е.В., Бондаренко В.М., Рябиченко В.В. Роль активных форм кислорода, генерируемых фагоцитами в патогенез заболеваний//ЖМЭИ.2000 г.-№4,Приложение.-С.65-71 53 Ahmed A.O., van Belkum A., Fahal A.H. The problem of staphylococcal infections// J.Clin.Microbiol.-1998.-Vol.36.-P.3614-3618 54 Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты//Вестник РАМН.-1998 г.-№7.-С.43-51 155 55 Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. Свободные радикалы в живых системах//ВИНИТИ.Серия: Биофизика.-М.-1987 г.-С.1-176 56 Проскуряков С.Я., Бикетов С.И., Иванников А.И., Скворцов В.Г. Оксид азота в механизмах внутриклеточных инфекций//Иммунология.-2000.№4.-9-20 57 Kaplan S. S.,Lancaster J.R., Basford R.E., Simmons R.L. Effect of nitric oxide on Staphylococcal killing and interactive effect with superoxide.Infect.Immun.-1996.-V.-64.-№1.-P.69-76 58 Rawlingson A., Greenacre S.A., Brain S.D. Generation of peroxynitrite in localized, moderate temperature burns.//Burns.-2000.-V.26.-P.223-227 59 Коркина Л.Г., Величковский Б.Т. Роль свободных радикалов в пылевой патологии легких//Сб.научных трудов «Кислородные радикалы в химии, биологии, медицине».-Рига.-1988.-С.153-163 60 Cohen G., Greenwald R. Specific mechanism in Oxyradicals and Their Scavenger Systems// Molecular Aspects.- Vol. 1.- 1999.- Elsevier, New York. – P.111-115 61 Clements M.O., Watson S.P., Foster S.J. Characterization of the major superoxide dismutase of Staphylococcus aureus and its role in starvation survival, stress resistance and pathogenicity// J.Bacteriol.-1999.-Vol.181.-P.3898-3903 62 Keyer К., Imlay J.A. Reactions of superoxide with metalloenzymes// Proc Natl Acad Sci USA.- 1996.-V. 93.-P.13635-13640 63 Clements M.O., Watson S.P., Foster S.J. Characterization of the major superoxide dismutase of Staphylococcus aureus and its role in starvation survival, stress resistance and pathogenicity// J.Bacteriol.-1999.-Vol.181.-P.3898-3903 64 McCord J. Oxygen-derived free radicals //New Horizons .- 1993.-V.1.P.70-76 65 Clements M.O., Watson S.P., Foster S.J. Characterization of the major superoxide dismutase of Staphylococcus aureus and its role in starvation survival, stress resistance and pathogenicity// J.Bacteriol.-1999.-Vol.181.-P.3898-3903 66 Harman D. Free radical theory of aging// Mutat Res.- 1992.-V. 275.-P.257156 266 67 McCord J. Oxygen-derived free radicals //New Horizons .- 1993.-V.1.P.70-76 68 Jaruga P., Zastawny T.H., Skokowski J., et al. Oxidative DNA base damage and antioxidant enzyme activities in human lung cancer// FEBS Lett.- 1994.-V. 341.P.59-64 69 Weitzman S.A., Turk P.W., Howard Milkowski D., Kozlowski К. Free radical adducts induce alterations m DNA cytosine methylation //Proc Natl Acad Sci USA.- 1994.-V. 91.-P.1261-1264 70 Moncada S., Higgs A. The L-arginine nitric oxide pathway// N. Engl . Med .- 1993.-V.329.-P.2502 71 Bauldry S.A., Nasrallah V.N., Bass D.A. Activation of NADPH oxidase in human neutrophils permeabilized with Staphylococcus aureus alpha-toxin. A lower Km when the enzyme is activated in situ//J.Biol.Chem.-1992.-Vol.267(1).-P.323-330 72 Bastian N.R., Hibbs J. Assembly and regulation of NADFH oxidase and nitric oxide synthase// Сurr.Op.Immunol.-1994.-Vol.6.-P.131-139 73 Варюшина Е.А., Конусова В.Г., Симбирцев А.С., Кетлинский С.А., Саламатов А.В., Золотарев Д.В., Бисенков Л.Н. Изучение механизмов местного иммуностимулирующего действия интерлейкина-1β. Усиление функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов человека в очаге воспаления под влиянием интерлейкина-1β.//Иммунология.-2000г.-№3.-С.18-22 74 Некрасова Н.И. Интерлейкинзависимый иммунодефицит при перитоните и его коррекция//Автореф.к.м.н.-М.-1998 г.- С. 30 75 Чивилева И.Ю. Свободно-радикальный статус клеток крови и костного мозга у детей с острыми лейкозами и анемией Фанкони.Автореф.к.м.н.-М.-1996 г.-С.17 76 Chacon E., Acosta D. Mitochondrial regulation of superoxide by Ca++//Tox.Appl.Pharm.-1991.-V.107(7).-P.117-128 77 Folling F., Johansson A., Dahlgren C. Intracellular production of reactive oxygen species in human neutrophils following activation by the soluble stimuli 157 FMLP, dioctanylglycerol and ionomycin//Cell.Biochem.Funct.-1991.-V.9.-P.27-37 78 Kobzik K.L., Godleski J., Brain J. Oxidative methabolism in alveolar macrophages. Analysis by flow cytometry//J.Leukocyte Biol.-1990.-V.47,№4.P.295-303 79 Kobayashi T., Tsunawaki S., Seguchi H. Evalution of the process for superoxide production by NADPH oxidase in human neutrophils: evidence for cytoplasmic origin of superoxide//Redox-Rep.- 2001-V. 6 (1).-P. 27-36 80 Altivia S.,Weinstein-Fischer D., Zhang A., et al. Production of reactive oxygen spiecies and problem of intracellular infection//Cell.-1997.-Vol.90.-P.43-53 81 Denis M. Tumor necrosis factor and granulocyte macrophage-colony stimulating factor stimulate human macrophage to restrict growth of virulent Mycobacterium avium and to kill avirulent Mycobacterium avium: killing effector mechanism depends on the generation of reactive nitrogen intermediates//J.Leuk. Biol.-1991.-V.49.-P.380-387 82 Kaplan S. S.,Lancaster J.R., Basford R.E., Simmons R.L. Effect of nitric oxide on Staphylococcal killing and interactive effect with superoxide.Infect.Immun.-1996.-V.-64.-№1.-P.69-76 83 Horsburgh M.J., Ingham E., Foster S.J. In Staphylococcus aureus is an interactive regulator with PerR, contributes to virulence, and is necessary for oxidative stress resistance through positive regulation of catalase and iron homeostasis// J.Bacteriol-2001.-Vol.183(2).-P.468-475 84 Iniesta V, Gomes-Nieto L-C, Corraliza I The inhibition of arginase by N(omega)-hydroxy-l-arginine controls the growth of Leishmania inside macrophages. J-Exp-Med. 2001 Mar 19; 193(6): 777-84 85 Пигаревский В.Е. Зернистые лейкоциты и их свойства//М.-Медицина.1978.-С.24-30 86 Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. Клеточные и молекулярные аспекты иммунных процессов//М.-ВИНИТИ.-1989.-Том.19.-С.84-122 87 Коркина Л.Г., Трахтман П.Е., характеристика оксидативного стресса при 158 Пагано Дж. Сравнительная некоторых наследственных заболеваниях, отличающихся предрасположенностью к злокачественным новообразованиям и раннему старению//Вестник РАМН.-1998 г.-№7.-С.51-56 88 Stites B.P.Defenzymes//Medical Immunology: A lange medical book.- 9-th Ed.-1997.-P.17.1-17.13 89 Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. Involvement of superoxide and myeloperoxidase in oxygen-dependent killing of Staphylococcus aureus bu neutrophils// Infect.Immun.-1996.-Vol.64.-P.3512-3526 90 Janeway C.A., Medzhitov R. Innate immune recognition//Ann.Rev.Immunol.-2002.-V.20.-P.197-216 91 Hii C., Stacey K., Moghaddami N. Role of the extracellular signal-regulated protein kinase cascade in human neutrophil killing of S.aureus, C.albicans and in migration//Infect.Immun.-1999.-Vol.67,№3.-P.1297-1302 92 Repine J.E., Fox R.B., Berger E. Hydrogen peroxide kills S.aureus by reacting with stathylococcal iron to form hydroxyl radical//J.Biol.Chem.-1981.V.256(14).-P.7094-7096 93 Jaruga P., Zastawny T.H., Skokowski J., et al. Oxidative DNA base damage and antioxidant enzyme activities in human lung cancer// FEBS Lett.- 1994.-V. 341.P.59-64 94 Weitzman S.A., Turk P.W., Howard Milkowski D., Kozlowski К. Free radical adducts induce alterations m DNA cytosine methylation //Proc Natl Acad Sci USA.- 1994.-V. 91.-P.1261-1264 95 Yim M.B., Chock P.B., Stadtman E.R. Copper, zinc superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radical production from hydrogen peroxide //Proc Natl Acad Sci USA.- 1990 .-V. 87.-P.5006-5010 96 Kapoor R., Prasad К. Role of oxyradicals in cardiovascular depression and cellular injury in hemorrhagic shock and reinfusion: Effect of SOD and catalase// Circ Shock.- 1995.-V. 43.-P.79-94 97 Watson S.P., Antonio M., Foster S.J. Isolation and characterization of Staphylococcus aureus starvation-induced, stationary-phase mutants defective in survival recovery//Microbiol.-1998.-Vol.144.-P.3159-3169 159 98 Beckman J.S., Beckman T.W., Chen J., et al. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: Implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide// Proc Natl Acad Sci USA.-1990.-V. 87.-P.1620 99 Beckman J.S., Chen J., Crow J.P. and Ye Y.Z. Reactions of nitric oxide, super-oxide and peroxynitrite with superoxide dismutase in neurodegeneration// Prog Brain Res.-1994.-V. 103.-P.371-380 100 Breland J.K., Remick D.G., Freeman P.T. The NO and superoxide anion interactions // Infect.and Immun.- 1995.-V.63.,№9.-P.3253-3258 101 Crow J.P., Beckman J.S. Reactions between nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: Footprints of peroxynitrite in vivo// Adv Pharmacol.- 1995.-V.34.P.17-43 102 Cazevielle C., Muller A., Meynier F. and Bonne С. Superoxide and nitric oxide cooperation hypoxial reoxygenation-induced neuron injury// Free Radic Biol Med.- 1993.-V.14-P.389-395 103 Киборт Р.В. Иммунный статус организма человека при стафилококовых инфекциях: взаимосвязь иммунных параметров//Автореф.Иркутск.-1988 г.-С.35 104 Taylor P.W. // In J.A.Roth (ed.) Virulence mechanism of bacterial pathogens.-ASM, Washington.-1988.-P.107-120 105 Taylor P.W. Bacterial persistens factors//Microbiol.Rev.-1983.-Vol.47.- P.46-83 106 Chan J.,Xing Y., MagliozzoR.S., BloomB.R. Killing of virulent mycobacterium tuberculosis by reactive nitrogen intermediates by activated murine macrophages//J.Exper. Med.-1992. – 175. –P.1111-1122 107 Denis M. Tumor necrosis factor and granulocyte macrophage-colony stimulating factor stimulate human macrophage to restrict growth of virulent Mycobacterium avium and to kill avirulent Mycobacterium avium: killing effector mechanism depends on the generation of reactive nitrogen intermediates//J.Leuk. Biol.-1991.-V.49.-P.380-387 108 Антипов А.Ю., Шепелев А.П., Поляков В.М. Влияние экзотоксина 160 токсического шока Staphylococcus aureus на хемилюминесценцию коеток цельной крови in vitro и in vivo// Вопросы мед.химии.-1995 г.-Том41, №2. С.40-42 109 Невмятуллин А.Л. Реактивная хемилюминесценция нейтрофилов человека в системах со стафилококками//автореф.к.м.н..-Челябинск.-1988г.С. 24 110 Рябиченко Е.В., Бондаренко В.М., Рябиченко В.В. Роль активных форм кислорода, генерируемых фагоцитами в патогенез заболеваний//ЖМЭИ.2000.-№4,Приложение.-С.65-71 111 Cazevielle C., Muller A., Meynier F. and Bonne С. Superoxide and nitric oxide cooperation hypoxial reoxygenation-induced neuron injury// Free Radic Biol Med.- 1993.-V.14-P.389-395 112 Dix T.A., Hess K.M., Medina M.A., et al. Mechanism of site-selective DNA nicking by the hydrodioxyl (perhydroxyl) radical// Biochemistry. - 1996.-V. 38.-P.4578-4583 113 Fantone J.C., Ward P.A. Role of oxygen-derived free radicals and metabolite, in leukocyte-dependent Inflammatory reactions// Am. J. Pathol.- 1982.-V. 107.-P.395-418 114 Umezava K., Akaike T., Horie H. The type of inflammatione mediators//Infect. Immun.-1997.-V.65.-P.2932-2940 115 Клебанов Г.И., Крейнина М.В., Барбараш О.Л., Чукаева И.И. Владимиров Ю.А. Изменение активности супероксиддисмутазы в процессе стимуляции полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови//Бюлл.экспер.биол.мед.- 1990 г.-Том 109.-№4.-С.33-336 116 Петухов В.И. Активные формы кислорода в прогрессировании хронического миелолейкоза: перспективы применения натуральных антиоксидантов//Тер.архив.-2000 г.-№8.-С.64-67 117 Янковский О.Ю. Кооперативное взаимодействие миелопероксидазы лейкоцитов и опсонинов плазмы крови в системах антимикробной и антиоксидантной защиты.-Автореф.д.м.н.-Спб.-1997 г.-С.36 118 Halliwell B., Gutteridge J.M. 161 Free radicals in biology and medicine.//Clarendon press.- Oxford.-1989.-P.58-188, 366-494 119 Янковский О.Ю. Кооперативное взаимодействие миелопероксидазы лейкоцитов и опсонинов плазмы крови в системах антимикробной и антиоксидантной защиты.-Автореф.д.м.н.-Спб.-1997 г.-С.36 120 Halliwell B., Gutteridge J.M. Free radicals in biology and medicine.//Clarendon press.- Oxford.-1989.-P.58-188, 366-494 121 Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases //Annu Rev Biochem.- 1995.-V. 64.-P.97-112 122 Rush J.D., Maskos Z., Koppenol W.H. The superoxide dismutase activities of two higher valent manganese complexes, MnIV desferrioxamine and MnIII-cyclam// Arch Biochem Biophys.- 1991.-V. 288.-P.97 123 McCord J.M., Fridovich I. Superoxide dismutase//J.Biol.Chem.-1969.- Vol.244.-P.6049-6055 124 Folling F., Johansson A., Dahlgren C. Intracellular production of reactive oxygen species in human neutrophils following activation by the soluble stimuli FMLP, dioctanylglycerol and ionomycin//Cell.Biochem.Funct.-1991.-V.9.P.27-37 125 Meister A. On the antioxidant effects of ascorbic acid and glutathione// BiochemPharmacol .- 1992.-V.44.-P.1905-1915 126 Прокопенко Л.Г., Сипливая Л.Е., Лазарев А.И., Шевцова Е.М. Коррекция иммуномодулирующего действия антибиотиков в норме и при стафилококковой инфекции//Антибиотики и химиотер.-1995 г.-Т.40, №11\12.-С.50-56 127 Павлюченко И.И., Быков М.И., Гуменюк С.Е. Состояние основных компонентов прооксидантно-антиоксидантной системы у хирургических больных с перитонитом// Int.J.Immunoreabil.-2001 г.-Том3,№3.-С.87-93 128 Фархутдинов свободнорадикального У.Р., окисления Фархутдинов при Р.Р. Процессы экспериментальной пневмонии// Бюлл.экспер.биол.мед.-2000.-Том 129,№3.-С.260-265 129 Weiss R.H., Fretland D.J., Baron D.A., et al. Manganese-based 162 superoxide dismutase mimetics inhibit neutrophil infiltration in vivo// J. Biol. Chem..- 1996 V.271.-P.26149-26156 130 Wizemann T., Gardner C., Laskin J., Quinones S., Durham S., Goller N., Ohnishi T., Laskin D. Production of nitric oxide and peroxynitrite in the lung during//.-1994 131 Youn Y.K., LaLonde Q., Demling R. Use of antioxidant therapy in shock and trauma// Circ Shock.- 1991.-V. 38.-P.245-249 132 Васильков В.Г., Шикунова Л.Г., Келина Н.Ю., Безручко Н.В. Роль нарушений антиоксидантного статуса организма в формировании синдрома эндогенной интоксикации у больных в токсической и терминальной стадиях перитонита//Анестезиол.реанимат.-2001.-№6.-С.31-34 Darley-Usmar V., Halliwell В. Blood radicals. Reactive nitrogen species, reactive oxygen species, transition metal ions, and the vascular system// Pharm Rev.- 1996 .-V.13-P.649-662 133 Deitch E.A., Bridges W., Berg R., et al. Hemorrhagic shock-lnduced bacterial translocation: The role of neutrophils and hydroxyl radicals// J Trauma.1990.- V.30.-P.942-961 134 Goode H.F., Webster N.R. Free radicals and antioxidants in sepsis //Crit. Care Med.- 1993 .-V.21.-P.1770-1776 135 Cuzzocrea S., Denniz P., Riley., et al. Antioxidant Therapy: A New Pharmacological Approach in Shock, Inflammation, and Ischemia/Reperfusion Injury// Pharmacol Rev.- 2001.-V.53.-P. 135-159 136 Kapoor R., Prasad К. Role of oxyradicals in cardiovascular depression and cellular injury in hemorrhagic shock and reinfusion: Effect of SOD and catalase// Circ Shock.- 1995.-V. 43.-P.79-94 137 Rhee P., Waxinan K., Clark I., et al. Superoxide dismutase polyethylene glycol improves survival in hemorrhagic shock// Am Surg.- 1991.-V. 57.-P.747-750 138 Северин Е.С. Биохимические основы патологических процессов. М.-Медицина.- 2000.-267-290 139 Снайдер С.Х., Бредт Д.С. Биологическая роль оксида азота.-В мире науки.-1992 г.-№7.-16-24 163 140 Bredt D.S., Snyder S.H. Nitric oxide: a physiologic messenger molecule//Ann.Rev.Biochem.-1994.-Vol.63.-P.175 141 Palmer R.M.J., Ferridge A.G., Moncada S. Nitric oxide releases accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor//Nature. 1987.-Vol.327.-P.524-526 142 Moncada S., Higgs A. The L-arginine nitric oxide pathway// N. Engl . Med .- 1993.-V.329.-P.2502 143 Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E. Nitric oxide: Physiology, pathophysiology and pharmacology// Pharmacol Rev .- 1991.-V.43.-P.09-141 144 Arai T., Hiromatsu K., Nishimura H. NO – radical and nitric-oxide syntase activity//Biochem.Biophys.Res.Com.-1995.-V.2313.-P.600-607 145 Griffith O.W., Stuehr D.J. Nitric oxide syntases-propetis and catalytic mechanism// Ann.Rev.Physiol. -1995.-V.57.-P.707 146 Marietta M.A. Nitric oxide synthase structure and mechanism //J Biol Chem.- 1993.-V 147 Geller D.A., Billiar T.R. Molecular biology of nitric oxide synthases//Cancer Metast.Rev.- 1998.-V. 17.-P.7-23 148 Ignarro L.J. Signal transduction mechanisms involving nitric oxide// Biochem Pharmakol .- 1991.-V.41.-P.485-490 149 Скулачев В.П. Возможная роль активных форм кислорода в защите от вирусных инфекций//Биохимия.-1998 г.-Т.63,вып.12.-С.1691-1694 150 Stuehr D.J. Structure-function aspects in the nitric oxide synthases// Ann Rev Pharmacol Toxicol.- 1997.-V. 37.-P.339-359 151 Annane D., Sanguer S., Sebille V., Faye A. Compartmentalised inducible nitric-oxide syntase activity in septic shock// Lancet.-2000.-V.355. P.1143-1148 152 Vermot C.L., Hartwig N.G., Fleer A.NO- synthase// J.Clin.Microbiol.- 1998.-Vol.36.-P.2485-2490 153 Маеда Х., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке. – Биохимия.-1998.-т.63.-вып.7.-с.1007-1019 164 154 Miles A.M., Bohle D.S., Glassbrenner P.A., et al. Modulation of superoxide-dependent oxidation and hydroxylation reactions by nitric oxide// J. Biol Chem .- 1996.-V.271.-P.40-47 155 Stamler J.S. Redox signaling: nirtosilation and related target interactions of nitric oxide//Cell.-1994.-V.78.-p.931-936 156 Huie R.E., Padmaja S. The reaction of nitric oxide with superoxide //Free Radical Res Commun.- 1993.-V. 18.-P.195-199 157 Floris A., Piersma S.R., Yang G., Jones P., Wever R. Interactions of myeloperoxidase with peroxynitrite// Eur J Biochem .- 1993 .-V.216.-P.767 158 Van der Vliet A., Smith D., O'Neill C.A., et al. Interactions of peroxynitrite with human plasma and its constituents. Oxidative damage and antioxidant depletion //Biocnem J.- 1994.-V. 303.-P.295 159 Beckman J.S., Beckman T.W., Chen J., Marshall P.A. Aparrent hydroxyl radical production by peroxinitrite implications for endothelial injuiry from nitric oxide and superoxide// Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1990.-V.87.-P.1620-1624 160 Beckman J.S. The double-edged role of nitric oxide in brain function and superoxide mediated injury// J. Dev. PhytuA.- 1991.-V.15.-P.53-59 161 Beckman J.S., Chen J., Ischiropoulos H., Crow J.P. Oxidative chemistry of peroxynitrite// Methods Enzymol.-1994.-V. 233.-P.229 162 Beckman J.S., Ischiropoulos H., Zhu L., et al. Kinetics of superoxide dismutase- and iron-catalyzed nitration of phenolic by peroxynitrite// Arch. Biochem Biophys .- 1992.-V.298.-P.438 163 Bonfoco E., Krainc D., Ankarcrona M., Nicotera P. and Lipton S.A. Apoptosis and necrosis: Two distinct events induced, respectively, by mild and intense insults with N-methyl-D aspartate or nitric oxide/superoxide in cortical cell cultures//Proc Natl Acad Sci USA.- 1995.-V.92.-P.7162-7166 164 Koppenol W.E., Moreno J.J., Pryor W.A., Ischiropoulos H., Beckman J.S. Peroxynitrite, a cloaked oxidant formed by nitric oxide and superoxide// Chem Res Toxicol .- 1992.-V.5.-P.834 165 Liew F.Y., Millott S., Parkinson C., et al. Macrophage killing of 165 Leischmania parasite in vivo is mediated by nitric oxide from L-arginin// J. Immun.1990.-V.144.-P.4794-4797 166 Malawista S.E., Montgomery R.R., Van Blaricom G. Evidence for reactive nitrogen intermediates in killing of staphylococci by human neutrophil cytoplasts – a new microbicidial pathway for polimophonuclear leukocytes// J. Clin. Invest. – 1992.-V.90.-P. 631-63 167 Weller R., Price R.C., Ormerod A.D. Antimicrobial effect of acidified nitrite on dermatophyte fungi, Candida and bacterial skin pathogens// J. Appl.Microbiol.-2001.-V.90(4).-P.648-652 168 Kaplan S. S.,Lancaster J.R., Basford R.E., Simmons R.L. Effect of nitric oxide on Staphylococcal killing and interactive effect with superoxide.Infect.Immun.-1996.-V.-64.-№1.-p.69-76 169 Fretland C.H., Anglin C., Widomski D.L. Temporal relationships of cytokine production in mouse non-lethal sepsis: effect of nitric oxide synthase inhibitors// Inflam. Res.-1997.–V.45.-p. S21-S22 170 Fuseler J.W, Conner E.M., Davis J.M., et al. Cytokine and nitric oxide production in acute phase of bacterial cell wall-induced arthritis. – Inflam.-1997.V.21.-№1.-p.113-117 171 Schmidt H.H., Walter U. NO at work//Cell.-1994.-Vol.78.-P.919-925 172 Stamler J.S. Redox signaling: nirtosilation and related target interactions of nitric oxide//Cell.-1994.-V.78.-p.931-936 173 Keyer К., Imlay J.A. Reactions of superoxide with metalloenzymes// Proc Natl Acad Sci USA.- 1996.-V. 93.-P.13635-13640 174 Kaur H., Halliwell В. Evidence for nitric oxide-mediated oxidative damage in chronic inflammation: Nitrotyrosine in serum and synovial fluid from rheumatoid patients// FEBS Lett .- 1994.-V.350.-P.9-12 175 Ma T.T., Ischiropoulos H., Brass C.A. Endotoxin-stumulated nitric oxide production increases injury and reduces rat liver chemiluminescence during reperfusion// Gastroenterology .- 1995 .-V.108.-P.463-469 176 Walhs R.A., Pamzzon K.L., Hanry D., Wasterlain C.G. Neuroprotection 166 against nitric oxide injury with inhibitors of ADP-nbosylation// Neuroreport.- 1993.P. S 245-248 177 Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Иванюшко Т.М., Хорева М.В., Емиленко Г.И. Локальная иммуноцитокинотерапия в лечении заболеваний парадонта//Иммунология.-2000.-№1.-С.46-49 178 Фрейдлин И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции//Иммунология.-2001 г.-№5.-С.4-7 179 Михальчик Е.В., Хараева З.Ф., Ковальчук Л.В., Шиян С.Д., Коркина Л.Г. Влияние интерлейкина-2 и γ-интерферона на дыхательный взрыв макрофагов: изменение углеводспецифических внутриклеточной продукции радикалов и взаимодействий//Биол.мембраны.-1996.-Том13,№4.- С.361-366 180 Kovalchuk L.V., Klebanov G.I., Ribarov S. R., et al. phagocytes by cytokines and water-soluble products Priming of of lipid peroxidation//Biomedical Sci.-1991.-Vol.2.-P.221-231 181 Wolf J., Cook G.H., Goldhammer A.R., Berkowitz S.A. Protein kinase C and priming of neutrophils//Curr.Op.Immunol.-1994.-Vol.6.-P.131-139 182 Uematsu T., Nagshima S., Umemura K., et al. Pharmacokinetics and safety of intravenous recombinant human superoxide dismutase (NK341) in healthy subjects// Int J Clin Pharmacol Ther.- 1994 .-V. 32.-P.638-641 183 Wolf J., Cook G.H., Goldhammer A.R., Berkowitz S.A. Protein kinase C and priming of neutrophils//Curr.Op.Immunol.-1994.-Vol.6.-P.131-139 184 and β Ferrante A., Nandoskar M., Walz A., Goh O. Effects of TNFα and IL-1α on human neutrophil migration, respiratory burst and degranulation//Int.Arch.Allergy. Appl.Immun.-1990.-Vol.86.-P.82-90 185 Hilger R.A., Brom J., Koller M., Koing W. Immunosupressive agents enhance the cytokin-induced priming of inflammatory cells//J.Immunol.-1993.Vol.150.-P.56 186 Фрейдлин И.С. Паракринные и аутокринные цитокиновой иммунорегуляции//Иммунология.-2001 г.-№5.-С.4-7 167 механизмы 187 Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. Клеточные и молекулярные аспекты иммунных процессов//М.-ВИНИТИ.-1989 г.-Том.19.-С.84-122 188 Portillo G., Turner M., Chantry D., Feldman M. Effect of cytokines on HLA-DR and IL-1 production by a monocytes// Immunilogy.-1989.-Vol.66.-P.170176 189 Hilger R.A., Brom J., Koller M., Koing W. Immunosupressive agents enhance the cytokin-induced priming of inflammatory cells//J.Immunol.-1993.Vol.150.-P.56 190 Павлова К.С., Шпакова А.П., Дронова В.М., Булычева Т.И., Ганковская Л.В., естественного Ковальчук комплекса Л.В. цитокинов Иммуномодулирующее на пролиферацию действие лимфоцитов и активность естественных киллеров человека in vitro//Иммунология.-2000 г. №2.-С.32-35 191 Винницкий Л.И. Проблемы клинического применения иммунокорректоров в хирургической клинике//Антибиотики и химиотер. 2000 г.-Т.45,№12.-С.12-16 192 Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета//Иммунология.1995.-№3.-С.30-36 193 Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В. Клеточные и молекулярные аспекты иммунных процессов//М.-ВИНИТИ.-1989 г.-Том.19.-С.84-122 194 Krakauer T., Oppenheim J.J. IL-1 and TNF each up-regulate both the expression of IFNγ receptors and enhance IFNγ-induced HLA-DR expression on human monocytes and a human monocytic cell Line //J.Immunol.-1993.-Vol.150.P.1205-1211 195 Larsson B.M., Larsson K., Malmberg P., Palmberg L. Gram-Positive bacteriae induce IL-6 and IL-8 production in human alveolar macrophages and epithelial cells//Inflammation.-1999.-V.23,№3.-P.217-231 196 Nagata M., Sedwick J.B., Busse W.W. Differantial effects of GM-CSF on eosinophile and neutrophile superoxide anion generation//J.Immunol.-1995.168 Vol.155.-P.4948-4954 197 MacDonald H.R., Lowental J.W. The IL-1α\ IL-β receptor interaction//Ann.Inst.Pasteur. Immun.-1997.-Vol.138.-P.482-485 198 Миронов П.И., Руднов В.А. Проблемы и перспективные направления коррекции медиаторного ответа при сепсисе//Анестез.реанимат.1999 г.-№3.-С.54-57 199 Васильева Г.И., Иванова И.А., Тюкавкина С.Ю. Кооперативное взаимодействие моно- и полинеуклеарных фагоцитов, опосредованное моно- и нейтрофилокинами//Иммунология.-2000 г.-№5.-С.11-17 200 Дамбаева С.В., Мазуров Д.В., Голубева Н.М., Пинегин Б.В. Влияние некоторых иммуномодуляторов на функциональную активность фагоцитарных клеток периферической крови доноров//Иммунология.-2000 г. №6.-С.15-19 201 Okayama N., Coe L., Itoh M., Steven J.A. Exogenous nitric oxide increases neutrophil adhesion to cultured human endothelial monolayers through a protein kinase G dependent mechanism//Inflam.-1999.-Vol.23,№1.-P.37-51 202 эффекты Ганова Л.А., Спивак Н.Л., Знаменский В.А. Иммуномодулирующие интерферона-α при инфекции Pseudomonas aeroginosa//Бюлл.экспер.биол.мед.-1996 г.-№8.-С.124-126 203 активности Лазаренко Л.Н. Модуляция фагоцитарных интерферонами клеток при функциональной стафилококковой инфекции//Автореф.к.б.н.-Киев.- 1991г.-С.17 204 Зубова С.Г., Окулов В.Б. Молекулярные механизмы действия фактора некроза опухоли α и трансформирующего фактора роста β в процессе ответа макрофага на активацию//Иммунология.-2001 г.-№5.-С.18-22 205 Масычева В.И., Даниленко Е.Д., Морозова Е.Н., Федосова Л.К., Сизова Л.Ю., Гамалей С.Г., Лебедев Л.Р., Пустошилова Н.М. Изучение токсических свойств рекомбинантного фактора некроза опухоли//Антибиотики и химиотер.-1997 г.-Т.42,№4.-С.24-28 206 Ковальчук Л.В., Чередеев 169 А.Н. Иммунорегуляторная роль моноцитов в норме и при патологии//ВИНИТИ.-Серия: Иммунология.\1991г.Том 27.-С.1-220 207 Yang G., Candy T.E.G., Boaro M., Wilken H.E., Jones P., Nazhat N.B., Saadalla Nazhat R., Blake D. Free radical yields from the homolysis of peroxynitrite-`acid// Free Radic Biol Med.- 1992.-V. 12.-P.327 208 Авербах М.М. Иммунологические аспекты чувствительности и резистентности к генерализованной стафилококковой инфекции/Автореф.д.м.н.-М.-1995 г.-С.34 209 and β Ferrante A., Nandoskar M., Walz A., Goh O. Effects of TNFα and IL-1α on human neutrophil migration, respiratory burst and degranulation//Int.Arch.Allergy. Appl.Immun.-1990.-Vol.86.-P.82-90 210 Бисенков Л.Н., Саламатов А.В., Чуприна А.П. //Хирургическое общество Пирогова. Заседание 2127:Сборник докладов -М.-1998 г.-С.5-7 211 Брусов О.С., Герасимов А.М., Панченко Л.Ф. Влияние природных ингибиторов радикальных реакций на автооксиление адренилина//Бюлл.экспер.биол.мед.-1976 г., №1.-С.33-35 212 Бухарин О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий//ЖМЭИ.-1994 г.-Приложение - С.4-13 213 Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хуснутдинова Л.М. Некоторые особенности микрофлоры миндалин и межмикробного взаимодействия (в норме и при патологии)//ЖМЭИ.-2000 г.-№4.-С.82-84 214 Журавлев В., Руднов В. Уросепсис: этиология, патогенез, лечение//Врач.-2000 г.-№10.-С.20-24 215 Акатов А.К., Зуева В.С. Стафилококки/М.-Медицина.-1983 г. С.201-224 216 Ахметова Л.И., Розанова С.М., Перевалова Е.Ю. Распространенность и антибиотикочувствительность метициллинрезистентных стафилокок-ков//Клин.лаб.диагностика.-1998г., №9.-С.10 217 Дерябин Д.Г., Шагинян И.А. Вирулентность и персистенция стафилококков: фенотипические проявления и механизмы генетического 170 контроля//ЖМЭИ.-2000 г.-№4,-Приложение - С.36-43 218 Афанасьева Т.И. Метициллинрезистентные стафилококки//Антибиотики и химиотер.-1998 г.-Т.43,№6.-С.29-32 219 Васина Этиотропная Т.А., Булава Г.В., антибиотикотерапия Меньшиков больных с Д.Д., Хватов В.Б. гнойно-воспалительными процессами//Антибиотики и химиотер.-1998 г.-Т.43,№11.-С.28-34 220 Меньшиков Д.Д., Васина Т.А., Воленко А.В., Залочуева Г.В., Васильев В.А. Влияние лекарственных препаратов различных групп на течение экспериментальных местных гнойно-воспалительных процессов//Антибиотики и химитер.-1995 г.-Т.40,№10.-С.30-35 221 Horsburgh M.J., Ingham E., Foster S.J. In Staphylococcus aureus is an interactive regulator with PerR, contributes to virulence, and is necessary for oxidative stress resistance through positive regulation of catalase and iron homeostasis// J.Bacteriol-2001.-Vol.183(2).-P.468-475 222 Позур В.К., Иммуносупрессивная Борисова Е.В., активность Фуртат И.М., пептидогликана Борисов В.А. Staphylococcus aureus//ЖМЭИ.-1995 г.,№1.-С.56-58 223 Чернова О.А. Персистенция стафилококков как модель системы «паразит-хозяин»//Автореф.д.б.н.-Пермь.-2000 г.-С.38 224 Михайлов С.П. Патогенетическое значение антилизоцимной активности возбудителя при сальмонеллезной инфекции//Автореф.дис.к.м.н.Челябинск.-1986 г.-С. 25 225 Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство/Екатеринбург.- 1996 г.-С.207 226 Федосеева К.Е. Антилизоцимная активность шигелл и ее значение в патогенезе и лечении острой дизентерии//Автореф.дис.к.м.н.-Челябинск.1985 г.-С.26 227 Keyer К., Imlay J.A. Reactions of superoxide with metalloenzymes// Proc Natl Acad Sci USA.- 1996.-V. 93.-P.13635-13640 228 Кулаев И.С., Северин А.И., Абрамочкин Г.В. Бактериологические 171 ферменты микробного происхождения в биологии и медицине//Вестник АМН СССР.-1984.-№8.-С.64-69 229 Кулаков В.В., Пинегин Б.В. Влияние некоторых иммуномодуляторов на функциональную активность нейтрофилов здоровых доноров//Иммунология.-1997 г.-№5.-С.44-47 230 Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов/М.-1987 г. С. 350 231 Мальшакова И. Л. Роль типового антигена Shigella flexneri в устойчивости бактерий к оксидативному стрессу//ЖМЭИ.-2000 г.-№4. Приложение.-С.76-77 232 С.Р. Cаямов Связь соотношения активности экстра- и интрабактериальной каталазы Yersinia pestis с их устойчивостью к перекиси водорода и уровнем вирулентности//ЖМЭИ.-1996 г.-№6.-С.60-61 233 Арцимович Н.Г., Настоящая Н.Н. .Антибиотики как регуляторы иммунитета//Гематология и трансфузиол.-1992 г.-Т.11., №12.-С.40-42 234 циластина Белобородов и В.Б. меропенема Мировой в опыт применения клинической имипенема, практике//Инфекции и антимикроб.терапия.-1999г.-Т.1, №2.-С.46-50 235 Блатун Л.А. и др. Опыт применения нетилмицина в борьбе с инфекцией в отделении интенсивной терапии. Использование современных аминогликозидов: Материалы симпозиума//М.-1998г.-С.156 236 Хмелевская И.Г., Ковальчук Л.В. Иммунокорригирующее и протективное действие протеолитических ферментов на антителогенез у мышей при стафилококковой инфекции и применении антибиотиков//ЖМЭИ.2001г.-№1.-С.54-56 237 Чечекин полярографическим восстановлении Г.В. Изучение методом некоторых при генерации химическом производных оксида и азота (NO) электрохимическом N-нитропиразола и 5- нитрофурана//Автореф.дис.к.ф.н.-М.-1998.-С. 19 238 Ахметова Л.И., Розанова 172 С.М., Перевалова Е.Ю. Распространенность и антибиотикочувствительность метициллинрезистентных стафилокок-ков//Клин.лаб.диагностика.-1998 г., №9.-С.10 239 Mihalache D., Luca V., Teodorescu I. Nosocomial staphylococcal meningitis//Clin.Microbiol.Infection 9-th European Congress, Berlin,Germany, March 21-24, 1999.-V.5,Supplement 3.-P.623 240 Пинегин Б.В., Андронова Т.М., Карсонова М.И., Хаитов Р.М. Современные представления об иммунопрофилактике и иммунотерапии хирургических инфекций//Анестез.реанимат.-1999 г.-№3.-С.61-65 241 Белломо Р., Ронко К. Очищение крови при сепсисе: целесообразная гипотеза или напрасная трата времени//Анестез. Реаниматол.-2002 г.-№2. С.76-79 242 Павлова К.С., Шпакова А.П., Дронова В.М., Булычева Т.И., Ганковская Л.В., естественного Ковальчук комплекса Л.В. цитокинов Иммуномодулирующее на пролиферацию действие лимфоцитов и активность естественных киллеров человека in vitro//Иммунология.-2000 г. №2.-С.32-35 243 Струсов В.В., Кузнецов В.П., Беляев Д.А. //Антибиотики и химиотер.-1992 г.-Т.37,№2.-С.40-44 244 Тарасенко В.С., Смолягин А.И., Кубышкин В.А. Особенности иммунного статуса при остром панкреатите//Хирургия.-2000 г.-№8.-С.51-54 245 Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Иванюшко Т.М., Хорева М.В., Емиленко Г.И. Локальная иммуноцитокинотерапия в лечении заболеваний парадонта//Иммунология.-2000 г.-№1.-С.46-49 246 Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Иванюшко Т.М., Буданова Е.В., Шабанова Н.А. Роль цитокинов в механизмах развития хронического воспаления в ткани парадонта//Иммунология.-2000 г.-№6.-С.24-28 247 Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. Иммуноцитокины и локальная иммунокоррекция//Иммунология.-1995 г.-№1.-С.4-7 248 Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Иванюшко Т.М., Буданова Е.В., Шабанова Н.А. Роль цитокинов в механизмах 173 развития хронического воспаления в ткани парадонта//Иммунология.-2000 г.-№6.-С.24-28 249 Docke W., Randow F., Syrbe U. Molecular aspectes of septic conditiones//Nature Med.-1997.-Vol.3.-P.678-681 250 Кручинский Н.Г., Савельев В.А. Влияние гемосорбции на состояние системы гемостаза у больных с сепсисом//Хирургия.-1997.-№7.-С.44-47 251 Bashir S., Hams G., Denman M.A., et al. Oxidative DNA damage and cellular sensitivity to on dative strew in human autoimmune diseases// Ann Rheum Die 1993.-V.52.-P.659-666 252 Black S.C., Schasteen C.S., Weiss R.H., et al. Inhibition of in vivo myocardial ischemic and reperfusion injury by a synthetic manganese-based superoxide dismutase mimetic// J. Pharmacol Exp Ther.- 1994.-V.270.-P.1208-1215. 253 Fines B.N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer// Free Radical Res Commun.- 1989.-V. 7.-P.121-128 254 Павлюченко И.И., Быков М.И., Гуменюк С.Е. Состояние основных компонентов прооксидантно-антиоксидантной системы у хирургических больных с перитонитом// Int.J.Immunoreabil.-2001 г.-Том3,№3.-С.87-93 255 Бобырев В.Н., Воскресенский О.Н. Антиоксиданты в клинической практике//Тер.архив.-1989 г.-Т.61.-№3.-С.122-126 256 Meister A. On the antioxidant effects of ascorbic acid and glutathione// BiochemPharmacol .- 1992.-V.44.-P.1905-1915 257 Bashir S., Hams G., Denman M.A., et al. Oxidative DNA damage and cellular sensitivity to on dative strew in human autoimmune diseases// Ann Rheum Die 1993.-V.52.-P.659-666 258 эффекты Ганова Л.А., Спивак Н.Л., Знаменский В.А. Иммуномодулирующие интерферона-α при инфекции Pseudomonas aeroginosa//Бюлл.экспер.биол.мед.-1996 г.-№8.-С.124-126 259 Гельфанд Б.Р. Инфекционно-токсический шок при гнойном перитоните//Анестез.реаниматол.-1984 г.-№5.-С.25-28 260 Гельфанд Б.Р. Антибактериальная хирургической инфекции//М.-2000 г.-С.270 174 терапия абдоминальной 261 Винницкий Л.И. Проблемы клинического применения иммунокорректоров в хирургической клинике//Антибиотики и химиотер.2000.-Т.45,№12.-С.12-16 262 Lebovitz R.M., Zhang H., Vogel H., et al. Neurodegeneration, myocardial injury and perinatal death in mitochondrial superoxide dismutasedeficient mice// Proc Natl Acad Sci USA.- 1996.-V. 93.-P. 9782-9787 263 Macrae, R., Robinson, R. K., Sadler, M. J.Cytokines and antimicrobial activity of macrophages //Eds. Academic Press: New York, 1993.- Vol. 6.- P. 35483553 264 Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Чернова О.Л. Патогенетические особенности формирования бактерионосительства//ЖМЭИ.-1996 г.-№2. С.98-101 265 Тихомирова О.В. Клинико-патогенетичнские аспекты дифференицальной диагностики и терапии дифтерии, ангины и мононуклеоза у детей//Автореф.д.м.н. –СПб. -1999 г.-С.32 266 Marletta M.A. Nitric oxide syntase: aspects concerning structure and catalisis//Cell.-1994.-V.78.-p.927-930 267 Bone R.C. American of Chest Physicians Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapy in sepsis//Crit.Care Med.-1996.-V.24.P.1125-1128 268 Bone R.C.New classification of sepsis and organ failure //Chest.-1992.- V.101.-P.1644-1655 269 Павлюченко И.И., Быков М.И., Гуменюк С.Е. Состояние основных компонентов прооксидантно-антиоксидантной системы у хирургических больных с перитонитом// Int.J.Immunoreabil.-2001 г.-Том3,№3.-С.87-93 270 Земсков В.М., Караулов А.В., Земсков В.М. Комбинированная иммунокоррекция/М.-Наука.-1994 г.-С.560 271 Maeda H., Akaike T., Yoshida M., Suga M. Multiple functions of nitric oxide in pathophisilogy and microbiology: analysis by a new nitric oxide 175 scavenger//J.Leukoc.Biol.-1994.-V.56,№5.-P.588-592 272 Black S.C., Schasteen C.S., Weiss R.H., et al. Inhibition of in vivo myocardial ischemic and reperfusion injury by a synthetic manganese-based superoxide dismutase mimetic// J. Pharmacol Exp Ther.- 1994.-V.270.-P.1208-1215. 273 Тихомирова О.В. Особенности процессов перекисного окисления липидов и активнгости ферментов антиоксидантной защиты в клетках крови у детей, больных острыми респираторными вирусными инфекциями, и пути корригирующей терапии//Автореф.к.м.н.-СПб.-1992 г.-С.25 274 Рябиченко Е.В., Бондаренко В.М., Рябиченко В.В. Роль активных форм кислорода, генерируемых фагоцитами в патогенез заболеваний//ЖМЭИ.2000 г.-№4,Приложение - С.65-71 176
