На правах рукописи Мураева Наталия Алексеевна Возрастные
advertisement
На правах рукописи Мураева Наталия Алексеевна Возрастные аспекты приспособления иммунной системы к действию хронического стресса 03.00.25 гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград - 2006 Работа выполнена в Волгоградском государственном медицинском университете. Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Капитонова Марина Юрьевна член-корр.РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Сергей Львович Официальные оппоненты: - доктор медицинских наук, профессор Павлов Алексей Владимирович - доктор медицинских наук, профессор Хлопонин Петр Андреевич Ведущая организация – Российский университет Дружбы народов Защита состоится «______»__________________2006г. в ______час. на заседании Диссертационного совета Д 208.008.01 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400066 Волгоград, пл.Павших борцов, 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета (400066 Волгоград, пл.Павших борцов, 1). 29 сентября Автореферат разослан «______»__________________2006г. Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Зайченко Светлана Ильинична 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Организм человека и животных отвечает на стресс интегрированной реакцией иммунной, нервной и эндокринной системы. Стресс по-разному влияет на различные звенья иммунного ответа (клеточный и гуморальный иммунный ответ, Т- и В-клеточные реакции, врожденный и приобретенный иммунитет) и производит неодинаковое действие на центральные и периферические органы иммунной защиты, а также на различные компартменты этих органов (М.Р.Сапин и Д.Б.Никитюк, 2000;. L.S.Gazda et al., 2003; S.K. Butcher et al., 2004; M.E.Bauer, 2005; R.Avitsur et al., 2006). Большинство исследователей однозначно трактуют действие стресса на иммунную систему как супрессивное (H.Engler et al., 2003; D.A.Padgett et al., 2003), однако другие указывают на его иммунопотенциирующее действие et al., 1999; D.C.Nieman et al., 1999), а третьи отмечают (F.S.Dhabhar неспособность стресса изменить иммунный статус организма (S.B.Pruett, 2001; V.Posevits et al., 2003). Ряд исследователей доказывают, что хронический стресс подавляет иммунный ответ (М.В.Тендитник и др., 2004; B.Obminska-Mrukowicz, 2005), в то время как острый стресс является иммуностимулирующим (R.Archana et al., 2000; B.S. McEwen et al., 2003), при этом другие исследователи демонстрируют угнетение иммунных функций при остром стрессе (H.Oya et al., 2002; M.Fleshner et al., 2005) или, напротив, указывают на усиление иммунного ответа при повторных действиях стрессоров (Л.В.Волкова, 1996; S.Zalcman et al., 1993). Многочисленные противоречия, встречающиеся в современной литературе по нейроиммуноэндокринологии стресса, касающиеся не только диапазона и механизмов адаптационных перестроек в иммунных органах, но и направленности постстрессовых иммуномодуляционных изменений в них, во многом объясняются тем, что большинство исследований проводится без учета компартментализации лимфоидных органов и взаимообусловленности 3 перестроек в центральном и периферическом звене иммунной системы. Наименее изученным является влияние стресса на иммунный статус организма на ранних стадиях постнатального онтогенеза в условиях функциональной незрелости органов иммунной защиты (M.Capri et al., 2000; B.Morein et al., 2002; A.Dakic et al., 2004; M.A.Firth et al., 2006). В этой связи мы провели, используя иммуногистохимические методы исследования и имидж-анализ, экспериментальное изучение влияния разных видов хронического психоэмоционального стресса на органы центрального и периферического звена иммунной системы в раннем постнатальном онтогенезе. Цель исследования. Целью настоящего исследования является экспериментальное изучение приспособительных возможностей центрального и периферического звена иммунной системы при хроническом психоэмоциональном стрессе в раннем постнатальном онтогенезе. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Определить соотношение структурных и иммуноцитохимических изменений, развивающихся в центральном (тимус) и периферическом (селезенка, лимфатические узлы) звене иммунной системы растущего организма при хроническом психо-эмоциональном стрессе различной силы. 2. Выявить механизмы иммуномодулирующего действия хронического психоэмоционального стресса на уровне центрального и периферического звена иммунной системы в раннем постнатальном онтогенезе. 3. Дать сравнительную характеристику изменений иммунных параметров в компартментах центральных и периферических иммунных органов, характеризующих врожденный и приобретенный иммунный ответ. Научная новизна исследования. Настоящее количественное иммуногистохимическое исследование позволило получить новые данные о 4 диапазоне, направленности и механизмах иммуномодуляционного действия хронического стресса, преювенильным начиная периодом, с и грудного впервые возраста выявить и заканчивая закономерности адаптационных изменений в центральном и периферическом звене иммунной системы при различной силе стрессорного воздействия. Теоретическое возрастной значение работы опосредованности иммуномодулирующего действия заключается в выявлении особенностей хронического механизмов стресса в растущем организме. Практическая значимость работы заключается в выделении наиболее информативных иммуноморфологических параметров стрессиндуцированных сдвигов в центральных и периферических органах иммунной защиты для оценки глубины акцидентальной иммуносуппрессии и применения при разработке иммунокоррегирующих лечебных схем. Внедрение в практику: полученные научные данные используются в учебном процессе на кафедре иммунологии и аллергологии и на кафедре анатомии человека ВолГМУ. Публикации и апробация материалов диссертации. Материалы диссертации были доложены на заседании Волгоградского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов (ноябрь, 2003 г.), конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Паттайа (Тайланд), 15-25 января 2005 года; III Всемирном конгрессе по клинической патологии и реабилитации в медицине, Паттайя (Тайланд), 4-11 февраля 2005 года; II научной конференции с международным участием «Современные проблемы науки и образования», г. Умаг (Хорватия), 2-9 июля 2005 года; юбилейной конференции с международным участием «Современные проблемы науки и образования», г. Москва, 5-6 декабря 2005 года; научной конференции с международным 5 участием «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии», г.Сусс (Тунис), 11-18 июня 2006г. Результаты исследования отражены в 7 публикациях, 2 из которых – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 4 - в материалах научных конференций с международным участием. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Соотношение адаптационных иммуномодуляционных изменений в центральном (тимус) и периферическом (селезенка, лимфатические узлы) звеньях иммунной системы на ранних этапах постнатального онтогенеза опосредовано возрастом и связано с силой стрессорного воздействия. 2. Диапазон и направленность изменений иммуноморфологических параметров, связанных с реализацией реакций врожденного и приобретенного иммунного ответа, имеют свою специфику в грудном, подсосном и инфантном периодах раннего постнатального онтогенеза. 3. Период перехода на самостоятельное питание характеризуется максимальной чувствительностью как центрального (тимус), так и периферического (селезенка, лимфатические узлы) звена иммунной системы к действию хронического психо-эмоционального стресса. Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I – обзора литературы, содержащего характеристику органов иммунной системы и в норме и при иммуномодулирующем действии стресса с учетом возрастных особенностей, и части II, представленной тремя главами с описанием материала и методов исследования, результатов, обсуждения полученных данных и выводов. Диссертация содержит 3 таблицы и 52 рисунка, из них 43 – микрофотографии гистологических препаратов. указатель содержит 268 ссылок, включая Библиографический 38 отечественных и 230 зарубежных источников. 6 Содержание работы Материалы и методы исследования. Исследование выполнено на 72 экспериментальных животных (белых крысах породы Sprague Dawley) трех групп: 14-, 21- и 30-дневного возраста, что соответствует грудному возрасту, периоду перехода на самостоятельное питание и инфантному возрасту (T.B.Poole, 1987), по 24 животных в группе. В каждой возрастной группе животные поровну подразделены на 3 подгруппы: 1-я экспериментальная подгруппа, животные которой испытывали хронический иммобилизационный стресс, помещенные в перфорированные пластиковые пеналы; 2-я экспериментальная подгруппа, животные которой подвергались действию хронического иммерсионноиммобилизационного стресса (K.Takagi et al., 1964), и контрольная группа: по 8 особей в каждой подгруппе. Экспериментальные животные подвергались действию хронического стресса в течение 7 дней по 5 часов ежедневно, после чего забивались под анестезией; тимус, селезенка, брыжеечные лимфатические узлы, а также надпочечники извлекались и взвешивались; слизистая оболочка желудка оценивалась микроскопически. Лимфоидные органы фиксировались формалином и заливались в парафин. На гистологических срезах тимуса, селезенки и лимфатических узлов, окрашенных гематоксилин-эозином, по Ван Гизону и Массону, а также иммуногистохимически на CD3 - маркер Т-лимфоцитов (клон 1F4, “Serotec”, #MCA 772); CD8 - маркер двойных позитивных тимоцитов, зрелых Тсупрессоров и NK-клеток (клон MRC OX8; “Serotec”, #MCA48G); CD4 маркер Т-хелперов, тимоцитов и макрофагов (клон W3/25; “Serotec”, #MCA55R); CD45RC (клон MRC OX22; “Serotec”, #MCA53R), CD90 - маркер тимоцитов, недавних тимусных иммигрантов (клон HIS51, “BD Pharmingen”, #550570), гранзим Б - маркер гранул цитолитических лимфоцитов (клон GB7, “Serotec”, #MCA 2118); произведена оценка динамики клеточных популяций иммуноцитов в компартментах центрального (тимус) и периферического 7 (селезенка, лимфатические узлы) звеньев иммунной системы, характеризующей приобретенный и врожденный иммунный ответ. Для выявления механизмов адаптационных изменений в иммунной системе при стрессе применено также иммуногистохимическое окрашивание исследуемых органов на PCNA – ядерный антиген пролиферирующих клеток (клон РС10, «Serotec», #MCA1558), каспазу-3 – ключевой фермент апоптозного каскада (Serotec #AHP476), для оценки уровня пролиферации и гибели клеток. Использован компьютерный анализ изображения (программа Image Pro Plus, сопряженная с программой Excel для статистической обработки полученных результатов иммуногистохимического исследования). Полученные результаты и их обсуждение Результаты оценки динамики массы тела в нашем исследовании представлены на рис. 1. Во всех возрастных группах имело место достоверное уменьшение массы тела у экспериментальных животных обеих групп по сравнению с контрольными животными, однако уровень значимости в возрастных группах был различным при иммерсионноиммобилизационном стрессе, и максимальным - в возрастной группе, соответствующей переходу на самостоятельное питание. Особенности возрастной динамики относительной массы тимуса, позволяющей оценить степень инволюции органа вне зависимости от общего роста организма, отражены на рис.2. Как следует из рисунка, в норме относительная масса тимуса увеличивается в течение 4-ой недели, в то время как на 5-ой неделе она уменьшается, снижаясь, хотя и не достоверно, относительно исходного уровня в возрасте 20 дней. Такая же возрастная динамика относительной массы тимуса наблюдается в обеих экспериментальных группах. 8 Рис 1. Возрастная динамика массы тела крыс (г) в норме и при хроническом стрессе. 90 80 70 60 79,37 50 72,05 69,34 * 40 ** * 30 20 27,04 *** 38,95 29,12 33,09 10 20,93 23,02 0 контроль иммобилизационный стресс (1-я гр.) - 20 дней иммобилизационный стресс (2-я гр.) - 27 дней - 36 дней * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001 К 36-дневному возрасту в обеих экспериментальных группах относительная масса тимуса также несколько снижается относительно его значения в 20-дневном возрасте. Отмеченная динамика относительной массы тимуса у контрольных животных соответствует представлениям о раннем начале возрастной инволюции тимуса, которая у грызунов начинается задолго до начала полового созревания (L.Dominguez-Gerpe et al., 2003). При хроническом стрессе достоверное снижение относительной массы тимуса отмечается только при иммерсионно-иммобилизационном стрессе с различным уровнем значимости во всех возрастных подгруппах. Результаты вычисления относительной массы селезенки представлены на рис.3. Как следует из рисунка, динамика здесь была иной, чем у относительной массы тимуса. 9 Рис. 2. Возрастная динамика относительной массы тимуса крыс (%) в норме и при хроническом стрессе. 0,5 0,45 0,4 0,35 0,415 ** 0,453 ** 0,3 0,404 0,25 0,348 0,384 0,347 0,323 0,342 * 0,290 0,300 0,287 0,2 0,15 0,1 0,05 0 контроль иммобилизационный стресс - 20 дней иммерсионноиммобилизационный стресс - 27 дней - 36 дней * p<0.05; ** p<0.01 Данный показатель неуклонно уменьшался с возрастом, как в контроле, так и в обеих экспериментальных группах, и был ниже у экспериментальных животных обеих групп по сравнению с контрольными особями, но уровня значимости это различие достигало лишь во 2-ой экспериментальной группе по всем возрастным подгруппам с одинаковой степенью достоверности. Между экспериментальными группами каждого возраста различий также выявлено не было. Снижение относительной массы селезенки в 1-ой и 2-ой экспериментальной группе соответственно составило для младшей возрастной группы 12,9% и 26,6%; для средней возрастной группы 20,8% и 28,9%; для старшей возрастной группы 12,9 и 27,2%. 10 Рис. 3. Возрастная динамика относительной массы селезенки крыс при хроническом стрессе (%). * p<0.05 0,6 0,5 0,549 Результаты вычисления 0,478 0,4 относительной *массы селезенки 0,512 представлены в рис 3. Как следует из рисунка, динамика* здесь была 0,3иной, 0,403 * 0,406 чем у относительной массы тимуса. Данный показатель 0,427 0,372 0,346 0,311 0,364 неуклонно уменьшался с возрастом как в контроле, так и в обеих 0,2 экспериментальных группах, был ниже у экспериментальных 0,1 животных по сравнению с контрольными, но уровня значимости это 0различие достигало лишь во 2-ой экспериментальной группе по всем контроль иммобилизационный стресс иммерсионно- возрастных группам с одинаковой степенью достоверности (p<0.05). иммобилизационный стресс - 20 дней - 27 дней - 36 дней Между экспериментальными группами каждого возраста различий *p<0.05 Таким образом, сравнение возрастной динамики относительной массы тимуса и селезенки показало, что полного параллелизма в ней не наблюдается, и стресс-индуцированные изменения в центральном (тимус) и периферическом (селезенка) органах иммунопоэза подчиняются различным закономерностям. Вместе с тем, как для органов центрального, так и периферического звена, просматривается отчетливая тенденция: наибольшая степень стресс-ассоциированного снижения изученных показателей отмечается у крыс в подсосный период, что может быть связано с особенно высокой чувствительностью органов иммуногенеза к действию стресса именно в период перехода на самостоятельное питание. Из литературных данных известно, что количество Т-лимфоцитов в тимусе и селезенке пропорционально весу этих органов (H.J.Hosea et al., 2003). Однако для получения данных о тонких механизмах стресс-индуцированной иммуносуппрессии нам потребовалось применить более точные методы 11 исследования: иммуногистохимическую оценку гистологических срезов с последующим цифровым анализом изображения. Оценка микроскопического строения органов иммунной системы контрольных животных также показала отсутствие параллелизма возрастной динамики в центральном (тимус) и периферическом (селезенка, лимфатические узлы) звеньях иммунной системы. Так тимус контрольных животных младшей соответствующим возрастной грудному группы периоду, с исходным возрастом, обнаруживает признаки функциональной зрелости, в то время как в селезенке и лимфатических узлах отмечается недоразвитие как В-, так и Т-клеточных компартментов. У контрольных животных средней возрастной группы в тимусе по сравнению с младшей возрастной группой отмечаются изменения, заключающиеся в незначительном усилении лимфофагоцитоза и появлении телец Гассаля, в то время как в селезенке и лимфатических узлах наблюдаются признаки быстро нарастающей функциональной зрелости: рост лимфоидных узелков и появление в них первых центров размножения, кроме того в селезенке – значительное расширение белой пульпы, дифференцировка наружной и внутренней зоны в крупных периартериальных лимфоидных влагалищах (ПАЛВ), а в лимфатических узлах - расширение периартериальной зоны. В старшей возрастной группе, соответствующей инфантному периоду, в тимусе появляются отчетливые признаки возрастной инволюции: снижение корковомозгового соотношения, увеличение числа телец Гассаля, дальнейшее нарастание интенсивности лимфофагоцитоза в корковом веществе. В противоположность этому, периферические органы иммунной системы продолжали наращивать признаки функциональной зрелости, характеризующие в меньшей степени Т- и в большей степени - В-зоны селезенки и лимфатических узлов. В обеих экспериментальных группах всех возрастных подгрупп в лимфоидных органах отмечались признаки акцидентальной инволюции, выраженность которых была сильнее при «жестком» иммерсионно12 иммобилизационном стрессе по сравнению с «мягким» иммобилизационным стрессом. В тимусе они заключались в резком снижении клеточности в большей степени коркового вещества и в меньшей степени – мозгового, стирании границы между корковым и мозговым слоем, значительном уменьшении корково-мозгового соотношения вплоть до инверсии слоев, резком усилении лимфофагоцитоза в корковом веществе, формировании кистозно измененных телец Гассаля в мозговом веществе, огрубении соединительнотканной стромы и расширении междольковых промежутков. В селезенке и лимфатических узлах отмечалось сужение паракортикальной зоны в лимфатических узлах и ПАЛВ в селезенке с усилением лимфофагоцитоза в Т-клеточных зонах, уменьшение числа и размеров лимфоидных фолликулов с исчезновением в них герминативных центров и дезорганизацией их стромы, сужение маргинальной зоны в селезенке. При этом в тимусе изменения были максимальными в подсосном периоде, а в селезенке – в инфантном, что также является проявлением асимметрии стресс-ассоциированных иммуномодуляционных изменений в центральных и периферических органах иммуногенеза. Еще одной интересной закономерностью является большая степень различия гистологической картины иммуносуппрессии в лимфоидных органах между экспериментальными подгруппами в инфантном возрасте по сравнению с грудным и подсосным периодом, что предполагает необходимость определенного уровня функциональной зрелости для дифференцированной адаптационной иммуномодуляции при действии стрессоров различной силы. Более выраженные иммуносуппрессивные сдвиги в селезенке по сравнению с лимфатическими узлами могут быть связаны с относительной возрастной функциональной незрелостью последних по сравнению с селезенкой. С различной функциональной зрелостью Т- и В-клеточных компартментов может быть связана и разная степень деструктивно-дегенеративных изменений в них как в селезенке, так и в лимфатических узлах, в различные возрастные периоды. В грудном и подсосном периодах обнаружена большая 13 степень изменений по сравнению с контролем в Т-зонах, а в инфантном периоде – в В-зонах периферических иммунных органов. Иммуногистохимическое данные гистологического исследование анализа, в основном дополнив подтвердило их деталями, характеризующими иммунный статус лимфоидных органов. Результаты иммуногистохимического окрашивания на CD8, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что данный показатель реакций приобретенного иммунного ответа был одним из наиболее чувствительных в оценке иммуносуппрессивных сдвигов в тимусе и селезенке при хроническом стрессе. Он достоверно с разным уровнем значимости различался у экспериментальных и контрольных животных всех возрастных групп при обоих видах стресса. Таблица 1. Динамика распределения СD8+клеток в тимусе и селезенке крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, M+/-m, %). группа грудной период возраст подсосный период инфантный период тимус селезенка тимус селезенка тимус селезенка контроль 19.74 ± 2.13 17.96 ± 1.94 21.69 ± 2.05 23.78 ± 2.21 22.45 ± 2.38 25.04 ± 2.62 иммобилизационный стресс 14.30 ± 1.44* 13.49 ± 1.39 14.16 ± 1.35** 16.55 ± 1.63** 16.06 ± 1.39* 17.97 ± 1.84* иммерсионно11.68 10.99 9.34 10.48 12.03 14.56 иммобилизаци± 1.21** ± 1.22** ± 0.97*** ± 1.10*** ± 1.47*** ± 1.65** оный стресс M – средняя арифметическая m – ошибка репрезентативности *- p<0.05, при сравнении с контролем ** - p<0.01, при сравнении с контролем *** - p<0.001, при сравнении с контролем 14 При этом наибольшие сдвиги по данному иммунному параметру отмечены в средней возрастной группе, соответствующей периоду перехода на самостоятельное питание. Как в тимусе, так и в селезенке, изменения по сравнению с контролем были более значимыми в старшей возрастной группе, чем в младшей группе. Результаты иммуногистохимического окрашивания на PCNA представлены в таблице 2. Как следует из таблицы, экспрессия РСNA поразному снижалась при хроническом стрессе у тимоцитов и спленоцитов: с большей достоверностью у крыс, перенесших стресс в инфантном периоде по сравнению с крысами, взятыми в эксперимент в период грудного возраста. Таблица 2. Динамика распределения PCNA+клеток в тимусе и селезенке крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, M+/-m, %). группа грудной период возраст подсосный период инфантный период тимус селезенка тимус селезенка тимус селезенка контроль 15.78 ± 1.58 25.13+/2.66 14.46 ± 1.58 23.74 ± 2.15 16.71 ± 1.73 21.39 ± 2.24 иммобилизационный стресс 11.53 ± 1.23* 19.06 ± 1.90 9.43 ± 0.95** 16.39 ± 1.75** 12.13 ± 1.3* 15.55 ± 1.82* иммерсионно9.89 15.38 иммобилизаци± 0.90** ± 1.57** оный стресс M – средняя арифметическая 7.94 12.51 9.05 12.09 ± 0.85*** ± 1.39*** ± 0.93*** ± 1.52*** m – ошибка репрезентативности *- p<0.05, при сравнении с контролем ** - p<0.01, при сравнении с контролем *** - p<0.001, при сравнении с контролем Отмечается определенный параллелизм в стресс-индуцированном снижении данного показателя в тимусе и селезенке при обоих видах стресса в старших возрастных группах. При этом наибольшие различия по данному 15 показателю между двумя экспериментальными группами как в тимусе, так и в селезенке, отмечены в старшей возрастной группе, что свидетельствует о необходимости определенной степени зрелости иммунной системы для дифференцировки силы стрессорного воздействия. Таблица 3. Динамика распределения каспаза-3+клеток в тимусе и селезенке крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, M+/-m, %). группа грудной период возраст подсосный период инфантный период тимус селезенка тимус селезенка тимус селезенка контроль 6.84 ± 0.73 8.16 ± 0.89 9.49 ± 0.87 7.51 ± 0.82 8.95 ± 0.91 9.75 ± 0.89 иммобилизационный стресс 8.79 ± 1.05 11.01 ± 1.26* 11.52 ± 1.12 10.64 ± 1.05* 11.86 ± 1.13* 13.45 ± 1.44* иммерсионно11.52 12.28 иммобилизаци± 1.31** ± 1.47* оный стресс M – средняя арифметическая 14.71 15.34 13.57 16.24 ± 0.85*** ± 1.58*** ± 1.43** ± 1.70*** m – ошибка репрезентативности *- p<0.05, при сравнении с контролем ** - p<0.01, при сравнении с контролем *** - p<0.001, при сравнении с контролем Как следует из таблицы, данный показатель, характеризующий подверженность тимоцитов и спленоцитов апоптозу, повышался при хроническом стрессе, но это повышение не было достоверным во всех подгруппах, кроме того, строгого параллелизма по данному параметру адаптационных возможностей иммуноцитов в тимусе и селезенке не было. Повышение уровня экспрессии каспазы-3 при стрессе было более значимым в старшей возрастной группе по сравнению с младшей. Рис.4 демонстрирует динамику удельной площади гранзим Биммунореактивных клеток. 16 Рис. 4. Динамика распределения гранзим Б+клеток в селезенке крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, %). 7 6 * * 3,46 4 3,51 5 ** 3 * *** контроль иммобилизационный стресс 4,12 2,93 3,1 4,56 5,43 0 4,61 1 4,8 2 имерсионно-иммобилизационный стресс - грудной период - подсосный период - инфантный период *- p<0.05, при сравнении с контролем ** - p<0.01, при сравнении с контролем *** - p<0.001, при сравнении с контролем Как следует из таблицы, данный иммунный параметр, характеризующий реакции врожденного иммунного ответа, достоверно снижался при иммерсионно-иммобилизационном стрессе во всех возрастных группах, а при иммобилизационном стрессе – только в младших. Наибольшая чувствительность к стрессу отмечалась у NK-клеток в период перехода на самостоятельное питание, который в целом характеризуется сложными взаимоотношениями между врожденным и приобретенным иммунитетом. Результаты количественного анализа удельной площади CD45RCиммунореактивных клеток представлены в рис.5. 17 Рис. 5. Динамика распределения CD45RC+клеток в тимусе крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, %) 12 * 10 8 6 ** 4 ** ** *** *** контроль иммобилизационный стресс 4,22 2,35 2,98 9,06 4,03 3,42 6,84 0 5,78 4,91 2 иммерсионноиммобилизационный стресс - грудной период - подсосный период - инфантный период *- p<0.05, при сравнении с контролем ** - p<0.01, при сравнении с контролем *** - p<0.001, при сравнении с контролем Данный параметр, характеризующий миграцию лимфоидных клеток из периферических иммунных органов в мозговое вещество тимуса в составе рециркулирующего пула лимфоцитов, также отличался высокой чувствительностью и продемонстрировал, что при сильном стрессорном воздействии трафик лимфоцитов «с периферии» в «центр» достоверно снижается, причем с более высоким уровнем значимости в младших возрастных группах по сравнению со старшей группой. Исключение составляет 1-я экспериментальная группа в инфантном возрасте, что свидетельствует об адаптационных изменениях в старшей возрастной группе, качественно отличающихся от таковых в более младших возрастных группах. 18 Рис.6 демонстрирует результаты оценки распределения недавних тимусных иммигрантов – клеток, с фенотипом CD90+, - в селезенке экспериментальных и контрольных животных. Данный показатель, характеризующий трафик лимфоидных клеток в противоположном направлении (с «центра» на «периферию»), достоверно снижался при обоих видах стресса во всех трех возрастных группах. Известно, что данный трафик также связан с активацией симпатической нервной системы. Различные тенденции стресс-индуцированных изменений миграции тимоцитов и лимфоцитов рециркулирующего пула заставили нас предположить наличие определенных ограничений адаптационных возможностей тимуса в плане поставки лимфоидных клеток на периферию при стрессе в связи с высокой степенью клеточной деплеции в периферических органах иммунной системы и побудили нас провести корреляционный анализ снижения клеточности в самом тимусе и уровнем НТИ в периферических органах иммуногенеза (в селезенке). Он показал наличие только в инфантном периоде сильной (r=0.73) достоверной (p<0.01) положительной корреляции между удельной площадью CD8+клеток в тимусе и недавних тимусных иммигрантов в селезенке, в то время эта корреляция в других возрастных группах, так же как и корреляция между удельной площадью СD8+клеток в тимусе и селезенке является слабой или средней по силе и недостоверной во всех возрастных группах. Это свидетельствует об ограниченных возможностях тимуса в выполнении «запроса» периферических иммунных органов на поставку Т-лимфоцитов в условиях резкой клеточной деплеции в Т-зонах селезенки и лимфатических узлов, которые снабжаются Т-лимфоцитами в зависимости от уровня клеточности тимуса, а не периферических иммунных органов (J.G.Damoiseaux et al., 1999). 19 Рис. 6. Динамика распределения СD90+клеток в селезенке крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, %). 10 9 8 * 7 6 ** * 5 *** * 4 3 *** *** контроль иммобилизационный стресс 5,62 2,97 1,94 6,27 4,83 3,07 0 8,89 4,85 1 6,49 2 иммерсионноиммобилизационный стресс - грудной период - подсосный период - инфантный период *- p<0.05, при сравнении с контролем ** - p<0.01, при сравнении с контролем *** - p<0.001, при сравнении с контролем Проведенное исследование показало, что на ранних стадиях постнатального онтогенеза (до 6-ой недели, что соответствует инфантному периоду у крыс T.B.Poole, 1987), имеет место некоторая асимметрия в развитии и созревании тимуса и периферических иммунных органов: селезенки и лимфатических узлов. В то время как тимус в норме достигает относительного пика функциональной зрелости к началу 5-ой недели, после чего в нем появляются первые признаки возрастной инволюции, в селезенке в это время еще продолжается функциональное созревание, сопровождающееся соответствующими структурными перестройками, что 20 согласуется в целом с данными других авторов (J.Flo et al., 1997; L.Dominguez-Gerpe et 1998). al., В лимфатических узлах процесс постнатального созревания запаздывает еще больше по сравнению с тимусом и селезенкой, даже в группе брыжеечных лимфатических узлов, использованных в нашем исследовании (именно эти лимфатические узлы развиваются после рождения быстрее других групп, таких как паховые, подколеннные и другие, чаще всего используемые в экспериментальных исследованиях) (P.Eikelenboom et al., 1979). В этой «асимметрии» центра и периферии, по-видимому, и состоит одна из причин резкой постстрессовой иммуносупрессии в раннем постнатальном онтогенезе. Вследствие функциональной незрелости иммунной системы, хрупкого баланса между врожденным и приобретенным иммунным ответом, центральные органы, в данном случае тимус, не могут адекватно ответить на «запрос» периферических органов, что приводит по мере усиления силы стрессорного воздействия к нарастающей гипоплазии и тимуса, и периферических иммунных органов, в которых в грудном и подсосном периоде в большей степени повреждается Т-клеточный компартмент, а инфантом периоде – и Т-, и В-зоны. Вопрос о соотношении постстрессовых иммуномодуляционных изменений в реакциях врожденного и приобретенного иммунного ответа на ранних этапах постнатального онтогенеза остается мало изученным. Известно, что сложные взаимоотношения врожденного и приобретенного иммунного ответа у детей остаются одной из важнейших проблем современной иммунологии. В то время, когда иммунная система ребенка остается незрелой, а уровень материнских антител настолько низок, что уже не защищает от инфекций, но еще настолько высок, что продолжает блокировать развитие приобретенного иммунитета, опасность развития инфекционных заболеваний очень велика (H.Harizi et al., 2005). У грызунов до 6-недельного возраста иммунная система останется функционально незрелой, и доминирующим в этот период является врожденный иммунный 21 ответ (B.Morein et al., 2002; A.Dakic et al., 2004). Одним из параметров врожденного иммунного ответа является содержание и активность в периферических органах иммуногенеза NK-клеток. Они в норме обнаруживаются в красной пульпе, а также в ПАЛВ и маргинальной зоне селезенки, в то время как в лимфатических узлах их количество очень мало (G.Pawelek et al., 1998; A.O.Dokun et al., 2001; E.C.De Jong et al., 2002; T.Walzer et al., 2005). Главная функция NK-клеток – это прямая цитотоксичность, обеспечивающая противоопухолевую защиту с эффективную помощью противовирусную и перфорин-опосредованного механизма (H.Oya et al., 2000; P.Toft et al., 2002). Они содержат гранзимы, половина из них является CD8-позитивными, причем от цитотоксических лимфоцитов их отличает отсутствие экспрессии Т-клеточных маркеров, в частности CD3. Обнаруженное нами при стрессе снижение гранзим Б+CD3клеток в селезенке, прежде всего в маргинальной зоне и белой пульпы, более выраженное в группе грудного и подсосного возраста, и менее выраженное – в группе инфантного периода, свидетельствует о возрастной зависимости постстрессовой иммуносуппрессии, связанной с реакциями врожденного иммунного ответа. В противоположность этому, показатели приобретенного иммунного ответа, реакции которого реализуются с помощью Т- и Влимфоцитов и антиген-презентирующих клеток, имели другую динамику при стрессе. Так CD8+лимфоциты снижали свою долю в Т-зонах (ПАЛВ, периартериальной зоне лимфоидных узелков) в большей степени в инфантном периоде и в меньшей степени – в грудном, что демонстрирует отчетливую онтогенетическую зависимость иммуномодуляционных сдвигов в раннем постнатальном онтогенезе. В отношение реакций приобретенного иммунного ответа, мы произвели оценку нескольких возможных механизмов постстрессовой гипоплазии тимоцитов и спленоцитов: уровня их пролиферации (окрашивание на PCNA), гибели апоптозом (окрашивание на каспазу-3), нарушения миграции (окрашивание на Thy1.1 и СD45RC для выявления 22 ранних тимусных иммигрантов в селезенке и рециркулирующего пула лимфоцитов в мозговом веществе тимуса соответственно) (J.Westermann et al., 1996; H.Harizi et al., 2005). Наше исследование показало, что стресс приводит к снижению количества недавних тимусных иммигрантов в Т-зонах селезенки, так же как и CD45RC-позитивных клеток в мозговом веществе тимуса, в большей степени выраженному в грудном возрасте и в меньшей степени – в инфантном возрасте, что может быть связано, среди прочих факторов, с активацией симпатической нервной системой, регулирующей трафик иммуноцитов и активируемой при стрессе. Выявленные различия в возрастных группах также являются отражением функциональной зрелости симпатической нервной системы на разных этапах раннего постнатального онтогенеза. Примечательно, что данный показатель при действии относительно слабого стрессора в старшей возрастной группе не только не снижается, но, напротив, повышается, что определенно свидетельствует о более широких адаптационных возможностях иммунной системы в перипубертатном периоде. Выявленное нами иммуногистохимически угнетение пролиферации тимоцитов и спленоцитов при стрессе было сильнее выражено в старшей возрастной группе, чем в младшей, так же как усиление апоптоза этих клеток, отмеченное в обеих экспериментальных подгруппах, но в большей степени – при иммерсионно-иммобилизационном стрессе. Из литературных данных известно, что процессы пролиферации и клеточной гибели контролируются глюкокортикоидами, выброс которых в кровь при стрессе связан с активацией гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) (N.Quan et al., 2001), причем уровень функциональной зрелости последней также весьма динамично меняется на ранних стадиях постнатального онтогенеза. Однако литературные источники неоднозначно трактуют действие глюкокортикоидов при стрессе на иммунный ответ. Так одни авторы показывают, что глюкокортикоиды, усиливая апоптоз лимфоцитов, имеющих к ним рецепторы, и тормозя выработку Il-2, 23 усиливающего пролиферацию лимфоцитов, а также нарушая экспрессию рецепторов лимфоцитов к Il-2, ингибируют таким образом экспансию Тклеточного пула (P.Sterzer et al., 2004; X.Zhang et al., 2005). Есть также мнение, что глюкокортикоиды влияют прежде всего на трафик лимфоцитов, снижая при стрессе клеточность иммунных органов (L.Dominguez-Gerpe et al., 2001; R.J.Tseng et al., 2005) В противоположность этому третьи авторы доказывают, что глюкокортикоиды тормозят развитие акцидентальной инволюции тимуса и стресс-ассоциированной гипоплазии периферических иммунных органов, т.к. не усиливают апоптоз двойных позитивных тимоцитов, а стимулируют пролиферацию двойных негативных тимоцитов и спленоцитов в зависимости от плотности их расположения in situ (G.J.Wiegers et al., 2001; А.Pazirandeh et al., 2004). В противоположность этим исследованиям, наши результаты показали усиление апоптоза тимоцитов и спленоцитов и торможение их пролиферации при стрессе в обеих экспериментальных группах, в соотношениях, имеющих возрастную опосредованность. Данные противоречия могут объясняться различием применяемых моделей стресса, возраста экспериментальных животных и методических подходов: в приведенных работах использовались в основном иммунологические методы исследования, не позволяющие оценить зональную специфичность иммуномодуляционных изменений в лимфоидных органах, в то время как мы, располагая иммуногистохимическими методами исследования, имели возможность оценить перераспределение иммуноцитов не только между центральным и периферическим звеном иммунной системы, но и между компартментами лимфоидных органов. Различия в степени повышения уровня апоптоза иммуноцитов в лимфоидных органах в разных возрастных группах свидетельствует с одной стороны о меняющейся чувствительности к действию кортикостероидов и с другой стороны - об увеличении степени зрелости самой ГГНС в растущем организме. Кроме того, известно, что у крыс вскоре после рождения наступает так называемый «рефрактерный период» к действию стресса, и хотя начало эксперимента в 24 младшей возрастной группе приходилось на конец «рефрактерного периода», реакции ГГНС в данной возрастной группе не могли не сказаться на всех иммуномодуляционых особенностях, связанных с действием органов позволит кортикостероидов. Знание разрабатывать механизмов адекватные гипоплазии методы иммунных профилактики постстрессового иммунодефицита с учетом возрастных особенностей стресс-ассоциированной иммуномодуляции. ВЫВОДЫ. 1. Иммуномодуляционные сдвиги в лимфоидных органах при хроническом психоэмоциональном иммуногистохимически и стрессе, характеризующие реакции выявляемые врожденного иммунного ответа, более выражены в грудном и подсосном возрасте, в то время как относящиеся к реакциям приобретенного иммунного ответа – в инфантном периоде раннего постнатального онтогенеза. 2. В грудной и подсосный периоды при хроническом стрессе иммуносуппрессивные сдвиги больше затрагивают Т-клеточные компартменты периферических иммунных органов, а в инфантный период – В-клеточные зоны. 3.На ранних этапах постнатального онтогенеза среди периферических лимфоидных органов изменения, характеризующие как врожденный, так и приобретенный иммунный ответ, выражены сильнее в селезенке, чем в лимфатических узлах. 4.При хроническом стрессе уровень недавних тимусных иммигрантов в периферических иммунных органах коррелирует со степенью снижения клеточности тимуса и не зависит от степени гипоплазии Т-клеточных компартментов селезенки. Сила этой корреляции максимальна в инфантном периоде преювенильного возраста экспериментальных животных. 25 5.Механизмы иммуносуппрессии имеют онтогенетическую зависимость: в грудном возрасте сильнее выражено влияние стресса на трафик популяций иммуноцитов, в то время как в инфантном периоде сильнее проявляются механизмы клеточной гибели и угнетения пролиферации, что может быть связано с различной в эти возрастные периоды степенью функциональной зрелости симпатической нервной системы, регулирующей трафик иммуноцитов, и гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковой системы, ответственной за усиление процессов клеточной гибели и торможение пролиферации иммуноцитов. 6.Зависимость степени иммуносуппрессивных изменений в органах иммуногенеза от силы стрессорного воздействия имеет возрастную опосредованность: различной силы в инфантном периоде при действии степень иммуносуппрессии, по стрессоров данным иммуногистохимического исследования, имеет большие различия, чем в грудном периоде. Практические рекомендации 1.Иммуногистохимические показатели, характеризующие иммунные параметры реакций врожденного и приобретенного иммунитета, пригодны для оценки иммунного статуса центральных и периферических органов иммуногенеза и могут быть учтены при разработке иммунокоррегирующих лечебных тактик. 2.Иммуногистохимические реакции на CD45RC и СD90 позволяют оценить состояние трафика иммуноцитов между центральными и периферическими органами иммуногенеза, что позволяет использовать их в качестве диагностических маркеров при экспериментальных иммунодефицитных состояниях. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ СОИСКАТЕЛЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1.Капитонова М.Ю., Краюшкин А.И., Федорова О.В., Мураева Н.А., Загребин В.Л., Худа Салех Т.А. Акцидентальная инволюция тимуса при действии нейрогенных и психогенных стрессоров // Фундаментальные 26 исследования, 2005, N6, C.46-47 (материалы II научной конференции с международным участием «Современные проблемы науки и образования», г. Умаг (Хорватия) 2-9 июля 2005 г). 2.Капитонова М.Ю., Улла М., Отман М., Мураева Н.А. и др. Иммуногистохимическая характеристика аденогипофиза при хроническом стрессе на ранних этапах онтогенеза // Успехи современного естествознания, 2004, N12, с.45 (материалы конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Паттайа (Тайланд), 15-25 января 2005 года). 3. Капитонова М.Ю., Клаучек С.В., Верстакова О.Е., Морозова З.Ч, Мураева Н.А., Нестерова А.А., Смирнова Т.С., Федорова О.В., Тхабит Худа С.А. Особенности реакции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы на действие хронического стресса в период грудного вскармливания // В сб.: Морфология процессов индивидуального развития, адаптации и компенсации, Труды ВолГМУ, Волгоград, 2005, т.62, вып.1, С.32-35. 4. Капитонова М.Ю., Морозова З.Ч., Сидоркина А.В., Нестерова А.А., Мураева Н.А., Фомина Н.Г., Демидович И.Л. Распределение S100позитивных клеток в белой пульпе селезенки крыс в возрастном аспекте // Успехи современного естествознания, 2006, N1, C.83-84. (материалы конференции с международным участием «Современные проблемы науки и образования», г.Москва, 5-6 декабря 2005г.). 5. Капитонова М.Ю., Улла М., Морозова З.Ч., Мураева Н.А. и др. Оценка пролиферации клеток аденогипофиза при действии психогенных и нейрогенных стрессорных факторов // Аллергология и иммунология", 2005, том 6, №2, стр. 216-217. 6.Мураева Н.А., Капитонова М.Ю. Краюшкин А.И., Хлебников В.В., Чернов Д.А., Федорова О.В. Возрастные аспекты иммуномодуляционных изменений при хроническом стрессе. // Фундаментальные исследования, 2006, N5, C.64-65 (материалы научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии», г.Сусс, (Тунис), 11-18 июня 2006г.). 7.М.Ю.Капитонова, А.И.Краюшкин, Н.А.Мураева, О.В.Федорова, А.А.Нестерова. Возрастная динамика распределения гранзим Б-содержащих клеток в периферических иммунных органах крыс при хроническом стрессе в раннем постнатальном онтогенезе // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета.- 2006.- N3.- C.28-32. 27
