На правах рукописи - институт биологии развития
реклама
На правах рукописи БУТОВСКАЯ ПОЛИНА РУСЛАНОВНА СОМАТИЧЕСКИЙ МОЗАИЦИЗМ У ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ ПО ДАННЫМ МУЛЬТИЛОКУСНОГО МАРКИРОВАНИЯ ДНК специальности: 03.02.07 – генетика, 03.01.07 – молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена в лаборатории организации генома и лаборатории нейрогенетики и генетики развития Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН Научные руководители: доктор биологических наук Павлова Галина Валериевна, доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Рысков Алексей Петрович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Крамеров Дмитрий Александрович кандидат биологических наук Куликов Алексей Михайлович Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН. Защита диссертации состоится « » 2010 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. Сайт: http://idbras.comcor.ru/; e-mail: [email protected]. С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Автореферат разослан «___»______________20__ года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук [email protected] 2 Абрамова Е.Б. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Отличительной особенностью эукариотического генома является большое количество различных типов диспергированных и тандемно организованных повторяющихся последовательностей ДНК. Многие из этих повторов являются источниками различных полиморфизмов и используются в качестве генетических маркеров в популяционных и эволюционных исследованиях (Рысков, 1999). Функциональная роль большинства повторов остается неясной, хотя и предполагается, что некоторые из них могут играть важную роль в регуляции генной экспрессии, например, путем участия в специфической организации хроматина (Трифонов, 2002). Встает вопрос, не играют ли эти последовательности определенную роль в спецификации клеток, в клеточной дифференцировке. Очевидно, эксперименты в рамках этой концепции направлены на выявление геномных различий между специализированными клетками и их предшественниками. В биологических системах описано такое явление, как соматический мозаицизм, что означает присутствие в одном организме генетически различных популяций соматических клеток. Структурные изменения в ДНК злокачественно трансформированных клеток - наиболее известный пример соматического мозаицизма (Ionov et al., 1993). Его причинами могут служить как генетические, так эпигенетические события (Vikki et al., 2001). Причиной соматического мозаицизма могут быть потеря гетерозиготности путем митотической рекомбинации, хромосомная нестабильность, изменения в микросателлитных локусах (Cavenee et al., 1983; Lengauer et al., 1998). В то же время, имеется очень мало данных о соматическом мозаицизме в нормальных тканях. Таким образом, актуальным является выявление возможных различий в строении ДНК разных органов и тканей на уровне индивидуального организма. Цель и задачи исследования Целью исследования является изучение феномена соматического мозаицизма в нормальных органах и тканях млекопитающих с помощью методов полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (RAPDPCR) и мультилокусного ДНК-фингерпринтинга. В работе были поставлены следующие задачи: 1. Разработать варианты RAPD-анализа для получения информативных амплификационных спектров ДНК органов и тканей человека и мыши. 2. Исследовать ДНК, выделенную из органов и тканей эмбрионов человека, методами ДНК-фингерпринтинга и RAPD-PCR с целью выявления соматического мозаицизма на уровне индивидуального организма. 3. Исследовать ДНК органов и тканей взрослых мышей методом RAPD-PCR с целью выявления соматического мозаицизма у индивидов разных линий. 3 4. Оценить наблюдаемые эффекты геномных изменений на модели длительно пассируемых клеточных культур с помощью RAPD-анализа. Научная новизна и практическая значимость работы Впервые обнаружена соматическая изменчивость ДНК в нормальных тканях эмбрионов человека и мыши методами RAPD-PCR и ДНКфингерпринтинга. Показано, что возникновение соматического мозаицизма происходит с довольно высокой частотой и носит случайный характер. Впервые показана измечивость PARD-спектров клеточных культур при длительном пассировании (мезенхимные прогениторные клетки костного мозга человека, стромальные клетки жировой ткани человека, клетки фибробластов человека). Эти результаты имеют фундаментальный характер и вносят важный вклад в изучение проблемы соматического мутагенеза. Практическая значимость результатов связана с разработкой эффективного варианта RAPD-анализа для геномной паспортизации клеточных культур человека и выявления генетических изменений при их длительном пассировании (Заявка на патент «Способ паспортизации и контроля за генетической изменчивостью в клеточных культурах различной длительности пассирования» No 2008114535/13 (016031) от 16 апреля 2008 года). Метод может найти применение в медицине для изучения клеточных аномалий (в том числе онкологических), контроля генетической стабильности клеточных культур, используемых в качестве источника материала для клеточной терапии и регенерации тканей, а также паспортизации клеточных линий с целью их юридического правообладания. Апробация работы Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: 11-th PhD meeting in evolutionary Biology. Bordeaux. France. 2005; IV International conference Molecular genetics of somatic cells. Zvenigorod. Russia, 2005; 12-th PhD meeting in evolutionary Biology. St.Andrews. Skotland. 2006; 13-th meeting in evolutionary Biology. Lund. Sweden. 2007. Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК – 2, заявка на патент – 1, тезисов докладов и материалов конференций – 3. Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 98 страницах, содержит 14 рисунков, 2 таблицы и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, 4 материалов и методов, результатов и их обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего в себя 125 цитируемых источника. 5 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для исследования были использованы следующие животные и материалы: 1. Мыши линий CBA, C57KC и 101 предоставленные И.И. Полетаевой (Биологический факультет МГУ); 2. Образцы ДНК органов и тканей четырех эмбрионов человека предоставленные В.С. Барановым (Институт акушерства и гинекологии им. Отто, Санкт-Петербург); 3. Первичные культуры клеток - мезенхимные прогениторные клетки мозга человека любезно предоставленные Рубинной . Эксперименты по ДНК-фингерпринтингу выполнены совместно с И.А. Мартиросян (ИБГ РАН, лаб. Организации генома) как это описано ранее (Tokarskaya et al., 2001). Методика включала в себя обработку ДНК рестриктазой Hinf I ,депротенизацию гидролизата смесью фенол-хлороформ, электрофоретическое фракционирование ДНК в 0,8 % агарозном геле, перенос (блоттинг) ДНК из геля на нейлоновую мембрану Hybond N, молекулярную гибридизацию ДНК на мембране с P32-мечеными олигонуклеотидами, радиоавтографию мембран. Полимеразную цепную реакцию со случайными праймерами (RAPD) проводили, используя набор Gene Pak PCR Core («Лаборатория Изоген»). В качестве праймеров использовали 10-членные олигонуклеотиды различного состава, по методике производителя. В четырехканальном ДНК-амплификаторе ТП4-ПЦР-01- «Терцик». ДНК выделяли из ядер клеток (Mathew, 1984) с добавлением додецилсульфата натрия (до 1%) и протеиназы. К (50-100 млг/мл); депротеинизировали ДНК смесью фенол-хлороформа и осаждали 2 объемами этанола. Стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) выделяли из жировой ткани, полученной в ходе полостных операций у неонкологических больных с письменного согласия каждого пациента в соответствии с требованиями этического комитета. СКЖТ мыши были выделены из подкожной жировой клетчатки мышей линий black6 и black-GFP обоих полов в возрасте 8-12 недель. Жировую клетчатку измельчали и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ед/мл) и диспазы. Инкубировали при 370C в течение 45 мин. Затем добавляли среду DMEM, 10% ЭБС и центрифугировали при 200g в течение 5 минут. В осадочной фракции эритроциты лизировали деионизированной водой. После добавления 10Х объема DMEM клетки фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм («BD Falcon», США). Клетки высаживали в количестве 5х104/см3 и инкубировали при 370C, 5% CO2. СКЖТ мыши культивировали в среде DMEM, 10% ЭБС, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина. СКЖТ человека в среде (Advance Stem Cell Basal Medium, HyClone) +10% смеси факторов роста (Advance Stem Cell Growth Supplement, HyClone). Получение культуры фибробластов кожи человека проводили совместно с Е.Ю.Рыбалкиной . Культуру клеток дермальных фибробластов выращивали в 6 среде роста фибробластов (DMEM / 10% ЭТС /10 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco) в одноразовых пластиковых флаконах (Corning Costar) в стерильных условиях культурального бокса в инкубаторе при 37С при 5% концентрации СО2. При достижении конфлюэнтного монослоя клетки пассировали. Для этого монослой клеток обрабатывали раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА (Gibco). Суспензию открепившихся от подложки клеток рассаживали в соотношении 1:3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выявление соматического мозаицизма у человека 1.1. Использование мультилокусного ДНК-фингерпринтинга Одним из методов выявления соматического мозаицизма является мультилокусный ДНК-фингерпринтинг органов и тканей индивидов. Впервые этот подход был использован для выявления микросателлитных мутаций в ДНК раковых тканей (Armour et al., 1990). В настоящей работе с помощью мультилокусного ДНК-фингерпринтинга впервые выявлены случаи соматического мозаицизма у эмбрионов человека. В экспериментах с применением ДНК-фингерпринтинга было использовано четыре олигонуклеотидных зонда (GATA)4, (GACA)4, (CAC)5, (GGCA)4 в сочетании с рестриктазой Hinf I. Анализировали суммарную ДНК, выделенную из частей органов, тканей и органов четырех эмбрионов человека (14 недель). Фингерпринтные спектры были одинаковы у всех исследованных образцов ДНК при использовании зондов (GATA)4 и (GGCA)4. Однако определенные различия в спектрах были выявлены при использовании (GACA)4 и (CAC)5. На рис. 1А приведены результаты ДНК-фингерпринтного анализа органов и тканей эмбрионов человека с использованием зонда (CAC)5. Изменения были обнаружены в образцах ДНК, выделенных из зачатка позвоночника (эмбрион I, 4) и зачатка глаза (эмбрион III, 18). При использовании олигонуклеотидной пробы (GACA)4 изменение ДНК-фингерпринтного спектра было обнаружено у эмбриона I в образце ДНК, выделенном из хориона (рис. 1Б, 6). Таким образом, соматический мозаицизм по ДНК-фингерпринтным спектрам был выявлен у двух из четырех исследованных эмбрионов человека, причем для одного из них он детектировался обоими зондами, но в ДНК разных органов. В целом, данные свидетельствуют о высокой стабильности фингерпринтных спектров и отсутствии повышенной их изменчивости в какихлибо конкретных органах. Можно предположить, что с помощью других зондов будут обнаруживаться изменения фингерпринтных спектров в ДНК многих органов и тканей. Следует также отметить, что электрофорез в 1% агарозном геле не выявляет сравнительно небольшие (< 250 п.н) различия в размерах рестрикционных фрагментов. Это означает, что частота соматической изменчивости фингерпринтных спектров может быть значительно выше. 7 Рис. 1. Фингерпринтный анализ ДНК, выделенной из тканей, частей тела и органов эмбрионов человека (14 недель) В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК фага , гидролизованную рестриктазами Hind III и Eco RI. I - IV - отдельные индивиды; измененные фрагменты показаны стрелками. А. Сочетание рестриктазы Hinf I и зонда (CAC)5: зачатки: 1-печени, 2-желудка, 3-руки, 4- позвоночника, 5-хорион, 6-сердца, 7-легких, 8-печени, 9-надпочечников, 10-хорион, 11легкого, 12-хорион, 13-надпочечников, 14- пуповина, 15-толстого кишечника, 16-почек, 17тонкого кишечника, 18-глаза, 19-глаза, 20-хорион; Б. Сочетание рестриктазы Hinf I и зонда (GACA)4: зачатки: 1-печени, 2-желудка, 3руки, 4-позвоночника, 5-мозга, 6-хорион, 7-сердца, 8-легких, 9-печени, 10-надпочечников, 11-хорион, 12-почек. Информации о соматическом мозаицизме в нормальных тканях в литературе явно недостаточно. С помощью ДНК-фингерпринтинга случаи соматического мозаицизма были выявлены у мышей и ящериц (Tokarskaya et al., 2004, Рысков и др., 2004). Наши данные находятся в соответствии с результатами этих работ. Молекулярная природа соматической изменчивости остается неясной. Метод ДНК-фингерпринтинга выявляет различия в электрофоретической подвижности рестрикционных фрагментов ДНК, детектируемых микросателлитными зондами. Однако различия в размерах самих микросателлитных кластеров, которые обычно невелики (в среднем 60 п.н.), не будет заметно влиять на подвижность крупных рестрикционных фрагментов в агарозном геле. Это означает, что наблюдаемые изменения в фингерпринтных спектрах связаны с точковыми мутациями или модификациями в сайтах рестрикции ДНК, приводящими к полиморфизму длины рестрикционных фрагментов, либо к крупным реорганизациям, делециям, инсерциям в локусах, содержащих микросателлитный кластер. В настоящее время получены данные о том, что в прилежащих к 8 микросателлитам зонах ДНК часто обнаруживаются однонуклеотидные замены (Korchagin et.al., 2007; Рысков и др., 2009). 1.2 Использование полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (RAPD-PCR) С помощью RAPD-PCR проводили изучение тех же образцов ДНК эмбрионов человека (за исключением индивидуума I). В предварительных экспериментах было протестировано 27 олигонуклеотидных праймеров, различающихся содержанием GC-пар. В результате были отобраны 8 праймеров со стабильным, хорошо воспроизводимым в повторных экспериментах, спектром амплификации. Шесть из них (OPA1, OPA11, OPA17, SB2, P29, P92) на исследуемых образцах ДНК давали мономорфные спектры в RAPD-анализе. Профили амплификации, полученные при использовании этих праймеров, приведены на рис. 2. Как можно видеть, некоторые праймеры (OPA1, P29, P92) дают достаточно большой набор амплификантов размером от 200-2000 п.н., другие продуцируют меньшее число фрагментов примерно в том же интервале размеров. Важно отметить, что в повторных экспериментах эти праймеры давали хорошо воспроизводимые спектры амплификации, и это свидетельствует о надежности метода и достоверности результатов. Различия в спектрах амплификации ДНК разных органов были получены при использовании праймеров R45 и 447 и были обнаружены только у эмбриона II (рис. 3). В результате амплификации с использованием праймера R45 в области электрофоретической подвижности 380 п.н. в RAPD-спектре ДНК, выделенной из зачатка глаза, обнаруживается мажорная дополнительная полоса, отсутствующая в спектрах других образцов. В случае RAPD-PCR этих же образцов ДНК с праймером 447 в амплификационных профилях зачатков хориона, пуповины и глаза (дорожки 1, 4 и 8) можно видеть появление дополнительной четкой полосы размером примерно 300 п.н. (показано стрелкой). Следует отметить, что в обоих случаях дополнительные амплификанты в повторных экспериментах на тех же образцах ДНК хорошо воспроизводились, что может отражать реальные вариации в структуре исследованных ДНК. 9 Рис. 2. RAPD-анализ образцов ДНК выделенных из тканей, частей тела и органов эмбрионов человека.1-15 дорожки с образцами ДНК. Индивидуум II: зачатки: 1-сердца, 2-легких, 3-печени, 4-надпочечников, 5-хорион. Индивидуум III: зачатки: 6-легкого, 7-тонкого кишечника, 8-хорион, 9надпочечников, 10-пуповина, 11-толстого кишечника, 12-почек, 13-глаза. Индивидуум IV: зачатки: 14-хорион, 15-глаза. М1 и М2 – молекулярные маркеры массы 100 bp Ladder+ и 1 kb Ladder (“Fermentas”). Сравнение результатов, полученных с использованием двух различных методов – мультилокусного ДНК-фингерпринтинга и RAPD-PCR анализа, показывает, что оба метода детектируют соматическую изменчивость в анонимных участках генома с высокой частотой (у трёх из четырёх исследованных эмбрионов). Можно предположить, что соматический мозаицизм на уровне ДНК присущ каждому индивиду, носит случайный характер и для его обнаружения требуется лишь повысить эффективность анализа, например, увеличением количества исследованных локусов или использованием крупноблочного секвенирования ДНК. Неясным остается вопрос, связаны ли соматические изменения ДНК нормальных тканей со специфическими структурными особенностями организации конкретных участков генома или они распределены случайным образом в ДНК. Природа таких вариаций остается неясной. Изменение подвижности или появление/утрачивание фрагментов ДНК в RAPD-спектрах может быть связано с геномными перестройками или мутациями, затрагивающими участки комплементарного связывания ДНК с олигонуклеотидными праймерами. 10 Мутации также могут влиять на эффективность амплификации ДНК, что будет изменять представленность амплификанта в RAPD-спектре, и выражаться в утрате или уменьшении интенсивности конкретной полосы в спектре. Аналогичный эффект может возникать при амплификации участков ДНК, различающихся по копийности в разных органах и тканях одного индивида, а также при амплификации дивергированных копий повторов одного семейства. Очевидно, для определения молекулярной природы соматической изменчивости RAPD-спектров необходима расшифровка первичной структуры соответствующих фрагментов ДНК. А Б Рис. 3. RAPD-анализ образцов ДНК выделенных из тканей, частей тела и органов эмбрионов человека. А. (индивид II, праймер 447): зачатки: 1-хорион, 2-надпочечников, 3-легкого, 4пуповина, 5-тонкого кишечника, 6-толстого кишечника, 7-почек, 8-глаза. Б. (индивид II, праймер R45): зачатки: 1-хорион, 2-надпочечников, 3-легкого, 4пуповина, 5-тонкого кишечника, 6-глаза, 7-тонкого кишечника. М – молекулярный маркер массы 1 kb Ladder (“Fermentas”). Различия показаны стрелками 2. Выявление соматического мозаицизма у мыши с помощью полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (RAPD-PCR) С помощью полимеразной цепной реакции со случайными праймерами проводили изучение образцов ДНК органов и тканей взрослых мышей. Было проанализировано 99 образцов ДНК органов 18 особей линий С57КС, СВА и 101. 11 На рисунке 4 в качестве примера представлены результаты RAPDанализа ДНК разных органов четырех мышей линии С57КС, с праймерами OPA10, OPA17, P29 и P92, дающими мономорфные амплификационные спектры. Спектры амплификации, полученные с помощью этих праймеров, содержали 6-8 фрагментов ДНК размером 2000-2500 п.н. Они были одинаковыми для всех исследованных ДНК независимо от типа спектра. Отличия некоторых спектров на рис. 4, например, дорожки 3 и 6 особи I (OPA17) или дорожки 5 и 6 особи IV (OPA17), носили технический характер, и при повторных экспериментах они не отличались от большинства спектров. В целом, получаемые картины RAPD-спектров были хорошо воспроизводимы. Аналогичные эксперименты с этими праймерами были проведены на ДНК, выделенной из разных органов мышей линий CBA и 101, соматической изменчивости RAPD-спектров выявлено не было (данные не приведены). Рис. 4. RAPD-анализ образцов ДНК, выделенных из разных органов взрослых мышей линии С57КС (особи I, II, III, IV), с использованием праймеров: OPA10, OPA17, P29, P92. 1кожа, 2-легкие , 3-мозг, 4-печень, 5-почки, 6-сердце. M – маркер молекулярной массы 100 bp Ladder+ («Fermentas»). На рисунке 5 представлены результаты RAPD-анализа ДНК разных органов мышей линий 101, CBA и C57KC с праймером R45. Соматические изменения спектра амплификации были обнаружены у ряда особей этих линий (показано стрелками). Среди 10 особей линии 101 (51 образец ДНК разных органов) изменение спектра амплификации выявлено у трех особей (V , VII , IX, показано стрелками.) У особи V (3) в ДНК, выделенной из сердца, 12 наблюдалось появление дополнительной полосы размером примерно 550 п.н. У особи 101 VII (1) наблюдалось появление дополнительной полосы размером примерно 1200 п.н. в ДНК, выделенной из легких. У особи IX (3 и 6) в образцах ДНК, выделенных из сердца и гонад, было выявлено появление дополнительных полос размером примерно 1500 п.н. У мышей линии СВА (4 особи, 24 образца ДНК разных органов) изменения спектра амплификации было обнаружено у особей I и III. У особи I (14) наблюдалось появление дополнительной полосы размером около 450 п.н., а также изменения в подвижности нескольких полос, размером около 900 - 1200 п.н. Рис. 5. RAPD-анализ образцов ДНК, выделенных из разных тканей и органов взрослых мышей, с использованием праймера R45. А. Линия 101 (особи IV, V, VII). 1-легкие, 2-печень, 3-сердце, 4-мозг, 5-почки, 6гонады. Б. Линия 101 (особи IX, VIII). Линия СВА (особь I). 1-легкие, 2-печень, 3-сердце, 4мозг, 5-почки, 6-гонады, 7-легкие, 8-печень, 9-сердце, 10-мозг, 11-почки, 12- легкие, 13печень, 14- кишечник, 15-сердце, 16-мозг. В. Линия СВА (особи II, III, IV). 1-кишечник, 2-легкие, 3-печень, 4-сердце, 5-мозг, 6почки, 7-кожа, 8-кишечник, 9-печень, 10-сердце, 11-мозг, 12-почки, 13-гонады, 14-кишечник, 15-печень, 16-сердце, 17-мозг, 18-почки, 19-кожа. Г. Линия С57КС (особи I, II, III). 1-кожа, 2-легкие , 3-мозг, 4-печень, 5-почки, 6сердце. M – маркер молекулярной массы 100 bp Ladder+ («Fermentas»). 13 У особи III линии CBA (дорожка 8) изменение амплификационного спектра выражалось в появлении дополнительной мажорной полосы размером около 450 п.н., а также в изменении подвижности одной из полос размером около 1200 п.н. Из 24 проанализированных образцов ДНК разных органов мышей линии С57КС (4 особи) только у особи I линии С57КС (дорожка 1) в образце ДНК, выделенном из кожи, было обнаружено изменение подвижности минорного фрагмента размером около 450 п.н. Во всех перечисленных случаях изменения RAPD-спектров были получены подтверждающие результаты в повторных экспериментах. На рис. 6 представлены типичные результаты RAPD-анализа ДНК разных органов мышей линий 101, CBA и C57KC с праймером 447, также дающим полиморфные спектры амплификации. У особей линии 101 соматических различий выявлено не было (VIII и IX). Идентичные RAPD-спектры были получены для всех исследованных образцов ДНК. В то же время достоверные изменения спектра амплификации были обнаружены у особей линии С57КС и СВА. Среди проанализированных образцов ДНК четырех мышей линии CBA (24 образца ДНК разных органов) изменения по мажорным полосам амплификационного спектра обнаружено у особей I и III (показано стрелками). У особи I линии CBA (дорожка 13) наблюдалось появление дополнительной полосы размером около 700 п.н. и изменение подвижности фрагмента размером около 900 п.н. в образце ДНК кишечника. В образце ДНК, выделенной также из кишечника у особи III линии СВА (дорожка 10) наблюдалось появление мажорных фрагментов размером около 550 и 700 п.н. (рис. 6Б, показано стрелками). На рисунке 6В представлены типичные результаты RAPD-анализа ДНК разных органов четырех мышей линии C57KC. На фоне хорошо воспроизводимого, практически идентичного, RAPD-спектра для большинства изученных образцов ДНК, изменение, выражающееся в появлении дополнительной полосы размером около 250 п.н., было обнаружено только у особи II линии C57KC (дорожка 3) в ДНК, выделенной из мозга (показано стрелкой). В RAPD-спектре этого образца ДНК наблюдается также заметное уменьшение интенсивности полосы размером около 800 п.н. Следует отметить, что использование праймера 447 позволило выявить соматическую изменчивость RAPD-спектров лишь у 3 особей из 18, однако они касались мажорных фрагментов и были вполне достоверны. При использовании двух праймеров (R45 и 447) соматические различия в ДНК были обнаружены у 7 особей из 18, и они носили случайный характер. Поскольку данный вариант RAPD-метода позволяет выявлять различия в ДНК отдельных индивидов, то он может быть использован и для геномной паспортизации клеточных культур, для контроля их стабильности и генетической изменчивости при длительном пассировании. 14 Рис. 6. RAPD-анализ образцов ДНК, выделенных из разных тканей и органов взрослых мышей, с использованием праймера 447. А. Линия 101 (особи VIII, IX). Линия СВА (особь I). 1-легкие, 2-печень, 3-сердце, 4мозг, 5-почки, 6-гонады, 7-печень, 8-сердце, 9-мозг, 10-почки, 11-гонады, 12- легкие, 13кишечник,14-печень, 15-сердце, 16-мозг Б. Линия СВА (особи II, III, IV). 1-кишечник, 2-легкие, 3-печень, 4-сердце, 5-мозг, 6почки, 7-кожа, 8-кишечник, 9-печень, 10-сердце, 11-мозг, 12-почки, 13-гонады, 14-кишечник, 15-печень, 16-сердце, 17-мозг, 18-почки, 19- гонады. В. Линия С57КС (особи II, III, IV). 1-кожа, 2-легкие, 3-мозг, 4-печень, 5-почки, 6сердце. В качестве маркера молекулярной массы использовался 100 bp Ladder+ («Fermentas»). 15 3. RAPD-анализ клеточных культур на разных стадиях пассирования Для исследования использовались клеточные культуры различного происхождения: мезенхимные прогениторные клетки человека, стромальные клетки жировой ткани человека и клетки фибробластов человека. Клетки были взяты у нескольких пациентов, и изучалось влияние длительного пассирования на их генотип. Для этого проводили RAPD-типирование ДНК клеток, взятых на разных стадиях пассирования, с использованием трех PCR-праймеров, оказавшихся наиболее эффективными при анализе соматического мозаицизма у человека. В качестве нулевого пассажа считали культуру клеток, не прошедшую смену питательной среды, первым пассажем – первый пересев клеточной культуры. Результаты амплификации образцов ДНК с праймером P29 представлены на рисунке 7. RAPD-спектры представлены в среднем 6-8 фрагментами в пределах от 300 до 1500 п.н. Оказалось, что в абсолютном большинстве случаев RAPD-спектры различных культур (№1-23) были одинаковыми (сравнивали между собой пассажи 0 и 1). Отличия на некоторых спектрах (например, №18- дорожка 1, №20- дорожка 1, МСК - дорожка 1) в повторных экспериментах не подтверждались и поэтому не принимались во внимание. При рассмотрении RAPD-спектров различных пассажей одной и той же клеточной культуры также не было обнаружено каких-либо достоверных различий. Уже упомянутые выше вариации (№ 20- дорожки 1, 5, 10) не подтверждались в повторных экспериментах. В частности, следует отметить, что в наших экспериментах смена среды культивирования не влияла на RAPDспектры (№ 14- дорожки 10*, 10*). Таким образом, с помощью праймера P29 не удавалось выявить достоверных различий в RAPD-спектрах исследованных ДНК. Результаты RAPD-анализа тех же образцов ДНК с праймером R45 представлены на рис. 8. Спектры амплификации содержали около 8 фрагментов размером 300-1500 п.н. В большинстве случаев спектры ДНК разных пассажей были сходными. Отдельные отличия - они касались главным образом минорных полос - при повторных экспериментах воспроизводились лишь частично. Это касается двойных полос размером примерно 600 п.н, интенсивность которых менялась, вплоть до исчезновения, и плохо воспроизводилась. Вариации минорных полос в районе более 1000 п.н. в повторных экспериментах также плохо воспроизводились, и мы считали их недостоверными. В целом, можно полагать, что праймер R45 выявляет небольшой полиморфизм минорных фрагментов, и это может быть связано с полиморфизмом минорных популяций клеток в культуре. 16 Рис. 7. RAPD-анализ ДНК клеточных культур на разных стадиях пассирования с использованием праймера P29. В качестве маркеров молекулярной массы использовались 100 bp Ladder+ и 1 kb Ladder (“Fermentas”). №1 – 5 – стромальные клетки жировой ткани; МСК – мезенхимные прогениторные клетки, №16, №14, №11, №20, №21, №23, №18, №19 – культуры клеток фибробластов кожи; 1 – 20 – разные пассажи; * – обозначена та же линия клеток, но выращенная на другой среде.1-23 культуры клеток, полученные от разных доноров. 17 Рис. 8. RAPD-анализ клеточных культур на разных стадиях пассирования с использованием праймера R45. См. обозначения к рисунку 7. 18 На рисунке 9 представлены результаты амплификации тех же образцов ДНК с праймером 447. RAPD-спектры представлены в среднем 8–9 фрагментами в зоне электрофоретического фракционирования от 250 до 1500 п.н. Видно, что на фоне сходных по электрофоретической подвижности мажорных и минорных полос наблюдаются значительные вариации в RAPDспектрах как между клеточными культурами, так и между пассажами некоторых культур. В этом отношении наиболее примечательным является амплификант размером около 350 п.н. Он имеется в виде мажорного продукта в спектрах большинства культур клеток, но отсутствует в №16, №14 и присутствует в небольшом количестве в №18, №19. Наблюдаются также воспроизводимые отличия по содержанию этого амплификанта в RAPDспектрах разных пассажей одной и той же культуры клеток. Так, в одних случаях (№ 2, 3, 23) происходило его увеличение на более поздних пассажах, а в других случаях (№5, МСК, №11, №20, №21) – его уменьшение. Причины таких вариаций остаются неясными и могут быть определены при сравнительном анализе организации амплифицируемых участков ДНК. Теоретически они могут быть вызваны геномными перестройками, мутациями, затрагивающими участки комплементарного связывания ДНК с праймерами, инсерциями и делециями ДНК. Различия в спектрах амплификации исходных пассажей клеточных культур, возможно, определяются индивидуальными различиями в ДНК, которые могут быть связаны с мутациями в эмбриогенезе у индивидов-доноров соответствующих клеток. Эти данные говорят о возможности использования метода для геномной паспортизации клеточных культур. Таким образом, в результате проведенных исследований был найден праймер, использование которого в RAPD-анализе позволяет выявить соматические различия в ДНК человека и мыши, а также проводить геномную паспортизацию и выявлять геномные различия в клеточных культурах, подвергавшихся длительному культивированию. При использовании клеточной терапии возникает вопрос безопасности применения клеточных материалов. На основании исследований ряда ученых было обнаружено появление геномных нарушений в клеточных культурах при длительном культивировании (Ong et al., 1998; Mikkola et al., 2006). Такие геномные нарушения несут в себе потенциальную опасность возникновения раковых трансформаций. В различных исследованиях предложены несколько методов, которыми детектируют уже значительные геномные изменения. Метод анализа белкового полиморфизма мог бы претендовать на возможность контроля за изменениями, происходящими в клетках. Использование нескольких сотен биохимических маркеров позволяет оценивать уровень генетического полиморфизма у более 2000 биологических видов (от микроорганизмов до человека) и дает возможность разработать основные теоретические положения популяционной генетики (Nei et al., 1987). Однако в ходе исследований выяснились определенные ограничения в применении этого типа маркеров. 19 Рис. 9. RAPD-анализ образцов ДНК, выделенных из разных клеточных культур человека разных пассажей, с использованием праймера 447. См. подписи к рисунку 7. 20 Прежде всего, это то, что анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей и только у экспрессирующихся генов. Если учесть, что у высших эукариот всего около 1% генома составляют белок-кодирующие последовательности, очевидно, что от внимания исследователей ускользает основная часть генома. При этом из анализа исключаются такие функционально значимые участки, как промоторные области, энхансеры, различные сайты регуляции, расположенные в интронах, нетранслируемых областях генов, а также вне генов, часто на значительном расстоянии от кодирующей последовательности. Более перспективными оказались методы, оценивающие изменение на уровне ДНК. Один из них - это мультилокусный ДНК-фингерпринтинг (Ryskov et.al., 1988). Высокая эффективность метода определяется гиперизменчивостью мини- и микросателлитов. Ранее различные варианты ДНК-фингерпринтинга были использованы для целей судебной медицины и криминалистики (Pena, 1994), а также для решения фундаментальных проблем популяционной генетики, этологии, экологии, биоразнообразия (Wetton et al., 1987; Gilbert et al., 1990; Ellegren et al., 1993; Baker et al., 1993; Tegelström, Sjöberg, 1995). ДНКфингерпринтинг также был использован для паспортизации клеточных линий. Однако данный метод крайне трудоемкий, дорогостоящий и требующий больших количеств ДНК. Существует еще один метод определения генетических изменений в клеточных культурах млекопитающих гибридизация in situ: при использовании флуоресцентной метки – FISH (флуоресцентная in situ гибридизация) и при использовании хромогенной метки – CISH (хромогенная in situ гибридизация) (Jacobs et al., 1999). Оба метода выполняются на фиксированных клетках. Недостатки этих методов связаны с тем, что они чувствительны к условиям фиксации материала. При использовании FISH-метода требуются специализированное дорогостоящее оборудование и наборы реагентов. В нашей работе предложено использование метода RAPD-PCR анализа ДНК как быстрого, простого и достаточно чувствительного. Мы полагаем, что чувствительность данного метода позволяет его использовать его для геномной паспортизации клеточных культур и контроля за геномными изменениями, происходящими в клеточных культурах при пассировании. Диагностические возможности RAPD-технологии успешно проиллюстрированы на многочисленных примерах описания генетического разнообразия микроорганизмов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных животных. RAPD применяется также для геномного маркирования в популяционных и эволюционных исследованиях. Например, для разных видов грибов с помощью УП-ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами) показана видоспецифичность ДНК-паттернов. Наиболее подробно с помощью RAPD-PCR изучались культурные растения, сельскохозяйственные и лабораторные животные с целью идентификации и дифференциации пород и отдельных линий, картирования хромосом и маркирования хозяйственно ценных признаков (Reinoso, 2004; Munoz et al., 21 2007; Lee et al., 2007). В данной работе предложено еще одно применение RAPD-PCR анализа, а именно метод раннего контроля геномных изменений при пассировании культур прогениторных клеток млекопитающих. 1. 2. 3. 4. 5. ВЫВОДЫ Подобраны праймеры, дающие информативные амплификационные спектры ДНК органов и тканей человека и мыши. Впервые с помощью RAPD-анализа и ДНК-фингерпринтинга обнаружена соматическая изменчивость ДНК у эмбрионов человека. При анализе нормальных органов и тканей соматический мозаицизм выявлен у трех из четырех исследованных эмбрионов. Впервые продемонстрированы случаи соматического мозаицизма при RAPD-анализе ДНК нормальных органов и тканей взрослых мышей линий C57KC, CBA, 101. Различия в RAPD-спектрах обнаружены у 7 из 18 особей, и они связаны с изменением подвижности или появлением/утратой амплифицированных фрагментов спектра. Предложен эффективный вариант RAPD-анализа для геномной паспортизации клеточных культур человека (заявка на патент). Впервые показана изменчивость RAPD-спектров ДНК клеточных культур человека (мезенхимные прогениторные клетки, стромальные клетки жировой ткани и клетки фибробластов) на разных стадиях пассирования. Список работ опубликованных по теме диссертации Статьи в журналах соответствующих Перечню ВАК» 1. Бутовская П.Р., Павлова Г.В., Мартиросян И.А., Сухих Г.Т., Рысков А.П. Соматический мозаицизм у мышей, выявляемый методом RAPDPCR // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 2009. №1. С. 3-7. 2. Бутовская П.Р., Мартиросян И.А., Баранов В.С, Егорова А.А, Киселев А.В., Павлова Г.В., Корочкин Л.И. Выявление соматического мозаицизма у человека с помощью полимеразной цепной реакции со случайными праймерами // Генетика. 2007. Т. 43. №12. C. 1694–1699. 3. Бутовская П.Р., Мартиросян И.А, Павлова Г.В, Сухих Г.Т, Рысков А.П. Способ паспортизации и контроля за генетической изменчивостью в клеточных культурах различной длительности пассирования. Заявка на патент № 2008114535/13 (016031) от 16 апреля 2008 года. Тезисы конференций 1. Butovskaya P.R., Martirosyan I.A., Korochkin L.I. Somatic mosaicism in mammals and humans // 12-th PhD meeting in evolutionary biology. 2006. St.Andrews. Scotland. Abstracts. P.41 22 2. Butovskaya P.R. Somatic mosaicism determination in humans by DNAfingerprinting // 11-th PhD meeting in evolutionary biology. 2005. Bordeaux. France. Abstracts. P.14-15. 3. Бутовская П.Р., Мартиросян И.A, Баранов В.С, Павлова Г.В, Корочкин Л.И. Выявление соматического мозаицизма у человека методом ДНКфингерпринтинга // IV International conference Molecular genetics of somatic cells. 2005. Звенигород. Россия. Абстракт. С. 26-27. 23
