ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИИ И
ГИГИЕНИЧЕСКОЙ РЕГЛАМЕНТАЦИИ БИОПРЕПАРАТОВ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ АГЕНТСТВО РОССИИ
(ФГУН НИЦ ТБП ФМБА)
ОТЧЕТ
Экспериментальное изучение репродуктивной токсичности препарата киллевнр
Руководитель исследований,
начальник отдела, к.б.н.
С.П.Рыбалкин
Серпухов 2005
СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ
Начальник отдела патоморфологии и
репродуктивной токсикологии, к.б.н.
Научный сотрудник
Научный сотрудник
Лаборант-исследователь
С.П.Рыбалкин
Лаборант-исследователь
Лаборант-исследователь
Ю.В.Иванова Е.В.Ковалева
'{' /.."У
Л.Г.Игнатьева
Н.Н.Хамьянова
Ю.В.Багрянцева
СОДЕРЖАНИЕ
^
№ стр.
ВВЕДЕНИЕ
5
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1.Методы изучения эмбриотоксического действия киллевира, регистрируемого
в антенатальном периоде
1.2 Методы изучения токсического действия киллевира на гонады самцов и самок
5
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Результаты исследования эмбриотоксического действия киллевира при
ректальном введении
2.2. Результаты исследования эмбриотоксического действия киллевира при
внутривенном введении
2.3. Результаты исследования токсического действия киллевира на гонады самцов
2.4. Результаты исследования токсического действия киллевира на гонады самок
8
11
19
21
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
21
6
7
8
РЕФЕРАТ
Объем отчета - 24 страниц, таблиц - 10
Ключевые слова: киллевир, фуллеренполиаминокапроновая кислота,
репродуктивная токсичность, эмбриотоксическое действие, тератогенное
действие, антенатальный период развития, гонадотоксическое действие
Целью проведенных исследований явилась экспериментальная оценка
репродуктивной токсичности нового фармакологического препарата киллевир.
Соединение представляет собой производное фуллерена и аминокапроновой кислоты фуллеренполиаминокапроновая
кислота.
Исследуемое
соединение
планируется
использовать в качестве лекарственного средства с противогерпесной активностью. Для
применения предложены две лекарственные формы киллевира: суппозитории и
инъекционная форма.
Экспериментальные исследования проведены на аутбредных белых крысах в дозах до
10-кратной эквитерапевтической. Так как исследуемый препарат в своей основе содержит
диметилсульфоксид (ДМСО), то в качестве контрольных групп были набраны животные,
которым вводили ректально суппозиторную основу с ДМСО, либо внутривенно водный
раствор ДМСО и воду для инъекций (контроль).
При экспериментальном изучении репродуктивной токсичности препарата киллевир в
форме суппозиториев для ректального введения, не установлено значимых признаков
повреждающего действия. Однако заслуживает внимания отмечавшееся увеличение
кровенаполнения печени плода при применении 3-х и 10-кратной эквитерапевтических доз.
При изучении инъекционной формы киллевира установленно нарушение общего
развития плода, выразившееся в уменьшении массы и размеров, в том числе при
воздействии эквитерапевтической дозы препарата.
Имеются все основания, чтобы предполагать, что выявленные эмбриотоксические
эффекты вызваны ДМСО. Вместе с тем, учитывая, что ДМСО является неотъемлемой
частью (растворителем субстанции) лекарственных форм киллевира, применение препарата
связано с риском для плода.
ВВЕДЕНИЕ
В отчете представлены результаты экспериментальных исследований репродуктивной
токсичности нового оригинального препарата киллевир, обладающего противовирусной
активностью. Авторы препарата рекомендуют его в качестве противогерпетического
средства.
Субстанция киллевира представляет собой производное фуллерена и
аминокапроновой кислоты - фуллеренполиаминокапроновую кислоту. Субстанция не
растворима в воде, поэтому для ее растворения используют диметилсульфоксид (ДМСО).
Для применения предложены две лекарственные формы киллевира: суппозитории и
инъекционная форма. Основные сведения о составе и условиях применения лекарственных
форм:
Суппозитории ректальные:
фуллеренполиаминокапроновая кислота — 10 мг,
ДМСО — 150 мг,
Персиковое масло – 40 мг,
витепсол — до 2000 мг.
Суппозитории предназначены для ежедневного однократного, в дозе 1 суппозиторий,
ректального применения, курсом не менее ЗгХ месяцев.
Концентрат для инъекций (на 1 дозу):
фуллеренполиаминокапроновая кислота — 50 мг,
ДМСО — 0,5 мл,
вода для инъекций — 2 мл.
Перед инъекцией концентрат разводят в 30 мл воды для инъекций. Препарат
применяют однократно путем внутривенного введения.
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проведены в соответствии с «Методическими указаниями по изучению
репродуктивной
токсичности
фармакологических
веществ».
/Руководство
по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. —
2-изд., перераб. и доп. — М:, ОАО "Издательство "Медицина", 2005, С. 87-100.
В работе использованы аутбредные белые крысы, приобретенные в Центральном
питомнике лабораторных животных РАМН, отделение "Крюково". Изучение
эмбриотоксического и тератогенного действия киллевира проводили в антенатальном
периоде. Изучение гонадотоксического действия киллевира проводили на самцах, в течение
6
30 дней и самках - в течение 15 дней.
Всего в опытах по эмбриотоксичности и
гонадотоксичности использовано 223 крысы.
Для изучения эмбриотоксического и тератогенного действия, суппозиторную массу
киллевира вводили самкам крыс ректально в дозах - 28,6 (эквитерапевтическая), 85,8 и
286,0 мг/кг массы тела с 1 по 20 день беременности. Внутривенно киллевир беременным
самкам вводили в дозах 0,5 (эквитерапевтическая); 1,5 и 5,0 мл/кг по следующей схеме:
для изучения влияния на предимплантационный период: в 1 и 3 день беременности;
для изучения влияния на ранний период органогенеза: в 7 и 9 день беременности;
для изучения влияния на поздний период органогенеза: в 11 и 13 день беременности;
для изучения влияния на развитие костной системы: в 16 и 18 дни беременности.
Так как киллевир имеет в своем составе ДМСО, обладающий эмбриотоксичностью,
отдельным группам животных на всех этапах исследования вводили суппозиторную
основу с ДМСО или водный раствор ДМСО в количестве и концентрациях,
соответствующих его содержанию в соответствующих лекарственных формах. Кроме
того, отдельным группам животных вводили воду для инъекций (контроль). Во время
введения препарата регистрировали поведение самок, клинические признаки и динамику
массы тела. На 20-й день беременности животных умерщвляли и проводили анализ
состояния плодов.
Для изучения токсического действия на гонады самцов, киллевир вводили ректально
в дозах 28,6 и 286,0 мг/кг и суппозиторную основу с ДМСО в дозе 286,0 мг/кг ежедневно на
протяжении 30 суток и внутривенно, в дозах 0,5 и 5,0 мл/кг и водный раствор ДМСО в дозе
5,0 мл/кг один раз в первый день эксперимента. Контрольным животным вводили воду
для инъекций.
Для изучения токсического действия на гонады самок, киллевир вводили ректально
в дозе 286,0 мг/кг ежедневно на протяжении 15 суток. Контролю вводили суппозиторную
основу с ДМСО в дозе 286,0 мг/кг.
Статистическую оценку результатов проводили с использованием t-критерия
Стьюдента.
1.1.
Методы
изучении
эмбриотоксического
действия
киллевира,
регистрируемого в антенатальном периоде
Для получения крыс с известным сроком беременности, с вечера самцов
подсаживали к самкам в соотношении 1:2. Наутро приготавливали нативные мазки
вагинального содержимого, которые анализировали под микроскопом. Показателем
оплодотворения самок служило наличие в мазках сперматозоидов.
На 20 сутки после оплодотворения, животных умерщвляли для изучения токсического
действия препарата в антенатальный период развития и проводили их вскрытие. У
беременных самйк подсчитывали количество желтых тел в яичниках, число мест
имплантации в матке, количество живых и резорбированных плодов. На основании этих
данных определяли уровень пред- и постимплантационной смертности зародышей.
Плоды каждого помета тщательно осматривали с целью выявления внешних
аномалий развития. Затем плоды взвешивали и определяли их краниокаудальный размер,
по этим показателям делался вывод о степени доношенности плодов.
После этого, половину всех плодов из потомства каждой крысы оставляли на
исследование состояния скелета плодов по методу Доусона в модификации отдела
эмбриологии НИИЭМ АМН СССР, у второй половины исследовали внутренние органы по
методике Вильсона в модификации отдела эмбриологии НИИРМ АМН СССР.
1.2. Методы изучения токсического действия киллевира на гонады самцов и
самок
Для изучения токсического действия на гонады самцов, киллевир и суппозиторную
основу с ДМСО вводили ректально ежедневно на протяжении 30 суток и внутривенно
-киллевир и водный раствор ДМСО, один раз в первый день эксперимента. Животных
ежедневно осматривали и еженедельно взвешивали, после чего проводилось их
умерщвление и вскрытие.
Для определения массовых коэффициентов у животных взвешивали семенники,
придатки и предстательную железу. Придаток семенника использовали для получения
суспензии и приготовления мазка для подсчета относительного количества патологических
форм сперматозоидов. Второй семенник фиксировали в 10% формалине и приготавливали
гистологические срезы для анализа сперматогенного эпителия, который оценивали по
следующим количественным показателям: индекс сперматогенеза; количество нормальных
сперматогоний.
Для изучения токсического действия на гонады самок, киллевир и водный раствор
ДМСО вводили в 1, 4 и 10 дни эксперимента. На протяжении 15 дней животных
осматривали и проводили еженедельное взвешивание, после чего проводилось их
умерщвление и вскрытие. У самок были взяты яичники, которые фиксировали в 10%
формалине с последующим приготовлением гистологических срезов через весь орган,
толщиной б микрометров и окрашиванием гематоксилином и эозином и последующим
подсчетом структурно-функциональных элементов в яичнике: фолликулы с одним слоем
гранулезных клеток; фолликулы с двумя и более слоями гранулезных клеток; граафовы
пузырьки и атретические тела. Указанные элементы подсчитывали по всей поверхности
среза.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Результаты исследования эмбриотоксического действия киллевира при
ректальном введении
На протяжении всего периода беременности при ректальном введении киллевира и
суппозиторной основы с ДМСО не было отмечено различий в динамике массы тела
животных во всех экспериментальных группах при сравнении с контрольной (табл.1).
Таблица 1
Динамика изменения массы тела беременных самок на протяжении всего срока ректального
введения киллёвира
Группа
Начальный вес
1-я неделя
2-я неделя
3-я неделя
Контроль
211,3±3,9
242,0±5,7
272,0±7,3
310,0+10,4
Киллевир
215±2,7
246,2±3,2
271,3±4,5
316,0±9,9
208,0+5,2
233,7±5,0
266,3±6,0
309,0±9,0
210,6±4,5
242,5+5,1
275,9±6,8
328,4+11,7
209,0±4,2
240,0±5,1
270,0±8,3
305,7±11,4
28,6 мг/кг
Киллевир
85,8 мг/кг
Киллевир
286,0 мг/кг
Суппозиторная
основа с ДМСО
286,0 мг/кг
Оценка состояния генеративной функции крыс под воздействием киллевира выявила
достоверное увеличение количества мест имплантации и живых плодов в группе животных,
получавших препарат в дозе 85,8 мг/кг массы тела (табл. 2). Изменение данных показателей
не носит дозозависимого характера. Анализ остальных показателей не выявил различий
между подопытными и контрольными животными.
Таблица 2
Результаты количественной оценки эмбриотоксического действия киллевира на белых крыс
при ректальном введении
Показатели
Контроль Киллевир
28,6 мг/кг
Группа
Киллевир Киллевир Суппозиторная
85,8 мг/кг 286,0 мг/кг основа с ДМСО
286,0 мг/кг
12
15
10
Количество беременных
12
11
самок
Результаты вскрытия (в расчете на одну самку)
Желтых тел
15,9±1,8
13,0±0,7
14,5±1,1
14,5±1,0
Мест имплантации
7,2±1,2
9,5±0,6
1О,3±О,5*
8,7±0,9
Живых плодов
6,4±1,2
9,0±0,7
9,6±0,6*
8,3±1,1
Резорбированных
0,9±0,3
0,5±0,2
0,8±0,4
0,5±0,3
13,0±0,6
9,1±0,8
7,9±0,9
1,2±0,4
ПЛОДОВ
Предимп лан га ционная
смертность, %
Постимплантационная
смертность, %
Плацентарно-плодовый
коэффициент, %
45,7±9,2
26,7±4,1
25,9±4,7
36,4±6,9
29,3±6,1
5,8±2,1
3,8±1,8
4,5±1,9
2,6±1,4
9,7±3,2
0,20±0,02
0,20±0,02
0,20±0,02
УГассателЕ. г
Краниокауцальный
размер, см
3,9±0,5
3,8±0,5
3,9±0,4
3,8±0,4
4,3±0,2
4,3±0,1
0,15±0,02 0,20±0,01
Параметры плодов
4,5±0,1
4,4±0,2
4,2±0,1
4,4±0,1
Результаты внешнего осмотра плодов
Количество
83
99
115
124
обследованных плодов
Количество плодов с
0/0
0/0
0/0
0/0
аномалиями развития:
общее / %
Результаты оценки состояния костной системы плодов
Количество
• 43
51
59
61
обследованных плодов
Количество плодов с
1/2,3
0/0,0
3/5,1
8/13,1
аномалиями развития:
общее / %
Результаты оценки состояния внутренних о канов плодов
Количество
40
48
56
63
обследованных плодов
Количество плодов с
3/7,5
1/2,1
6/10,7
9/14,3
аномалиями развития:
общее / %
1римечан; е: "о>0,05
79
1/1,27
37
5/13,5
42
5/11,9
Внешний осмотр плодов во время вскрытия самок подопытных групп выявил один
случай патологии плода в группе получавшей суппозиторную основу с ДМСО в дозе 286,0
мг/кг. Отме чгно общее недоразвитие плода, а также аплазия левой передней конечности и
синдактилия на обеих задних конечностях. Во всех остальных группах патологии плодов не
обнаружено.
Анализ состояния внутренних органов плодов методом серийных срезов показал
достоверно; увеличение количества плодов с полнокровием сосудов печени, в тех группах,
где крысы получали ректально киллевир в дозах 85,8 мг/кг и 286,0 мг/кг (таблица 3). В
целом в этих группах наблюдался повышенный уровень возникновения кровоизлияний. По
остальным аномалиям существенных различий с контролем не отмечено.
Таблица 3
Результаты >[соледования токсического действия киллевира на состояние внутренних
органов плодов при ректальном введении
Группа
Контроль
Киллевир
Количество плодов с аномалиями внутренних органов (абс/%)
КровоизПолно- Кровоиз- Подкожное Кровоиз- Кровоизлияние в
лияние в
кровие
лияния в
кровоизлияние в
твердых
сосудов
печени
лияние
почках кишечнике
и желудке
мозговых
печени
оболочках
0/0
0/0
0/0
0/0
0/0
3/7,5
0/0
0/0
0/0
1/2,1
0/0
0/0
4/7,1
0/0
0/0
0/0
1/1,8
1/1,8
4/6,3
1/1,6
2/3,2
0/0
0/0
2/3,2
0/0
0/0
0/0
0/0
2/4,8
3/7,1
28,6 мг/кг
Киллевир
85,8 мг/кг
Киллевир
286,0 мг/кг
Суппозиторная
основа с ДМСО
286,0 мг/кг
При изучении развития костной системы в группе эмбрионов, матери которых
получали ректально киллевир в дозе 286,0 мг/кг, выявлена достоверная задержка в
оссификац™ костей грудины (табл.4). При этом наиболее высокий показатель задержки
оссификации отдельных костей отмечен при воздействии суппозиторной основы с ДМСО.
Таблица 4
Результаты исследования токсического действия киллевира на развитие костной системы
плодов при ректальном введении
Группа
Количество плодов с аномалиями костной системы (абс/%)
Задержка
Задержка
Задержка
Отсутствие
оссификации
оссификации
оссификации
конечностей
грудной кости
подъязычной
костей пясти и
Контроль
(грудины)
0/0
кости
1/2,3
плюсны
0/0
0/0
Киллевир
0/0
0/0
0/0
0/0
3/5,1
0/0
0/0
0/0
6/9,9
2/3,3
0/0
0/0
1/2,7
1/2,7
28,6 мг/кг
Киллевир
85,8 мг/кг
Киллевир
286,0 мг/кг
Суппозиторная
1/2,7
■ 2/5,4
основа с ДМСО
286,0 мг/кг
2.2. Результаты исследования эмбриотоксического действия киллевира при
внутря зепиом введении
Наблюдение за экспериментальными животными при внутривенном введении
киллевира не выявило каких-либо изменений их физического состояния. Динамика
изменения массы тела крыс подопытных и контрольной групп, была положительной и не
имела достоверных отличий, за исключением группы, получавшей водный раствор ДМСО в
максимально,! дозе в 16 и 18 день беременности. Масса животных в данной группе была
достоверно выше контроля (табл. 5), что, как было установлено при вскрытии животных,
объяснялось большим количеством плодов в среднем у каждой самки.
12Таблица
5
Динамика изменения массы тела крыс при внутривенном введении киллевира
Группа
Контроль
Начальный вес
1-я неделя
2-я неделя
3-я неделя
197,2±4,9
225,0±6,3
254,7+7,7
296,3+11,3
Предимплантация (1 и 3 дни введения)
Киллевир 5,0 мл/кг
205,8±3,3
228,3±4,8
255,8+5,4
316,8±13,2
Водный pan вор
ДМСО 5,С мл; кг
197,9±6,2
220,0+5,0
253,6+5,4
323,6+7,1
241,7+12,6
284,0+24,4
Органогенез (7 и 9 дни введения)
Киллевир 0,5 мл/кг
181,7±10,8
205,8±9,5
Киллевир i .5 мл/кг
189,3+9,9
216,4+9,8
245,0+11,2
273,0+24,1
Киллевир 5.0 мл/кг
182,5+6,2
208,3+8,2
244,2±13,2
281,5±19,0
Водный раствор
ДМСО 0,5 мл/кг
Водный раствор
ДМСО 1,5 мл/кг
Водный раствор
ДМСО 5,0 мл/кг
185,0±13,4
208,3±9,1
235,0±11,8
282,3±22,4
192,5+11,5
209,2+10,0
241,7±12,2
298,2±23,9
181,0±7,0
204,0±9,9
232,0+13,2
266,4±22,5
Киллевир ■<„> ил/кг
186,3+15,9
217,5+10,1
252,5±12,5
310,5+21,4
Киллевир 1.5 мл/кг
196,3+13,8
225,0+11,7
250,0±15,2
285,3±28,0
Киллевир 5,0 мл/кг
182,5+14,2
212,5+7,8
250,0±7,1
295,0±5,4
Водный рас■■ вор
180,0+4,1
209,5±6,1
243,8+10,3
286,8124,0
192,5±10,1
216,3±9,5
246,3±6,6
280,3121,0
188,8+17,1
210,0±18,4
252,5+21,0
305,0122,2
Органогенез (11 и 13 дни введения)
ДМСО 0,5 чллх
Водный раствор
ДМСО 1,5 мл/кг
Водный раствор
ДМСО 5,0 ■ л/кг
Оссификация (16 и 18 дни введения)
Киллевир 5.0 .мл/кг
205,0±4,6
241,3+9,7
275,018,7
307,0122,5
Водный раствор
201,3±7,5
236,3±6,3
276,3±9,4
342,8111,1*
ДМСО 5,0 мл/кг
Примечание: !!о>0.05
Результаты вскрытия самок контрольной и подопытных групп показали, что такие
параметры оценки эмбриотоксического действия, как количество желтых тел в яичниках и
число мест имплантации, а, следовательно, и предимплантационная смертность зародышей,
статистически не отличалась (таблица 6). За исключением группы получавшей внутривенно
водный расгвор ДМСО в 16 и 18 дни беременности в дозе 5,0 мл/кг. У животных в данной
группе отмечено достоверно повышенное количество мест имплантации и живых плодов, и
достоверно снижена предимплантационная смертность. Для всех остальных
экспериментальных групп статистически значимых различий не было.
Внеш 1й осмотр плодов во время вскрытия самок выявил один случай патологии
эмбриона в группе, получавшей внутривенно водный раствор ДМСО в дозе 5,0 мл/кг в 1 и 3
дни, и один случай патологии эмбриона, вызвавшей внутриутробную гибель, в группе,
получавшей внутривенно водный раствор ДМСО в дозе 5,0 мл/кг в 16 и 18 дни
беременное iii. В первом случае отмечено общее недоразвитие, грыжа головного мозга, а
также гипса и ия верхней челюсти с расщеплением верхней губы и твердого нёба, во
втором — было отмечено отсутствие кистей и стоп, а также лизис мягких тканей в
результате внутриутробной смерти. В группах животных, получавших киллевир, случаев
грубой патологии (внешних аномалий развития) не отмечено.
Во всех энспериментальных группах, независимо от дозы и срока введения киллевира
или растьора ДМСО, было отмечено достоверное снижение массы тела и
краниокаудальього размера эмбрионов за исключением групп, которым киллевир и водный
раствор ДМСО вводили в 16 и 18 дни беременности (таблица 6). Это свидетельствует об
эмбрио- и фетотоксическом воздействии, а именно о влиянии в период органогенеза.
Имеются все основания, чтобы предполагать, что данный эффект вызван ДМСО. Однако,
учитывая, что ДМСО "является неотъемлемой частью (растворителем субстанции)
инъекционной формы препарата киллевир, применение препарата всегда будет связано с
риском дня плода.
Таблица 6
Результаты количественной оценки эмбриотоксического действия киллевира на белых крыс при внутривенном введении
Группа
Сонтроль
Киллевир 5,0
мл/кг
Водный раствор
ДМСО 5,0 мл/кг
Результат вскрытия (в
Количество Желтых тел ы Мест
t
беременных
имплантации Живы,.
самок
ПЛОДОВ
15,7±1,5
9,5±1,6
7,2±1,6
10
Предимплантация (1
13,3±1,2
9,8±1,4
9,3±1,3
6
10,9±0,8
мечете на одну
<ку)
сал
'езорбирокаипых
| Прелим11.1!лита-п
т лодов
* 1 .иоиная
смертность, %
2,3±0,8
39,5±8,0
и 3 дни введения)
0,5±0,2
28,3±6,0
0,7±0,4
Постимилантационнаи
смертность, %
24,2±4,7
Плацентарно
-плодовый
коэф-т
0,25±0,03
5,1±1,6
0,29±0,02
23,9±5,1
6,1±5,0
0Д6±О,01
7
15,9±1,4
11,7±0,5
Киллевир 0,5
мл/кг
Киллевир 1,5
мл/кг
Киллевир 5,0
мл/кг
Водный раствор
ДМСО 0,5 мл/кг
Водный раствор
ДМСО 1,5 мл/кг
Водный раствор
ДМСО 5,0 мл/кг
5
13,2±0,7
Органогенез (7 и 9 дни введения)
7,0±2,3
6,6±2,1
0,4±0,4
49,4±14,8
5,7±2,7
0^4±0,04
5
13,4±2,1
9,0±2,2
9,0±2,2
0,0±0,0*
32,8±11,1
0,0±0,0*
0Д5±0,01
5
16,2±1,3
5,8±1,9
4,4±1,8
1,4±0,80
64,2±14,1
24,1±4,6
0,28±0,02
4
13,3±1,5
10,0±2,1
9,8±2,1
0,3±0,3
24,5±13,6
2,5±2,1
ОД9±0,02
3
17,3±0,7
6,0±2,1
ll,7d=l,2
0,3±0,3
30,8±4,6
2,8±1,9
0,27±0,00
3
18,7±4,1
8,О±1,5
5,7±0,3
2,3±1,9
57,1±12,0
29,2±8,9
0,27±0,03
Киллевир 0,5
мл/кг
Киллевир 1,5
мл/кг
Киллевир 5,0
мл/кг
4
15,3±2,5
Органогенез (11 и
8,5±2,5
8,3±2,5
13 дни введения)
О,3±О,3
44,3±20,5
3,О±2,1
0,32±0,07
4
14,0±1,1
8,5±2,7
7,0±2,9
1,5±0,5
39,3±20,0
17,7±2,5
0,2б±0,01
4
15,3±1,7
8,3±0,9
8,О±0,8
0,3±О,3
45,9±9,4
3,О±1,3
0,27±0,02
Продолжение таблицы 6
Водный раствор
ДМСО 0,5 мл/кг
Водный раствор
ДМСО ! ,5 мл/кг
Водный раствор
ДМСО 5,0 мл/кг
3
Киллевир 5,0
мл/кг
Водный раствор
ДМСО 5,0 мл/кг
4
16,0±3,8
4
16,9±1,4
16,7±3,7
10,0±2,1
13,0±1,5
6,0±2,i
15,8±1,2
9,0±2,0
10,0±2,1
5,7±2,3
j
4
.
7,5±0,9
Оссш
8,5±2,6
12,5±1,7*
0,0±0,0*
40,0±11,7
0,0±0,0*
0,27±0,02
о,з±и.з
53,9*24.5
5,6±2,2
0,29±0,01
1,5±0,3
42,9±3,7
16,7±1,8
* 0,28±0,01
46,9±22,7
3,0±3,6
0,22±0,01
12,3±3,5*
8,0±2,6
0,23±0,02
икация (16 и 18 дни введения)
8,0±2,6
О,3±О,3
11,3±0,4*
0,7±0,4
1
Результаты оценки плода
Группа
Контроль
Киллевир 5,0
мл/кг
Водный раствор
ДМСО 5,0 мл/кг
Киллевир 0,5
мл/кг
Киллевир 1,5
мл/кг
Параметры плодов
Результаты внешнего
Результаты оценки состояния
осмотра плодов
костной системы плодов
Количество Количество
Количество
Масса тела, г Кранио-кау Количество
дальный
обследованплодов с
обследованных плодов с
размер, см ных плодов
аномалиями плодов
аномалиями
развития:
развития: общее /
общее / %
%
3,8±О,3
3,8±О,1
72
0/0,0
33
3/9,1
Предимплантация (1 и 3 дни введения)
2,6±0,06*** 3,3±О,1***
56
0/0,0
27
14/51,9
2,6±0,08***
3,2±0,2**
77
2,5±0,06***
3,4±0,05**
32
2,6±0,08***
3,4±0,09*
45
1/1,3
39
Органогенез (7 и 9 дни введения)
0/0,0
16
0/0,0
22
Результаты оценки состояния
внутренних органов плодов
Количество
Количество
обследованных плодов с
плодов
аномалиями
развития:
общее / %
39
0/0
29
9/31,0
25/32,5
38
12/15,6
13/81,3
16
6/37,5 .
17/77,3
23
6/26,1
Продолжение таблицы б
Киллевир 5,0
■
раствор ДМеО
1,5 мл/кг
Водный раствор
ДМСО 5,0 мл/кг
3,7±0,2
2,9±0,1**
мл/кг Водный
раствор ДМСО
2,6±0,2*
0,5 мл/кг Водный 2,8±0,05*
■
-
-
■
!
i
з,з±о,з
3,4±0,08
22 39
0/0,0
10
35
0/0,0
1917
0/0,0
0/0,0
7/70,0
14/73,7
12
0/0
20
7/35,0
15/88,3
18
9/50,0
4/50,0
9
3/33,3
2,7±0,1*
3,3±0,2*
17
2,7±0,1**
3,5±0,2
33
1/3,0
15
7/46,7
18
6/33,3
2,9±0,07»
3,6±0,04
28
0/0,0
14
10/71,4
14
2/14,3
2,7±0,08**
3,5±0,06*
32
0/0,0
16
16/100,0
16
6/37,5
2,5±0,06**
3,2±0,1*
30
0/0,0
15
14/93,3
15
2/13,3
2,8±0,2*
3,5±0,2
17
0/0,0
8
7/87,5
9
1/11,1
2,7±0,02**
3,5±0,01*
30
0/0,0
15
15/100,0
15
4/26,7
8
Органогенез (11 и 13 дни введения)
Киллевир 0,5
мл/кг
Киллевир 1,5
мл/кг
Киллевир 5,0
мл/кг
Водный раствор
ДМСО 0,5 мл/кг
ВОДНЫЙ раствор
ДМСО 1,5 мл/кг
ВОДНЫЙ раствор
ДМСО 5,0 мл/кг
|
Оссш шкация (16 и 18 дни введения)
Киллевир 5,0
3,8±0,4
4,0±0,2
мл/кг
Водный раствор
4,1±0,1
4,1±0,05
ДМСО 5,0 мл/кг
Примечание: *р>0,05; **р>0,02; ***р>0,01
аз
0/0,0
9
0/0
24
0/0
46
1/2,2
23
1/4,4
23
3/13,1
f
f
При изучении состояния внутренних органов методом серийных срезов, практически
во всех подопытных группах было отмечено достоверное увеличение количества
эмбрионов с нарушением кровообращения, характеризующееся венозным полнокровием в
печени, особенно в группе животных, получавших киллевир и водный раствор ДМСО в 1 и 3
дни беременности в дозе 5,0 мл/кг (табл. 7).
Таблица 7
Результаты исследования состояния внутренних органов плодов после внутривенного
введения килчевира
Группа
Количество плодов с аномалиями внутренних органов (абс/%)
Полнокровие в сосудах печени
Кровоизлияния в печени
Контроль
0/0
0/0
Предимшгантация (1 и 3 дни введения)
Киллевир 5,0 мл/кг
7/24,1
2/6,9
Водный раствор
11/28,9
1/0,4
ДМСО 5,0 мл/кг
Органогенез (7 и 9 дни введения)
Киллевир 0,з мл/кг
4/25,0
1/6,3
Киллевир 1,5 мл/кг
5/21,7
1/4,3
Киллевир 5,0 мл/кг
0/0
0/0
Водный рас/вор
4/20,0
3/15,0
ДМСО 0,5 мл/кг
Водный раствор
8/44,4
1/5,6
ДМСО 1,5 мл/кг
Водный раегвср
3/33,3
0/0
ДМСО 5,0 мл/кг
Органогенез (11 и 13 дни введения)
Киллевир 0,5 мл/кг
0/0
6/33,3
Киллевир 1,5 мл/кг
1/7,1
1/7,1
Киллевир 5,0 мл/кг
5/31,3
0/0
Водный рлм'вор
2/13,3
0/0
ДМСО 0,5 мл/кг
Водный раствор
1/11,1
0/0
ДМСО 1,5 мл/кг
Водный раствор
4/26,7
0/0
ДМСО 5,0 мл/кг
Оссификация (16 и 18 дни введения)
Киллевир 5,0 мл/кг
0/0
0/0
Водный раствор
1/4,3
0/0
ДМСО 5,0 мл/кг
При изучении развития костной системы наиболее часто выявляли задержку
оссификаш■■■« зудины во всех экспериментальных группах животных за исключением
эмбрионов получавших киллевир и водный раствор ДМСО в 16 и 18 дни беременности
(табл.8). В этом есть кажущееся противоречие, поскольку именно в последние дни
беременности наблюдается пик остеогенеза. Однако подобное противоречие объяснимо с
точки зрения установленного токсического воздействия инъекционной формы киллевира и
ДМСО в период органогенеза и общего недоразвития плодов. То есть, в данном случае,
задержка осси^икации, особенно крупных костей, связана именно с этим.
Таблица 8
Результаты исследования аномалий развития костной системы плодов после внутривенного
введения киллевира
Группа
Контроль
„
Киллевир 5.0 мл/кг
Водный расгвор
ДМСО 5,0 мл/кг
Киллевир 0,5 мл/кг
Киллевир 1,5 мл/кг
Киллевир 5.0 мл/кг
Водный рз,:- вер
ДМСО 0,5 мл/кг
Водный р'г::т вор
ДМСО 1,5 мл/кг
Водный раствор
ДМСО 5*0 мл/кг
Киллевир 0,5 мл/кг
Киллевир 1.5 мл/кг
Киллевир 5,0 мл/кг
Водный раствор
ДМСО 0,5 мл/кг
Водный раствор
ДМСО 1,5 мл/кг
Водный -рг,:\ вер
ДМСО 5,0 мл/кг
Силлевир 5,0 мл/кг
Водный раствор
ДМСО 5,0 мл/кг
Количество плодов с аномалиями костной системы (абс./%)
Задержка
Задержка
Задержка
Задержка
оссификации
оссификации
оссификации
оссификации
грудной кости
седалищных
подъязычной
костей пясти и
(грудины)
костей
кости
плюсны
3/9,1
0/0
0/0
0/0
Предимплантация (1 и 3 дни введения)
13/48,2
1/3,7
0/0
0/0
24/61,4
1/2,6
0/0
0/0
Органогенез (7 и 9 дни введения)
11/68,8
1/6,3
0/0
17/77,3
0/0
0/0
6/60,0
1/10,0
0/0
11/57,9
1/5,3
1/5,3
1/6,3
0/0
0/0
1/5,3
15/88,3
0/0
0/0
0/0
3/37,5
1/12,5
0/0
0/0
о/о
о/о
о/о
о/о
1/6,7
1/7,2
1/6,3
Органогенез (11 и 13 дни введения)
6/40,0
0/0
9/64,3
0/0
'
15/93,8
0/0
14/93,3
0/0
0/0
5/62,5
0/0
1/12,5
1/12,5
12/80,0
2/13,3
0/0
1/6,7
Оссификация (16 и 18 дни введения)
0/0
0/0
0/0
1/4,4
0/0
0/0
0/0
0/0
19
Таким образом, проведенные исследования позволили установить наличие
эмбриотоксигеского действия киллевира и водного раствора ДМСО при внутривенном
ведении в лредш»щлантационный период, а также в различные периоды эмбриогенеза.
2.3. '-',j.y.штаты исследования токсического действия киллевира на гонады
сами з
Реззлыаты изучения морфофункционального состояния семенников представлены в
таблице 9.
Как : !едует из приведенных в таблице данных, при введении киллевира самцам
крыс бьп' i! злено достоверное уменьшение массового коэффициента семенников в
группе по.",;. чазшей ректально киллевир в дозе 286,0 мг/кг. Кроме того, уменьшение
массового коэффициента предстательной железы отмечено в группах, получавших
ректально i иллевир в дозах 28,6 и 286,0 мг/кг. Однако при гистологическом исследовании
семенник достоверных отличий в показателях семяродного эпителия во всех
исследуемь л г|.>ппах обнаружено не было.
20
Таблица 9
Морфофункциональкые показатели состояния семенников белых крыс после ректального и внутривенного введения киллевира
Показатель
Кон-.ро-;»
Кшыевир,
0,5 мл/кг
5,0 мл/кг
Гм.диьж раствор
ДМСО 5,0 мл/кг
Киллевир,
28,6 мг/кг
жталыюе.
Ilвc^
(СНЙС
Суппозиторная
основа ДМСО
286,0 мг/кг 286,0 мг/кг
7,7±0,2*
8,5±0,4
KMJUitBHp,
Массовый коэффициент
семенников
Массовый коэффициент
придатков
Массовый коэффициент
предстательной железы
Патологические формы
сперматозоидов, %
Индекс сперматогенеза
8,8±0,3
8,7±0,2
9,2±0,3
8,1±0,7
8,О±О,3
4,0±0,6
3,4+0,2
3,4±0,2
3,5+0,2
3,4±0,3
3,0±0,02
3,7±0,5
3,1±0,4
2,8+0,5
3,0±0,2
2,3±0,6
1,7±0,3*
1,7±0,6
2,5±0,5
37,3±1,9
31,3+1,6
35,1±2,3
34,6±1,2
40,0±1,6
35,7±1,2
42,8±1,0
3,12±0,04
3,08+0,08
3,11±0,04
3,02±0,03
3,09±0,03
3,06±0,04
3,03±0,04
Число канальцев со слущенным
эпителием, %
0,8±0,6
0,6±0,4
1,6±0,7
2,0±0,4
2,2±0,4
3,0±1,0
1,6±0,5
Среднее число сперматогониев, %
40,7±1,3
39,4±1,9
40,3+0,9
39,7±0,9
36,0±1,6
39,2±2,2
39,1±1,0
Примечание: р>0,05
21
2.4. Результаты исследования токсического действия киллевира на гонады самок
Ежедневный анализ влагалищных мазков крыс на протяжении всего срока
наблюдения в течение 15 суток (3 астральных цикла) показал правильное регулярное
чередование фаз астрального цикла у всех животных, получавших рекгально киллевир в
дозе 286 мг/кг массы тела. У контрольных животных также не выявлено нарушений
чередования фаз и общей продолжительности астрального цикла.
Для более детального анализа состояния гонад самок проводили подсчет структурных
элементов яичников (таблица 10). Как следует их представленных в таблице данных,
введение препарата киллевир самкам крыс не повлияло на количественные показатели
структурно-функциональных элементов яичников.
Таблица 10
Результаты количественной оценки структурных элементов яичников крыс после
ректального введения киллевира
Структурные элементы яичников
Атретические тела яичника
Граафовы пузырьки
Фолликулы с одним слоем
гранулезных клеток
Флликулы с 2-мя и более слоями
гранулезных клеток
Контроль
Киллевир
286,0 мл/кг
1186,4 ±115,7
1245,3 + 149,6
Суппозиторная
основа с ДМСО
286,0 мг/кг
1088,9 ±122,8
6,4 ± 0,6
6,8 ±0,4
6,1 ±0,6
675,2 ±48,0
744,4 ±54,8
649,5 ±64,1
86,5 ± 8,7
92,3 ± 7,4
82,3 ± 6,2
Таким образом, препарат киллевир не оказал токсического действия на гонады самок
при ректальном введении в течение 3-х астральных циклов в дозе, соответствующей
10-кратной эквитерапевтической.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведено экспериментальное изучение репродуктивной токсичности нового
оригинального препарата киллевир, обладающего противовирусной активностью и
рекомендуемого в качестве противогерпетического средства.
Субстанция киллевира представляет собой производное фуллерена и
аминокапроновой кислоты - фуллеренполиаминокапроновую кислоту. Субстанция не
растворима в воде, поэтому для ее растворения используют диметилеульфоксид (ДМСО).
22
Для применения предложены две лекарственные формы киллевира: суппозитории и
концентрат для инъекций.
Эксперименты проведены на аутбредных белых крысах, приобретенных в
Центральном питомнике лабораторных животных РАМН, отделение "Крюково". Изучение
эмбриотоксического и тератогенного действия киллевира проводили в антенатальном
периоде. Изучение гонадотоксического действия киллевира проводили на самцах, в течение
30 дней и самках - в течение 15 дней.
Для изучения эмбриотоксического и тератогенного действия, суппозиторную массу
киллевира вводили самкам крыс ректально в дозах - 28,6 (эквитерапевтическая), 85,8 и
286,0 мг/кг массы тела с 1 по 20 день беременности. Внутривенно киллевир беременным
самкам вводили в дозах 0,5 (эквитерапевтическая); 1,5 и 5,0 мл/кг по следующей схеме: для
изучения влияния на предимплантационный период: в 1 и 3 день беременности; для изучения
влияния на ранний период органогенеза: в 7 и 9 день беременности; для изучения влияния на
поздний период органогенеза: в 11 и 13 день беременности; для изучения влияния на развитие
костной системы: в 16 и 18 дни беременности. Отдельным группам животных на всех этапах
исследования вводили суппозиторную основу с ДМСО или водный раствор ДМСО в
количестве и концентрациях, соответствующих его содержанию в соответствующих
лекарственных формах. Кроме того, дополнительным группам животных вводили воду
для инъекций (контроль). Во время введения препарата регистрировали поведение самок,
клинические признаки и динамику массы тела. На 20-й день беременности животных
умерщвляли и проводили анализ состояния плодов.
Для изучения токсического действия на гонады самцов, киллевир вводили ректально в
дозах 28,6 и 286,0 мг/кг и суппозиторную основу с ДМСО в дозе 286,0 мг/кг ежедневно на
протяжении 30 суток и внутривенно, в дозах 0,5 и 5,0 мл/кг и водный раствор ДМСО в дозе
5,0 мл/кг один раз в первый день эксперимента. Контрольным животным вводили воду для
инъекций. Животных ежедневно осматривали и еженедельно взвешивали, после чего
проводилось их умерщвление и вскрытие.
Для изучения токсического действия на гонады самок, киллевир вводили ректально в
дозе 286,0 мг/кг ежедневно на протяжении 15 суток. Контролю вводили суппозиторную
основу с ДМСО в дозе 286,0 мг/кг.
При ректальном введении киллевира, оценка состояния генеративной функции крыс
выявила достоверное увеличение количества мест имплантации и живых плодов в группе
животных, получавших препарат в дозе 85,8 мг/кг массы тела. Изменение данных
23
показателей не носит дозозависимого характера. Анализ остальных показателей не выявил
различий между подопытными и контрольными животными.
Анализ состояния внутренних органов плодов методом серийных срезов показал
достоверное увеличение количества плодов с полнокровием сосудов печени, в тех группах,
где крысы получали ректально киллевир в дозах 85,8 мг/кг и 286,0 мг/кг. В целом в этих
группах наблюдался повышенный уровень возникновения кровоизлияний. По остальным
аномалиям существенных различий с контролем не отмечено.
При изучении развития костной системы в группе эмбрионов, матери которых
получали ректально киллевир в дозе 286,0 мг/кг, выявлена достоверная задержка в
оссификации костей грудины. При этом наиболее высокий показатель задержки
оссификации отдельных костей отмечен при воздействии суппозиторной основы с ДМСО.
При оценке результатов внутривенного введения киллевира было установлено, что
такие параметры оценки генеративной функции, как количество желтых тел в яичниках и
число мест имплантации, а, следовательно, и предимплантационная смертность зародышей,
статистически не отличалась. За исключением группы получавшей внутривенно водный
раствор ДМСО в 16 и 18 дни беременности в дозе 5,0 мл/кг. У животных в данной группе
отмечено достоверно повышенное количество мест имплантации и живых плодов, и
достоверно снижена предимплантационная смертность. Для всех остальных
экспериментальных групп статистически значимых различий не было.
Во всех экспериментальных группах, независимо от дозы и срока внутривенного
введения киллевира или раствора ДМСО, было отмечено достоверное снижение массы тела
и краниокаудального размера эмбрионов за исключением групп, которым киллевир и
водный раствор ДМСО вводили в 16 и 18 дни беременности. Это свидетельствует об
эмбрио- и фетотоксическом воздействии, а именно о влиянии в период органогенеза. Кроме
того, при изучении состояния внутренних органов методом серийных срезов, практически
во всех подопытных группах было отмечено достоверное увеличение количества
эмбрионов с нарушением кровообращения, характеризующееся венозным полнокровием в
печени, особенно в группе животных, получавших киллевир и водный раствор ДМСО в 1 и 3
дни беременности в дозе 5,0 мл/кг.
При изучении развития костной системы наиболее часто выявляли задержку
оссификации грудины во всех экспериментальных группах животных за исключением
эмбрионов получавших киллевир и водный раствор ДМСО в 16 и 18 дни беременности. В
этом есть кажущееся противоречие, поскольку именно в последние дни беременности
наблюдается пик остеогенеза. Однако подобное противоречие объяснимо с точки зрения
установленного токсического воздействия инъекционной формы киллевира и ДМСО в
24
период органогенеза и общего недоразвития плодов. То есть, в данном случае, задержка
оссификации, особенно крупных костей, связана именно с этим.
При изучении токсического действия киллевира на гонады самцов крыс было
выявлено достоверное уменьшение массового коэффициента семенников в группе
получавшей ректально киллевир в дозе 286,0 мг/кг. Кроме того, уменьшение массового
коэффициента предстательной железы отмечено в группах, получавших ректально
киллевир в дозах 28,6 и 286,0 мг/кг. Однако при гистологическом исследовании семенников
достоверных отличий в показателях семяродного эпителия во всех исследуемых группах
обнаружено не было.
Ежедневный анализ влагалищных мазков крыс на протяжении всего срока
наблюдения в течение 15 суток (3 эстральных цикла) показал правильное регулярное
чередование фаз эстрального цикла у всех животных, получавших ректально киллевир в
дозе 286 мг/кг массы тела. У контрольных животных также не выявлено нарушений
чередования фаз'и общей продолжительности эстрального цикла.
Кроме того, введение препарата киллевир самкам крыс не повлияло на
количественные показатели структурно-функциональных элементов яичников.
Таким образом, при экспериментальном изучении репродуктивной токсичности
препарата киллевир в форме суппозиториев для ректального введения, не установлено
значимых признаков повреждающего действия. Однако заслуживает внимания
отмечавшееся увеличение кровенаполнения печени при применении 3-х и 10-кратной
эквитерапевтических доз.
При изучении инъекционной формы киллевира внимания установленно нарушение
общего развития плода, выразившееся в уменьшении массы и размеров, в том числе при
воздействии эквитерапевтической дозы препарата.
Имеются все основания, чтобы предполагать, что выявленные эмбриотоксические
эффекты вызваны ДМСО. Вместе с тем, учитывая, что ДМСО является неотъемлемой
частью (растворителем субстанции) лекарственных форм препарата киллевир, применение
препарата связано с риском для плода.