1.2.Методы микробной трансформации органических соединений.
advertisement
Лекция №5 БИОТРАНСФОРМАЦИЯ И БИОДЕГРАДАЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ Все органические соединения, взаимодействующие с живыми организмами, могут подвергаться процессам биотрансформации (изменение отдельных фрагментов молекулы) и биодеградации (разрушению до простых молекул типа CO2, H2O, NH4, CH4 и т.д.). Предметом данной лекции являются процессы биотрансформации приводящие к образованию полезных для человека продуктов (лекарств, химических веществ или полупродуктов), и процессы биодеградации токсичных отходов в живой природе. Содержание 1.Биотрансформация органических соединений ........................................................................2 1.1.Процессы микробной химии ..................................................................................................4 1.2.Методы микробной трансформации органических соединений. .......................................8 1.2.2.Трансформация суспензиями неразмножающихся клеток ............................................10 1.2.3.Трансформация осуществляемая спорами грибов и актиномицетов ............................11 1.2.4.Непрерывные методы культивирования ..........................................................................11 1.2.5.Кометаболизм .....................................................................................................................12 1.2.6.Применение поврежденных и дезинтегрированных клеток ..........................................13 1.2.7.Ингибирование определенных участков метаболитических путей...............................14 1.2.8.Применение мутантов с блокированным синтезом определенных ферментов ...........14 1.2.9. Конструирование штаммов с повышенной способностью к трансформации .............15 1.2.10.Ферментные препараты и иммобилизованные ферменты............................................15 1.2.11.Иммобилизация клеток ....................................................................................................16 1.2.12.Политрансформации ........................................................................................................17 1.3.Микроорганизмы трансформирующие органические соединения ..................................18 1.4.Примеры трансформации органических соединений ........................................................19 2.Биодеградация токсичных соединений ..................................................................................25 2.1.Деградация ксенобиотиков с помощью микроорганизмов ...............................................27 2.2. Использование методов генной инженерии для биодеградации ксенобиотиков ..........32 1.Биотрансформация органических соединений Микробная трансформация — неполное превращение органических соединений ферментами микроорганизмов, сопровождающееся накоплением в среде продуктов этого превращения. Микробные трансформации осуществляются одним или несколькими ферментами и поэтому не приводят к значительным изменениям структуры субстрата. Микробная трансформация проявляется как в образовании соединений, которые далее не используются данным микроорганизмом, так и во временном накоплении промежуточных продуктов в процессе использования различных органических соединений в качестве ростовых субстратов. Примером первого типа процессов может служить окисление, пксилола в п-толуиловую кислоту, которая накапливается в среде и не метаболизируется некоторыми штаммами рода Nocardia при выращивании их в синтетической среде с глюкозой и п-ксилолом: CH3 COOH Nocardia sp. глюкоза CH3 CH3 п-толуиловая кислота п-ксилол Примером второго типа процессов является временное накопление глюконовой кислоты отдельными штаммами рода Pseudomonas в процессе роста на среде с глюкозой: COOH CHO H HO H OH H Pseudomonas sp. HO OH H H OH H OH H OH H OH CH2OH Глюкоза CH2OH Глюконовая кислота При этом глюконовая кислота после значительной аккумуляции в среде используется как источник углерода. Микробная трансформация — естественное свойство микроорганизмов, широко распространенное в природе. Это свойство используется человеком в практической деятельности для получения ценных продуктов. Таким образом, микробы могут выполнять роль химических реагентов в органической химии. Поэтому микробную трансформацию, когда она используется в этих целях, называют ферментативной, микробной или микробиологической химией. Действительно, цели и подходы микробной трансформации близки целям и методам органической химии. В микробной химии используются не только процессы трансформации, осуществляемые микроорганизмами в природе или в стандартных условиях культивирования но, различные биохимические, генетические, микробиологические и технологические методы воздействия на метаболизм микробной клетки, позволяющие препаративно получать продукты неполного превращения органических соединений, используя микроорганизмы, у которых в обычных условиях способность осуществлять данную трансформацию не выражена. Таким образом, огромные возможности органической химии дополняются не менее широкими возможностями микробиологической, или ферментативной, химии. Методы химии и микробиологии, конкурируя между собой, дополняют друг друга. В различных случаях предпочтение отдается тому или другому подходу на основе сравнительной оценки их рентабельности, особенностей технологии, влияния производственных процессов на человека и биосферу в целом. Преимущества ферментативных методов по сравнению с химическими заключаются в следующем: 1) специфичность действия ферментов позволяет осуществлять весьма тонкие перестройки молекул разных соединений с использованием простых технологических схем, в то время как аналогичные химические превращения обычно требуют трудоемких многостадийных синтезов или вообще невозможны: 2) «мягкие» условия действия ферментов, так как они функционируют обычно в водных, неагрессивных средах и при температуре не выше 100 °С; 3) небольшое количество вредных для биосферы отходов и побочных продуктов. Последние две особенности характеризуют микробиологические методы как основу «мягкой технологии» в отличие от химических, которые по технологическим условиям и действию на биосферу являются «жесткими». Недостатками микробиологических методов на современном уровне их развития по сравнению с химическими являются следующие. Ферменты функционируют в большинстве случаев в водной среде, а большинство субстратов как правило плохо растворимы в воде. Поэтому в процессах приходится использовать растворы низкой концентрации, что приводит к низкому выходу целевого продукта с единицы объема аппарата. В связи с этим, а также некоторыми другими трудностями, связанными с культивированием микроорганизмов (необходимость асептических условий, интенсивного массообмена и обработки больших количеств микробной массы или культуральной среды, загрязнением целевого продукта биотрансформации питательными веществами и продуктами их метаболизма и др.), крупнотоннажное производство на основе методов микробиологической трансформации требует высоких энергетических затрат. Поэтому на современном этапе методы микробной химии рентабельны, прежде всего, в тех случаях, когда необходимы тонкие перестройки достаточно сложных молекул, таких, как углеводы, стерины и стероиды, антибиотики, алкалоиды, простагландины, некоторые аминокислоты, нуклеотиды и др., если речь идет о производстве средних масштабов — не более чем сотен или тысяч тонн в год. 1.1.Процессы микробной химии Хотя любое превращение, осуществляемое ферментами микроорганизмов в процессах метаболизма, в принципе может быть использовано как трансформация, т. е. для препаративного получения его продуктов, в настоящее время реализована и практически используется лишь незначительная их часть. Но число процессов, позволяющих препаративно получить продукты ферментативных реакций и описанных в настоящее время, составляет несколько тысяч. Эти процессы очень разнообразны по природе исходных субстратов, использованным микроорганизмам, типу и количеству участвующих ферментов, характеру превращения органических соединений. Только часть из них осуществляется отдельными ферментами и может рассматриваться как ферментативные реакции. Значительная часть процессов микробной химии состоит из нескольких таких реакций, например приведенное выше окисление п-ксилола в птолуиловую кислоту. Поэтому чаще говорят не о реакциях, а о процессах микробиологической трансформации. Классификации моноферментных процессов микробной трансформации, построенные на основе химических механизмов реакций или номенклатуры участвующих ферментов, сложны и насчитывают десятки различных типов. Более широко распространена классификация микробных трансформаций по типу химического превращения субстрат- продукт. Она отражает суммарное превращение исходного соединения, но не механизм процесса. Поэтому, например, все превращения альдоз в кетозы относят к типу «изомеризация», хотя у разных микроорганизмов в этом случае могут быть ответственны ферменты различных классов — соответствующая изомераза или две последовательно действующие оксидоредуктазы. Обычно выделяют класс процессов «дезаминирование», несмотря на то, что за них могут быть ответственны как окислительные, так и гидролитические ферменты. К типу «окисления» относят как моноферментные реакции, так и процессы, осуществляемые несколькими ферментами и т. д. В связи с этим классификация микробных трансформаций по типу превращения субстрат — продукт является искусственной и чисто прагматической, хотя и широко распространена. В настоящее время выделяют следующие типы процессов микробной трансформации: 1) окисление, 2) восстановление, 3) декарбоксилирование, 4) дезаминирование, 5)образование гликозидов, 6) гидролиз, 7) метилирование, 8) этерификация, 9) дегидратация, 10) диспропорцирование, 11) конденсация, 12) аминирование, 13) ацетилирование, 14) амидирование, 15) нуклеотизация, 16) галогенирование, 17) деметилирование, 18)асимметризация, 19) рацемизация, 20) изомеризация. Наиболее изученный и широко используемый в промышленности процесс-реакции окисления. Они объединяют гидроксилирование неактивированного углерода в sp3-гибридном состоянии (введение спиртовой группы ОН), окисление непредельных С=С связей, гидроксилирование ароматического кольца, дегидрирование, β-окисление жирных кислот, окисление спиртовой или альдегидной групп и т.д. Характерным примером таких реакций является дегидрирование стероидов с целью получения антивоспалительных стероидных препаратов преднизона, преднизолона и их производных: CH2OH C O CH2OH O C OH O O OH Mycobacterium globiforme O O Кортизон Преднизон Микробное восстановление имеет преимущества перед многими химическими реакциями такого типа. Например, селективность действия микробных ферментов позволяет восстановить определенную кето-группу стероидов (химическим путем это невозможно). В синтезе стероидов эта особенность микроорганизмов используется очень широко, например, для восстановления 14а- или 17(3-кетогрупп) секостероидов ряда эстрана: OH O Streptomyces O uvarum H3CO 17 -оксипроизводное O O H3CO Bacillus thuringiensis OH H3CO 14 -оксипроизводное Известные примеры ферментативного декарбоксилирования в основном относятся к декарбоксилированию а-кетокислот и аминокислот (кетоглутаровая кислота до янтарной, аспарагиновая кислота до аланина). Микробное дезаминирование имеет большое значение для превращений аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований и нуклеотидов. Аминирование описано для многих соединений, имеющих олефиновую двойную связь или кетогруппу (фумаровая кислота – аспарагиновая кислота, кетоглутаровая кислота - глутаминовая кислота). Аминирование может также происходить путем замещения атома водорода или оксигруппы, например, у гетероциклических оснований. Все эти реакции играют ключевую роль в клеточном синтезе различных аминокислот. Особенно большое значение имеет процесс аминирования фумаровой и а-кетоглутаровой кислот. Микробный процесс по сравнению с химическим протекает в «мягких» условиях с хорошим выходом продукта и для аспарагиновой кислоты реализован в промышленном масштабе (Япония, США). Реакции амидирования редко встречаются в микробной химии. Один из таких примеров — образование биотинамида из биотина. Реакции гидролиза чрезвычайно широко распространены в микробной химии. Они включают гидролиз эфиров, амидов и других соединений. Наиболее часто эти реакции используют в антибиотической промышленности и при производстве стероидов. Современное производство пенициллинов основано на синтезе различных производных 6аминопенициллановой кислоты (6-АПК). Кислоту получают из бензилпенициллина ферментативным гидролизом: O H2C C HN S +H2O , пенициллинацилаза CH3 CH3 N O _ COOH CH2 COOH Бензилпенициллин H2N S N O CH3 CH3 COOH 6 - Àì èí î ï åí èöèëëàí î âàÿ êèñëî òà (6-ÀÏ Ê) Реакции конденсации — синтез молекул органических веществ из двух или более фрагментов с помощью различных микробных ферментов. Реакции широко применяются при получении новых антибиотиков — производных пенициллина и цефалоспорина, которые синтезируют на базе 6аминопенициллановой и 7-аминоцефалоспорановой кислот ферментативным и химическим способами. Большое значение имеет синтез аминокислот из предшественников. Конденсацией пирокатехина и его функциональных производных с аланином и серином удалось получить L-диоксифенилаланин— (ДОФА) — ценный лекарственный препарат, применяемый при болезни Паркинсона: OH CH3CHNH2COOH CH2CHCOOH Pseudomonas spp. NH2 OH OH HO Пирокатехин L-аланин L-диоксифенилаланин (ДОФА) Реакции нуклеотидации – синтез различных нуклеотидов микроорганизмами из гетероциклических оснований или нуклеозидов. Они включают образование рибозидов и их фосфорилирование. В зависимости от условий различные микроорганизмы могут синтезировать нуклеозиды, их моно-, ди- и трифосфаты (АМФ, АДФ,АТФ и др.). Реакция галогенирования редко встречается в микробном мире, но имеет особое значение, так как селективное галогенирование химическим путем – одна из самых сложных проблем химии. Она дает возможность получать галогенированные производные стероидов и других лекарственных препаратов. Наиболее изучен процесс галогенирования ферментом мицелия гриба Caldariomyces fumago, получившим название хлорпероксидазы. Фермент катализирует хлорирование кетокислот, циклических дикетонов, бромирование тиазолов, анизола, стероидов и т. д. CH3 CH3 C O C O H Cl O O Хлорпероксидаза Caldariomyces fumago O O Расщепление рацемических соединений на оптические антиподы широко используется в промышленности для получения стереоизомеров. Эти процессы основаны на стереоспецифичности ферментов, например ацилаз. Ацилазы используют для разделения смесей DL-аминокислот, которые вначале ацилируют, а ацильные производные подвергают гидролизу с помощью этих ферментов, получая L-аминокислоты. Аналогичным путем происходит разделение некоторых терпенов, например dl-изопулегола: CH3 CH3 OOCCH3 H3C CH2 OH Trichoderma sp. Ацетат DL-изопулегола CH3 H3C CH2 L-изопулегол OOCCH3 H3C CH2 Ацетат D-изорулегола Реакции изомеризации имеют большое практическое значение. На их использовании основан, например, такой важный промышленный процесс, как получение фруктозы из глюкозы: 1.2.Методы микробной трансформации органических соединений. Современная методология микробной химии существенно отличается от подходов, традиционных для начального этапа развития этой науки. Наиболее распространенными ранее методами были трансформация растущей культурой или отмытыми клетками, находящимися в определенной фазе развития. Конец 50—60-х годов ознаменовался появлением ряда новых подходов — была обнаружена и стала использоваться ферментативная активность спор грибов и актиномицетов, выполнены основные работы по применению непрерывного культивирования для трансформации ряда органических соединений, разработаны основные принципы использования поврежденных в различной степени клеток (высушенные клетки, ацетоновые порошки и др.), прочно вошли в практику ферментные препараты. В настоящее время существуют несколько методов микробной трансформации органических соединений: I. Использование ферментативных свойств интактных (нормальных) клеток: 1) трансформация растущей культурой в периодических условиях; 2) использование ферментативной активности микробных культур, находящихся в определенных фазах развития; а) трансформация суспензиями неразмножающихся вегетативных клеток; б) трансформация спорами; в) непрерывные процессы; 3) кометаболизм. II. Методы, основанные на дезорганизации обменных процессов клетки: 1) применение в различной степени поврежденных и дезинтегрированных клеток; 2) ингибирование определенных участков метаболических путей; 3) применение мутантов с блокированным синтезом определенных ферментов; III. Конструирование штаммов с повышенной способностью к трансформации органических соединений. IV. Использование ферментных препаратов, иммобилизованных ферментов и клеток. V. Политрансформации. 1.2.1.Трансформация растущей культурой в периодических условиях Это наиболее простой метод, применяемый в тех случаях, когда микробная трансформация представляет собой процесс, продукты которого не используются данной культурой. Трансформируемый субстрат может вноситься в культуру, растущую, используя какой-либо другой источник углерода, как, например, при окислении 3-метилпиридина до никотиновой кислоты нокардиями, растущими за счет использования глюкозы. В других случаях рост может происходить при использовании части молекулы субстрата, который в данном случае является и ростовым, и трансформируемым, например при окислении децилбензола до фенилуксусной кислоты. Ростовой частью в этом случае выступает алкильный заместитель (н-алкан) при бензольном кольце, который утилизируется микроорганизмами по схеме β-окисления жирных кислот. После прохождения 4 циклов β-окисления остается неусваиваемый остаток – молекула фенилуксусной кислоты, которая и является целевым продуктом. CH2(CH2)8CH3 Nocardia sp. CH2COOH Pseudomonas sp. Децилбензол Фенилуксусная кислота Если ростовой субстрат является одновременно и трансформируемым, то максимумы скоростей ростового и трансформационного процессов совпадают. Поэтому воздействия, регулирующие рост клеточной культуры, соответственно влияют на накопление продукта трансформации. Если же ростовой и трансформируемый субстраты различны, то максимумы скоростей ростового и трансформационного процессов, как правило, сдвинуты во времени. Обычно наибольшая трансформирующая активность приходится на фазу замедления роста, когда скорость прироста биомассы начинает падать. Процесс трансформации может иметь место по окончании роста, т. е. когда максимальная удельная скорость трансформации соответствует стационарной фазе развития культуры. 1.2.2.Трансформация суспензиями неразмножающихся клеток Метод широко применяется в тех случаях, когда наибольшая активность трансформации приурочена к определенной фазе развития культуры микроорганизма или если трансформируемый субстрат может разлагаться культурой до конечных продуктов, а процесс метаболизма необходимо остановить на определенном этапе. Метод сравнительно легко применим в тех случаях, когда трансформация осуществляется грибными культурами, мицелий которых возможно без особых затруднений отделить от среды выращивания в нужный момент и ресуспендировать в буферном растворе или водопроводной воде, где и осуществляется трансформационная реакция. Метод трансформации суспензиями неразмножающихся клеток позволяет использовать культуру определенного физиологического состояния. Так, 11гидроксилирование кортексолона с помощью Tieghemella orchldis 233 наиболее интенсивно осуществляется 19-часовым мицелием. Трансформация ацетата кортизона в кортизон (гидролиз) Actinomyces corymbosus наиболее активно осуществляется 24-часовой культурой мицелия в период ее перехода в стационарную фазу. 1.2.3.Трансформация осуществляемая спорами грибов и актиномицетов Трансформация органических веществ спорами имеет ряд особенностей, представляющих интерес в связи с практическим использованием. Эти процессы обычно осуществляются в простых средах — дистиллированной или водопроводной воде, буферных растворах. Иногда для этого требуются добавки органических веществ в небольших концентрациях. Споры активны после длительного хранения (до трех лет в замороженном состоянии). Если процесс трансформации идет в бедной среде, то споры могут быть отмыты и использованы еще 4-5 раз. Оптимум рН обычно выражен менее четко, чем у вегетативных клеток. Это позволяет использовать условия, предотвращающие заражение посторонними микроорганизмами. Подобные наблюдения стимулировали попытки применения трансформации с использованием спор в промышленных масштабах. Такая возможность продемонстрирована на следующих процессах: 11а-гидроксилирования прогестерона и кортексолона спорами Aspergillus ochraceus; 1-дегидрогенизации кортексолона спорами Septomyxa affinis; 1la-гидроксилирования 6а-, 16а-, 17а-диоксипрегн-4-ендиона в нестерильном 200-литровом ферменте. В последние годы осуществлен гидролиз феноксиметилпенициллина спорами Fusarium sp. Конидии Aspergillus candidus NRRL 305 синтезировали, манит из глюкозы с 75%-ным выходом. Появились работы по иммобилизации спор в полиакриламидный гель, что дает возможность применения непрерывно действующих колонок. Таким образом, были осуществлены гидролиз сахарозы и многочисленные трансформации стероидов. 1.2.4.Непрерывные методы культивирования Преимущество непрерывного культивирования по сравнению с периодическим при получении биомассы клеток стимулировали его применение для синтеза микробных метаболитов. Процессы получения продуктов, непосредственно связанные с ростом микроорганизмов, в условиях непрерывного культивирования осуществляются сравнительно легко. Образование микробных метаболитов, не связанное с ростом, потребовало больших усилий для реализации процессов непрерывным методом, и хотя многие из них осуществлены в лаборатории, внедрение этого метода в практику сопряжено с рядом затруднений. Одним из недостатков непрерывного метода, имеющим существенное значение, является то, что в периодической культуре легче получить максимальный выход продукта на единицу субстрата, в то время как в проточной культуре часть субстрата обычно не превращается. Однако более детальное и углубленное исследование непрерывной трансформации сорбита в сорбозу культурой Acetobacter suboxydans, прогестерона в 11α-оксипрогестерон культурой Aspergillus ochraceus, прегнандиена в прегнатриен с помощью Septomyxa affinis и т. д. наглядно продемонстрировали рентабельность и преимущества этого метода. Непрерывные методы микробной трансформации получили интенсивное развитие благодаря разработке метода иммобилизации спор, клеток и ферментов. 1.2.5.Кометаболизм Кометаболизм — процессы трансформации или полного разложения органических соединений, осуществляемые микроорганизмами сопряженно с метаболизмом других субстратов – косубстратов, которые не являются ростовыми. Так, упомянутое выше окисление нокардиями п-ксилола или 3метилпиридина в соответствующие кислоты без косубстратов на питательной среде, содержащей такие соединения, как глюкоза и ацетат, происходит медленно. В присутствии же ксилозы или глицерина активность трансформации резко возрастает. Важно отметить, что глюкоза и ацетат являются оптимальными ростовыми субстратами для культур, осуществляющих описываемые процессы, в то время как ксилоза лишь частично окисляется, но не используется ими в качестве источника углерода, а глицерин поддерживает лишь медленный рост. Таким образом,оптимальные ростовые субстраты - глюкоза и ацетат- не стимулируют трансформацию и, следовательно, не являются косубстратами. При использовании метода растущих культур накопление продуктов трансформации на средах с глюкозой и ацетатом, но без косубстратов, происходит лишь в связи со значительным увеличением массы клеток в культуре, которые имеют низкую удельную активность. В вариантах же с глицерином или ксилозой даже при медленном росте или в его отсутствие удельная активность трансформации значительно выше, что и стимулирует значительное накопление продуктов даже при низкой плотности клеточной культуры. Такие процессы и называют кометаболизмом; он обнаруживается при сравнении удельных скоростей процессов трансформации на различных средах. Механизм сопряжения между трансформацией и метаболизмом косубстрата, приводящего к интенсификации первого процесса, изучены слабо. По всей вероятности такое сопряжение заключается в использовании в первом процессе каких-то метаболитов, образующихся во втором процессе и обеспечивающих первый энергией и (или) кофакторами. Поэтому кометаболизм играет важную роль в тех случаях, когда в метаболической системе микроорганизма отсутствует или недостаточно совершенна координация метаболических путей. Именно поэтому условия кометаболизма бывают, необходимы микроорганизму для превращения необычных для него субстратов (например, упомянутых выше п-ксилола и 3-метилпиридина). Поскольку косубстрат играет в процессе кометаболизма специфическую и вполне определенную роль, правильный его выбор имеет важнейшее значение. В некоторых случаях, когда ферментативный механизм трансформации известен, выбор косубстрата не составляет труда. Так, для интенсификации процесса восстановления карвона в дигидрокарвон культурой Pseudomonas ovalis в качестве косубстрата был выбран этанол потому, что данный микроорганизм имеет активную НАД-зависимую алкогольдегидрогеназу, окисляющую этанол в ацетальдегид; последняя обеспечивает трансформацию карвона восстановительными эквивалентами (НАД*H): C2H5OH + HAD ----- CH3COH + НАД*H CH3 CH3 O O Pseudomonas ovalis этанол H2C (-)-Карвон H2C (-)-Дигидрокарвон В случаях, когда механизм процесса неясен, косубстраты приходится подбирать путем проверки разных соединений. Окислительные процессы кометаболизма иногда называют соокислением (под таким названием они были описаны впервые американским микробиологом Фостером), восстановительные — совосстановлением. 1.2.6.Применение поврежденных и дезинтегрированных клеток Для получения метаболита, не накапливающегося в среде в обычных условиях в заметных количествах, часто требуются особые приемы радикального воздействия на клетки. Сущность этих приемов заключается в «дезорганизации» нормально функционирующих ферментных систем клетки с целью вычленения их отдельных участков. Одним из способов такой дезорганизации является повреждение в той или иной степени клеток микроорганизмов, от простого высушивания до глубокой дезинтеграции клеточных структур. Примером может служить превращение 5'уридинмонофосфорной кислоты (УМ) в уридиндифосфат-N-ацетилглюкоз- амин (УДФАГ) под действием препарата сухих дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Процесс идет в фосфатном буферном растворе (рН 7,6 с глюкозамином, фруктозой и MgCL2). Через 10 ч инкубации выход УДФАГ составляет 66 % от исходного УМФ. Интактные дрожжи трансформирующей активностью не обладают. Когда высушивание не достигает цели, применяют другой способ дезорганизации клеточного метаболизма. Примером может служить превращение аденозинмонофосфата (АМФ) в аденозинтрифосфат (АТФ) ацетоновым порошком или механически растертыми клетками дрожжей. 1.2.7.Ингибирование определенных участков метаболитических путей. Если положение фермента, ответственного за микробную трансформацию, в общей системе обмена веществ установлено, то во многих случаях есть возможность вычленить реакцию, осуществляемую этим ферментом, специфически ингибируя следующий фермент. Так, деградация продуктов первичного окисления н-алканов (β-окисление жирных кислот) может быть остановлена с помощью специфического ингибитора — акриловой кислоты. В этих условиях углеводороды окисляются в алкановые кислоты и кетоны. Внесение в растущую культуру Nocardia sp. KCN (l-10~3 M) ингибирует катаболизм прогестерона культурой до конечных продуктов. В качестве основного продукта получают 9α-оксипрогестерон: 1.2.8.Применение мутантов с блокированным синтезом определенных ферментов Этот метод аналогичен предыдущему, только вместо ингибиторов в этом случае применяют генетические методы — получение мутантов с блокированным синтезом определенных ферментов. Так, из штамма Candida cloaceae, окисляющего парафины, был получен мутант М-1, не способный далее ассимилировать дикарбоновые кислоты, и накапливающий при использовании гексадекана до 22 г/л тетра-декандикарбоновой кислоты. Затем был получен штамм MR-12,вообще не способный расти на средах с налканами и нуждающийся в других субстратах (ацетат). Отмытые клетки этого штамма накапливают около 4,3 г/л тетрадекановой кислоты из чистого гексадекана, а при росте на среде гексадекана с ацетатом — до 61 г/л. В данном случае путем получения мутанта удалось вычленить функцию начального этапа катаболизма н-алканов (не более трех ферментов) и использовать их активность для окисления этих углеводородов в дикарбоновые кислоты. 1.2.9. Конструирование штаммов с повышенной способностью к трансформации Изучение нехромосомных элементов наследственности, контролирующих катаболизм у микроорганизмов многих органических веществ («плазмиды биодеградации»), навело на мысль об использовании их для создания «улучшенных» штаммов, трансформирующих органические соединения. Принципиальная возможность этого подхода показана на примере окисления нафталина в салициловую кислоту. Процесс получения салициловой кислоты из нафталина с помощью бактерий рода Pseudomonas был описан достаточно давно. Недостатком исходных штаммов было то, что салициловая кислота после кратковременного накопления в среде потребляется культурой в качестве источника углерода, что значительно снижает производительность процесса. Штамм Ps. putida 41, полученный методом конъюгации в результате переноса плазмиды NPL-1, контролирующей первичный этап окисления нафталина до салициловой кислоты, от донорного штамма Ps. putida 12А к реципиенту Ps. putida 4, не обладающему способностью окислять нафталин до салициловой кислоты, накапливал салициловую кислоту без ее дальнейшего потребления и отличался от донорного штамма значительно более высокой производительностью. В присутствии анионообменной смолы Амберлит IR-45, связывающей образующийся салицилат, в ферментационной среде выход продукта, равный 90 %, достигался за 10 ч ферментации. 1.2.10.Ферментные препараты и иммобилизованные ферменты Применение очищенных препаратов — логически наиболее естественный способ практического использования активности отдельных ферментов микробных клеток для трансформации органических веществ. Однако технически этот подход реализуем лишь в том случае, если ферментные препараты могут быть получены сравнительно легко, если ферменты стабильны и не требуют кофакторов и т. д. Особенно широкие перспективы в использовании ферментов для синтеза различных соединений открываются в связи с разработкой методов их иммобилизации. Основные достоинства иммобилизованных ферментов — возможность неоднократного использования, отсутствие необходимости очистки продукта от катализатора, стабильность при хранении и в процессе использования, возможность вести реакцию в более широком диапазоне физико-химических условий, в непрерывных условиях и т. д. Реализация большого числа процессов трансформации углеводов, стероидов, антибиотиков, аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов убедила в экономической перспективности этого метода. Кроме названных выше процессов, имеющих промышленное применение, представляет интерес получение L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония с помощью иммобилизованной в полиакриламидный гель аспартазы Escherichia coli. Фермент работает непрерывно длительное время (до 8 дней), не снижая активности, и количественно превращает субстрат при концентрации фумарата 0,2 М и скорости протока 0,16 ч-1. Сравнение с процессами, в которых участвовала растворимая форма фермента или интактные клетки Е.coli, показало экономическую целесообразность использования иммобилизованной аспартазы. 1.2.11.Иммобилизация клеток Наряду с успешной иммобилизацией многих ферментов и применением этого метода в промышленности исследователи столкнулись с рядом трудностей, характерных для работы с ферментами, зависимыми от кофакторов, а также в тех случаях, когда трансформации осуществляются несколькими ферментами. Были предприняты попытки использовать активность «сложных» ферментов и ферментных комплексов путем иммобилизации клеток. Иммобилизация клеток позволяет эксплуатировать отдельные ферменты, а также их системы, что затруднительно при работе с иммобилизованными ферментами. Обмен иммобилизованных клеток отличается от метаболизма интактных микроорганизмов, что может быть использовано в целях регуляции трансформации. Эффективность процессов, осуществляемых иммобилизованными клетками, в ряде случаев выше их эффективности, как у свободных микроорганизмов, так и у иммобилизованных ферментов. Для иммобилизации клеток используются почти все методы, применяемые для иммобилизации ферментов, но наиболее распространенным в настоящее время является включение в полиакриламидный (ПААГ) и каррагенановый гели. Получение аминокислот и органических кислот с использованием клеток, иммобилизованных в полиакриламидный и каррагенановый гели — один из примеров, демонстрирующих возможности и перспективы метода. Клетки Е. coli, иммобилизованные в ПААГ, осуществляли превращение фумаровой кислоты в аспарагиновую. При этом активность иммобилизованных клеток сохранялась при 37°С в присутствии ионов Mg++ в течение 40 сут. при скорости протока 0,5 мл/ч через колонку размером 10х100 см, причем выход аспартата достигал 95 %. Процесс был успешно применен в промышленном масштабе. Ежесуточный выход кислоты при использовании промышленной колонки 1900 кг или 57,6 т/мес, время полужизни и активность клеток свыше 120 сут. Позже был разработан более экономичный способ иммобилизации клеток в каррагенан. Продуктивность иммобилизованных в каррагенан клеток в 15 раз превышала таковую для иммобилизованных в ПААГ, время полужизни их также увеличилось до 2 лет. Преимущества метода были так велики перед существовавшим ранее, что фирма “Танабе” в 1979 г. заменила им промышленное получение Lacnaрагиновой кислоты. Такой же процесс был осуществлен в Советском Союзе. Получение L-яблочной кислоты из фумаровой с помощью иммобилизованных в каррагенан клеток Brevibacterium [iuvum — второй пример промышленного использования ферментативной активности микроорганизмов для биоконверсии органических соединений. Пристального внимания заслуживает и метод иммобилизации смешанных культур. Так, осуществлена трансформация сорбозы в 2-кето-Lгулоновую кислоту смесью иммобилизованных в ПААГ клеток Gluconobacter melanogenus IFO 3293 и Pseudomonas syringae NRRL B-865. Первая бактерия окисляла сорбозу в сорбозон, а вторая, обладая активной сорбозоноксидазой, образовывала 2-кето-L-гулоновую кислоту. 1.2.12.Политрансформации Трансформация сложных органических молекул часто предполагает более чем одну ферментативную реакцию. В ряде случаев для получения практически ценных продуктов требуются весьма существенные перестройки молекулы субстрата, которые могут включать различные процессы, например окисление и гидролиз или окисление, восстановление и гидролиз и т. д. Эти задачи могут быть решены разными путями. 1.Подбор штамма, способного осуществлять нужную трансформацию полностью. Так, Mycobacterium mucosum 77 в присутствии ингибитора расщепления кольцевой структуры осуществляет трансформацию 17а-метил ∆5-андростендиол-3β, 17β в дианабол: OH CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Mycobacterium mucosum 77 HO 17 -метил O 5-андростендиол-3 ,17 дианабол Процесс, таким образом, заключается в окислении гидроксила, изомеризации ∆5 → ∆4 и 1-дегидрогенизации. В Советском Союзе был разработан опытно-промышленный регламент получения преднизолона из гидрокортизона иммобилизованными в полиакриламидный гель клетками Arthrobacter globiformis. 2. Использование нескольких последовательных микробных трансформаций. Показательным примером такого рода процессов может служить трансформация боратного комплекса 16-а-оксикортексолона. Первая стадия—11-а-гидроксилирование — наиболее эффективно осуществляется мицелием Aspergllus ochraceus в неростовых условиях. Через 24 ч вносится ацетоновый порошок клеток Arthrobacter simplex и за несколько часов происходит 1-дегидрогенизация. Выход почти количественный. 3. Использование смешанных культур. В большинстве случаев метод применяется для трансформации стероидов, например для 1-дегидрогенизации и дезацетилирования. Эти процессы дают возможность получить преднизон из ацетата кортизона в одну стадию. Смешанные культуры в некоторых случаях более эффективны, чем последовательно использованные монокультуры. Сравнение ферментативных активностей Arthrobacter globiformis и Mycobacferium album в монокультуре и в смеси показало, что дезацетилирующая активность М. album в присутствии A. globiformis повышается. 1.3.Микроорганизмы трансформирующие органические соединения Современная методология микробной трансформации позволяет использовать для осуществления того или иного химического превращения в принципе любой микроорганизм, имеющий соответствующие ферменты. Требования, предъявляемые к микробному штамму, пригодному для использования в исследовательской и производственной практике, сводятся к следующему: 1) микроорганизм должен развиваться на сравнительно простых средах; 2) активность фермента и ферментной системы, ответственных за трансформацию, должна быть достаточна высокой; 3) накопление продукта трансформации в среде должно быть достигнуто наиболее простыми методами; 4) перечисленные выше условия должны обеспечивать экономическую рентабельность процесса. В соответствии с этими требованиями для микробной трансформации органических соединений используются обычно сапрофитные микроорганизмы, способные расти на обычных микробиологических средах и отличающиеся интенсивным обменом веществ. Набор микробов, применяемых в настоящее время в лабораторной и производственной практике для препаративного получения органических веществ методом микробной трансформации, очень широк. Он включает представителей грибов (аскомицеты, фикомицеты, базидиомицеты, несовершенные грибы), актиномицетов и родственных им организмов, многих других бактерий и даже микроформы водорослей. Попытки многих исследователей установить видовую и родовую специфичность микроорганизмов, осуществляющих различные трансформации, не всегда приводили к успеху. Можно сказать с определенностью, что, например, для гидроксилирования алкильных заместителей ароматических соединений следует искать активные штаммы в группе rhodochrous рода Nocardia, для окисления оксигрупп полиолов — среди уксуснокислых бактерий, для изомеризации альдоз — среди стрептомицетов бурой группы, артробактеров, лактобацилл, бацилл и др. Однако в большинстве случаев приходится ориентироваться на более крупные таксоны и более широкий поиск, что усложняет задачу. Таким образом, потенциальная способность осуществлять различные трансформационные процессы распространена весьма широко среди микроорганизмов, и далеко не всегда можно заранее указать узкую таксономическую группу, в которой следует искать штаммы, осуществляющие определенное превращение. Существуют, однако, некоторые таксоны — роды и даже виды, способные проводить разнообразные превращения органических веществ с накоплением продуктов трансформации. Среди них заслуживают особого внимания G. oxydans, осуществляющий десятки различных окислительных превращений углеводов и родственных соединений, Aspergillus niger, который наряду с окислением углеводов используется также для их восстановления, гидролиза гликозидных связей и трансгликозидирования, Brevibacterium ammoniagenes, который синтезирует рибозиды и нуклеотиды из предшественников и аминирует органические кислоты. Очень часто упоминаются в литературе проводящие различные трансформации представители родов Arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterrium, Pseudomonas. 1.4.Примеры трансформации органических соединений Способность клеток микроорганизмов к сложнейшим процессам биотрансформации наиболее полно реализовалась при получении промышленно важных стероидов. Использование абсолютной субстратной специфичности и стереоспецифичности биологических катализаторов, присущих целым клеткам микроорганизмов, позволило разработать условия осуществления множества химических реакций для структурных перестроек стероидов. В результате были получены новые соединения с лучшими фармакологическими свойствами. Биотрансформация стероидов обычно заключается в селективном воздействии на одно из положений стероидного скелета. Первый промышленный процесс микробной биотрансформации стероидов основывался на технологии направленного гидроксилирования (11-αгидроксилирование) прогестерона: CH2OH CH2OH C O C O HO Гидроксилаза Aspergilius oshraceus O O Прогестерон 11--Гидроксипрогестерон Значимость разработанной микробной трансформации определяется тем, что процессы гидроксилирования кортикостерона и его производных лежат в основе промышленного получения многих ценных продуктов: противовоспалительных и противоопухолевых препаратов, трансквилизаторов, анестезирующих средств, половых гормонов и пр. В качестве типичного примера микробиологической трансформации рассмотрим подробнее превращение гидрокортизона в преднизолон культурой Mycobacterium globiforme для которой характерны окислительновосстановительные превращения стероидной молекулы (микроорганизм применяется в промышленности для получения стероидных гормонов): CH2OH CH2OH C O C O HO OH HO OH Mycobacterium globiforme O O Гидрокортизон Преднизолон Культуру Mycobacterium globiforme предварительно выращивают на питательной среде содержащей кукурузный экстракт 1,0 г, глюкозу 1 г, агарагар 3,0 г, на 1 л водопроводной воды при рН среды 6,8-7,2 в течени 4-5 сут. Затем водной суспензией клеток засевают колбы с жидкой средой того же состава, разлитой по 50 мл в медицинские качалочные колбы. Одновременно с бактериальной суспензией вносят в качестве индуктора ацетат кортизона (10 мг в 1 мл метанола на 50 мл среды). Через 24 ч (при сухой биомассе 1,6— 2,5 мг/мл) в культуральную жидкость вносят водную суспензию тонкоизмельченного гидрокортизона до величины частиц менее 5мкм. Трансформацию проводят при 28-30 °С на качалке с 200—220 об/мин в течение 18—24 ч. Культуральную жидкость (300 мл) экстрагируют три раза этилацетатом (по 1л), объединенный экстракт упаривают до 300 мл, добавляют 0,3 г активированного угля, кипятят 5-10 мин, уголь отфильтровывают, промывают горячим этилацетатом и растворитель отгоняют до 45 мл. Раствор охлаждают 16 ч при 0 °С для полного выделения преднизолона. Осадок отфильтровывают, промывают охлажденным этилацетатом, высушивают при 60-70 °С. Выход преднизолона 85 % от теоретического, в качестве примесей образуется 20β-оксипроизводное преднизолона (0,5 %) и исходный гидрокортизон – 6-8 %. При использовании иммобилизованных в полиакриламидный гель клеток Mycobacterium globiforme реакционную смесь, содержащую 0,1 г/л гидрокортизона в фосфатном буфере (рН 7,0), пропускали через колонку, содержащую гранулы геля. Скорость потока через колонку 1,3 мл/ч на 1 мл геля (SV), температура 20-22 °С. Выделение стероидов проводили по методике, описанной выше. При таких условиях наблюдалось количественное превращение субстрата в течение 9-10 сут, через 15 сут активность снижалась на 50%, через 20 сут обнаруживалось лишь 5-7 % превращенного субстрата. Разработка крупномасштабного производства преднизолона путем биотрансформации стероидов позволила снизить стоимость этого препарата в 200 раз. Важнейший источник стероидных гормонов - культуры клеток растений. Так, культура клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoided) корневого происхождения продуцирует фитостерин диосгенин и его гликозидные производные (сапонины). Существенно, что способность к сверхсинтезу фуростаноловых гликозидов ряда штаммов диоскореи, например штамма ДМ-ОГ, стабильно поддерживалась в течение 27 лет. Таким образом, культивирование клеток растений in vitro представляет собой новое решение проблемы промышленного получения вторичных метаболитов. Биотрансформация стероидов с использованием культур растительных клеток имеет целый ряд преимуществ перед микробиологической трансформацией. Так, если трансформация в положения 3 и 5 характерна практически для всех используемых культур (микроорганизмы, растительные клетки), то реакции Iβ-, 4β-, I2β- (дигитоксин в дигоксин), 16βгидроксилирования и изомеризации 17β-лактонного кольца, осуществляются только некоторыми культурами растительных клеток, и сильно, зависят от происхождения ткани и условий трансформации. Изучение биотрансформации малоиспользуемого в терапии сердечного гликозида дигитоксина в ценные гликозиды (дигоксин, пурпуреогликозид А и др.) проводилось на клеточных линиях Digitalis. Высокий выход конечных продуктов был достигнут при селекции специализированных линий и оптимизации условий роста в специальных аппаратах. Процесс биотрансформации дигитоксина протекал в две стадии. После 10-дневной инкубации клеток Digitalis lanata в “ростовой” питательной среде (Мурасиге - Скуга) культуру переносили в "продукционную” среду (8% раствор глюкозы) с субстратом для биотрансформации - дигитоксином. В этих условиях весь дигитоксин в течение 2 дней трансформировался в дигоксин. O CH3 O O OH CH3 CH3 CH3 OH R O Дигитоксин O Diditalis lanata OH R O Дигоксин Дальнейшие успехи в производстве стероидных препаратов связывают с применением иммобилизованных клеток, использованием оптимального сочетания биологических и химических превращений, а также с совершенствованием технологии очистки получаемых соединений. Так, в настоящее время разработаны промышленные способы получения ценных карденолидов, основанные на иммобилизации растительных клеток Digitalis в специальных биокатализаторах. В последнее время сильно возрос интерес к использованию микроорганизмов для избирательной биотрансформации гетероциклических соединений. Среди гетероциклических соединений наиболее широко изучены процессы окисления пиридинов в пиридоны, селективное окисление боковых алкильных групп в различных гетероциклах, энантиоселективное цисдигидроксилирование бензотиофенов и бензофуранов. Alicaligenes faecalis N COOH H3C H3C 75% P. putida N CH3 90% O N COOH H3C H3C N COOH P. putida H3C N H CH3 40% H3C H3C N H COOH H3C OH P. putida S 79% OH S Поразительным примером возможностей микробной биотрансформации является катализируемое ферментами введение аминокислотных фрагментов в 4-, 5-, 6-, 7-азаиндолы при алкилировании их серином. COOH H NH2 COOH N триптофансинтетаза H N HO NH2 pH 8, пиридоксаль N H H 88% Учеными фирмы “Сетус корпорепйшин” предложен оригинальный ферментативный способ синтеза различных окисей алкенов (эпоксидов), являющихся исходным соединением для синтеза различных пластмасс и производных диолов (антифриз, тормозная жидкость и т.д). В настоящий момент окиси алкенов получают химическим путем. Процесс протекает под высоким давлением, является взрывоопасным и требует большого количества дорогостоящего серебряного катализатора. Ферментативный синтез окисей алкенов из алкенов, протекающей в водной среде, основан на 3 ферментах: глюкозозо-2-оксидазе из базидомицета Oudemansiella mucida, галопероксидазе из гриба Caldariomyces или других источников и эпоксидазе из Flavobacterium. На первом этапе синтеза глюкозозо-2-оксидаза вызывает образование перекиси водорода (Н2О2) из глюкозы, которая служит и субстратом, и источником энергии. На втором этапе, катализируемом галопероксидазой, перекись водорода взаимодействует с вводимыми в реакционную среду алкеном и галогенид-ионом (ионом фтора, хлора или брома) с образованием соответствующего β-алкангалогенгидрина. На последнем этапе водород гидроксильной (Н+) группы и галогенид-анион отщепляются под действием эпоксидазы, в результате чего получается окись соответствующего алкена. N O HO CH2 (CHOH)4 C H ãë þ ê î çà + H2O2 + O2 + NaCl + H2O ï åðî ê ñè äàçà ãàë î ï åðî ê ñè äàçà + C + H2O2 OH NaOH Cl OH -алкангалогенгидрин àë ê åí + NaOH Cl OH O HO CH2 (CHOH)4 ãë þ ê î í î âàÿ ê è ñë . ýï î ê ñè äàçà + NaCl O ýï î ê ñè ä Ферментативный путь синтеза окисей алкенов весьма выгоден с экономической и экологической точек зрения по сравнению с химическим, поскольку источником галогенид-иона может служить обычная соль, такая как хлорид натрия, а в химическом синтезе используют элементарный хлор. Не нужен и серебряный катализатор. При использовании ферментативного метода в качестве побочного продукта с высоким выходом из глюкозы образуется глюконовая кислота, которая в свою очередь является очень ценным продуктам. Другое преимущество ферментативного способа синтеза окисей алкенов – его гибкость: изменяя субстрат на который действует галопероксидаза, можно синтезировать различные окиси алкенов. Еще одно достоинство этого метода состоит в том, что он не дает отходов: галоген можно опять использовать в новом цикле синтеза. Перспективным является увеличение активности ферментов за счет их иммобилизации или модификации активных центров с использованием методов генной инженерии. 2.Биодеградация токсичных соединений Еще относительно недавно ни у кого не возникало сомнения в том, что окружающая среда — воздух, земля и вода — всегда будут эффективно «перерабатывать» бытовые, промышленные и сельскохозяйственные отходы. Теперь мы знаем, что это не так. Человечество столкнулось с двумя фундаментальными проблемами: переработкой отходов, постоянно образующихся в огромном количестве, и разрушением токсичных соединений, десятилетиями накапливавшихся на свалках, в воде и почве. Все промышленные отходы можно условно разделить на две категории: 1. Отходы производств основанных на использовании биологических материалов и процессов (продукты сельского хозяйства, пищевой и лесоперерабатывающей промышленности). 2. Отходы неприродных, синтетических веществ (химическая промышленность). Большинство отходов первой категории может легко перерабатываться и утилизоваться биологическим путем. Более того, многие виды отходов могут использоваться как субстрат для различных биотехнологических производств. Разработаны различные виды аэробной и анаэробной очистки сточных вод, которая является самым крупным, по объему, биотехнологическим производством. Более сложной является ситуация с отходами второй категории. Большинство соединений, составляющих отходы, не встречаются в природе и поэтому “не знакомы” микроорганизмам – деструкторам. Но, если в их структуру входят функциональные группы, встречающиеся в природных соединениях, то они могут подвергаться, в разной степени, частичной биодеградации (биодеструкции) с потерей своих токсичных свойств. Однако это бывает не всегда. Часто процесс биодеструкции приводит к образованию других вредных веществ, иногда с еще большей токсичностью. Так дегалогенирование трихлорэтилена некоторыми почвенными бактериями приводит к образованию еще более токсичного и канцерогенного соединения – винилхлорида. Поэтому прежде чем внедрять процесс биоутилизации того или иного неприродного химического вещества необходимо тщательно исследовать всю цепочку его превращений, подобрать оптимальные штаммы микроорганизмов и условия проведения процесса. Однако это не всегда возможно, т.к. в таких процессах могут участвовать микробные сообщества, состоящие из большого количества членов (до нескольких десятков), комплексно воздействующих на молекулу разрушаемого соединения за счет поставки тех или иных ферментов и кометаболитов. Проследить всю цепочку превращений и подобрать стандартные условия в этом случае очень сложно или вообще невозможно. Все это существенно сдерживает внедрение биологических методов утилизации такого рода отходов. Однако биологические методы переработки имеют целый ряд преимуществ перед термическими (сжигание, пиролиз) и химическими (химическая трансформация, комплексообразование и т.д.). 1. Высокая скорость и селективность ферментативных реакций. 2. Разнообразие ферментов, позволяющее микроорганизмам утилизовать широкий круг субстратов и возможность их приспособления (адаптации) к незнакомому субстрату за счет мутаций. Так недавно были обнаружены плесневые грибы, использующие в качестве источника питания фторопласт (тефлон) – вещество устойчивое к воздействию практически любого агрессивного химического вещества за счет наличия в нем большого количества прочных связей C-F. Особенно интересным является тот факт, что в тефлоне отсутствуют связи С-Н и С-О-Н, расщепление которых служит источником энергии практически для всех живых существ (гликолиз, цикл Кребса и др.). Предполагается, что энергию эти микроорганизмы получают за счет расщепления связи С-С линейной молекулы тефлона. 3. Возможность конструирования с помощью методов генной инженерии специальных микроорганизмов – деструкторов, оптимизированных для усвоения тех или иных конкретных соединений. 4. Меньшая стоимость переработки (затраты на оборудование, энергию, воду). 5. Большая экологическая безопасность. 2.1.Деградация ксенобиотиков с помощью микроорганизмов Проблема утилизации токсичных отходов химической промышленности сейчас стоит очень остро. До недавних пор основную массу токсичных веществ разрушали, сжигая их или обрабатывая другими химикатами, однако это тоже приводило к загрязнению окружающей среды, а, кроме того, обходилось очень дорого. В середине 1960-х гг. были обнаружены почвенные микроорганизмы, способные к деградации ксенобиотиков (неприродных, синтетических химических веществ; от греч. xenos, чужой) — гербицидов, пестицидов, хладагентов, растворителей и т. д. Это открытие подтвердило правильность предположения о том, что микроорганизмы можно использовать для экономичного и эффективного разрушения токсичных химических отходов. Основную группу почвенных микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики, составляют бактерии рода Pseudomonas. Биохимические исследования показали, что разные штаммы Pseudomonas способны расщеплять более 100 органических соединений. Нередко один штамм использует в качестве источника углерода несколько родственных соединений. В биодеградации сложной органической молекулы в природных условиях обычно участвуют целые сообщества микроорганизмов и множество разных ферментов. Бактерии, разрушающие негалогенированные ароматические соединения, как правило, превращают их в катехол (рис.1) или протокатехоат (рис.2), а затем, в ходе нескольких реакций окислительного расщепления, — в ацетил-Со А и сукцинат (рис.3) или пируват и ацетальдегид (рис.4). Эти последние соединения метаболизируются практически всеми микроорганизмами. Галогенированные ароматические соединения, основные компоненты большинства пестицидов и гербицидов, с помощью тех же ферментов разрушаются до катехола, протокатехоата, гидрохинона или их галогенированных производных, причем скорость их деградации обратно пропорциональна числу атомов галогена в исходном соединении. Дегалогенирование (отщепление замещающего атома галогена от органической молекулы), необходимое для детоксикации соединения, часто осуществляется в ходе неспецифической диоксигеназной реакции, путем замещения галогена в бензольном кольце на гидроксильную группу. Эта реакция может происходить как в ходе биодеградации исходного галогенированного соединения, так и потом. Разрушение ароматических соединений содержащих сульфогруппу (эмульгаторы, смачиватели, компоненты красителей) протекает обычно через предварительное удаление сульфогруппы, которая обеспечивает общую устойчивость молекулы к биодеградации. H OH OH SO3H O2 + SO3H OH H OH - - SO3H- O OH - SO3H Высокотоксичные ароматические нитросоединения в природных условиях довольно быстро восстанавливаются до соответствующих ароматических аминов, которые весьма токсичны, а многие являются канцерогенами. Дальнейшая деградация аминов протекает достаточно сложно, т.к. они легко конденсируются с карбоксильными и карбонильными группами биомолекул с образованием полииминов и полиаминов, устойчивых к последующему действию микроорганизмов. Скорость и глубина биодеградации нефтяных загрязнений определяется, прежде всего, их компонентным составом. Легче всего разрушаются линейные алканы, гораздо хуже разветвленные, циклоалканы, непредельные и ароматические соединения. Ускорению биодеградации способствует наличие в среде солей азота и фосфора, интенсивная аэрация. Устойчивость алкилсульфатов (ПАВы, детергенты, моющие средства и стиральные порошки) к биодеградации существенно зависит от природы и строения алкильной группы. “Мягки ” ПАВы, содержащие линейные, неразветвленные алкильные группы, довольно легко разлагаются микроорганизмами (β-окисление). “Жесткие” ПАВы, содержащие разветвленные радикалы на несколько порядков более устойчивы. Механизм биодеструкции тех и других включает на первом этапе удаление сульфатной группы под действием соответствующих ферментов-сульфатаз, приводящее к образованию спиртов, которые далее подвергаются дальнейшему метаболизму. У микроорганизма Bacillus stearothermophilus обнаружен фермент роданаза, катализирующий превращение цианид-иона в роданид-ион. В грибах, паразитирующих на растениях цианогенах, обнаружен фермент цианатгидратаза, катализирующая гидролиз цианистого водорода до формамида. Представляется перспективным создание систем биологической очистки сточных вод от органических и неорганических соединений, содержащих цианогруппу. Большой интерес для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов представляют сульфатредуцирующие бактерии. Эти микроорганизмы – анаэробы в качестве акцепторов атомов водорода от NAD*H используют не продукты собственного метаболизма (пируват, ацетальдегид), а сульфат – анионы SO42-, присутствующие в окружающей среде. В результате происходит восстановление сульфат – анионов до сульфид-анионов, которые далее взаимодействуют с ионами железа или других тяжелых металлов присутствующих в среде с образованием нерастворимых сульфидов. 2.2. Использование методов генной инженерии для биодеградации ксенобиотиков Некоторые микроорганизмы обладают природной способностью к деградации различных ксенобиотиков, однако следует иметь в виду, что: 1) ни один из них не может разрушать все органические соединения; 2) некоторые органические соединения в высокой концентрации подавляют функционирование или рост деградирующих их микроорганизмов; 3) большинство очагов загрязнения содержит смесь химикатов, и микроорганизм, способный разрушать один или несколько ее компонентов, может инактивироваться другими компонентами; 4) многие неполярные соединения адсорбируются частицами почвы и становятся менее доступными; 5) биодеградация органических соединений часто происходит довольно медленно. Часть этих проблем можно решить, осуществив конъюгационный перенос плазмид, которые кодируют ферменты разных катаболических путей, в один реципиентный штамм (рис.5). Если две плазмиды содержат гомологичные участки, то между ними может произойти рекомбинация с образованием гибридной плазмиды, которая имеет больший размер и обла- дает свойствами исходных плазмид. Если же две плазмиды не содержат гомологичных участков и относятся к разным группам несовместимости, то они могут сосуществовать в одной бактерии. В 1970-х гг. Чакрабарти и его коллегами (США) был создан первый бактериальный штамм, обладающий более широкими катаболическими возможностями. Он расщеплял большинство углеводородов нефти и был назван «супербациллой». Для его получения использовали плазмиды, каждая из которых кодировала фермент, расщепляющий определенный класс углеводородов: плазмида САМ детерминировала деградацию камфары, ОСТ — октана, NAH — нафталина, XYL - ксилола (рис.5). Сначала путем конъюгации перенесли плазмиду САМ в штамм, несущий плазмиду ОСТ. Эти две плазмиды несовместимы (не могут существовать в одной клетке в виде отдельных плазмид), но в результате происходящей между ними рекомбинации образуется одна плазмида, объединяющая их функции. Затем аналогичным путем плазмиду NAH перенесли в штамм, несущий плазмиду XYL. Эти плазмиды совместимы и могут сосуществовать в одной клетке несли плазмиду САМ в штамм, несущий плазмиду ОСТ. Эти две плазмиды несовместимы (не могут существовать в одной клетке в виде отдельных плазмид), но в результате происходящей между ними рекомбинации образуется одна плазмида, объединяющая их функции. Затем аналогичным путем плазмиду NAH перенесли в штамм, несущий плазмиду XYL. Эти плазмиды совместимы и могут сосуществовать в одной клетке-хозяине. И, наконец, гибридную плазмиду перенесли в штамм, несущий плазмиды NAH и XYL. В результате всех этих манипуляций получили штамм, который растет на неочищенной нефти лучше исходных штаммов, взятых по отдельности или вместе. Хотя сам этот штамм не использовали для ликвидации нефтяных загрязнений, он сыграл важную роль в становлении биотехнологической промышленности. Изобретатель «супербациллы» получил патент США, описывающий структуру данного штамма и возможности его применения. Это был первый патент, выданный за создание генетически модифицированного микроорганизма и подтвержденный Верховным судом США, который постановил, что биотехнологические компании могут защищать свои изобретения точно так же, как химические и фармацевтические. Большинство созданных в настоящее время рекомбинантных микроорганизмов – биодеструкторов, используемых в лабораторных условиях, являются мезофиллами, т.е. хорошо растут при температурах 20400С. Это связано с общепринятыми мерами безопасности при работе с рекомбинантными микроорганизмами. Однако температура сточных вод или загрязненных водоемов обычно лежит в диапазоне 0-200С. Поэтому проводятся работы по созданию аналогичных психрофильных штаммов, которые в недалеком будущем найдут широкое применение. Однако необходимо разработать и специальные технологии их использования в различных случаях. Так, вряд ли возможно из постоянное присутствие в “активном иле” очистных сооружений совместно с природными микроорганизмами, обладающими более высокой жизнеспособностью. Это неизбежно приведет к быстрой утрате рекомбинантых плазмид. Поэтому такие штаммы целесообразно добавлять в сточные воды или очистные сооружения периодически, в момент “пиковых” перегрузок по загрязняющим компонентам, для деградации которых они предназначены. Возможно так же создание отдельных линий или установок по очистке тех стоков, которые губительно действуют на “активный ил”, в которых будут использоваться специально созданные рекомбинантные микроорганизмы.
