ЛЕКЦИИ - ИНСТИТУТ ЖИВЫХ СИСТЕМ

ЛЕКЦИЯ № 6
Радиационно-генетические эффекты
История
В 1925 в опытах на дрожжевых клетках и плесневых грибках Г. Н. Надсон и Г. Ф.
Филиппов выявили действие ионизирующих излучений на генетический аппарат
клетки, сопровождающееся наследственной передачей вновь приобретенных признаков.
Так, исследуя влияние рентгеновских лучей на половой процесс у низших грибов, они
обратили внимание на появление отдельных колоний оранжевого цвета. Изучение этих
новых форм грибов показало их резкое отличие от исходной культуры – они были
способны образовывать жиры и оранжевый пигмент. Наблюдением грибков в течение
многих поколений было показано, что речь идёт о наследуемых изменениях, таким
образом, было установлено, что рентгеновские лучи обладают мутагенным действием.
В 1927 это подтвердил Г. Мюллер на дрозофиле, а затем Л. Стадлер – на кукурузе.
Затем исследования были проведены на мышах и других организмах.
В настоящее время радиационно-генетические исследования проводятся во всем мире
широким фронтом.
Хромосомные аномалии обычно возникают при облучении клеток в периоде G,
(пресинтетическом периоде) клеточного цикла, перед удвоением генетического
материала. Облучение клеток в периоде G2 (постсинтетическом периоде) может вызвать
повреждение лишь одной хроматиды в хромосоме. Частота хромосомных аберраций в
циркулирующих лимфоцитах коррелирует с дозой облучения, и поэтому величину этой
дозы можно установить путем сравнения числа хромосомных аберраций в лимфоцитах
и в клеточной культуре, получившей определенную дозу ионизирующего излучения in
vitro. Минимальная доза, которую можно выявить при анализе лимфоцитов, составляет
примерно от 10 до 20 бэр. Обнаружение хромосомных аберраций в лимфоцитах –
доказательство недавнего облучения организма.
Генетические отдаленные последствия или наследственные заболевания (или
нарушения) относятся ко второй группе стохастических эффектов облучения, которые
проявляются не у самих облученных людей, а в их потомстве. Они являются следствием
радиационных мутаций в зародышевых клетках облученных родителей, в отличие от
злокачественных новообразований, возникающих в результате мутаций в соматических
клетках самих облученных объектов.
Геном человека содержит от 50 000 до 100 000 генов. Поэтому потенциальное число
возможных мутаций и, следовательно, вероятность возникновения различных
генетических нарушений в принципе огромно. Распространенная точка зрения о том,
что ионизирующие излучения способны индуцировать особенных, фантастических
мутантов и монстров абсолютно не верна. На самом деле не существует каких-либо
специфических радиационных мутаций, облучение лишь увеличивает вероятность
проявления спонтанных мутаций, т.е. тех самых, которые обычно регистрируются в
естественных природных условиях.
Различают три категории наследственных заболеваний – менделианские,
хромосомные и мультифакториальные.
1
Менделианские (генные) нарушения являются следствием мутаций в единичных
генах одной или двух аутосом или половых хромосом. Они могут быть доминантными,
рецессивными и связанными с полом.
Хромосомные нарушения проявляются в виде изменения (увеличения или
уменьшения) числа хромосом, а также изменения их структуры (хромосомные
аберрации).
Мультифакториальные нарушения обязательно имеют генетический компонент, но
не могут быть описаны как просто менделианские.
Мутация – изменения генотипа, происходящие под влиянием внешней или
внутренней среды. Процесс возникновения мутации получил название мутагенеза.
Естественный темп появления мутаций часто очень мал, поэтому обычно мутация
происходит в одной клетке и затрагивает один ген. Большая часть мутаций абсолютно
безопасна, потому что совсем не затрагивает фенотип. Относительная небольшая
фракция мутаций вызывает изменения в строении РНК и/или белка, и тогда есть шанс,
что мутация повлияет на функционирование клетки. Мутации, которые ухудшают
деятельность клетки в многоклеточном организме, часто приводят к уничтожению
клетки. Если внутри- и вне- клеточные защитные механизмы не распознали мутацию, то
мутантный ген передаётся всем потомкам клетки и, чаще всего, приводит к тому, что
все эти клетки начинают функционировать иначе. Мутации появляются постоянно в
ходе процессов, происходящих в живой клетке, но существуют факторы, способные
заметно увеличить частоту мутаций. Наиболее распространённые из них – воздействие
на клетку вредных веществ, микроорганизмов или излучения, в том числе естественного
радиационного фона.
Мутация в соматической клетке сложного многоклеточного организма может
привести к злокачественным или доброкачественным новообразованиям. Мутация в
половой клетке – к изменению свойств всего организма-потомка.
В большинстве случаев мутации, которые проявляются на уровне фенотипа, имеют
пагубные последствия, и мутантный организм погибает либо сам собой, либо под
влиянием окружающей среды. Однако в очень редких случаях мутация может случайно
привести к появлению у организма новых полезных признаков, и тогда последствия
мутации оказываются положительными. Таким образом, мутации являются двигателем
естественного отбора.
Также известно, что высшие организмы используют целенаправленные мутации в
механизмах иммунитета. Такие мутации называются соматическими. С их помощью
создаётся разнообразие популяций лимфоцитов, среди которых, в результате, всегда
находятся единицы, способные дать иммунный ответ на новую, неизвестную для
организма болезнь. Подходящие лимфоциты подвергаются положительной селекции, в
результате возникает иммунологическая память.
Если мутация затрагивает «молчащие» участки ДНК, либо приводит к замене одного
элемента генетического кода на синонимичный, то она никак не проявляется внешне, в
фенотипе. Однако, методами генного анализа такие мутации можно обнаружить.
Поскольку чаще всего мутации происходят в результате естественных причин, то в
предположении, что основные свойства внешней среды не менялись, получается, что
частота мутаций должна быть примерно постоянной. Этот факт можно использовать для
исследования происхождения той или иной особи, в том числе, и человека. Таким
образом, мутации в молчащих генах служат для исследователей своеобразными
«генетическими часами».
2
Спонтанные повреждения ДНК встречаются довольно часто, такие события имеют
место в каждой клетке. Для устранения последствий подобных повреждений имеется
специальный репарационный механизм (например, ошибочный участок ДНК
вырезается и на этом месте восстанавливается исходный). Мутации возникают лишь
тогда, когда репарационный механизм по каким-то причинам не работает или не
справляется с устранением повреждений.
Исследование мутаций в митохондриальной ДНК (наследуется по материнской
линии) и в Y-хромосомах (наследуется по отцовской линии) широко используется в
эволюционной биологии для изучения происхождения рас и народностей,
реконструкции биологического развития человечества.
Классификации мутаций
В современной учебной литературе принята классификация, основанная на
характере изменения структуры отдельных генов, хромосом и генома в целом. В рамках
этой классификации различают следующие виды мутаций:
генные или точковые (изменение молекулярной структуры генов, возникающие в
результате замен, вставок или выпадения нуклеотидов); Генные ( точковые ) мутации
затрагивают, как правило, один или несколько нуклеотидов, при этом один нуклеотид
может превратиться в другой, может выпасть (делеция), продублироваться, а группа
нуклеотидов может развернутся на 180 градусов. Например, широко известен ген
человека, ответственный за серповидно-клеточную анемию, который может привести к
летальному исходу. Соответствующий нормальный ген кодирует одну из
полипептидных цепей гемоглобина. У мутантного гена нарушен всего один нуклеотид
(ГАА на ГУА). В результате в цепи гемоглобина одна аминокислота заменена на
другую (вместо глутамина – валин). Казалось бы ничтожное изменение, но оно влечет
за собой роковые последствия: эритроцит деформируется, приобретая серповидноклеточную форму, и уже не способен транспортировать кислород, что и приводит к
гибели организма. Генные мутации приводят к изменению аминокислотной
последовательности белка. Наиболее вероятная мутация генов происходит при
спаривание тесно связанных организмов, которые унаследовали мутантный ген у
общего предка. По этой причине вероятность возникновения мутации повышается у
детей, чьи родители являются родственниками. Генные мутации приводят к таким
заболеваниям, как амавротическая идиотия, альбинизм, дальтонизм и др.
хромосомные (структурные изменения хромосом, возникающие вследствие
перемещения или выпадения значительных по протяженности частей хромосом);
Хромосомные мутации приводят к изменению числа, размеров и организации
хромосом, поэтому их иногда называют хромосомными перестройками. Хромосомные
перестройки делятся на внутри- и межхромосомные. К внутрихромосмным относятся:
Дубликация – один из участков хромосомы представлен более одного раза.
Делеция – утрачивается внутренний участок хромосомы.
Инверсия – повороты участка хромосомы на 180 градусов.
Межхромосомные перестройки (их еще называют транслокации) делятся на:
Реципрокные – обмен участками негомологичных хромосом.
Нереципрокные – изменение положения участка хромосомы.
Дицентрические – слияние фрагментов негомологичных хромосом.
Центрические – слияние центромер негомологичных хромосом.
3
Хромосомные мутации проявляются у 1% новорожденных. Однако интересно,
исследования показали, что нестабильность соматических клеток здоровых доноров не
исключение, а норма. В связи с этим была высказана гипотеза о том, что нестабильность
соматических клеток следует рассматривать не только как патологическое состояние, но
и как адаптивную реакцию организма на измененные условия внутренней среды.
Хромосомные мутации могут обладать фенотипическими явлениями. Наиболее
распостраненный пример – синдром "Кошачьего крика" (плачь ребенка напоминает
мяукание кошки). Обычно носители такой делеции погибают в младенчестве.
Хромосомные мутации часто приводят к паталогическим нарушениям в организме, но в
то же время хромосомные перестройки сыграли одну из ведущих ролей в эволюции.
Так, у человека 23 пары хромосом, а у обезьяны – 24. Таким образом различие
составляет всего одна хромосома. Ученые предполагают, что в процессе эволюции
произошла хотя бы одна перестройка. Подтверждением этого может служить и тот
факт, что 17 хромосома человека отличается от такой же хромосомы шимпанзе лишь
одной перецентрической инверсией. Такие рассуждения во многом подтверждают
теорию Дарвина.
геномные (изменение числа хромосом). Главная отличительная черта геномных
мутаций связана с нарушением числа хромосом в кариотипе. Эти мутации так же
подразделяются на два вида: полиплоидные, анеуплоидные.
Полиплоидные мутации ведут к изменению хромосом в кариотипе, которое кратно
гаплоидному набору хромосом. Этот синдром впервые был лишь обнаружен в 60-ых
годах. Вообще полиплоидия характерна в основном для человека, а среди животных
встречается крайне редко. При полиплоидии число хромосом в клетке насчитывается по
69 (триплоидие), а иногда и по 92 (тетраплоидие) хромосомы. Такое изменение ведет
практически к 100 % смерти зародыша. Триплоидие имеет не только многочисленные
пороки, но и приводит к потере жизнеспособности. Тетраплоидие встречается еще реже,
но так же зачастую приводит к летальному исходу.
Анеуплоидные же мутации приводят к изменению числа хромосом в кариотипе,
некратное гаплоидному набору. В результате такой мутации возникают особи с
аномальным числом хромосом. Как и триплоидия, анеуплоидия часто приводит к
смерти еще на ранних этапах развития зародыша. Причиной же таких последствий
является утрата целой группы сцепления генов в кариотипе.
В целом же, механизм возникновения геномных мутаций связан с патологией
нарушения нормального расхождения хромосом в мейозе, в результате чего образуются
аномальные гаметы, что и ведет к мутации. Изменения в организме связаны с
присутствием генетически разнородных клеток. Такой процесс называется мозаицизм.
Индуцированный мутагенез
Чтобы оценить давление мутаций на популяции человека, необходимо выяснить ряд
особенностей о влиянии на ДНК химических и физических мутагенов как в отношении
зародышевых клеток, так и для соматических клеток человека. Ряд закономерностей
выяснен на экспериментальных животных, растениях и микроорганизмах, на культурах
клеток человека и других млекопитающих. Эти закономерности в основе имеют общий
характер для всех организмов. Однако результаты этих экспериментов в качественном и
количественном отношении невозможно прямо экстраполировать на человека.
Для общей радиочувствительности целых организмов большую роль играют их
4
эволюционные особенности. Для человека смертельная доза облучения равна 6 Гр, для
мыши – 9 Гр, для амебы – 100 Гр, для ряда бактерий – до нескольких сот тысяч.
Разные
виды
ионизирующих
излучений
обладают
разной
генетической
эффективностью. Если принять генетическую эффективность гамма-излучений за
единицу, то рентгеновское излучение в той же дозе в среднем эффективнее в 2 раза,
медленные нейтроны – в 5 раз, альфа-частицы и быстрые нейтроны – в 10 раз.
Особой эффективностью обладают радионуклиды при проникновении их в клетку.
Радиация вызывает весь спектр генных и хромосомных мутаций. Среди мутаций,
возникающих в соматических клетках, имеются те, которые вызывают канцерогенез. В
исследованиях in vitro и in vivo показано, что частота мутаций линейно возрастает с
увеличением доз (концентраций) ионизирующей радиации или химических мутагенов,
но только в диапазоне низких концентраций. При повышении доз облучения
мутагенный и (или) канцерогенный эффект также увеличивается и достигает
максимума. Затем, при дальнейшем возрастании уровня воздействия, частота мутаций
или опухолей снижается, что объясняется гибелью клеток.
Линейная зависимость частоты мутаций от уровня воздействия (при низких дозах)
показана и для ряда химических мутагенов. Более детальные исследования
генетического риска выявили нелинейную зависимость частоты мутаций при действии
ряда физических и химических мутагенов. На культуре лимфоцитов крови установлено,
что при низкоинтенсивном облучении эта зависимость имеет бимодальный характер:
нарастание мутаций при низких дозах до определенного максимума (низкодозовый
максимум), затем снижение и вновь повышение частоты мутаций при дальнейшем
увеличении дозы. Величины и положения низкодозового максимума зависят от
природы, мощности (концентрации) воздействия и времени после воздействия
облучения.
Ряд биохимических и гематологических показателей у людей, облученных при
авариях на атомных станциях, также обнаруживают бимодальную зависимость от дозы
облучения. Среди лиц, работающих на объектах атомной промышленности США,
Канады, Великобритании, а также при обследованиях населения Японии и России
(район реки Теча), подвергавшихся облучению, было зафиксировано резкое увеличение
частоты лейкозов при низких дозах облучения.
Ионизирующая радиация может выступать в роли как промотора (активатора), так и
инициатора злокачественных новообразований. Увеличение мощности и времени
облучения (в определенных пределах) снижает промотирущую и увеличивает
инициирующую функции воздействия. При низкоинтенсивном облучении процессы
репарации генетических повреждений либо вовсе не включаются, либо включаются не в
полном объеме. Нелинейная зависимость частоты мутаций от дозы установлена и при
действии токсических соединений и фармацевтических препаратов в низких
концентрациях. Такая зависимость характерна для людей, проживающих в
экологически неблагоприятных районах.
Одной из актуальных задач при исследованиях мутагенеза вследствие загрязнения
биосферы радиационными и химическими мутагенами является анализ особенностей
процессов мутирования, индуцированных воздействием мутагенов в малых дозах. В
последние годы получено много данных, показывающих, что воздействия физических и
5
химических агентов при очень низких концентрациях вызывают выраженные
мутагенный и канцерогенный эффекты.
ОЦЕНКИ РАДИАЦИОННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РИСКОВ
Существует два пути оценки рисков радиационных наследственных нарушений в
потомстве. Первый – сравнение числа радиационно-индуцированных мутаций с
наблюдающимся спонтанным фоном и выражением результатов в виде так называемой
удваивающей дозы, т. е. уровня излучения, при котором в данной генерации
(поколении) возникает число радиационных мутаций, равное числу спонтанных
мутаций. Удваивающая доза определяется отношением средней частоты спонтанных и
радиационно-индуцированных мутаций в одних и тех же генах.
Концепцию удваивающей дозы применяют в экспериментах на животных для
оценки риска возможных наследственных эффектов, исходя из предположения: «если в
природе происходят эти эффекты, то радиация индуцирует их же». Это и составляет
понятие относительного мутационного риска.
При втором, альтернативном подходе частота спонтанных (естественных) мутаций
игнорируется и просто оценивается число нарушений, вызываемых мутациями в первом
поколении. Это дает оценку прямого, или абсолютного мутационного риска.
История оценок радиационного генетического риска насчитывает значительно
большее число лет, чем канцерогенного, и содержит как драматические эпизоды, так и
удивительные, по сей день мало понятные факты.
Решающее влияние на оценку радиационно-генетического риска оказали результаты
исследования, осуществленного Л.Б. и У.Л. Расселами в Окриджской национальной
лаборатории США на 7 млн инбредных мышей обоего пола. В этом исследовании,
известном как проект «Мега-мышь», было изучено 7 специфических мутаций в
отдельных локусах, 6 из которых были связаны с изменением окраски шерсти, а одна
приводила к задержке роста ушей. Эти мутации встречаются и спонтанно, но их частота
возрастает в результате облучения. Облучение проводят в широком диапазоне доз, при
различных мощностях дозы и ее фракционировании.
В результате проведенного уникального по объему и значимости исследования было
сделано пять чрезвычайно важных выводов.
1. Радиочувствительность в отношении индукции различных мутаций у мышей
сильно варьирует с коэффициентом ~ 35, что позволяет оценивать результаты лишь в
терминах средней частоты мутаций.
2. В отличие от дрозофил в опытах на мышах сильно выражен ослабляющий эффект
уменьшения мощности дозы, что свидетельствует о функционировании у этих
животных мощных систем пострадиационной репарации1.
3. Самцы мышей отличаются значительно большей радиочувствительностью, чем
самки. Это особенно проявляется при низкой мощности дозы, когда учащение мутаций
у самок вообще мало вероятно даже при дозах в несколько грей (нескольких сотен рад).
Эти половые различия важно учитывать в практическом плане, имея в виду, что
носителями генетического груза в популяции, подвергшейся облучению при низкой
мощности дозы, являются самцы.
4. Частота генетических последствий у мышей сильно снижается с удлинением
интервала времени между облучением и оплодотворением. Это прежде всего связано со
стадией сперматогенеза, на которой произошло облучение. При спаривании
непосредственно после облучения в оплодотворении участвует сперма, подвергшаяся
облучению на стадии зрелых сперматозоидов, в связи с чем возникает относительно
6
наибольшее число мутаций. В противоположность этому при спаривании через
несколько недель после облучения сперма, используемая для оплодотворения,
подвергалась облучению на ранних стадиях, что вызвало меньшее число индуцируемых
мутаций. Отсюда следует вывод, что снижение частоты мутаций со временем после
облучения является следствием процессов репарации.
Полученная в эмпирических наблюдениях информация об ослаблении радиационных
генетических последствий с удлинением интервала времени между облучением и
оплодотворением чрезвычайно важна в практическом отношении и постоянно
учитывается в генетических исследованиях. У мышей интервал в 2 мес достаточен для
максимального снижения эффекта облучения. Аналогичным периодом у человека
считают 6 мес. Это всегда принимается во внимание при диагностическом и лечебном
облучении человека, когда в поле воздействия вовлекаются гонады.
Между тем, анализ рассмотренных материалов свидетельствует о чрезвычайно
важном факте – существовании больших количественных межвидовых различий в
проявлении радиационно-генетических эффектов. В ряду дрозофила – мышь – человек
выход мутаций на единицу дозы, максимально выраженный у дрозофилы, резко
снижается у мыши (особенно при пролонгированном облучении) и практически
нивелируется у человека.
Наиболее вероятным объяснением этого феномена представляется разная степень
эффективности механизма пострадиационной репарации, который совершенствовался
по мере эволюции и достиг максимума у человека. Важнейшим фактором,
определяющим эффективность репарации, по-видимому, является фактор времени, о
чем свидетельствует как ослабление эффекта при пролонгировании радиационного
воздействия, так и при удлинение интервала между облучением и оплодотворением.
Поэтому удлинении всех жизненных циклов (отдельных стадий сперматогенеза, его
общей длительности и продолжительности жизни эмбриона), что и имеет место в ряду
дрозофила – мышь – человек, должно облегчать репарационные процессы.
Таким образом, решающее значение для облученного индивидуума или его потомков
имеет вид мутаций и то, в каких клетках (зародышевых или соматических) они
возникают. Например, если доминантные мутации (к числу которых относятся и многие
хромосомные аберрации) возникают в зародышевых клетках, то они либо приводят к
уменьшению вероятности зачатия или рождаемости, либо проявляются, как правило, в
первом поколении, не переходя в последующие. Возникая в соматических, активно
пролиферирующих клетках, такие мутации наиболее сильно сказываются при их
делении, чаще всего приводя к гибели самих клеток и/или их потомства, что является
главной причиной гибели организма при ОЛБ вследствие опустошения критических
органов. В покоящихся клетках те же мутации могут быть причиной утраты
генетического контроля за рядом функций, а сохраняясь, могут иметь большое значение
в развитии злокачественных опухолей.
Рецессивные мутации вызываются повреждениями отдельных генов, в большинстве
случаев в виде точковых мутаций. Если они возникают в половых клетках, то эффект
облучения может проявляться в последующих поколениях, подчиняясь общим законам
расщепления признаков, вероятность проявления которых растет с численностью
облученной популяции.
Исследования, проведенные на различных генетических группах бактерий, выявили,
что облучение усиливает проявление тех генетически обусловленных признаков и
свойств клеток, которые и без облучения приводят клетки к гибели с некоторой
7
вероятностью. Существует множество мутаций, незначительно нарушающих различные
стороны обмена. Такие мутации могут происходить во многих клетках, но их действие в
необлученных клетках проявляется слабо и лишь в определенных «провокационных
формах», т. е. при определенных изменениях внешних условий. После облучения
летальный эффект таких генов во много раз увеличивается, особенно при отклонениях
условий культивирования от оптимальных для данных организмов, что и приводит к
повышению чувствительности облученных клеток к колебаниям внешних условий. В
результате даже незначительные изменения, мало влияющие на жизнедеятельность контрольных клеток, у облученных могут вызвать различные нарушения обменных
процессов и даже гибель. Не исключено, что эта закономерность имеет
общебиологический характер.
8