Введение - Иркутский государственный медицинский университет
реклама
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Министерства здравоохранения и социального развития РФ (ГОУ ВПО ИГМУ Минздравсоцразвития России) Илларионова Е.А., Сыроватский И.П. Методические рекомендации по токсикологической химии для студентов фармацевтического факультета ПО ТЕМЕ: «ОСНОВЫ МЕТОДА МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА» Иркутск – 2009 Авторы методических рекомендаций для студентов фармацевтического факультета «Основы метода масс-спектрометрии. Практическое применение метода»: доктор химических наук, профессор кафедры фармацевтической и токсикологической химии Иркутского государственного медицинского университета Илларионова Елена Анатольевна; кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической и токсикологической химии Иркутского государственного медицинского университета Сыроватский Игорь Петрович. Рецензенты: доктор медицинских наук, профессор кафедры общей химии Иркутского государственного медицинского университета Осипенко Борис Гордеевич; кандидат химических наук, доцент кафедры бионеорганической и биоорганической химии Иркутского государственного медицинского университета Станевич Любовь Михайловна. Учебное пособие обсуждено на методическом совете фармацевтического факультета ИГМУ и рекомендовано к печати и использованию в учебном процессе на кафедре фармацевтической и токсикологической химии протокол №5 от 14.10. 2009 г. 2 ПРЕДИСЛОВИЕ Методические рекомендации охватывает раздел токсикологической химии, касающийся использования современных методов анализа. В методических рекомендациях приведена краткая историческая справка появления метода масс-спектрометрии. Изложены основные теоретические положения метода. Разобрана принципиальная схема масс-спектрометра. Представлен материал по использованию масс-спектрометрии. Пособие составлено в соответствии с программой по токсикологической химии (2003г.) для студентов 4 и 5 курсов фармацевтического факультета. Авторы 3 Содержание Предисловие. ............................................................................................................ 5 Введение…………………………………………………………………………...5 Общая схема метода масс-спектрометрии............................................................ 7 Методы ионизации вещества. ................................................................................ 8 Способы разделения ионов. ................................................................................. 12 Виды регистрирующих устройств. ...................................................................... 16 Обработка результатов. ........................................................................................ 17 Характеристики приборов. ................................................................................................. 20 Применение масс-спектрометрии. ................................................................................... 23 Литература. ............................................................................................................ 26 4 Введение Современный масс-спектрометр базируется на основополагающей работе, сделанной сэром Дж. Дж. Томсоном в Кэвендишевской лаборатории Кембриджского университета. Исследования Томсона, приведшие к открытию электрона в 1897 году, также привели к созданию первого масс-спектрометра, построенного им для изучения влияния электрического и магнитного полей на ионы, генерируемые в остаточном газе на катоде рентгеновской трубки. Томсон обратил внимание, что эти ионы движутся по параболическим траекториям, пропорциональным отношениям их массы к заряду. В 1906 году Томсон получил Нобелевскую премию по физике за "Выдающиеся заслуги в теоретическом и экспериментальном изучении электропроводимости газов". Период с 1930-ых по начало 1970-ых годов отмечен выдающимися достижениями в области масс-спектрометрии. К концу Первой мировой войны работы Френсиса Астона и Артура Демпстера привели к значительному улучшению точности и воспроизводимости измерений на масс-спектрометрах. Позднее Альфред Нир воплотил эти достижения вместе со значительным продвижением в вакуумной технике и электронике в конструкцию массспектрометра, значительно сократив его размеры. Нир и Джонсон впервые построили масс-спектрометр с двойной фокусировкой. Еще раньше, в 1946 году, Уильям Стивенс предложил концепцию время-пролетных анализаторов, способных разделять ионы путем измерения скоростей их движения по прямому пути к коллектору. В середине 1950-ых годов Вольфганг Пол разработал квадрупольный масс-анализатор. Этот анализатор способен разделять ионы с помощью осцилирующего электрического поля. Другой инновационной разработкой Пола было создание квадрупольной ионной ловушки, специально предназначенной для захвата и измерения масс ионов. Первая ионная ловушка стала коммерчески доступной в 1983 (патент Finnigan). Сегодня квадруполи и квадрупольные ионные ловушки являются наиболее распространенными массанализаторами в мире и за свои инновационные работы Вольфганг Пол полу5 чил в 1989 году Нобелевскую премию по физике. В 1950-е годы впервые были соединены газовый хроматограф и масс-спектрометр (Голке, Маклаферти и Рихаге). Затем появились новые методы ионизации - бомбардировка быстрыми атомами (Барбер), химическая ионизация (Тальрозе, Филд, Мансон), полевая десорбция/ионизация (Беки), лазерная десорбция/ионизация, ассистируемая матрицей - MALDI (Танака, Карас, Хилленкампф) ионизация в электроспрее ESI (Доул, Фенн), ионизация в индуктивно-связанной плазме (Фассел). Были разработаны новые приборы для новых применений - масс-спектрометры ионно-циклотронного резонанса (Хиппл) и, затем, с Фурье-преобразованием сигнала (Комиссаров, Маршалл), тройные квадрупольные тандемные массспектрометры (Йоуст, Энке). Возросло число параметров, требующихся при создании этих приборов: точное измерение масс, ультравысокое разрешение, наличие всех методов ионизации – электроискровой, матричной лазерной десорбционной (MALDI), электрораспыление (ESI), электронного удара (EI) и химической (CI). Основные определения и понятия. Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических спектральных, например оптических, методов состоит в том, что оптические методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс-спектрометрия — непосредственно сами частицы вещества. Прибор, осуществляющий измерение отношения массы фрагмента молекулы к его заряду, называется масс-спектрометр. Попадая в него, анализируемые молекулы, последовательно ионизируются, получившиеся в результате этого ионы разделяются в зависимости от присущих им отношений массы к заряду и детектируются. Результатом этих процессов является масс-спектр, который несет в себе информацию о молекулярной массе аналита и его структуре. Таким образом, масс-спектр представляет собой совокупность данных об образующихся при определенных условиях ионизации в результате распада конкретного вещества ионах и их интенсивности. 6 Характеристический ион — обычно молекулярный ион или его фрагмент, присутствие которого в масс-спектре способствует идентификации вещества. Интенсивность ионов в масс-спектре, хотя иногда она опускается, выражается в процентах к интенсивности максимального иона в данном спектре и называется относительной интенсивностью. Масс-спектрометры любого вида обычно работают в двух режимах регистрации ионов: сканирования (SCAN) полного или части диапазона величин отношения массы к заряду для исследуемого вещества или мониторинга характеристических ионов (селективный ионный мониторинг, SIM) этого и других веществ в пределах определенного заданного времени (dwell times). Важной характеристикой метода является отношение сигнал/шум, которое представляет собой отношение величины сигнала детектора к интенсивности систематических и других помех, вызванных разными причинами. Обычно соотношение 3:1 считается значимым с точки зрения регистрации сигнала анализируемого вещества. Общая схема метода масс-спектрометрии Масс-спектрометрия – метод исследования и анализа вещества, основанный на ионизации атомов и молекул, входящих в состав пробы, и регистрации спектра масс образовавшихся ионов. Идея метода проста и может быть изложена в виде следующей схемы. 1. Превратить нейтральные частицы – атомы или молекулы в частицы заряженные – ионы. 2. Разделить образовавшиеся ионы в пространстве в соответствии с их массой посредством электрического или магнитного поля. 3. Измеряя электрический ток, образуемый направленно движущимися ионами, можно судить об изотопном, атомарном и молекулярном составе анализируемого вещества, как на качественном, так и на количественном уровне. 7 Оборудование для проведения исследований методом масс- спектрометрии обычно состоит из нескольких основных блоков. На рисунке приведена принципиальная блок-схема масс-спектрометра. ЭВМ Ввод пробы Ионный источник Массанализатор детектор Система обработки данных Система откачки Блок-схема масс-спектрометра Методы ионизации вещества Наиболее старый и наиболее широко применяемый в современной массспектрометрии метод ионизации молекул органических соединений - это, так называемый, электронный удар (ЭУ, по-английски EI - Electron Impact). Для того, чтобы ионизовать органическое вещество его нужно сначала из конденсированной фазы (жидкость, твердое тело) перевести каким-нибудь образом в газовую фазу, например, нагреть (этого, конечно, не нужно делать с газами). Затем, их нужно ввести в так называемый источник ионов, где они подвергаются бомбардировке пучком электронов, который можно получить нагревая, например, металлическую ленточку (катод). Можно поместить вещество в конденсированной фазе в источник ионов и там его испарить. Электроны - легкие по сравнению с молекулами отрицательно заряженные частицы - сталкиваясь с молекулами вырывают из электронных оболочек электроны и превращают молекулы в ионы. При этом молекулы часто разваливаются на заряженные фрагменты по определенному для каждого соединения механизму. Именно в результате этого процесса в конечном итоге получится масс-спектр - помните, набор рас8 сортированых по массам ионов - несущий информацию о структуре молекулы и, часто, настолько характерный для определенного органического соединения, что его называют "отпечатком пальцев", то есть настолько же индивидуальный как рисунок на пальцах человека. Все это должно происходить в вакууме, иначе электроны слишком быстро зарядят молекулы, составляющие компоненты воздуха, а ионы, образовавшиеся из того соединения, которое нас интересует, слишком быстро вновь превратятся в нейтральные молекулы. Другой способ ионизации - это ионизация в ионно-молекулярных реакциях, называемая химической ионизацией (ХИ, CI - Chemical Ionization). При этом способе источник ионов заполняется каким-либо газом при повышенном давлении (типично используется метан или изобутан, очень редко аммиак и другие газы), который ионизуется все тем же электронным ударом, а в результате большой популяции молекул в источнике начинают происходить ионномолекулярные реакции, ведущие к образованию ионов-реагентов, которые, в свою очередь взаимодействуют с молекулами интересующего нас вещества, ведя к их ионизации. При этом происходит протонирование, т.е. образование положительно заряженных ионов. Вводимые в источник ионов соединения также могут реагировать с "медленными" ("термическими") электронами, которые охотно образуются и блуждают в плазме источника работающего в режиме химической ионизации. При этом взаимодействии происходит так называемый диссоциативный резонансный захват электронов, ведущий к тому, что образуется ион с "лишним" электроном, т.е. отрицательно заряженный. Такая ионизация в газовой фазе является "мягкой", то есть образовавшиеся ионы не разваливаются на мелкие фрагменты, а скорее остаются крупными кусками либо чуть меньше, чем исходная молекула, либо даже большее ее за счет присоединения других ионов. Этот метод дает меньше информации о том, как устроена структура молекулы, зато с его помощью легче определить ее молекулярную массу. Это касается, в основном, положительно заряженных ионов. Большим преимуществом химической ионизации с образованием отрицательных ионов является 9 значительное улучшение чувствительности и селективности в отношении избранных соединений (соединений с большим сродством к электрону, например, содержащих атомы галогенов). Предел обнаружения таких соединений может быть снижен до трех порядков. Тандемная масс-спектрометрия (или многостадийная, или многомерная, каждый может выбрать себе название по вкусу, смысл от этого не меняется) весьма полезна для того, чтобы использовать информационно значимые ионы, образовавшиеся при химической ионизации, и подвергнуть дополнительной фрагментации, позволяющей выявить структуры фрагментов молекулы. К сожалению, очень многие органические вещества невозможно испарить без разложения, то есть перевести в газовую фазу. А это значит, что их нельзя ионизовать электронным ударом. Но среди таких веществ почти все, что составляет живую ткань (белки, ДНК и т.д.), физиологически активные вещества, полимеры, то есть все то, что сегодня представляет особый интерес. Массспектрометрия не стояла на месте и последние годы были разработаны специальные методы ионизации таких органических соединений. Сегодня используются, в основном, методы ионизации при атмосферном давлении - ионизация в электроспрее (ESI) или - химическая ионизация при атмосферном давлении APCI (и ее подвид с дополнительной фотоионизацией - APPI), а также ионизация лазерной десорбцией при содействии матрицы (MALDI). В первом случае жидкость (интересующие нас соединения с растворителем) вырывается под давлением вместе с коаксиально подаваемым разогретым газом (азотом) из узкого капилляра (на самом деле, иглы, которая находится под повышенным потенциалом - 5 - 10 кВ) с огромной скоростью и прямо в этой струе мелкодисперсного тумана с оболочек молекул срываются электроны, превращая их в ионы. Большая часть растворителя при движении этой струи переходит в газовую фазу и не попадает в отверстие входного конуса источника ионов API. В режиме химической ионизации при атмосферном давлении потенциал прикладывается не к игле, через которую поступает жидкость, а к электроду в области рас10 пыления, что приводит к образованию коронного разряда. В этом случае фрагментация значительно меньше, чем в предыдущем - электроспрее (ESI). В методе MALDI лазерный луч вырывает ионы с поверхности мишени, на которую нанесен образец со специально подобранной матрицей. До сих пор мы описывали методы, применяемые для ионизации относительно "мягких" соединений, составляющих органическую материю. "Мягких" означает, что для того, чтобы перевести молекулы органики в ионы нужны относительно небольшие энергии. Для ионизации неорганических материалов (металлы, сплавы, горные породы и т.д.) требуется использование других методов. Энергии связи атомов в твердом теле гораздо больше и значительно более жесткие методы необходимо использовать для того, чтобы разорвать эти связи и получить ионы. Многие способы ионизации были опробованы и на сегодняшний день лишь несколько из них применяются в аналитической массспектральной практике. Первый метод, наиболее распространенный, ионизация в так называемой индуктивно-связанной плазме. Индуктивно-связанная плазма (ИСП, ICP) образуется внутри горелки, в которой горит, обычно, аргон. Аргон, вообще говоря, инертный негорючий газ, поэтому, чтобы заставить его гореть, в него закачивают энергию, помещая горелку в индукционную катушку. Когда в плазму аргоновой горелки попадают атомы и молекулы, они моментально превращаются в ионы. Для того, чтобы ввести атомы и молекулы интересующего материала в плазму их обычно растворяют в воде и распыляют в плазму в виде мельчайшей взвеси. Другой метод состоит в том, чтобы превратить вещество в газ. Например, это делают с помощью мощного лазерного луча, который "взрывает" кратер в подставленном под него кусочке материала, переводя небольшую его часть в газообразное состояние (лазерная абляция). Другой способ - это так называемая термоионизация или поверхностная ионизация. Анализируемое вещество наносится на проволочку из тугоплавкого 11 металла, по которой пропускается ток, разогревающий ее до высокой температуры. За счет высокой температуры нанесенное вещество испаряется и ионизируется. Этот метод обычно используется в изотопной масс-спектрометрии. Два других метода могут применяться для ионизации проводящих ток материалов. Это искровая ионизация и ионизация в тлеющем разряде. Не останавливаясь на подробностях этих методов, скажем только, что в первом за счет разницы потенциалов между кусочком исследуемого материала и другим электродом пробивается искра, вырывающая с поверхности мишени ионы, а во втором происходит тоже самое, но за счет так называемого тлеющего разряда, поджигаемого между кусочком проводящего материала и электродом в атмосфере инертного газа, находящегося под очень низким давлением (того же аргона в большинстве случаев). Надо отметить, что начиная от ионного источника и до детектора масс-спектрометр представляет собой вакуумный прибор. Довольно глубокий вакуум обеспечивает беспрепятственное движение ионов внутри массспектрометра, а при его отсутствии ионы просто рассеятся и рекомбинируют (превратятся обратно в незаряженные частицы). Способы разделения ионов Как способов ионизации, так и способов пространственного разделения ионов существует достаточно много. На рис. 1 приведена схема, иллюстрирующая принцип работы так называемого магнитного масс-спектрометра, в котором ионы разделяются под действием магнитного поля, с ионизацией посредством электронного удара. Массспектрометр требует создания в нем очень чистого вакуума. Давление остаточного газа в приборе обычно составляет около 10-7 – 10-10 мм рт.ст. Нейтральные молекулы исследуемого газа поступают в область камеры ионизации, где подвергаются столкновению с ионизирующими электронами. При этом часть молекул (около 0,1%) превращается в ионы по схемам, приведенным выше. Электрическое поле, образованное ускоряющей разностью потенциалов U уск, сообщает ионам кинетическую энергию. 12 В результате ион с массой m и зарядом z будет двигаться в магнитном поле по дуге окружности радиуса R, определяемого из соотношения или Таким образом, изменяя либо Uуск , либо B, можно заставлять двигаться по окружности радиуса Rд , на линии которой находится щель входа в детектор, ионы той или другой массы или величины заряда. Записывая зависимость ионного тока от m/z, получают набор пиков, называемый масс-спектром. Некоторые другие способы разделения ионов по массе. Комбинированное высокочастотное (несколько мегагерц) переменное и постоянное электрическое напряжение вида U = V + U0 cos ωt, подаваемое на систему четырех электродов (рис. 2), вынуждает ионы совершать колебательное движение в такт с частотой ω этого поля. При определенных величинах U0 , V и ω во выходную щель масс-анализатора будут проходить только ионы с определенной массой m, отвечающей условию: m = aU0 / ω2, 13 где а – некоторая постоянная прибора. Все ионы с отличными массами будут двигаться с нарастающими амплитудами колебаний, что приводит к их нейтрализации на стенках электродов. Путем изменения амплитуды высокочастотного напряжения U0 или его частоты ω масс-анализатор настраивают на регистрацию ионов той или иной требуемой массы. Так работают квадрупольные масс-анализаторы. Они гораздо компактнее магнитных и обладают довольно высокой чувствительностью. Еще один способ разделить ионы по массам – создать кратковременный импульс постоянного электрического поля (рис. 3). 14 Приобретая скорость ионы долетают до коллектора за время где L – длина анализатора. Таким образом, из-за различия в массах ионы приобретают различные скорости, обратно пропорциональные . Образуется ионный "пакет", в голове которого летят легкие ионы, тогда как тяжелые его замыкают, и, следовательно, ионы достигают коллектора в разные моменты времени. В этом состоит принцип разделения ионов по массам во времяпролетном масс-спектрометре, главными преимуществами которого являются практически неограниченный диапазон масс и очень быстрое время регистрации масс-спектра порядка 10- 3 с. В масс-спектрометрах ион-циклотронного резонанса ион движется под действием сразу двух полей: сильного постоянного магнитного и переменного электрического (рис. 4). Под действием магнитного поля ион движется по окружности с циклической частотой определяемой массой иона и магнитной индукцией. Электрическое поле изменяется с циклической частотой wЕ по закону E = E0 сos ωEt При равенстве частот ωЕ и ωВ (напомним, что последняя зависит от массы иона) наступает резонанс, проявляющийся в заметном поглощении энергии электрического поля. Такой масс-спектрометр черезвычайно компактен (ячейка некоторых разновидностей не превышает размера кусочка сахара), имеет очень высокие чувствительность, разрешающую способность и диапазон масс. Интересно отметить, что ионы в ячейке могут удерживаться на своих круговых орбитах по нескольку десятков часов. Отрицательные ионы, которые также могут образовываться в процессе ионизации, вращаются в ячейке в противоположном направлении и также будут регистрироваться в масс-спектре при частоте электрического поля, соответствующей их массе. 15 Виды регистрирующих устройств Третья обязательная деталь масс-спектрометра – регистрирующее устройство, с помощью которого можно определить количество ионов с данным m/z. Первые масс-спектрографы использовали в качестве детектора фотопластинку. Сейчас используются динодные вторично-электронные умножители, в которых ион, попадая на первый динод, выбивает из него пучок электронов, которые в свою очередь, попадая на следующий динод, выбивают из него еще большее количество электронов и т.д. Другой вариант - фотоумножители, регистрирующие свечение, возникающее при бомбардировке ионами люминофора. Кроме того, используются микроканальные умножители, системы типа диодных матриц и коллекторы, собирающие все ионы, попавшие в данную точку пространства (коллекторы Фарадея). В современном приборе регистрирующее устройство непосредственно связано с компьютером, который производит обработку результатов и управляет экспериментом. 16 Обработка результатов Библиотеки масс-спектров являются мощным средством, позволяющим выяснить структуры масс-спектров электронного удара. В большинстве из них поиск возможен в режиме on-line. Из информации об измеренном спектре выбирают только небольшой объем данных о наиболее важных пиках и эти данные сравнивают с библиотечными спектрами. Согласие между измеренным спектром и библиотечным образцом выражается некоторым числом, обычно лежащим в диапазоне 0—1000, где значение 1000 соответствует идеальному совпадению. Десять наилучших библиотечных спектров выводятся на экран для последующей визуальной обработки пользователем. Компьютерный поиск в библиотеках спектров оказывается весьма полезным, так как он дает направления поиска в случае анализа совершенно неизвестных образцов или предоставляет надежные данные для подтверждения того, что исследуемое вещество действительно присутствует в образце. Однако следует отметить, что наиболее часто используемые библиотеки содержат от 2000 до 500 000 масс-спектров, а количество известных соединений в настоящее время более 12 000 000. Таким образом, результаты поиска в компьютерных базах данных нельзя воспринимать как истину в последней инстанции. При использовании компьютерного поиска следует твердо придерживаться правила: компьютер быстро сравнивает измеренный масс-спектр с библиотечным, но окончательное решение об идентификации исследуемого соединения принимает пользователь после изучения имеющихся данных и результатов компьютерной обработки. В то время как поиск в компьютерных базах данных при массспектрометрии с ионизацией электронным ударом является достаточно мощным средством благодаря как временной («день ото дня»), так и межлабораторной («от прибора к прибору») воспроизводимости спектров электронного удара, ситуация при мягкой ионизации и десорбционной химической ионизации совершенно противоположная. В этих случаях результаты масс-спектрометрии настолько сильно зависят от экспериментальных условий, что накопление уни17 версальных библиотек становится невозможным. Однако иногда использование библиотек внутри фирмы или лаборатории может быть оправданным. Критерии идентификации. При масс-спектрометрии в комбинации с разделительными методами в каждой лаборатории должны быть утверждены в установленном порядке критерии идентификации, на основании которых аналитики интерпретируют полученные результаты и выдают свои заключения. Разумеется, для разделительного метода и масс-спектрометрии такие критерии должны быть свои, учитывающие особенности использованных методов. Ниже приведены типовые критерии для оценки наркотиков, стимуляторов, лекарственных веществ и их метаболитов в моче живых лиц. Критерии для масс-спектрального анализа. При работе в режиме сканирования масс-спектров условия подбираются таким образом, чтобы снятие спектров начиналось с величины m/z, превышающей все аналогичные показатели искомых аналитов или их продуктов дериватизации, если для другого нет специальных указаний. После получения спектров в выбранном диапазоне проводят сравнение спектра анализируемого вещества со спектром аналитического вещества сравнения, добавленного в мочу. При этом все пики с относительной интенсивностью более 10% от интенсивности максимального пика аналитического образца сравнения должны присутствовать в исследуемом спектре. Относительная интенсивность трех характеристических ионов может быть получена путем анализа одиночного или усредненного спектра или по площадям пиков масс-фрагментограмм этих ионов. Поиск по базам данных масс-спектров должен проводиться квалифицированным специалистом. В лаборатории должны быть установлены критерии идентификации с применением баз данных, например максимальный индекс сходимости результатов. Если не удается достичь совпадения относительных интенсивностей трех характеристических ионов в пределах 5%, используют дериватизацию или другой метод ионизации. К результатам этих исследований применяются те же критерии. 18 При работе в режиме сканирования характеристических ионов используют критерий относительной интенсивности трех характеристических ионов, как описано выше. При этом наименьший из выбранных пиков должен удовлетво- Относительная интенсивность % рять критерию сигнал—шум 3:1. 49 100 84 86 51 5 0 47 41 40 5 0 60 7 0 80 9 0 0 100 m/z Масс-спектр дихлорэтана Таблица: Масс-спектрометрические характеристики производных бензодиазепина, продуктов их гидролиза и дериватов диазепам 284, 283, 256, 221, 77 феназепам 350, 348, 321, 313, 177 Феназепам TMS 422, 420, 405, 385, 73 2-амино-2/-бромо-5-хлорбензофенон 311, 309, 276, 274, 195 Нитразепам TMS 353, 352, 338, 306, 73 нордазепам 270, 269, 242, 241, 77 Нордазепам TMS 342, 341, 327, 269, 73 2-амино-5-хлоробензофенон 231, 230, 154, 105, 77 Оксазепам 2TMS 430, 429, 340, 313, 73 Оксазепам TMS 356, 341, 312, 239, 135 Жирным шрифтом выделены характеристические ионы TMS – триметилсилированные производные 19 Характеристики масс-спектрометров и масс-спектрометрических детекторов Важнейшими техническими характеристиками масс-спектрометров являются чувствительность, динамический диапазон, разрешение, скорость. Скорость сканирования. Масс-анализатор, как мы показывали выше, пропускает ионы с определенным соотношением массы и заряда в определенное время (кроме многоколлекторных приборов и ионно-циклотронного резонанса, орбитальной ловушки ионов). Для того, чтобы проанализировать все ионы по отношению их массы к заряду он должен сканировать, то есть параметры его поля должны за заданный промежуток времени пройти все значения, нужные для пропускания к детектору всех интересующих ионов. Эта скорость разворачивания поля называется скоростью сканирования и должна быть как можно больше (соответственно, время сканирования должно быть как можно меньше), поскольку масс-спектрометр должен успеть измерить сигнал за короткое время, например за время выхода хроматографического пика, которое может составлять несколько секунд. При этом, чем больше масс-спектров за время выхода хроматографического пика будет измерено, тем точнее будет описан хроматографический пик, тем менее вероятно будет проскочить мимо его максимального значения, а с помощью математической обработки определить является ли он индивидуальным и "доразделить" его с помощью масс-спектрометрии. Самым медленным масс-анализатором является магнит, минимальное время его сканирования без особой потери чувствительности составляет доли секунды. Квадрупольный масс-анализатор может разворачивать спектр за десятые доли секунды, а ионная ловушка еще быстрее, линейная ионная ловушка - еще быстрее и чуть медленнее масс-спектрометр ионно-циклотронного резонанса. Любое сканирование всех перечисленных выше масс-анализаторов является компромиссным - чем больше скорость сканирования, тем меньше времени тратиться на запись сигнала на каждое массовое число, тем хуже чувствительность. 20 Разрешение. Наглядно разрешение (разрешающую способность) можно определить как возможность анализатора разделять ионы с соседними массами. Очень важно иметь возможность точно определять массу ионов, это позволяет вычислить атомную композицию иона или идентифицировать пептид путем сравнения с базой данных, сократив число кандидатов с тысяч и сотен до единиц или одного единственного. Для магнитных масс-анализаторов, для которых расстояние между пиками масс-спектра не зависит от масс ионов, разрешение представляет собой величину равную M/DM. Эта величина, как правило, определяется по 10 % высоте пика. Так например, разрешение 1000 означает, что пики с массами 100.0 а.е.м. и 100.1 а.е.м. отделяются друг от друга, то есть не накладываются вплоть до 10 % высоты. Для анализаторов, у которых расстояние между пиками меняется в рабочем диапазоне масс (чем больше масса, тем меньше расстояние), таких как квадрупольные анализаторы, ионные ловушки, времяпролетные анализаторы, строго говоря, разрешение имеет другой смысл. Разрешение, определяемое как M/DM в данном случае характеризует конкретную массу. Имеет смысл характеризовать эти масс-анализаторы по ширине пиков, величине, остающейся постоянной во всем диапазоне масс. Эта ширина пиков, обычно, измеряется на 50 % их высоты. Для таких приборов ширина пика на полувысоте равная 1 является неплохим показателем и означает, что такой масс-анализатор способен различить номинальные массы, отличающиеся на атомную единицу массы практически во всем его рабочем диапазоне. Масс-спектрометры с двойной фокусировкой (магнитной и электростатической), ионно-циклотронного резонанса - приборы среднего или высокого разрешения. Типичным для магнитного прибора разрешением является >60,000, а работа на уровне разрешения 10,000 - 20,000 является рутинной. На масс-спектрометре ионно-циклотронного резонанса на массе около 500 а.е.м. можно легко достигнуть разрешения 500,000, что позволяет проводить измерения массы ионов с точностью до 4-5 знака после запятой. Разрешения в несколько тысяч также можно добиваться при использовании времяпролетных масс-анализаторов, однако, на высоких массах, в области которых, 21 собственно этот прибор имеет преимущество перед другими, и этого разрешения хватает лишь для того, чтобы измерить массу иона с точностью +/- десятки а.е.м. Как видно из вышесказанного, разрешение тесно связано с другой важной характеристикой - точностью измерения массы. Проиллюстрировать значение этой характеристики можно на простом примере. Массы молекулярных ионов азота (N2+)и монооксида углерода (СО+) составляют 28.00615 а.е.м. и 27.99491 а.е.м., соответственно (оба характеризуются одним массовым числом 28). Эти ионы будут регистрироваться масс-спектрометром порознь при разрешении 2500, а точное значение массы даст ответ - какой из газов регистрируется. Измерение точной массы доступно на приборах с двойной фокусировкой, на тандемном квадрупольном масс-спектрометре и на масс-спектрометрах ионноциклотронного резонанса. Динамический диапазон. Если мы анализируем смесь, содержащую 99.99 % одного соединения или какого-либо элемента и 0.01% какой-либо примеси, мы должны быть уверены, что правильно определяем и то и другое. Для того, чтобы быть уверенным в определении компонентов в этом примере, нужно иметь диапазон линейности в 4 порядка. Современные масс-спектрометры для органического анализа характеризуются динамическим диапазоном в 5-6 порядков, а масс-спектрометры для элементного анализа 9-12 порядков. Динамический диапазон в 10 порядков означает, что примесь в пробе будет видна даже тогда, когда она составляет 10 миллиграмм на 10 тонн. Чувствительность. Это одна из важнейших характеристик масс- спектрометров. Чувствительность это величина, показывающая какое количество вещества нужно ввести в масс-спектрометр для того, чтобы его можно было детектировать. Для простоты будем рассматривать связанный с чувствительностью параметр - минимальное определяемое количество вещества, или порог обнаружения. Типичная величина порога обнаружения хорошего хрома- 22 то-масс-спектрометра, используемого для анализа органических соединений, составляет 1 пикограмм при вводе 1 микролитра жидкости. Важнейшая характеристика при анализе органических соединений - это чувствительность. Для того, чтобы достигнуть как можно большей чувствительности при улучшении отношения сигнала к шуму прибегают к детектированию по отдельным выбранным ионам. Выигрыш в чувствительности и селективности при этом колоссальный, но при использовании приборов низкого разрешения приходится приносить в жертву другой важный параметр - достоверность. Ведь если Вы записывали только один пик из всего характеристического масс-спектра, Вам понадобится еще много поработать, чтобы доказать, что этот пик соответствует именно тому компоненту, который Вас интересует. Как же разрешить эту проблему? Использовать высокое разрешение на приборах с двойной фокусировкой, где можно добиться высокого уровня достоверности не жертвуя чувствительностью. Или использовать тандемную масс- спектрометрию, когда каждый пик, соответствующий одиночному иону можно подтвердить масс-спектром дочерних ионов. Применение масс-спектрометрии Масс-спектрометрия в настоящее время является одним из наиболее информативных, чувствительных и надежных аналитических методов. Любая крупная физическая, химическая, биологическая, токсикологическая экологическая лаборатория имеет в своем распоряжении масс-спектрометр, ориентированный на те или иные специфические исследования. Совершенствование техники позволило создать приборы, способные исследовать молекулы с огромными массами порядка 100 000 а.е.м. и выше, что, несомненно, открывает просторы для изучения таких сложных биологических молекул, как белки, а также длинноцепочечные органические полимеры. Масс-спектрометрия способна обнаруживать примеси на уровне 0,0001% и ниже, что актуально при анализе биологического материала на содержания токсикантов. 23 Без масс-спектрометрии немыслим контроль над незаконным распространением наркотических и психотропных средств, криминалистический и клинический анализ токсичных препаратов, анализ взрывчатых веществ. Выяснение источника происхождения очень важно для решения целого ряда вопросов: например, определение происхождения взрывчатых веществ помогает найти террористов, наркотиков - бороться с их распространением и перекрывать пути их трафика. В эпоху "химизации сельского хозяйства" весьма важным стал вопрос о присутствии следовых количеств применяемых химических средств (например, пестицидов) в пищевых продуктах. По-видимому, самым ярким и эффективным применением массспектрометрии в химическом анализе смесей явилась разработка метода, объединяющего два мощнейших аналитических инструмента: хроматографию и масс-спектрометрию, что привело к созданию хромато-масс- спектрометрического метода. В этом методе образец (исследуемая газовая смесь) смешивается с газом-носителем (обычно гелий) на входе в хроматограф. Смесь проходит через длинную капиллярную хроматографическую колонку. Скорость диффузии компонентов смеси сильно зависит от химической природы каждого из них, вследствие чего происходит разделение смеси. Образуемые на выходе хроматографа порции разделенных компонентов смеси поступают последовательно один за другим в масс-спектрометр. Таким образом, получается набор масс-спектров, каждый из которых соответствует индивидуальному компоненту смеси. Использование вместо газового хроматографа жидкостного позволило изучать не только газовые, но и жидкие смеси. ВЭЖХ/МС системы являются основным аналитическим инструментом при разработке новых лекарственных средств. Без этого метода не может обходиться и контроль качества производимых лекарств и выявления такого распространенного явления как их фальсификация. 24 25 Литература 1. Физическая энциклопедия / Под ред. А.М. Прохорова. М.: Большая рос. энциклопедия, 1992. Т. 3. 672 с. 2. Полякова А.А., Хмельницкий Р.А. Масс-спектрометрия в органической химии. Л.: Химия, 1972. 368 с. 3. Бейнон Дж. Органическая масс-спектрометрия. М.: Наука, 1968. 4. Семенов Г. А., Николаев Е. Н., Францаева К. Е. «Применение массспектрометрии в неорганической химии», 1976 г. 5. Вульфсон Н. С., Заикин В. Г., Микая А. И. «Масс-спектрометрия органических соединений», 1986 г. 6. Карасек Ф., Клемент Р. Введение в хромато-масс-спектрометрию: Пер. с англ. -М.: Мир, 1993. - 237 с. 7. Лейстнер Л., Буйташ П. Химия в криминалистике: Пер. с венг.-М.: Мир, 1990-302 с. 8. Баффингтон Р., Уилсон М. Детекторы для газовой хроматографии: Пер. с нем. - М.: Мир, 1993. - 80 с. 9.Токсикологическая химия/ под ред. проф. Плетеневой Т.В. -М.: ГЭОТАРМедиа, 2006.-512 с. 10. Токсикологическая химия/ под ред. проф. Калетиной. Н.И. -М.: ГЭОТАРМедиа, 2008.-1015 с. 11. Симонов Е.А., Изотов Б.Н., Фесенко А.В. Наркотика: методы анализа на коже, в ее придатках и выделениях. - М: Ангахарсис, 2000. - 130 с. 12. Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств.М: Мысль, 1993.- 272 с. 26