полный текст доклада

В.Б. Васильев
Новые данные о цитоплазматической
наследственности
Доклад на заседании Ученого Совета
ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН
24 мая 2012 г.
Наследование митохондриальной ДНК человека по отцовской линии в
поколениях трансмитохондриальных мышей
ВВЕДЕНИЕ
Под цитоплазматической наследственностью (или наследованием)
принято понимать передачу признаков, информация о которых содержится в
митохондриальной
ДНК
(мтДНК).
Локализованные
в
цитоплазме,
митохондрии содержат собственный геном, включающий 37 генов. Из них 22
– гены тРНК, 2 – гены рибосомальной РНК, и 13 генов кодируют белковые
субъединицы, являющиеся составными частями сложных комплексов
дыхательной цепи, синтезирующей АТФ. Общепризнано, что за редким
исключением мтДНК наследуется по материнскому типу [Birky, 1995;
Cummins, 2000; Poulton and Marchington, 2002]. При слиянии двух половых
клеток
очень
немногочисленные
митохондрии
сперматозоида
уничтожаются, и в оплодотворённой яйцеклетке остается несколько сотен
её собственных органелл.
Примеры отцовского наследования мтДНК находят, например, у
растений [Cummins, 2000], а двуродительского наследования мтДНК у
моллюсков [Cummins, 2000; Passamonti and Ghiselli, 2009]. В последнее
время описан ряд экспериментов, демонстрирующих возможность передачи
отцовской мтДНК у млекопитающих - крупного рогатого скота [Steinborn,
1998], овец [Zhao et al., 2004], низших приматов [John and Schatten, 2004].
Описана мутация мтДНК, унаследованная от отца, у пациента с
миопатией. Мутантная мтДНК была найдена только в мышцах, тогда как в
клетках крови присутствовала нормальная мтДНК, унаследованная от
матери [Schwartz, Wissing, 2003]. Этот случай не нашел подтверждения при
гаплотипическом анализе мтДНК других пациентов с мутациями мтДНК,
ограниченными мышечной тканью [Filosto et al., 2003], поэтому его считают
исключением. Это мнение подтверждается тем, что при искусственной
внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидов (ICSI) отцовская
мтДНК не сохраняется и не передается потомству [Houshmand et al., 1997;
Marchington et al., 2002].
У мышей наследственную передачу мтДНК от самцов исследовали
при скрещивании животных двух видов – Mus musculus и Mus spretus
[Gyllensten et al., 1991; Shitara et al., 1998]. Доля молекул мтДНК,
унаследованных от отца, составляла примерно 0,1%. Кроме того, отцовская
мтДНК, присутствуя не во всех исследованных органах, что и можно было
ожидать в случае типичной гетероплазмии, сохранялась только до первого
поколения [Shitara et al., 1998].
Проблема наследования мутантной мтДНК и ее распределения в
тканях и в органах в ходе эмбрионального развития очень важна для
понимания
механизмов
заболеваний,
развивающихся
вследствие
нарушений энергетического метаболизма [Wallace, 1999]. Ранее мы
показали
возможность
получения
лабораторных
животных
(мышей),
развивающихся из зигот, в которые были инъецированы митохондрии
человека [Sokolova et al., 2004; Bass et al., 2006, Bass et al., 2010]. Было
показано, что мтДНК человека передается трансмитохондриальными (ТМ)
мышами по материнской линии вплоть до третьего и даже до четвертого
поколения.
Взяв одну из линий трансмитохондриальных мышей, полученных
ранее [Bass
et al.,
гетерологичной
2010],
мы исследовали
митохондриальной
ДНК
возможность передачи
(человека)
самцами
трансмитохондриальных мышей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В предшествующих исследованиях было проведено сравнение
частоты обнаружения мтДНК человека в различных органах мышей трех
независимых линий, полученных от потомков самки, микроинъецированной
митохондриями человека [Bass et al., 2010]. От трех самок F0 1, 2 и 3 были
основаны три независимые линии: 61, 62 и 63. Схема этих линий
представлена на фиг. 1. Получены данные о несколько различающейся
частоте встречаемости мтДНК человека, по меньшей мере, в одном органе
(возможно, в двух-трех) у мышей различных линий, что объясняется либо
“эффектом основателя”, либо некоторыми особенностями сегрегации
чужеродной мтДНК в последовательных поколениях трансгенных животных
[Bass et al., 2010].
Линия 63 заинтересовала нас тем, что для нее было характерно
достаточно частое обнаружение мтДНК человека в семенниках самцов.
Доля самцов, положительных по мтДНК человека, возросла ко второму
поколению (см. Таблицу 1), причем именно в F2 у большинства из них (3 из
5) она была локализована в семенниках.
Таблица 1. Число трансмитохондриальных самцов в двух поколениях
трех независимых линий
Число самцов
Всего ТМ+ Семенники
6-1 F1
2
2
0
F2
5
2
1
Всего 7
4
1
6-2 F1
6
4
1
F2
5
2
1
6
2
Всего 11
6-3 F1
5
1
0
F2
8
5
3
6
3
Всего 13
Для исследования возможной передачи гетерологичной мтДНК
(человека)
самцами
трансмитохондриальных
мышей
было
выбрано
потомство самки 80 (Рис. 1) линии 63, у которой мтДНК человека была
обнаружена в одном из яичников, т.е. существовала большая вероятность,
что в её потомстве будут часто встречаться трансмитохондриальные мыши.
Самцов-потомков самки 63-80, а затем самцов последующих поколений
скрещивали с самками дикого типа. Так была получена линия, в которой
основателями каждого последующего поколения были самцы (Рис. 2).
Потомство от каждого самца анализировали на присутствие мтДНК
человека в органах. В отличие от описанных ранее экспериментов по
материнскому наследованию мтДНК, в случае парных органов (яичники,
семенники, легкие, почки) анализировали оба органа, и мтДНК человека
почти всегда обнаруживалась только в одном из них (Рис. 2).
Рис. 1. Схема линии трансмитохондриальных мышей.
Носитель мтДНК человека
самец
без мтДНК человека
самка
Рис. 2
кишечник,
семенник (1)
печень, легкое,
семенник (1)
семенник (1), семенник (1)
легкое
почка,
семенник (1)
почка (2)
яичник (1)
почка (1)
печень,
печень
семенник (1)
печень семенник (1) семенник (1), семенник (1)
селезенка
желудок
почка (1)
кишечник,
семенник (1),
сердце
кишечник
селезенка
Как видно из Рис. 2, мы получили потомство от трех самцовоснователей, принадлежащих к F3 линии 63 (дальнейшие поколения,
начиная с потомства самки 80, обозначены как линия 63-80). В потомстве
двух самцов (103 и 105) были обнаружены трансмитохондриальные мыши.
ПЦР-анализ ДНК из органов самцов-основателей показал, что мтДНК
человека
у всех
троих локализована
в
семенниках,
что
косвенно
подтверждает возможность ее передачи потомкам. И в последующих
поколениях в потомстве самца обнаруживались трансмитохондриальные
мыши, если мтДНК присутствовала в семенниках их отца (Рис. 2).
Исключение составляет самец 158, у которого мтДНК человека была
обнаружена в кишечнике, но не в семенниках, хотя от него получено два
трансмитохондриальных потомка. Возможно, в данном случае не хватило
чувствительности ПЦР. На Рис. 3 приведены результаты ПЦР анализа ДНК
самца 234, у которого мтДНК была обнаружена в трех органах.
249 п.о.
200 п.о.
А
249 п.о.
200 п.о.
100 п.о.
Б
Рис. 3. Идентификация с помощью ПЦР мтДНК человека в органах самца
234. Рис. 2А: 1 - кишечник, 2,3 - семенники, 4 - печень, 5,6 - легкие, 7 желудок, 8 - мочевой пузырь, 9 - хвост, 10 - мышцы, 11 - головной мозг, 12 селезенка, 13 - положительный контроль (ДНК HepG2), 14 - отрицательный
контроль (ДНК мыши), 14 - маркер молекулярной массы. Рис. 2Б: 1 кишечник, 2 - сердце, 3 - ухо, 4,5 - глаза, 6,7 - почки, 8 - положительный
контроль (ДНК HepG2), 14 - отрицательный контроль (ДНК мыши), 14 маркер молекулярной массы.
Для установления чувствительности используемого нами метода
ПЦР, мы провели ПЦР анализ серийных разведений контрольной мтДНК,
выделенной из клеток HepG2 (Рис. 4). Выяснилось, что при 35 циклах ПЦР
можно минимально обнаружить 0,1 фг мтДНК человека (что соответствует
5-6 копиям). Хотя для выделения ДНК из органов мышей использовали
максимально возможное количество материала (примерно ½ органа, иногда
орган целиком) и для ПЦР брали примерно в два раза больше ДНК, чем при
анализе материнского наследования, как видно на Рис. 3, интенсивность
сигнала ПЦР достаточно низка. Известно, что доля мтДНК сперматозоидов
в оплодотворенных яйцеклетках крайне мала (10-3 - 10-4) [Shitara et al., 1998].
Это значит, что число клеток с отцовской мтДНК у потомков также должно
быть крайне мало из-за стохастической сегрегации мтДНК во время
клеточного деления [Birky, 1995], что может приводить к нахождению ее не
во всех клетках органа. Возможно, не во все проанализированные нами
образцы, взятые для выделения ДНК, попало обнаружимое количество
мтДНК человека. И тем не менее, в нашем случае этого количества
оказалось
достаточно,
чтобы
дать
начало
развитию
трансмитохондриального потомства.
Рис. 4. Определение чувствительности ПЦР с видоспецифичными
праймерами на мтДНК человека при 35 циклах ПЦР: 1,2 - 100 пг мтДНК
человека в реакционной смеси; 3,4 - 10 пг; 5,6 - 1 пг (56000 копий); 7,8 - 0,1
пг (5600 копий); 9,10 - 0,01 пг (560 копий); 11,12 - 1 фг (56 копий); 13,14 - 0,1
фг (5,6 копий).
Наследственную
подтверждает
тот
передачу
факт,
что
мтДНК
в
человека
одноклеточных
самцами
косвенно
зародышах
самок,
оплодотворенных самцами 234 и 237 (F7), обнаружена мтДНК человека.
Не удалось получить потомство от самцов 129 и 130 (F4), 156 (F5) и
236 (F7) – многократные попытки скрещивания были неудачными. Все эти
самцы были носителями мтДНК человека. Хотя известно, что у человека
подвижность сперматозоидов по меньшей мере частично детерминирована
мтДНК [Moore and Reijo-Pera, 2000], в данном случае неясно, вызван ли
неуспех скрещивания присутствием гетерологичной мтДНК или случайными
факторами.
Группа органов, в которых обнаруживали мтДНК человека у потомков
трансмитохондриальных самцов, в целом соответствует такой же группе,
описанной при изучении материнского наследования мтДНК у животных
этой линии [Bass et al., 2010].
Как было упомянуто, в литературе описаны редко наблюдаемые
случаи передачи отцовской мтДНК по наследству [Steinborn, 1998; John and
Schatten, 2004; Zhao et al., 2004; Gyllensten et al., 1991; Shitara et al., 1997]. В
двух первых упомянутых работах отцовская мтДНК была искусственно
внесена в клетку в результате слияния клеток [Steinborn, 1998] или ядерного
переноса [John and Schatten, 2004] и в отдельных случаях сохранилась в
клетке. В экспериментах на овцах различных пород [Zhao et al., 2004] и
мышах различных видов [Gyllensten et al., 1991; Shitara et al., 1997]
наблюдалось явление, называемое “paternal leakage”, то есть “протеканием”
митохондрий сперматозоида в яйцеклетку. Однако ни в одном случае не
была показана передача отцовской мтДНК последующим поколениям.
В нашем случае самцы, основавшие линию трансмитохондриальных
мышей, были потомками второго поколения животных, которые получили по
материнской линии мтДНК человека, исходно микроинъецированную в
зиготы мыши. Как показано в последнее время рядом исследователей, для
обеспечения распределения митохондриального генома в делящихся
клетках и его размножения мтДНК упакована в макромолекулярные
структуры, называемые нуклеоидами, состоящие из одной или большего
числа копий мтДНК и ассоциированных белков [Malka et al., 2006; Gilkerson,
2009]. В наших исследованиях распределения микроинъецированной мтДНК
человека в делящихся бластомерах была подтверждена кластерная
передача мтДНК; кроме того, не исключено, что целенаправленная
микроинъекция мтДНК в перинуклеарное пространство, возможно, “задает”
направление ее последующего распределения в дочерних клетках [Bass et
al., 2010]. Возможно, в случае нашей линии 63 исходно инъецированная
мтДНК ‘включилась’ в кластер, целенаправленно попадающий в гонады
(мать нашей исходной самки 80, самка 22 F1, содержала мтДНК человека
исключительно в яичнике), в том числе в семенники самцов.
Пока не удалось выясниить, почему в поставленных нами опытах
мтДНК, попадавшая в яйцеклетку со сперматозоидами, не распознавалась
защитными клеточными механизмами элиминации отцовской мтДНК.
Логично предположить, что пройдя путь развития от оплодотворённой
яйцеклетки до взрослого организма чужеродная мтДНК с самого начала
находилась в составе митохондрий, «сконструированных» из молекулярных
и надмолекулярных структур организма-хозяина, то есть мыши. Тогда для
защитных механизмов в яйцеклетке они выглядят, по крайней мере, как
органеллы
с
белками
своего
вида.
И
всё
же
в
опытах
других
исследователей митохондрии, привнесённые спермиями, почти неизбежно
элиминировались [Kaneda et al., 1995]. В экспериментах по скрещиванию
мышей разных видов [Shitara et al., 1997] в первом поколении достаточно
большое количество мышей наследовало мтДНК от отца, поэтому, видимо,
отцовские митохондрии другого вида распознаются клеткой хуже, чем
своего. Нельзя исключить, что в нашем случае в данной конкретной линии
мышей по неизвестной причине были нарушены механизмы распознавания
отцовской мтДНК. Чтобы проверить это предположение, нужен анализ
других
линий
дальнейшем.
трансмитохондрильных
Тем
не
менее,
мышей,
результаты
что
и
настоящего
планируется
в
исследования
доказывают, что наследование мтДНК по отцовской линии многими
поколениями
придется
млекопитающих
учитывать
при
возможно,
изучении
и,
по-видимому,
родословной
называемыми митохондриальными болезнями.
этот
пациентов
факт
с
так
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Bass M.G., Sokolova V.A., Kustova M.E., Grachyova E.V., Kidgotko O.V.,
Sorokin A.V. & Vasilyev V.B. (2006) Assaying the probabilities of obtaining
maternally inherited heteroplasmy as the basis for modeling OXPHOS diseases
in animals. Biochim. Biophis. Acta, 1757, 679-685.
Bass M.G., Sokolova V.A., Kustova M.E., Kidgotko O.V., Zakharova F.M.
and Vasilyev V.B. (2010) Transmitochondrial mice in studying Mtdna distribution
and transmission. In: Horizons in DNA Research, Volume 1 ISBN: 978-1-60876968-1 Editor: Jason R. Chesterton, pp. 151-170
Bell G.I., Karam J.H., Rutter W.J. (1981) Polymorphic DNA region adjacent
to the 5' end of the human insulin gene. Proc Natl Acad Sci USA 78: 5759-5763.
Birky C. (1995) Uniparental inheritance of mitochondrial and chloroplast
genes: Mechanisms and evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11331-11338
Bromham L., Eyre-Walker A., Smith N.H. and Smith J.M. (2003)
Mitochondrial Steve: paternal inheritance of mitochondria in humans. Trends in
Ecology and Evolution 18: 2-4
Cummins J.M. (2000) Fertilization and elimination of the paternal
mitochondrial genome. Human Reproduction 15: 92-101
Filosto M., Mancuso M., Vives-Bauza C., Vilà M.R., Shanske S., Hirano
M., Andreu A.L., DiMauro S. (2003) Lack of paternal inheritance of muscle
mitochondrial DNA in sporadic mitochondrial myopathies. Ann. Neurol. 54: 524526
Gilkerson
R.W.
(2009)
Mitochondrial
DNA
nucleoids
determine
mitochondrial genetics and dysfunction. Int J Biochem Cell Biol 41: 1899-906
Glantz, S.A. (1994). Primer of Biostatistics. New York – St. Louis – San
Francisco – Auckland, USA McGraw-Hill Inc.
Gyllensten U., Wharton D., Josefsson A., Wilson A.C. (1991) Paternal
inheritance of mitochondrial DNA in mice. Nature 352: 255-257
Houshmand, M., Holme E., Yanson C., Wennerholm U.-B. and Hamberger
L. (1997) Is Paternal Mitochondrial DNA Transferred to the Offspring Following
Intracytoplasmatic Sperm Injection? Journal of Assisted Reproduction and
Genetics 14: 223-227
Howell N. (1999) Human mitochondrial diseases: answering questions and
questioning answers. Intern. Rev. Cytol., 186, 49-116.
John J.C. and Schatten G.
(2004) Paternal Mitochondrial DNA
Transmission During Nonhuman Primate Nuclear Transfer. Genetics 167: 897905
Kaneda H., Hayashi J.-I., Takahama S., Taya C., Lindahl K.F. and
Yonekawa H. (1995) Elimination of paternal mitochondrial DNA in interspecific
crosses during early mouse embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 45424546
Malka F., Lombès A., Rojo M. (2006) Organization, dynamics and
transmission of mitochondrial DNA: focus on vertebrate nucleoids. Biochim
Biophys Acta 1763:463-72
Marchington, D.R., Scott Brown M.S.G., Lamb V.K., van Golde R.J.T.,
Kremer J.A.M., Tuerlings J.H.A.M., Mariman E.C.M., Balen A.H. and Poulton J.
(2002) No evidence for paternal DNA transmission to offspring or extraembryonic tissues after ICSI. Molecular Human Reproduction 8: 1046-1049
Moore F.L. and Reijo-Pera R.A. (2000) Male Sperm Motility Dictated by
Mother’s mtDNA. Am. J. Hum. Genet. 67: 543-548
Passamonti M. and Ghiselli F. (2009) Doubly uniparental inheritance: two
mitochondrial genomes, one precious model for organelle DNA inheritance and
evolution. DNA and Cell Biology 28: 79-89
Poulton J. and Marchington D.R. (2002) Segregation of mitochondrial DNA
(mtDNA) in human oocytes and in animal models of mtDNA disease: clinical
implications. Reproduction 123: 751-755
Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: a
Laboratory Manual. New York, USA Cold Spring Harbor Lab Press, v 2, pp. 9.169.19
Schwartz M. and Vissing J. (2003) New patterns of inheritance in
mitochondrial disease. Biochemical and Biophysical Research Communications
310: 247-251
Shitara H., Hayashi J.-I., Takahama S., Kaneda H. and Yonekawa H.
(1998) Maternal Inheritance of Mouse mtDNA in Interspecific Hybrids:
Segregation of the Leaked Paternal mtDNA Followed by the Prevention of
Subsequent Paternal Leakage. Genetics 148: 851-857
Shitara H., Kaneda H., Sato A., Inoye K., Ogura A., Yonekawa H. and
Hayashi J.-I. (2000) Selective and continuous elimination of mitochondria
microinjected into mouse eggs from spermatids, but not from liver cells, occurs
tgroughout embryogenesis. Genetics 156: 1277-1284.
Sokolova V.A., Kustova M.E., Arbuzova N.I., Sorokin A.V., Moskaliova
O.S., Bass M.G. & Vasilyev V.B. (2004) Obtaining mice that carry human
mitochondrial DNA transmitted to the progeny. Mol. Reprod. Dev., 68, 299-307.
Torroni A., Schurr T.G., Yang C.C., Szathmany E.J.E., Williams R.C.,
Schanfield M.S. & Troup G.A. (1992) Native American mitochondrial DNA
analysis indicates that the Amerind of the Nadene populations were founded by
two independent migrations. Genetics, 130, 153-162.
Vasilyev V.B., Sokolova V.A, Sorokin A.V., Bass M.G., Arbuzova N.I.,
Patkin E.L., Golubkov V.I., Dyban A.P. & Gaitskhoki V.S. (1999). Persistence of
human mitochondrial DNA throughout the development to the blastocyst of
mouse zygotes microinjected with human mitochondria. Zygote, 7, 279-283.
Wallace D. C. (1999) Mitochondrial diseases in man and mouse. Science
283: 1482-1488
Williams S.R. (2002) Another surprise from the mitochondrial genome. N
Engl J Med 347: 609-611
Zhao, X., Li N., Guo W., Hu X., Liu Z., Gong G., Wang A., Feng J. And Wu
C. (2004) Further evidence for paternal inheritance of mitochondrial DNA in the
sheep (Ovis aries). Heredity 93: 399-403