Дифференциация и каллусообразование.
реклама
МИНСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН СЕМИПАЛАТИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени ШАКАРИМА Документ СМК 3 уровня УМКД УМКД 042.042-14.4.0120.01/03УМКД Редакция №2 2011 Рабочая учебная от 01.09.2011г. программа дисциплины взамен редакции №1 от «Биотехнология 18.09 2010 сельскохозяйственных растений» для преподавателя УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ «Биотехнология сельскохозяйственных растений» для специальности: 5В080100 «Агрономия» УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ Семей – 2011 УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г СОДЕРЖАНИЕ 1. 2. 3. 4. 5. Глоссарий Лекции Практические и лабораторные занятия Курсовая работа и дипломный проект (работа) Самостоятельная работа студентов Страница 2 из 74 УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 3 из 74 1 ГЛОССАРИЙ In vitro – выращивание растительных объектов «в стекле» (пробирке, колбе, биореакторе) на искусственных питательных средах, в асептических условиях. Тотипотентность – свойство соматических клеток полностью реализовать генетический потенциал целого организма. Омнипотентность ядер – сохранение ядрами соматических клеток растений всех потенций ядра зиготы, то есть сохранение всей генетической информации. Культура тканей in vitro – выращивание в длительной пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов или самих органов растений. Культура органов in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней, стеблевых апексов, незрелых частей цветка, незрелых плодов. Культура корней in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде в пересадочном режиме изолированных корней. Культура меристем in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде изолированного апекса или пазушной почки побега конуса нарастания с одним или двумя листовыми примордиями. Культура суспензионная или культура клеток in vitro – асептическое выращивание отдельных клеток или их небольших групп во взвешенном состоянии в жидкой питательной среде. Культура зиготических зародышей in vitro – асептическое выращивание на искусственной питательной среде незрелых или зрелых изолированных зародышей. Апекс – верхушечная часть стебля или корня. Меристема – образовательная ткань с мелкими, активно делящимися клетками. Апикальное доминирование – явление подавления роста боковых почек побега в присутствии терминальной почки. Адвентивные почки – почки, возникшие из тканей и клеток растения, обычно их не образующих. Фитогормоны – (гормоны растений) – биологически активные соединения, образующиеся в растениях в малых количествах, вызывающие специфический ростовой или формообразовательный эффект. Ауксины – фитогормоны (ИУК, НУК, 2,4-Д), активизирующие рост стеблей и корней, стимулирующие образование корней у проростков. Цитокинины – фитогормоны (кинетин, 6-БАП), активизирующие развитие меристем, стимулирующие образование почек. Гиббереллины – фитогормоны (ГК и др.), активизирующие рост стеблей, вызывающие прорастание семян. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 4 из 74 ГК – гибберелловая кислота ИУК – b-индолилуксусная кислота НУК – a-нафтилуксусная кислота 2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 6-БАП – 6-бензиламинопурин Клональное микроразмножение или микроклональное размножение – полу-чение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному (метод вегетативного размножения растений в культуре in vitro). Эксплант фрагмент ткани или органа, инкубируемый на питательной среде самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса. Пролиферация – новообразование клеток и тканей путем размножения уже существующих. Дедифференциация – переход специализированных клеток к пролиферации и неорганизованному каллусному росту (утрата клетками специализации). Редифференциация – переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими делениями или непосредственно. Дифференциация – комплекс процессов, приводящих к различиям между клетками. Дифференцировка – состояние специализации клеток, отличающее их от других. Морфогенез in vitro – процесс формообразования, то есть заложения, роста и развития клеток (цитогенез), тканей (гистогенез) и органов (органогенез) в культуре клеток и тканей in vitro. Ризогенез – процесс заложения, роста и развития корней. Регенерация – восстановление целостного организма из клетки, ткани, органа. Эмбриоидогенез – процесс образования зародыше подобных структур (эмбриоидов) неполовым путем в культуре тканей и клеток in vitro. Каллус – группа дедифференцированных клеток, возникших in vivo или in vitro путем неорганизованной пролиферации. Культура каллусов in vitro – выращивание в длительной пересадочной культуре каллусов, возникших путем дедифференциации и пролиферации клеток, тканей, органов растений. Культура «привыкших» тканей – выращивание тканей, возникших путем редифференциации или мутации клеток нормальных каллусных тканей, и способных расти на питательных средах без гормонов. Трансплант – часть каллусной ткани, используемая для переноса на свежую питательную среду. Инокулюм – часть клеточной суспензии, используемая для переноса на свежую питательную среду. Субкультивирование – процесс переноса транспланта или инокулюма в культуральный сосуд на свежую питательную среду. Цикл выращивания – период от помещения клеточного инокулюма УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 5 из 74 или каллусного транспланта на питательную среду до последующего субкультивирования. Ростовой цикл – рост популяции клеток в цикле периодического выращивания, характеризующийся сигмоидальной (S-образной) кривой. Фазы ростового цикла: латентная (лаг-фаза), экспоненциальная (лог-фаза, фаза логарифмического роста), замедления роста, стационарная, деградации. Штамм – культура, возникшая после первого субкультивирования, и состоящая из многих клеточных линий, возникших из клеток первичного каллуса. Линия – культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования, имеющая маркерные признаки. Клон – культура, возникшая из одной клетки. Клеточная селекция in vitro – метод выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций с помощью селективных условий. Сомаклональные вариации и варианты– фенотипическое выражение непостоянства ядерного и органелльных цитоплазматических геномов культивируемых клеток. От истинных генных мутаций отличаются большей частотой возникновения и комплексностью изменений (изменения в структуре генов, хромосом, геномов). Эпигенетические вариации – фенотипическое выражение дифференциальной активности генов. От мутаций и сомаклональных вариаций отличаются тем, что не сохраняются в цикле клетка-растениеклетка. Соматическая (парасексуальная) гибридизация – способ создания гибридных клеточных линий и соматических гибридов растений путем генетической рекомбинации хромосом и генов ядра и органелл вне сексуального цикла, например путем слияния изолированных протопластов. Изолированный протопласт – растительная клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного или механического разрушения. Цитопласт – ограниченный мембраной участок цитоплазмы, возникший при фрагментации изолированного протопласта. Субпротопласт – изолированный протопласт, потерявший часть цитоплазмы, сохранивший ядро. Слияние изолированных протопластов – формирование одной клетки из двух и более объединением их поверхностных мембран. Культура изолированных протопластов – выращивание клеток, лишенных стенок, в жидкой или на агаризованной среде, содержащей в качестве дополнительного компонента осмотически активное вещество (стабилизатор) в оптимальной для данного вида концентрации. При регенерации стенок изолированные протопласты превращаются в культуру клеток. Соматический гибрид – растение, полученное путем гибридизации изолированных протопластов. Цибрид – растение, полученное при слиянии изолированного протопласта УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 6 из 74 с цитопластом, протопластом с инактивированным ядром или с энуклеированным протопластом. Кариотип – набор хромосом, характерных для данного вида. Моноплоид – ядро, клетка, организм, характеризующиеся основным числом хромосом в полиплоидной серии (символ Х). Гаплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся набором хромосом, представляющим половину полного набора, свойственного виду (символ n). Диплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся двойным набором гомологичных хромосом, представленным числом, характерным для данного вида (символ 2n). Псевдодиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся диплоидным числом хромосом, отличающиеся от зигот данного вида по кариотипу. Полиплоид – ядро, клетки, организм, характеризующиеся умноженным основным числом хромосом (символ 3Х, 4Х и т.д.). Эуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, кратным Х. Анеуплоид – ядро, клетки, организм с числом хромосом, отклоняющимся от Х и от чисел, кратных Х. Мутация – изменения в генетическом материале клеток путем перестройки ДНК ядер и органелл, изменений в структуре хромосом или уровне плоидности организма. Рецессив – ген или генетически обусловленный признак, проявляющийся в диплоидной клетке или организме при условии, когда оба набора хромосом несут данные гены. Доминант – ген, проявляющийся как признак при условии, когда гомологичные наборы имеют разные гены. 2 ЛЕКЦИИ Лекция № 1 Тема: Введение. Содержание и значение курса Содержание лекционного занятия: 1. Основные понятия и термины дисциплины «Биотехнология сельскохозяйственных растений» 2. Значение биотехнологии как науки 3. Этапы развития биотехнологии Биотехнология известна с давних времен, но как самостоятельная прикладная наука сформировалась в середине 70-х годов нашего столетия, когда человечество осознало необходимость первоочередного решения на принципиально новых основах главнейших проблем современности — продовольственной, энергетической, ресурсной, загрязнения окружающей среды и др. Биотехнологические процессы базируются на использовании биосинтетического потенциала микроорганизмов, растительных и животных клеток, тканей и органов, культивируемых на искусственных питательных УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 7 из 74 средах. В настоящее время во многих странах мира развитию биотехнологии придается первостепенное значение в силу ряда существенных преимуществ перед другими видами: технологий: биотехнологические процессы обладают низкой энергоемкостью, почти безотходны, экологически чистые. Вместе с тем, эти технологии предусматривают использование стандартного оборудования и препаратов, а также проведение исследований круглый год, независимо от климатических условий, занимая при этом незначительные площади. Эти преимущества имеют непосредственное отношение к культуре клеток, тканей и органов растений. 3.Клеточная биотехнология базируется на использовании культуры клеток, тканей и протопластов. Для того чтобы манипулировать клетками, нужно выделить их из растения и создать такие условия, при которых они могли бы жить и размножаться вне растительного организма. Метод культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (invitro) получил название культуры изолированных тканей и приобрел особое значение в связи с возможностью использования его в биотехнологии. Роль культуры изолированных клеток и тканей в биотехнологии следует рассматривать в трех направлениях. Первое связано со способностью изолированных растительных клеток продуцировать ценные для медицины, парфюмерии, косметики и других отраслей промышленности вещества вторичного синтеза: алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др. Как правило, вторичные вещества получают из каллусной ткани, выращенной на твердой (агаризованной) или жидкой (суспензионная культура) питательной среде. На основе клеточных технологий получают такие медицинские препараты, как диосгенин из клеток диоскореи, аймолин из клеток раувольфии змеиной, тонизирующие вещества из клеток женьшеня, используемые в медицине и парфюмерии. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно/превышать продуктивность целых растений. Преимуществом такого способа получения веществ вторичного синтеза является также возможность использовать для этой цели растения, не произрастающие в наших природных условиях, и получать продукцию круглый год. Второе направление — это использование культуры изолированных тканей для размножения и оздоровления посадочного материала от вирусов и других патогенов. Этот метод, названный клональным микроразмножением растений, позволяет получать от одной меристемы сотни тысяч растений в год. Третье направление—использование изолированных клеток в селекции растений, дающее возможность получать быстрорастущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факторам среды: засухе, засолению, низким и высоким температурам, фитопатогенам, тяжелым УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 8 из 74 металлам и др. Вместе с тем, это направление предусматривает создание новых растений путём слияния изолированных протопластов и получения неполовых (соматических) гибридов. Перенос в изолированные протопласты чужеродных генов с помощью методов генной инженерии позволяет получать в дальнейшем растения с новыми наследуемыми свойствами. Культивирование изолированных пыльников и семяпочек на искусственных питательных средах дает возможность получать гаплоиды, культивирвание зародышей — прием, позволяющий получать растения из невсхожих (с плохо развитым эндоспермом) гибридных семян. А оплодотворение в пробирке позволяет преодолеть нескрещиваемость некоторых растений. Успех в применении культуры клеток и тканей в первую очередь зависит от оптимизации физиологических процессов, обеспечивающих нормальное деление клеток, их дифференцировку и регенерацию из них взрослых растений. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. В первую очередь это касается злаковых растений. Поэтому важнейшее значение имеет выяснение механизма морфогенеза invitro, регенерации и лежащих в их основе процессов. Попытки культивировать изолированные от растений ткани делались давно, и в истории развития этого метода можно выделить несколько этапов. I этап (1892—1902 гг.) связан с именами таких немецких исследователей, как Г, Хаберландт, Фехтинг, Рехингер. Они пытались культивировать в растворе сахарозы различные растительные ткани, однако рост их не был получен. Лишь для сегментов стеблей одуванчика и тополя был получен первичный каллус и определен минимальный размер сегмента, способного к каллусогенезу. Не достигнув экспериментальных успехов, эти исследователи высказали ряд идей и гипотез которые нашли свое подтверждение значительно позже. Так, Хаберландт выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой растительной клетки, т. е. способности клеток реализовывать свой потенциал развития и давать начало образованию целого растения при определенных условиях культивирования. II этап (1902—1922 гг.) ознаменовался созданием первых питательных сред для культивирования тканей животных. Эти среды были природного происхождения и содержали, как правило, плазму крови и зародышевую жидкость. Попытки вырастить изолированные растительное ткани на искусственных питательных средах, содержащих растительные экстракты, оказались неудачными, так как в экспериментах использовались мало подходящие для проявления ростовой активности клетки и ткани высших растений. III этап (1922—1932 гг.). В этот период независимо друг от друга американский ученый В. Робинс и немецкий ученый Котте показали возможность культивирования на твердых питательных средах меристемы УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 9 из 74 кончиков корня томатов и кукурузы. Однако через определенное время растительные ткани бурели и погибали. Подлинное развитие метода культуры тканей растений началось с 1932 г. IV этап (1932—1940 гг.) связан с именем французского ученого Р. Готре, который показал возможность долгого культивирования в условиях invitro растительных тканей за счет периодического пересаживания их на свежую питательную среду. Это открытие дало новый толчок в работе по культуре ткани, который ознаменовался нарастающим числом новых объектов, успешно введенных в культуру. V этап (1940—1960 гг.). G открытием в 1955 г. нового класса фитогормоновцитокининов, и в частности кинетина, была получена возможность стимулировать деление клеток кусочка ткани сердцевинной паренхимы табака, лишенной проводящих пучков и камбия. В зависимости от концентрации и соотношения стимуляторов роста можно было усиливать деление клеток экспланта, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез. В этот период было оценено положительное действие натуральных экстрактов типа эндосперма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений для поддержания неорганизованного клеточного роста и. стимуляции процессов морфогенеза в культуре каллусных тканей и клеточных суспензий. VI э т а п (1960—1975 гг.). Наиболее важным событием этого периода была разработка профессором Ноттингемского университета Э.К. Коккингом метода получения ферментативным путем изолированных протопластов из корней и плодов томата и культивирования их в контролируемых условиях. Позже в 1970 г. в той же лаборатории Пауэром с сотр. было осуществлено искусственное слияние протопластов, что открыло новый путь к созданию соматических гибридов. Еще один метод, разработанный в этот период,— это микроразмножение растений в условиях invitro с использованием меристемной культуры.. Первоначально этот метод был разработан французским учёным Ж. Морелем для получения оздоровленного посадочного материала орхидей. VII этап (1975 г.— по настоящее время). Продолжается быстрое развитие техники invitro, изучение биологии культивируемых объектов, разрабатываются методы электрослияния изолированных протопластов, методы мутагенеза и клеточной селекции, методы получения гаплоидных растений, Совершенствуется Метод глубинного культивирования клеток с использованием изолированных протопластов и векторов, созданных на основе Ti- и Ri-плазмид Agrobacteriumtufnefaciensи А. rhizogenes. С помощью методов генной инженерии разработан эффективный метод переноса генов для двудольных растений. Таким образом, за последние десятилетия был сделан большой шаг вперед в развитии технических приемов работы с. изолированными тканями и клетками растений. Однако объектом ис- УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 10 из 74 следования, как правило, служили однодольные и двудольные травянистые растения и в редких случаях — древесные. Вопросы для самоконтроля: 1. Основные понятия и термины дисциплины «Биотехнология сельскохозяйственных растений». 2. Значение биотехнологии как науки. 3. Этапы развития биотехнологии Список использованнои литературы 1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, 1996. 2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе. М..ФБК-ПРЕСС, 1999. 3. Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998. Лекция № 2,3 Тема: Биология культивируемых клеток и тканей. Содержание лекционного занятия: Список использованнои литературы: 1. 2. 3. 4. Питательные среды. Получение каллуса и его культивирование. Культивирование клеток в жидкой среде. Получение суспензионной культуры. 1Питательные среды. Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также витамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток. Для получения каллусной ткани в отдельных случаях к питательной среде добавляют жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана и др. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 11 из 74 Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей, так как в большинстве случаев последние не способны к автотрофному питанию. Чаще всего в качестве углевода используют сахарозу или глюкозу в концентрации 2—3 %. Фитогормоны необходимы для дедифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны обязательно входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление клеток. В случае индукции стеблевого морфогенеза содержание ауксинов в среде может быть снижено или они могут быть полностью исключены из питательной среды. На безгормональной среде растут опухолевые и «привыкшие» ткани. Автономность по отношению к обоим гормонам или к одному из них связана со способностью этих клеток синтезировать гормоны. В качестве источников ауксинов в питательных средах используют 2,4дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индо-лил-3-уксусную кислоту (ИУК), анафтилуксусную кислоту (НУК). Для получения рыхлого хорошо растущего каллуса чаще применяют 2,4-Д, так как ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин. 6-БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином. В состав некоторых сред входит аденин. В настоящее время известно большое число различных по составу питательных сред, но наиболее часто применяемая при выращивании изолированных растительных тканей в условиях invitro среда Т. Мурасига и Ф. Скуга, впервые составленная в 1962 г. Эта среда содержит хорошо сбалансированный состав питательных веществ и отличается от других, как правило, соотношением аммонийного и нитратного азота. Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар, который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. С целью рационального использования времени растворы солей макро- и микроэлементов, а также витаминов и фитогормонов готовят более концентрированными, что позволяет многократно их использовать. Концентрированные (маточные) растворы хранят в холодильнике. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 12 из 74 2 Получение калуса и его культивирование. Каллус — ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток. Пролиферация — это новообразование клеток и тканей путем размножения уже существующих. Каллус (от лат. callus — «толстая кожа», «мозоль») — особый тип ткани, образующийся на целом растении в результате его ранения. Он защищает место травмы, накапливает питательные вещества и способствует регенерации специального защитного слоя или утраченного органа. Подобные клетки возникают и в культуре клеток и тканей. Образование и рост каллуса invitro регулируется ауксинами и цитокининами. Эти гормоны индуцируют образование каллуса и у тех тканей растения, которые его не образуют в ответ на ранение. Процесс получения первичного каллуса и дальнейшее его культивирование требуют стерильности. Предварительно тщательно вымытый растительный материал подвергается затем стерилизации различными веществами, содержащими активный хлор (гипохлориты натрия и кальция, хлорамин, хлорная известь), ртуть (сулема, диоцид), а также диоксидом водорода, этанолом. Реже используют для этих целей бром, серную кислоту, фенол и в особых случаях антибиотики. Вид стерилизующего средства, его концентрация и длительность воздействия зависят от растительного объекта, подвергаемого стерилизации. Правильный выбор стерилизующего вещества заключается в том, чтобы оно губительно действовало на все микроорганизмы и в то же время минимально повреждало растительные ткани. Кроме того, стерилизующее вещество должно легко удаляться при промывании водой, в противном случае произойдет отравление тканей и это отрицательно скажется на результатах эксперимента при культивировании. Обычно используют известные методики стерилизации либо разрабатывают их экспериментально для каждого конкретного объекта. Фрагмент ткани или органа, так называемый эксплант, помещенный на подходящую по составу стерильную питательную среду, через некоторое время начинает расти и превращается в массу недифференцированных клеток — каллус. Этот процесс называется каллусообразованием, или каллусогенезом. Следует заметить, что в последние годы в русскоязычной литературе стали использовать английский термин «эксплант» вместо прежде употребляемого «эксплантат». Специализированные неделящиеся клетки возобновляют клеточные деления, то есть вновь возвращаются к меристематическому состоянию. Переход специализированных неделящихся клеток к пролиферации называется дедиффереициацией. Дифференциаций— это комплекс процессов, приводящих к различиям между материнскими и дочерними клетками, а также между дочерними УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 13 из 74 клетками. В результате дифференциации клетки, казавшиеся до того сходными, приобретают морфологические различия и начинают выполнять разные физиологические функции. При дедифференциации и образовании каллуса наблюдается обратное: клетки теряют структуры, характерные для их специфических функций, и возвращаются к состоянию делящейся клетки, т. е. они как бы обезличиваются, становятся одинаковыми. Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом на агаре, представляет собой аморфную массу тонкостенных пареихимных клеток, не имеющих строго определенной анатомической структуры. Однако было бы ошибочным думать, что каллусные ткани однообразны. Исследователи делят их на типы по таким морфологическим признакам, как цвет, консистенция, характер поверхности, опушение, а также по интенсивности роста и способности к озеленению. Цвет каллусной ткани может быть беловатым, желтоватым, бурым, коричневым, полностью или частично пигментированным хлорофиллом или антоцианами. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают компактными и плотными или рыхлыми и оводненными, распадающимися при извлечении каллуса на отдельные кусочки. Под понятием «происхождение каллусной ткани" подразумевают видовое, органное и тканевое происхождение. Возникшая каллусная ткань будет отличаться в зависимости от вида растения, его физиологического состояния в момент изолирования экспланта для культивирования. Кроме того, органы или их фрагменты представляют собой «мозаику» тканей с клетками различной дифференциации, которые не все переходят к делению. Образование каллуса происходит в области первичных или вторичных меристем, а также из паренхимы, прилегающей к этим меристемам или к вторичным сосудистым тканям. Этот процесс зависит также от размера экспланта и составляющих клеток. Чем крупнее эксплант, тем более сложен и разнообразен набор клеток, быстрее образуют каллус молодые ткани, чем зрелые, поэтому чаще для получения каллуса используют ткани и органы проростков. Многие ткани обладают физиологической полярностью. Например, на фрагментах стебля каллус более интенсивно образуется на той стороне экспланта, которая на растении обращена к корню, Г поэтому экспланты помещают на агар апикальной стороной. Каллусные ткани в условиях invitroможно выращивать неопределенно долго, периодически пересаживая их на свежую питательную среду. Каллусные культуры выращивают в чашках Петри, пробирках, колбах и флаконах. Каллусную ткань через 3—4 недели роста извлекают, нарезают на кусочки и пассируют (пересаживают) на свежую питательную среду, потому что ухудшаются питание и аэрация внутренних участков ткани, истощается питательная среда. Состав новой среды определяется целями эксперимента. Если нужно только поддерживать рост каллуса, то среда остается прежней. В некоторых опытах, учитывая, взаимодействия клеток между собой, применяют специальные методы выращивания каллуса. Так метод культуры УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 14 из 74 «няньки», или «кормящего слоя», используется для стимуляции роста одного каллуса другим. При этом ткань пересаживается на фильтровальную бумагу, смоченную средой, и помещается на хорошо растущую клеточную массу того же вида растений. Иногда в одном культивируемом сосуде совместно выращивают ткани разных видов растений. В отдельных случаях прибегают к прививке тканей либо органа на ткань. Какие-то вещества, выделяемые хорошо растущими тканями или органами, стимулируют рост опытной каллусной ткани. Таким образом, основным типом культивируемых клеток всех высших растений являются каллусные клетки. Техника культивирования тканей растений позволяет получить длительную пересадочную каллусную культуру из любых живых клеток интактного растения. Широкое культивирование каллусных тканей обусловлено их способностью к различным типам морфогенеза. Изменяя состав питательной среды, можно добиться того, что неорганизованно растущая каллусная ткань вновь вернется к эмбриональному состоянию и даст начало растению регенеранту. Следовательно, можно получить целое растение даже из одной клетки, в этом проявляется уникальное свойство растительной клетки — тотипотентность. 3. Культивирование клеток в жидкой среде Дифференциация и каллусообразование. Любая живая растительная ткань, помещенная на подходящую питательную среду, переходит к делению и образует массу недифференцированных клеток -каллус. Это означает, что дифференцированные клетки тканей, которые давно перестали делиться, вновь приступают к делению. Переход специализированных неделящихся клеток к пролиферации связан с их дедифференциацией, другими словами - утратой специализации. В основе этого процесса, как и при дифференциации клеток в интактном растении, лежит дифференциальная активность генов. Структура и функции клеток определяются активностью генов, и если клетки различаются по своей структуре и функциям, то это обусловлено различиями в экспрессии их генов, то есть специализация обеспечивается «включением» разных генов в разных клетках. Обычно активна небольшая часть (5%) всего пула генов, свойственных данному виду. В этот состав активных генов входят, кроме видоспецифичных и обязательных для поддержания клеточного метаболизма, гены, активные только в данном органе, ткани, клетке, а также гены, активные лишь в определенном возрасте или начавшие работать только под влиянием изменившихся внешних условий. Возникновение физиологических и структурных различий между клетками и тканями растений, связанное с их функциональной специализацией, называют процессом дифференциации. Понятие «дифференциация» отражает превращение эмбриональной, меристематической клетки в специализированную. Меристематические клетки, однотипные по структуре и функции, начинают развиваться различными пу- УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 15 из 74 тями, создавая ткани разных органов. Как это осуществляется — один из труднейших вопросов клеточной биологии. Между геномами в клетках, которые приобретают разную форму и функцию, по-видимому, нет качественных различий, и клетки эти начинают различаться только вследствие разной экспрессии генов. Вновь возникшая клетка обладает широкими потенциями и может развиваться по любому из многих путей в морфологическом и физиологическом смысле. Состав питательных сред для культивирования изолированных тканей растений Компоненты питательной среды Концентрация, мг/л МурасигаСкуга Гамборга ШейкаХильдебрандта Грес-хофф - Доу NH4NO3 1650 2500 2500 - NH4H2P04 - - 300 - KNO3 1900 - - 1000 СаС12 -2Н20 440 150 200 150 MgS04 -7Н20 370 250 400 250 (NH4)2S04 - 130 - 200 КН2Р04 170 - - - Na2ЭДТА 37,3 37,3 20.0 37,3 FeSCu -7Н20 27,95 27,85 15,0 27,8 NaH2P04 –Н2О - 150 - 90 Н3ВО3 6,2 3,0 5,0 3.0 MnS04 -4Н20 22,3 10,0 10,0 10.0 ZnS04 -7Н20 8,6 2,0 1.0 3,0 KI 0,83 0,75 1.0 0.75 Na2Mo04 -2H20 0,25 0,25 0,1 0,25 CuS04 -5Н20 0,025 0,025 0,2 0.25 УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 16 из 74 CoU2 -6H20 0,025 0,025 0,1 0.25 Глицин 2,0 - - 2,0 Мезоинозит 100 100 1000 10 Никотиновая кислота 0,5 1.0 5,0 1,0 Пиридоксин-Н1 0,5 1.0 0,5 0,1 Тиамин-Н1 1 10,0 5,0 0,1 2.4-Д - 0.1—1,0 - - Кинетин - 0,1 0,1 - Глутамин - - - 2.0 Сахароза 30 000 30 000 30 000 20 000 Условия культивирования. Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные условия выращивания. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеют хлоропластов и питаются гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани, такие, как каллусная ткань мандрагоры. В некоторых случаях каллусные ткани, не способные к автотрофному питанию, все же выращивают на непрерывном освещении, что является необходимым условием дальнейшего успешного морфогенеза, как у люцерны. Большинство же каллусных тканей получают в темноте или при рассеянном свете. Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далее культивируют их просвещенности 1000—4000 лк. Культивирование изолированных меристем и их микроразмножение также происходит на свету. Освещенность факторостатной (световой) комнаты должна составлять в зависимости от культуры 1000—10 000 лк. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта. Влажность в культуральной комнате должна составлять 60—70%. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 17 из 74 Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей 25— 26°С, для культуры тканей тропических растений она может достигать 29— 30° С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18—20° С. Наилучшие световой и температурный режимы, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер. 4.Получение суспензионной культуры. Суспензионные культуры – это одиночные клетки, мелкие, средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2–3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60–100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100–120 об./мин. Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает: лагфазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации. Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 суток. Суспензии используют для получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском хозяйстве. Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и особенно молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, необходимые для соматической гибридизации, генетической инженерии, а также для изучения метаболизма клеток. 1. В асептических условиях извлечь каллус из пробирки и поместить в колбу с питательной средой, из расчета 2–3 г на 100 мл среды: 1. МС+2,4-Д, 2. МС+ИУК, 3.МС+ИУК+6-БАП, 4. МС без гормонов. 2. Колбы с суспензией поместить на круговые качалки при 100–120 об./мин. и оставить на 2 недели. 3. Результаты культивирования суспензии на различных по составу средах зарисовать и сделать выводы. ПОДСЧЕТ ПЛОТНОСТИ СУСПЕНЗИИ. По плотности суспензии можно не только охарактеризовать состояние клеточной популяции, но и определить время субкультивирования (отбора инокулянта и пересадки на свежую питательную среду). В большинстве случаев суспензию для субкультивирования отбирают в конце экспоненциальной фазы (через 14–16 дней после начала культивирования). При построении кривой роста показатели снимают через день. Плотность УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 18 из 74 суспензии за 2–3 недели культивирования возрастает в 20 раз. Клетки суспензий удобнее всего подсчитывать в специальных счетных камерах Фукса-Розенталя /гемоцитомерах/. Для подсчета клеток суспензии иногда используют временные препараты, но это более трудоемкий процесс: значительно увеличивается число повторностей. Объем выборки должен составлять не менее 1000 клеток. Подсчет клеток затрудняется, если в суспензии преобладает фракция агрегатов. В таких случаях к 1 объему культуры добавляют 2 объема 8 % оксида хрома и нагревают до 700С в течение 2–15 минут. После охлаждения культуру встряхивают, чтобы распались агрегаты. Для разрушения агрегатов в суспензию добавляют пектиназу – 0,25 % объема. Плотность суспензии можно определить и по соотношению объема биомассы к общему объему суспензии. Измеряют средний объем клетки и получают число клеток в 1 мл суспензии. 1. Колбу с суспензией встряхнуть и отобрать пипеткой несколько мл суспензии. 2. 1 мл суспензии смешать с 2 мл 8 % оксида хрома и поставить на 15 минут в термостат при температуре 700 С. 3. Смесь пропустить 3 раза через шприц с толстой иглой (пипетировать). 4. Камеру Фукса-Розенталя заполнить суспензией. 5. Подсчитать клетки под микроскопом. 6. Плотность суспензии рассчитать по формуле: Мґnґ1000 Х=, где Х – число клеток в мл, 3,2 М – среднее число клеток в камере, n – разведение. 1. 2. 3. 4. Вопросы для самоконтроля: Питательные среды. Получение каллуса и его культивирование. Культивирование клеток в жидкой среде. Получение суспензионной культуры. Список использованнои литературы: 1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, 1996. 2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе. М..ФБК-ПРЕСС, 1999. 3. Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 19 из 74 Лекция № 4,5 Тема: Регуляторы роста и развития растений. Содержание лекционного занятия: 1. Понятие фитогормона и фиторегулятора, их классификация. 2. Применение фитогормонов и фиторегуляторов в целях индукции корнеобразования, эмбриогенеза. ФИТОГОРМО́НЫ (гормоны растений), органические вещества небольшого молекулярного веса, образуемые в малых количествах в одних частях многоклеточных растений и действующие на другие их части как регуляторы и координаторы роста и развития. Гормоны появляются у сложных многоклеточных организмов, в том числе растений, в качестве специализированных регуляторных молекул для осуществления важнейших физиологических программ, требующих координированной работы различных клеток, тканей и органов, нередко значительно удаленных друг от друга. Фитогормоны осуществляют биохимическую регуляцию — наиболее важную систему регуляции онтогенеза у многоклеточных растений. По сравнению с гормонами животных специфичность фитогормонов выражена слабее, а действующие концентрации, как правило, выше. В отличие от животных, у растений нет специализированных органов (желез), вырабатывающих гормоны. Известно 5 основных групп фитогормонов, широко распространенных не только среди высших, но и низших многоклеточных растений. Это ауксины, цитокинины, гиббереллины, абсцизины и этилен. Каждая группа фитогормонов производит свое характерное действие, сходное у растений разных видов. Помимо пяти «классических» фитогормонов, для растений известны другие эндогенные вещества, в ряде случаев действующие подобно фитогормонам. Это брассиностероиды, (липо)олигосахарины, жасмоновая кислота, салициловая кислота, пептиды, полиамины, фузикокциноподобные соединения, а также фенольные ингибиторы роста. Вместе с фитогормонами их обозначают общим термином «природные регуляторы роста растений». 3.Рост – необратимое увеличение размеров, связанное с новообразованием клеток, тканей и органов. Развитие – качественные изменения в растительном организме, которое сопровождается заложением новых органов, либо каких-то структур. Этапы развития растений: 1. зародышевый – включает в себя временной промежуток от момента образования семени до созревания зародыша. 2. ювинеальный (молодость) – включает в себя период от прорастания семян и заканчивается формированием вегетативных органов УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 20 из 74 3. репродуктивный (зрелости) – начинается с момента закладки генеративных органов, включает в себя опыление, оплодотворение и развитие плодов и семян. 4. старение и смерть – характеризуется снижением жизненной активности, старением его органов и постепенное их отмирание. Покой растений – временное снижение функциональной активности растений. Даже у тропических растений все равно наблюдается покой. Бывает: вынужденным (определяется неблагоприятными условиями внешней среды) и физиологическим (глубокий, определяется внутренними факторами организма). Для растений, которые ведут относительно неподвижный образ жизни, но испытывают повреждения, характерна регенерация, т. е. восстановление поврежденных участков. Регенерация может быть физиологическая и травматическая. Факторы, влияющие на рост и развитие: Внутренние: возраст растений, развитость фотосинтетической ткани, наличие в растении воды, интенсивность обменных процессов, интенсивность дыхания. Внешние – наличие питательных элементов, воды в почве, температура, освещенность. Фитогормоны – это природные регуляторы роста, которые оказывают влияние на морфогенетические процессы растений. Фитогормоны делят на 2 группы: 1. стимуляторы роста (ауксин, цитокенин, гиберелин). 2. ингибиторы роста (этилен и абсцизовая кислота). Ауксин – синтезируется в верхушечных почках главных побегов, обеспечивает апикальное доминирование (верхушечный рост), сдерживает рост боковых побегов, обеспечивает рост клеток растяжения, а также стимулирует рост корней. Гормоны передвигаются в растении по живым элементам флоэмы, проникает через оболочку клетки, увлекает за собой протоны водорода, которые подкисляют оболочки клетки, что повышает кислотность клеточной стенки и активирует кислые гидролазы, которые разрывают поперечные сшивки между молекулами целлюлозы, вода поступает в клетку, оказывает давление на цитоплазму. Цитокенины впервые получены в 1963г. из незрелых зерновок кукурузы – зеатин. стимулирует деление клеток Синтезируется в точке роста и распространяется по растению в составе ксилемного тока при увеличении концентрации цитокенинов увеличивается синтез нуклеиновых кислот. При УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 21 из 74 начальных этапах старения органа обработка цитокенином приводит к омоложению. Гиберелин – регулирует рост. Его действие отличается от действия ауксина. Выводит органы растения из состояния покоя. Синтезируется в листьях, семенах, корнях. Передвигаются по проводящим тканям ксилемного ифлоэмного тока. Абсцизовая кислота – гормон абсцизин. При подготовке к зиме абсцизовая кислота синтезируется в концевых почках растений. Сдерживает рост, переводит растение в состояние покоя, снижает синтез АТФ, всех физиологических процессов, стимулирует закрытие устьиц. Этилен – в низких концентрациях обладает гормональным воздействием. Стимулирует созревание плодов, развитие отделительного слоя в черешках листьев и в местах крепления плодов. Содержание этилена регулируется самим растением. Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны. Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимых солей К+, Na+, Са, Мg. Железо используется в виде хелатов [Fe О 4 или Fe 2 O 4 + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кисло-та) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями. Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К+, Na+, Са++, Cl –, Н + необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиентов клеток (тургора, осмотического давления, полярности). В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20–60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 22 из 74 содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, рафинозой, целлобиозой. Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы – витамины группы В (В1, В6, В12), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит. Тиамин (В1) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислительного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы. Пиридоксин (В6) в виде фосфорнркислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот. Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную цепь Н+ (отнятие Н+ от молекул органических веществ). Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины. Ауксины: ИУК – b-индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-мас-ляная кислота, НУК – a-нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота. Цитокинины: кинетин – 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенилмочевина, 6-БАП – 6-бензиламинопурин. Гиббереллины: гиберрелловая кислота. В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10–15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину. В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений-регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов. Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6–6,0. иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 23 из 74 используют полиакриламидные гели (биогели) P10 и P200. Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при -20оС в небольших по 5–10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы). Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10–40 раз, микросолей – в 100–1000 раз, витаминов – в 1000 раз. Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами. Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка). Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей. Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно. Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5– 2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5–1 н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества). 1. В химический стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированной водой до 400 мл и растворить. 2. Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция. 3. Приготовить агар: навеску 7 г поместить в стакан и залить водой до 200 мл, растворить, нагревая плитке или газовой горелке, при постоянном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей. 4. Питательную среду довести до нужного объема (1 л) дистиллированной водой. Измерить pH среды: если pH превышает 5,5– 6,0 добавить несколько капель 0,1 н HCl, если ниже этого значения – 0,1 н КОН. 5. Готовую питательную среду разлить в пробирки на 1/3 объема, закрыть пробирки ватными пробками, поместить пробирки в металлические штативы. 6. Штативы с пробирками завернуть в целлофановую бумагу (чтобы УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 24 из 74 в автоклаве не открылись пробки). 7. Поместить штативы с пробирками в автоклав и проавтоклавировать. Вопросы для самоконтроля: 1. Понятие фитогормона и фиторегулятора, их классификация. 2. Применение фитогормонов и фиторегуляторов в целях индукции корнеобразования, эмбриогенеза, Список использованнои литературы: 1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, 1996. 2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе. М..ФБК-ПРЕСС, 1999. 3. Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998. Лекция № 6,7 Применение методов in vitro в селекции растений. Содержание лекционного занятия: 1. Использование методов in vitro для размножения гибридов с низкой нежизнеспособностью. Оплодотворение in vitro. 2. Культура изолированных семяпочек и зародышей. Андрогенез, партегенез и гиногенез Роль культуры изолированных клеток и тканей в биотехнологии следует рассматривать в трех направлениях. Первое связано со способностью изолированных растительных клеток продуцировать ценные для медицины, парфюмерии, косметики и других отраслей промышленности вещества вторичного синтеза: алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др. Как правило, вторичные вещества получают из каллусной ткани, выращенной на твердой (агаризованной) или жидкой (суспензионная культура) питательной среде. На основе клеточных технологий получают такие медицинские препараты, как диосгенин из клеток диоскореи, аймолин из клеток раувольфии змеиной, тонизирующие вещества из клеток женьшеня, используемые в медицине и парфюмерии. Продуктивность культивируемых клеток в результате клеточной селекции может значительно/превышать продуктивность целых растений. Преимуществом такого способа получения веществ вторичного синтеза является также возможность использовать для этой цели растения, не произрастающие в наших природных условиях, и получать продукцию круглый год. Второе направление — это использование культуры изолированных тканей для размножения и оздоровления посадочного материала от вирусов и других патогенов. Этот метод, названный клональным микроразмножением 1. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 25 из 74 растений, позволяет получать от одной меристемы сотни тысяч растений в год. Третье направление—использование изолированных клеток в селекции растений, дающее возможность получать быстрорастущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факторам среды: засухе, засолению, низким и высоким температурам, фитопатогенам, тяжелым металлам и др. Вместе с тем, это направление предусматривает создание новых растений путём слияния изолированных протопластов и получения неполовых (соматических) гибридов. Перенос в изолированные протопласты чужеродных генов с помощью методов генной инженерии позволяет получать в дальнейшем растения с новыми наследуемыми свойствами. Культивирование изолированных пыльников и семяпочек на искусственных питательных средах дает возможность получать гаплоиды, культивирвание зародышей — прием, позволяющий получать растения из невсхожих (с плохо развитым эндоспермом) гибридных семян. А оплодотворение в пробирке позволяет преодолеть нескрещиваемость некоторых растений. Успех в применении культуры клеток и тканей в первую очередь зависит от оптимизации физиологических процессов, обеспечивающих нормальное деление клеток, их дифференцировку и регенерацию из них взрослых растений. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. В первую очередь это касается злаковых растений. Поэтому важнейшее значение имеет выяснение механизма морфогенеза invitro, регенерации и лежащих в их основе процессов. 2. Одно из направлений клеточных технологий — это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы. Первая группа — это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 26 из 74 В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение. Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т. д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т. д.). Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М.Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986). Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде. Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов — эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу среда с УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 27 из 74 повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов. Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком. Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений. Исследована гормональная регуляция роста и развития зародышей томата in vitro . Обсуждается возможность применения эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изучаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления. Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости, но также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей — использование ее в клеточной селекции. Партеногенез-активация и развитие яйца может идти без участия сперматозоида. Естественный партеногенез-пчелы после осеменения в семяприемнике царицы оказывается много спермиев. И матка при этом откладывает оплодотворенные яйца- будущие рабочие пчелы , и неоплодотворенные яйца-будущие трутни. Есть примеры партеногенеза у человека, но дальнейшее развитие- неудачно. Искусственный партеногенезвозможен у всех видов животных. Впервые Тихомиров у шелкопряда. Андрогенез-явление противоположное андрогенезу, то есть яйцеклетка развивается только при участии мужского ядра. Астауров- 30-е годы 20 века шелкопряд. Ядро яйца инактивировалось , после этого яйца оплодотворились УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 28 из 74 проникшие сперматозоиды сформировали пронуклеусы. При искусственном и естественном партеногенезе соматические клетки нового поколения могут быть или гаплоидными или диплоидными. Диплоидный обеспечивается за счет редукциитеелец, возвращающихся в ооцит или в отсутствии редукции хромосом. партеногенез и андрогенез являются доказательством того что цитоплазма яйца имеет все факторы, необходимые для начального развития. Пускающим механизмом могут быть разнообразные внешние стимулы. Гиногенез- частный случай партеногенеза, особая форма размножения и развития зародыша, при которой после проникновения спермия в яйцеклетку их ядра не сливаются и в последующем развитии участвует тока ядро яйцеклетки. При этом нет объединения наследственного материала родителей. Роль сперматозоида ограничивается активацией осемененного яйца к развитию. Встречается крайне редко в природе. Известен у нескольких видов рыб (серебряный карась), круглых червей и растений семейства амариллисовых Андрогене́з (от др.-греч.ἀνήρ, род. п.ἀνδρός — мужчина и γένεσις — происхождение) — развитие яйцеклетки с мужским ядром, привнесённым в неё спермием в процессе оплодотворения. Андрогенез наблюдается у отдельных видов животных (шелкопряд) и растений (табак, кукуруза) в тех случаях, когда материнское ядро погибает до оплодотворения, которое при этом является ложным, то есть женское и мужское ядра не сливаются (Псевдогамия) и в дроблении участвует только мужское ядро. Андрогенез — особый случай девственного развития, или партеногенеза; иногда его называют «мужской партеногенез». Андрогенез можно вызвать искусственно; при этом собственное ядро яйцеклетки или удаляется совсем (микрохирургически, центрифугированием, встряхиванием, вызывающими отрыв ядросодержащих фрагментов, и т. п.), или же повреждается специфическими ядерными ядами (трипофлавином), ионизирующими излучениями, сильным нагревом и пр. и в дальнейшем дегенерирует. Ставились опыты получения андрогенетического потомства от сильно различающихся родителей (например, при отдалённых скрещиваниях) с целью решить вопрос, какой элемент клетки — цитоплазма (полученная от матери) или ядро (полученное от отца) — контролирует развитие наследственных особенностей андрогенетической особи. Почти во всех опытах получали лишь начальные стадии развития андрогенных зигот. Такие зародыши жизнеспособны при восстановлении диплоидного набора хромосом (см. Плоидность), что возможно, когда в яйцеклетку проникает УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 29 из 74 одновременно несколько сперматозоидов и происходит слияние двух отцовских ядер. Случаи, когда в развитии яйцеклетки с мужским ядром участвует только часть цитоплазмы яйца, чаще обозначают термином мерогония (от др.-греч.μέρος — часть и γόνος — потомство). Половозрелые животные (всегда самцы) получены только у тутового шелкопряда и наездника Habrobracon juglandis. При этом Б. Л. Астаурову и В. П. Остряковой удалось на животном впервые осуществить (1956) при скрещивании двух видов шелкопряда полный межвидовой андрогенез. Несколько случаев полного андрогенеза наблюдалось у растений при отдалённых скрещиваниях разных видов табака, скерды и кукурузы. Во всех случаях полного андрогенеза как растений, так и животных андрогенные потомки оказались сходными с отцовским видом, что указывает на ведущее значение клеточного ядра в наследственности. Т.о., с помощью андрогенеза удаётся выяснить ряд вопросов, связанных с ядерно-плазменными отношениями, оценить роль цитоплазмы и ядра в передаче видовых признаков. Андрогенез используют также в целях управления полом при необходимости получения только мужского потомства (например, при разведении шелкопряда). Гиногенез Перевод гиногенез (от греч. gynē — женщина и ...генез), способ развития яйцеклетки и образования зародыша, при котором после проникновения в яйцеклетку сперматозоида их ядра не сливаются и в развитии участвует только ядро яйцеклетки. Гиногенез — форма партеногенеза. Вопросы для самоконтроля: 1. Использование методов in vitro для размножения гибридов с низкой нежизнеспособностью. 2. Оплодотворение in vitro. 3. Культура изолированных семяпочек и зародышей. 4. Андрогенез, партегенез и гиногенез Список использованнои литературы 1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, 1996. 2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе. М..ФБК-ПРЕСС, 1999. 3. Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998. Лекция № 8,9 Тема: Криосохранение, банк клеток и тканей. Содержание лекционного занятия: 1. Криосохранения растительного генофонда. 2. Технология замораживания, криосохранения, оттаивания, реактивация клеток и меристем. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 30 из 74 Методика криоконсервации, способы замедления роста При получении клеточных линий с полезными признаками встает проблема сохранения этих признаков. Растения могут хранить генетическую информацию в семенах, однако этот источник не вполне надежен, так как со временем из-за мутаций всхожесть семян падает. Кроме того, некоторые растения размножаются только вегетативно. Этим обусловлена необходимость сохранения части материала in vitro. С другой стороны, в некоторых случаях удается получить новые клеточные линии, синтезирующие большее количество вторичных метаболитов, то есть более продуктивные, которые тоже нуждаются в сохранении. Для исследования физиологических и биохимических процессов, протекающих в тканях, также требуются стандартные исходные культуры, чем вызвана необходимость сохранять материал в течение определенного промежутка времени, когда идут серийные эксперименты. Все это делает проблему сохранения генофонда весьма актуальной. Можно, конечно, пассировать и перевивать клеточные культуры. Однако при этом возникает опасность сомаклональной изменчивости, накопления мутаций, контаминаций (заражения чужеродным генетическим материалом). Это также требует определенных финансовых и трудовых затрат (необходимость частых пересадок, расходы, связанные со средой и т.д.). Цель исследователей состоит в увеличении интервала между пересадками. Существует разные подходы к сохранению культур: - криосохранение, - замедление роста, - сушка (распылительная и лиофильная) – для клеток микроорганизмов. Криосохранение Криосохранение - замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196oC. Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов: - вид и тип клеток, - их концентрация в суспензии, - состав среды для консервирования, - вид и концентрация криопротектора, - режим охлаждения и отогрева, - способ реабилитации клеток после отогрева. Существенную роль в успешном замораживании клеток играет их морфофизиологическое состояние: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Клетки для замораживания отбирают в середине экспоненциальной фазы ростовой кривой. Немаловажное значение имеет и плотность замораживаемой суспензии. Оптимальные результаты по восстановлению клеток были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью 1*105 - 5*106 клеток в 1 мл. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 31 из 74 Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например: 2-6% маннит или сорбит для уменьшения размера вакуолей; аминокислоты, в первую очередь пролин, который служит для связывания воды в клетке (концентрация до 1 моля или 11,5%), аспарагин, γ-аминомасляную кислоту; диметилсульфоксид (ДМСО), который добавляют к среде для предкультивирования в концентрации от 2,5 до 10% на 48 часов для увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны; кроме того, применяют искусственное закаливание к холоду, когда снижают температуру культивирования, имитируя естественный осенний процесс подготовки к периоду зимнего покоя (применим только для растений умеренного климата). Клеточные культуры выдерживают несколько суток при температуре +8 - +10oC, а затем при +2 - +5oC в течение 1 - 6 недель. Процесс замораживания растительных клеток от животных отличает, в основном, наличие этапа предварительного культивирования. Криопротекторы - вещества, позволяющие снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. К ним относятся сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирролидон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин. Для определения токсичности криопротектора клетки выдерживают при комнатной температуре в различных его концентрациях в течение 30 - 50 минут, после чего определяют их жизнеспособность. Дополнительно оценивают его протективные свойства путем пробного замораживания и оттаивания культур. Наиболее часто в качестве криопротекторов используют глицерин и ДМСО. Перед добавлением криопротектора суспензию клеток концентрируют путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают. Криопротекторы вносят в культуру за час до замораживания, что приводит к изменению проницаемости мембраны, изменению точки замерзания и оттаивания. Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от изучаемого образца и обработки криопротекторами, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. В этом случае клетки повреждаются. Обычно охлаждение проводят в два этапа (рис. 26): УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 32 из 74 Рис. 26. Замораживание клеток: а) быстрое, б) медленное, поэтапное 1-й этап: от +20 до -28oC со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до -35оС), выдерживают при этой температуре 15 минут. o 2-ой этап: погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до - 196 C). Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии на спиртовой бане (0,5 - 1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до 32oC (температура должна быть не выше -28 и не ниже -32оС). Далее переносят ампулы в жидкий азот. При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37 - +40оС, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5 - 1 минуты. После размораживания клетки отмывают либо в ростовой среде (животные), либо в поддерживающей среде. Растительные клетки также можно отмывать 3 - 10% раствором сахарозы. Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры. Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной. Замедление роста Замедления роста можно добиться следующими методами: УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 33 из 74 1. Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур). 2. Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда. 3. Изменение светового режима. 4. Охлаждение до температуры прекращения активного роста. 5. Применение гормональных и осмотических ингибиторов. Из гормональных ингибиторов наиболее часто используют хлорхолинхлорид (для растительных клеток), из осмотических - маннит в концентрации 3-6%. 6. Замена СaCl2 на Ca(NO3)2 в питательных средах. Для картофеля в качестве способа, позволяющего сохранить генофонд, рекомендуется клубнеобразование в пробирках. Одно из направлений клеточных технологий – это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы. Первая группа – это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление программной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии. 1.Вспомогательное использование методов in vitro в селекции растений В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение. Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т.д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т.д.). Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 34 из 74 семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М.Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986). Преодоление постгамной несовместимости. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде. Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов – эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу среда с повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов. Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком. Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений. Исследована гормональная регуляция роста и развития зародышей томата in vitro. Обсуждается возможность применения эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изучаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 35 из 74 Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости, но также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей–использование ее в клеточной селекции. Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Эмбриокультура дает возможность вырастить гибридные растения из неполноценных зародышей. Однако выход гибридных растений мал, и гибриды часто бывают стерильны. Иногда, например, при селекции гречихи, трудно воспроизвести в потомстве уникальные генотипы из-за перекрестного опыления культуры. Поэтому перед исследователями часто встает задача – размножить и сохранить полученные растения. В этом помогает метод клонального микроразмножения. Размножают гибриды путем активации развития меристемы пазушных почек (черенкованием стерильных побегов), адвентивными почками или регенерацией растений из каллусной ткани, в частности полученной при культивировании зародышей. Получение гаплоидов in vitro и использование их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций. В диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах. Особь обычно гетерозиготна (два гена различаются), при этом проявляется действие только доминантного (но не рецессивного) гена. Поскольку мутации чаще рецессивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных же растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомологичных хромосом, мутации проявляются немедленно. Селекция на гаплоидном уровне позволяет вести прямой отбор не только доминантных, но и рецессивных признаков. Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные гомозиготные растения. Гаплоиды могут возникать спонтанно, но частота их спонтанного возникновения очень мала. Искусственным путем с Использованием методов in vitro удается получить большие количества гаплоидных растений. Существует три способа получения гаплоидов с использованием метода культуры изолированных тканей: андрогенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников и микроспор. гиногенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек; УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 36 из 74 партеногенез – получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы. Образовавшиеся в результате элиминации хромосом отцовского генома гаплоидные эмбриоиды культивируют на искусственных питательных средах и получают гаплоидные растения. Сорта ячменя Исток и Одесская-15 были получены комбинацией партеногенетического метода с культурой изолированных зародышей за четыре года вместо обычных 10–12 лет. Методом культуры пыльников из сортов и гибридов мягкой и твердой пшеницы в НПО «Элита Поволжья» за четыре года получено более 2,5 тыс. дигаплоидных линий, которые характеризуются гомогенностью и стабильностью. Продолжается разработка технологии получения гаплоидов посредством культуры пыльников пшеницы, ячменя, кукурузы, озимой ржи, картофеля. В культуре пыльников возможны два пути образования гаплоидных растений. Первый – образование растений путем эмбриогенеза в пыльцевых зернах. При этом внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен возникают эмбриоиды. Они прорастают и дают гаплоидные растения. Второй – образование каллуса из клеток пыльника. В дальнейшем в результате морфогенеза из каллусных клеток регенерируют растения. В этом случае образовавшиеся растения не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности. До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слившихся клеток. Гаплоиды, полученные in vitro, могут применяться не только в практической селекции, но и в работах по генетической инженерии, а также по клеточной селекции. Пыльцевые зерна являются в некоторых случаях более удобными, чем протопласты, объектами для опытов по генетической трансформации. Криосохранение растений. Криосохранение соматических клеток растений в жидком азоте (температура – 196° С) – новое направление в биотехнологии, которое широко стало развиваться с начала 70-х годов XX столетия. Цель данной технологии заключается в сохранении в культуре in vitro генофонда, а также в обеспечении селекционеров в любое время генотипом, имеющим искомые признаки: необходимая пыльца для проведения гибридизации; уникальные и единичные семена, в том числе не выносящие обезвоживания; трансформированные, мутантные, гибридные клетки разных видов растений, способных к морфогенезу in vitro; зиготические и соматические зародыши и т.д. В настоящее время разработаны условия криосохранения для культивируемых клеток более 30 видов, каллусных культур (около 10 видов), изолированных протопластов (8 видов), сохранения меристем (25 видов) и кончиков стебля (13 видов). Приоритет в этом направлении принадлежит Институту физиологии растений РАН и, в частности, отделу культуры тканей и морфогенеза, возглавляемому проф. Р.Г. Бутенко. При проведении работ по криосохранению необходимо, прежде всего, учитывать специфику растительных клеток: отбирать мелкие клетки, с маленькой вакуолью и пониженным содержанием воды; разрабатывать в каждом отдельном случае подходы замораживания и последующего оттаивания УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 37 из 74 растительных клеток. При криосохранении встречается ряд трудностей, одна из которых связана с защитой замораживаемых клеток и тканей от осмотического стресса и механического разрушения структур в результате образования и роста кристаллов льда внутри клетки. Одновременно с этим необходимо правильно подбирать условия, обеспечивающие высокую выживаемость клеток при оттаивании и рекультивации. Несмотря на многообразие работ в этом направлении, в них все же наметились общие приемы, лежащие в основе криосохранения: обработка клеток перед замораживанием, применение криопротекторов, соблюдение определенного режима замораживания в интервале от 0 до –40° С (в редких случаях до -70° С), а также специальные предосторожности при оттаивании объектов. Процесс криоконсервации, как правило, начинается с подготовки культуры клеток к замораживанию. Это может быть достигнуто несколькими способами, предусматривающими культивирование клеток на питательных средах, содержащих различные осмотически активные вещества: маннит или сорбит в концентрации 2–6%, аминокислоты и среди них, в первую очередь, пролин, чье значение для связывания воды в клетках растений широко известно, а также уаминомасляная кислота. Подбор криопротекторов, веществ, уменьшающих повреждение клеток от осмотического и механического стресса, проводят эмпирически по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. Среди всех известных криопротекторов выделяются такие легко проникающие в клетки вещества, как диметилсульфоксид (ДМСО, 5–10%), глицерин (10–20%), а также непроникающие высокомолекулярные–поливинилпиролидон (ПВП), декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000. Большое значение при криосохранении имеет правильно подобранный режим замораживания от 0 до –40° С. Как правило, для всех объектов устанавливается скорость замораживания 0,5–1 °С в минуту и всю эту работу проводят на специальном оборудовании, обеспечивающем программное замораживание. Такие приборы выпускает специальное конструкторское технологическое бюро с опытным производством при Институте проблем криобиологии и криомедицины (г. Харьков). Таким образом, медленное замораживание и использование криопротекторов позволяет освободить клетку от свободной воды, и при –40° С клетки становятся полностью обезвоженными, что дает возможность проводить дальнейшее замораживание, а именно погружать ампулы с растительным материалом в жидкий азот. Хранение материала в жидком азоте практически не лимитировано. Например, в криобанке Института физиологии растений РАН хранятся клетки моркови, которые находятся в жидком азоте около 20 лет, меристемы картофеля – более 10 лет и др. Оттаивание и проверка жизнеспособности клеток после хранения в жидком азоте является последним этапом технологии криосохранения. Если замораживание осуществляют медленно, постепенно, то оттаивание должно УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 38 из 74 быть проведено как можно быстрее. Для этого ампулы помещают в водяную баню с температурой 40°, а иногда и 60° С и выдерживают до полного исчезновения последнего кристаллика льда. Для определения жизнеспособности клеток после оттаивания применяют наиболее простой, быстрый и вполне удовлетворительный способ – окраска витальным красителем (0,1%-ным феносафранином или 0,25%-ным раствором сини Эванса), в результате которой мертвые клетки окрашиваются, а живые нет. Окончательным критерием, безусловно, служит четкое возобновление роста и деления клеток при рекультивации на искусственных питательных средах после оттаивания. Экспериментально было показано, что клетки после хранения в жидком азоте не теряют способности к делению, регенерации растений, не уменьшается продуктивность синтеза вторичных метаболитов (клетки продуценты) и т.д. Так, Институтом физиологии растений РАН совместно с НПО по картофелеводству разработаны методы криосохранения меристем четырех сортов картофеля и показана возможность из 20% хранящихся меристем регенерировать целые растения, которые при высадке в поле не отличались по всем признакам, включая темпы роста и продуктивность, от обычных пробирочных растений (С. Манжулин и др., 1982). Более подробно о технике криосохранения можно узнать из обзорных работ А.С. Попова. Таким образом, технология, связанная с криосохранением растительных объектов, развивается и постоянно совершенствуется. Несомненно, эта технология имеет свое будущее, так как уже сегодня криобанки могут значительно облегчить работу селекционеров, предоставив им возможность широко использовать пул генов сортов, в том числе старой селекции и диких видов, а также исчезающих видов растений. 2. Клеточная селекция растений Сомаклональная вариабельность. Метод культуры изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro, широко используемый для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений, в настоящее время находит все большее применение и при создании новых биотехнологий. Начиная с первых работ по культивированию растительных клеток, тканей и органов особый интерес у исследователей вызвал вопрос о том, какие клеточные изменения могут происходить в изолированных клетках, растущих на искусственных питательных средах, и причины, их вызывающие. С разработкой техники получения растенийрегенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений. Такое разнообразие среди клеточных линий и растений-регенерантов получило название «сомаклоны», хотя еще в 70–80-е годы нашего столетия было принято называть растения, регенерировавшие из каллусной ткани, «калликлонами», а из протопластов – «протоклонами». УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 39 из 74 Генетическая природа и механизм возникновения сомаклональной изменчивости пока мало изучены. Однако четко можно выделить зависимость возникновения сомаклональных вариантов, прежде всего, от генетической гетерогенности соматических клеток исходного экспланта, генетической и эпигенетической изменчивости, индуцируемой условиями культивирования in vitro, а также от генотипа и исходного экспланта. Дифференцированные клетки в нормальном растении могут иметь разную степень плоидности, но для отдельных видов характерно наличие только диплоидных клеток. Однако в процессе онтогенеза могут возникать клетки с разной плоидностью. Например, экспериментально доказано, что в меристемных тканях, наряду с фактором видового постоянства числа хромосом, почти у 80% покрытосеменных растений в процессе дифференцировки в соматических клетках может происходить эндоредупликация хромосом и формирование тканей различного уровня плоидности. Для вегетативно размножаемых и апомиктичных растений характерно образование с высокой частотой анеуплоидных клеток. Усиление хромосомных перестроек, приводящих к появлению химерности и миксоплоидии у растений, наблюдается при изменении условий произрастания, особенно при их резком ухудшении: засоление почв, повышенные или пониженные температуры, применение гербицидов или пестицидов, минеральных удобрений в повышенных дозах и др. Эти и другие часто встречающиеся в практике факторы могут приводить к физиологическим нарушениям, связанным, в первую очередь, с появлением аномальных митозов и формированием клеток с числом хромосом, отличающимся от такового в материнской ткани. Цитологические исследования показали, что вариабельность, индуцируемая условиями культивирования in vitro, связана с генетическими изменениями. Прежде всего одним из основных источников появления фенотипических вариантов являются различные кариологические изменения и перестройки. Однако выявить, какие из них будут иметь фенотипический эффект и наследоваться как стабильная мутация генов, часто сложно. Как грубые, так и тонкие хромосомные изменения – мелкие деления, дупликации, транслокации, инверсии – могут вызвать существенные фенотипические изменения как в растениях-регенерантах, так и в последующем потомстве. Хромосомные изменения часто наблюдаются при мейозе. Анализ мейоза клетки в регенерантах показал такие интенсивные перестройки хромосом, как транслокация, инверсия, субхроматидный обмен, частичная утрата хромосом. Это является доказательством того, что большая часть фенотипических изменений обусловлена генетическими механизмами. Сомаклональную изменчивость можно проследить на молекулярном уровне, оценивая тонкие перестройки ядерной ДНК. Кроме сомаклональной вариабельности, связанной с наследуемыми перестройками генома, отмечены фенотипические изменения («эпигенетические»), которые могут стабильно передаваться дочерним клеткам, но не проявляться в растениях-регенерантах или их половом потомстве УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 40 из 74 (Приложение 1). Высокая степень разнообразия сомаклонов зависит от исходного генотипа, природы и стадии развития экспланта. Например, у различных злаков степень изменчивости среди сомаклонов может значительно различаться: у пшеницы (2n=6х=42) из 192 исследованных растений-регенерантов 29% были анеуплоидами, у гексаплоидного овса (2n=6х=42) выявлены цитогенетические изменения с такой же частотой, а для кукурузы частота возникновения анеуплоидных растений не превышала 2–3%. Образование полиплоидных и анеуплоидных растений может наблюдаться и у других видов, например, на картофеле. Причем частота появления новых вариантов у диких видов значительно ниже, чем у дигаплоидных линий культивируемого картофеля. Тип исходного экспланта также влияет на появление сомаклональных вариантов, отличающихся количественными и качественными признаками. Для картофеля, например, аномальные растения получены в 12% случаев при использовании в качестве первичного экспланта мезофильных тканей листа, а в случае использования лепестков или оси соцветий частота формирования растений с фенотипическими отклонениями от нормы составила 50%. Условия культивирования и, в частности, нарушение гормонального баланса питательной среды – одна из причин возникновения генетического разнообразия культивируемых клеток вследствие нарушения клеточного цикла, в частности митоза. От соотношения фитогормонов, входящих в состав питательных сред, во многом зависит цитогенетическая структура клеточных популяций. Однако морфологическая и цитогенетическая разнокачественность клеточных популяций может возникнуть и вследствие влияния отдельных компонентов питательной среды: некоторых минеральных солей, сахарозы или другого источника углеродного питания, витаминов, растительных экстрактов, а также от режима выращивания. Длительное культивирование клеток in vitro также способствует повышению генетического разнообразия сомаклонов. Причем для некоторых видов показано, что, несмотря на присутствие в культуре клеток разной плоидности, регенерировавшие растения были преимущественно диплоидными. Это явление было объяснено тем, что в процессе культивирования отбирались растения-регенеранты с более или менее нормальной морфологией, которые регенерировали, как правило, в первую очередь. Различные типы морфогенеза – соматический эмбриогенез или органогенез– также могут по-разному сказываться на генетических изменениях и, соответственно, на фенотипе растений. Экспериментально установлено, что при соматическом эмбриогенезе время прохождения цикла клетка – растение значительно короче, чем при органогенезе, поэтому степень сходства получаемого материала и исходного родительского генотипа может быть значительно выше. Сомаклональные варианты имеют, несомненно, практическое применение в сельскохозяйственной практике, в силу появления форм, отличающихся от родительских по различным биохимическим, качественным и количественным УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 41 из 74 признакам, а также цитогенетическим характеристикам. Например, получены сомаклоны картофеля сорта Зарево, отличающиеся высокой урожайностью, повышенной устойчивостью к заболеваниям, более высоким содержанием в клубнях протеина и крахмала. Причем наследование важных признаков при размножении клубнями сохранялось в течение трех лет полевых испытаний (В.В. Сидоров и др., 1984, 1985). Для растений табака получены через каллусную культуру сомаклоны, устойчивые к вирусу табачной мозаики, а для сахарного тростника» получен новый сорт, характеризующийся высокой урожайностью и повышенной устойчивостью к заболеваниям, в частности к болезни Fiji. В настоящее время метод культуры тканей начал широко использоваться в селекции не только кормовых и технических культур, но и декоративных и лекарственных растений. Примером тому может служить новый сорт пеларгонии Velvet Rose, полученный через каллусную культуру. Таким образом, полученные положительные результаты свидетельствуют о необходимости более эффективного внедрения различных приемов получения сомаклональных вариантов в практику селекционной работы, и наиболее реальным является применение сомаклональной изменчивости для улучшения или «доработки» уже существующих сортов или линий по отдельным недостающим признакам. Селекция растений на клеточном уровне. Значительный интерес представляет вопрос об использовании клеточной селекции в комплексе с получением сомаклонов. Одна из наиболее сильных сторон культуры in vitro в создании технологий для сельского хозяйства – возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мутаций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками. Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы: — прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь определенный искомый мутантный тип клеток; — непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели делящихся клеток дикого типа и выживания метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений; — тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны; — визуальная селекция и неселективный отбор, когда вариантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических методов (тонкослойная или жидкостная хроматография, радиоиммунный анализ, микроспектрофотометрия и др.). Из перечисленных выше приемов клеточной селекции прямая селекция является наиболее распространенным методом и используется главным образом для выделения растений-регенерантов, устойчивых, например, к гербицидам, антибиотикам, токсинам, тяжелым металлам, солям и другим антиметаболитам. Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. Выбор объекта УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 42 из 74 зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а также от конечных целей исследования. Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или пересадочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований. Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта, медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токсических веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток. Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на перечисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным. Получение стабильно устойчивых линий – процесс длительный. Как правило, селекция начинается с получения достаточного количества каллусной массы из изолированных растительных эксплантов, использующейся в дальнейшем для определения концентрации селективного фактора (построение дозовой кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани, и в то же время часть каллусных колоний погибает. Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших экспериментах. Так как первично полученные на средах с селективными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть генетически устойчивыми, то в течение последующих 4–6 субкультивирований на селективной среде проверяется стабильность устойчивости полученных клонов. Затем их переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще 2–3 пассажа. И только после повторного возвращения в селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить растениярегенеранты. Однако работы, проведенные с получением растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, выделенным из грибов–возбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать. Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и другим факторам. Большое число работ по культивированию каллуса, с целью получения нового селекционного материала, проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, а также на картофеле, томатах, люцерне и, крайне редко, на древесных. Уже достигнуты первые положительные результаты по получению растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых к NaCl или Na2S04. Получены клетки, а из них растения УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 43 из 74 моркови, которые синтезируют в 20 раз больше метионина, в 30 раз – триптофана, в 5 раз – лизина путем добавления в питательную среду токсичных аналогов аминокислот. Для картофеля получены растения, устойчивые к кольцевой гнили. Что касается древесных, то для них работы в этом направлении крайне редки и часто имеют поисковый характер. Таким образом, использование каллусной культуры в селекционных целях открывает огромные возможности в создании новых форм растений, несущих ценные признаки, необходимые для человечества. Наряду с перечисленными выше объектами (каллусная, суспензионная культура, изолированные протопласты), в качестве исходного материала для селекции могут быть использованы культуры соматических или андрогенных эмбриоидов, такие органогенные экспланты, как сегменты листьев или различные меристематические и стеблевые части растений, а также культура изолированных зародышей. Например, путем культивирования и селекции in vitro зародышей из семян получены растения ячменя, устойчивые к аналогам аминокислот, с улучшенным содержанием белка. Для картофеля разработан эффективный метод обработки побегов и черенков мутагеном, приводивший к получению химерных мутантов хлорофилл дефектности и антибиотико устойчивости. При культивировании пыльников яровой пшеницы сорта Саратовская-29 и Москов-ская-35 на питательных средах с повышенным содержанием солей хлорида натрия получены соматические эмбриоиды, а в дальнейшем растения-регенеранты, проявившие повышенную солеустойчивость (Беккужина, 1993). Таким образом, проведение селекции на клеточном уровне позволяет создавать новые формы растений в 2–4 раза быстрее по сравнению с традиционными способами селекции. 3. Гибридизация соматических клеток Следующий метод клеточной селекции–создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров. Выделение, культивирование и слияние изолированных протопластов. Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще в конце прошлого века. Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как в 1960 г. И.К. Коккинг УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 44 из 74 впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты. В настоящее время продолжается разработка и совершенствование методов выделения и культивирования протопластов на искусственных питательных средах (рис. 1.15). Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаС1 2. В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На формирование колоний протопластами влияет состав питательной среды. Дальнейшая задача – получение из каллусной ткани растений-регенерантов. Пока не удалось получить регенеранты из протопластов многих злаковых (пшеницы, ячменя). Однако успешно осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты) и других культур. Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и целлюлозой (Приложение 2). Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но довольно редко. Индуцированное слияние изолированных протопластов впервые было получено в лаборатории Коккинга в 1970 г. его сотрудниками Пауэром и др. В качестве индуктора они использовали нитрат натрия. Но этот метод оказался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким рН (9–11) и высокой концентрацией ионов кальция (100–300 мМ). Протопласты предварительно агглютинируют с помощью концентрированных растворов полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500–6000. У. Циммерман с сотрудниками разработали физический метод слияния протопластов животных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использовались импульсы электрического тока. Слияние протопластов приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида (рис. 1.17). Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного. Это возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер, и одно ядро дегенерирует. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облучения. Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несущие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам. Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 45 из 74 и N. Langsdorfii. В настоящее время методом парасексуальной гибридизации получено большое число межвидовых, межсемейственных и межтрибных гибридов. Однако во многих случаях гибридные растения, полученные таким путем, в той или иной степени ненормальны. Примером может служить соматический гибрид между арабидопсисом и турнепсом, который является растением-монстром. Возникающие аномалии являются результатом хромосомной несбалансированности (Ю.Ю. Глеба, 1982). Особый интерес представляют межцарственные клеточные гибриды, полученные от слияния протопластов растительных и животных клеток. Описаны гибриды между протопластами эритроцитов крысы и протопластами дрожжевых клеток, между протопластами моркови и человека, табака и человека и др. При соматической гибридизации эксперимент строится аналогично опытам по генетике микроорганизмов. Иными словами, используются большие популяции клеток обоих родителей. При обработке смешанной суспензии протопластов фьюзогенами часть из них сливается друг с другом, но в суспензии остаются и неслившиеся протопласты. Все они, включая гибридные, в дальнейшем регенерируют клеточные стенки и переходят к делениям. Возникает задача – выделить из общей массы гибридные экземпляры. Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими методами. Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селективных маркеров использовались зеленые хлоропласты табака и красно-оранжевые хромопласты моркови. Другим методом, позволяющим производить отбор гибридов, является генетическая комплементация. Этот метод был применен для обнаружения гибридов табака, при этом использовались хлорофиллдефектные мутации у родителей с последующей комплементацией в гибридных продуктах. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светоза-висимую хлорофилльную недостаточность. Растения, гомозиготные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. После слияния и регенерации клеточные колонии пересаживают на среду, индуцирующую стеблевой органогенез, и культивируют на свету. Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразумевают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какойнибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия. Например, половые гибриды между N. glauca и N. Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов в условиях in vitro способны расти и размножаться на УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 46 из 74 питательных средах без гормонов. Гормононезависимость клеток гибрида и была положена в основу метода селекции. После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти в этих условиях. Существуют также другие методы селекции соматических гибридов: смешанная физиологогенетическая комплементация, физическое обогащение (метод основан на разделении протопластов при центрифугировании в связи с их различной плотностью), механическая изоляция. Использование изолированных протопластов в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоропласты. Из этих протопластов Карлсон получил растения-регенеранты, содержащие хлоропласты другого организма. Однако работы по переносу чужеродных органелл и ДНК только начинают развиваться. В целом использование изолированных протопластов в генетической реконструкции клетки, как мы видим, открывает богатые перспективы перед клеточной селекцией. Вопросы для самоконтроля: 1. Задачи и значение криосохранения растительного генофонда. 2. Технология замораживания, криосохранения, оттаивания, реактивация клеток и меристем. Список использованнои литературы 1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, 1996. 2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе. М..ФБК-ПРЕСС, 1999. 3. Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 47 из 74 Лекция №10,11 Тема: Методы клонального микроразмножения. Содержание лекционного занятия: 1. Клональное микроразмножение растений и его преимущества. 2. Методы клонального микроразмножения растений. размножения. Этапы Всегда приятно приобрести что-то новое и интересное. Но, придя на выставку или в магазин можно услышать, что это новое и интересное растение выращено «в пробирке». В связи с эти возникает ряд вопросов: на сколько безопасны эти растения; их преимущества и недостатки по сравнению с размноженными традиционным способом растениями. В последнее время некоторые российские производители цветочной продукции, вслед за зарубежными предлагают растения, выращенные с применением технологий клонального микроразмножения или, проще говоря, выращенные «в пробках». В основе метода лежит уникальная способность каждой растительной клетки давать начало целому растению. Т.е., вырастить целое растение вполне возможно из кусочка растения, даже одной его клетки. Клональное микроразмножение включает в себя несколько этапов. Первый этап. Во-первых, выбор растения-маточника (растение с ценными признаками, которое необходимо размножить). Во-вторых: отделение фрагмента или «кусочка» растения. Для размножения возможно использование практически все части растения. Для луковичных хорошо подходят чешуи луковицы, для роз и хризантем – почки на стебле, для комнатных декоративно-лиственных бегоний, сенполий, эписций и глоксиний – части листа. Можно использовать даже части цветка. Размер выбранных фрагментов около 1 кв. см. Затем они обеззараживаются ртутьсодержащими или хлорсодержащими растворами. Далее помещаются на питательную среду в пробирки или любые другие сосуды (культуральные сосуды) с добавлением различных регуляторов роста. Таким образом на этом этапе, стерильные «кусочки» растения-маточника располагают на питательной среде в пробирках, и они начинают расти. 3. Следует отметить, что большое количество растений, полученных из-за рубежа, содержат грибные и бактериальные инфекции. В этом заключается причина плохого роста и, иногда, полного изменения внешнего вида (например, окраски цветков) у таких растений. Это может быть связано с нарушением технологий размножения, транспортировки и хранения посадочного материала импортерами. Поэтому для микроразмножения такие растения не пригодны. Для естественного оздоровления можно УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 48 из 74 рекомендовать: для уличных растений– высадка в грунт сроком не менее на 1 год, для комнатных – содержание в условиях пониженной влажности не менее чем на 6 месяцев. Второй этап - это собственно микроразмножение с получением максимального количества миниатюрных растений. За счет внесения различного количества регуляторов роста (гормонов) в питательную среду мы добиваемся разрастания этих фрагментов растений. Это происходит «в пробирке» в условиях искусственного освещения. Образуется большое количество миниатюрных растений в каждой пробирке. На третьем этапе осуществляется укоренение и адаптация размноженных миниатюрных растений к почвенным условия: растения пересаживают на специальную питательную среду для укоренения, а затем высаживают в стерильный грунт. Адаптация растений к почвенным условиям происходит в течение 1-4 недель. Полученные миниатюрные растения доращиваются в условиях теплицы или открытого грунта до необходимых размеров. Метод клонального микроразмножения растений имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения: 1) стабильное сохранение сортовых особенностей, в том числе оригинальной пестролистности; 2) растения освобождаются от болезней и вредителей (оздоровление растений); 3) из одного кусочка растения-маточника можно получить от 10.000 для хвойных до 10.000.000 для цветочных культур штук молодых растений в год; 4) сокращение селекционного периода в 3-4 раза; 5) ускорение цветения растений; 6) ускорение размножения медленно растущих и плохо размножающихся культур; 7) возможность проведения работ в течение круглого года. Методы биотехнологии позволяют снизить стоимость посадочного материала, что делает доступным его для большинства покупателей. Таким образом, растения, полученные методом клонального микроразмножения, безопасны для здоровья человека и окружающей среды. Т.к. сам метод основан на уникальном свойстве растительного организма – возможности формирования молодого растения из одной единственной клетки. Одна из возможностей обогатить рынок новыми интересными растениями - это использовать достижения в области биотехнологии растений. Факторы, влияющие микроразмножения на процесс клонального На эффективность микроклонального размножения влияет масса факторов различной природы. Это физиологические особенности вводимого в культуру УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 49 из 74 растения, химические и физические условия культивирования. Наиболее важным моментом является выбор материнского растения и экспланта. При выборе материнского растения необходимо учитывать его физиологические, сортовые и видовые особенности. Исходные растения должны быть здоровы, не поражены грибными, бактериальными и вирусными болезнями. Кроме того, они должны находится в состоянии интенсивного роста (выход из фазы покоя и переход к активному росту). Луковицы, корневища и клубни в состоянии покоя непригодны, перед введением в культуру их предварительно обрабатывают высокими или низкими температурами. Способность к размножению также детерминирована генетически. Например, земляника размножается всеми способами, облепиха – ни одним, хотя в природе черенкуется. Двудольные обладают большей регенерационной способностью, чем однодольные и древесные. При выборе экспланта необходимо учитывать его возраст, строение и происхождение. Для обеспечения максимальной стабильности клонируемого материала, во избежание появления аномальных растений в качестве экспланта желательно использовать молодые, слабодифференцированные ткани. Кроме того, экспланты от ювенильных растений лучше укореняются, чем от зрелых, особенно это касается древесных пород. Лучше всего использовать кончики стеблей, пазушные почки, зародыши, молодые листья, черенки, соцветия, чешую луковиц, то есть экспланты, содержащие меристемы. Опыты с эмбрионами кукурузы, проведенные Грином и Филипсом в 1975 году, показали, что при извлечении эмбрионов из зрелых семян они образуют каллус и корни. Если же изолировать их через 2 – 3 недели после опыления, то образуются и каллус, и растения. Вероятно, это связано с разворачиванием генетической программы в онтогенезе растения. Следует отметить, что не всегда молодые ткани являются удачным объектом для размножения. У эхеверии на эксплантах из молодых листьев возникают только корни, из старых – только побеги, из средних по возрасту – и побеги, и корни. Чем меньше размер экспланта, тем меньше его регенерационная способность. С другой стороны, в крупном экспланте увеличивается возможность появления в его клетках вирусов и других патогенов, что препятствует оздоровлению тканей. Длительность культивирования также влияет на эффективность микроразмножения. Физиологическое состояние экспланта меняется в течение пассажей, при длительном культивировании частота укореняемости побегов возрастает. Возможно, что при этом эксплант приобретает признаки ювенильности, что ведет к повышению его морфогенетического потенциала. Успех введения в культуру часто определяется эффективностью стерилизации. Выбор стерилизующего агента определяется особенностями УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 50 из 74 экспланта. Для нежных тканей концентрация стерилизующего агента должна бать снижена, чтобы сохранить жизнеспособность экспланта. Часто внутреннее заражение исходных эксплантов бывает намного сильнее, чем поверхностное, поэтому экспланты предварительно обрабатывают фунгицидами и антибиотиками против грибной и бактериальной инфекций. Хорошие результаты дает обработка растений бензоатом натрия. В зависимости от вида растений необходимо испытывать как твердые, так и жидкие питательные среды. Иногда жидкие среды имеют преимущество, так как обеспечивают большую подвижность трофических элементов. Например, при размножении роз более успешным было культивирование побегов на двухслойной питательной среде: нижний слой – агаризованный, верхний – жидкий. На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и т.д.), а также соотношение объема эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов. Состав питательной среды необходимо подбирать для каждого вида растений. На клональное микроразмножение влияют гормоны, минеральные соли, витамины и углеводы. При микроразмножении in vitro часто используют среды Мурасиге и Скуга, Линсмайера и Скуга, Шенка и Хильдебрандта, Нича, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасиге–Скуга, которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. В наших экспериментах (Кузьмина Н.А., Внукова В.В., 1997) выход морфогенных каллусов твердой пшеницы был выше на среде Мурасиге-Скуга по сравнению со средой Гамборга, которая одержала окисленные формы азота. Среда Мурасиге-Скуга также способствовала стабилизации хромосомного набора клеток твердой пшеницы при высоком содержании ауксина в среде. Вообще вопрос оптимального соотношения NH4 : NO3 остается открытым, так как литературные данные весьма противоречивы и универсального рецепта для всех видов растений нет. В качестве источника углеродного питания используют различные углеводы типа сахарозы, глюкозы, фруктозы, галактозы. Разные культуры требуют различной концентрации углеводов на разных этапах клонального микроразмножения. К физическим факторам выращивания относятся температура и условия освещения. На первых двух этапах освещенность колеблется от 1000 до 3000 Лк, фотопериод 14 – 16 часов, но эти параметры зависят от культуры. Высокая интенсивность света может вызывать хлорозы и задерживать развитие, но при переносе в почву эти растения чувствуют себя лучше и растут энергичнее. Спектральный состав также играет немаловажную роль. Некоторые исследователи (Катаева Н.В., Аветисов В.А, 1981) указывают на синий свет как основной компонент морфогенеза. Красный свет стимулирует УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 51 из 74 образование почек у табака, у салата – образование побегов, у березы – укоренение. В работах Т.Н. Константиновой с соавторами (1987) показано, что синий свет усиливает закладку вегетативных почек у побегов табака в условиях in vitro , а красный стимулирует развитие цветочных почек. Однако при добавлении цитокининов и ауксинов в различной концентрации соотношение процессов дифференциации цветочных и вегетативных почек меняется, в некоторых случаях наблюдается даже противоположный эффект. В исследованиях Р. А. Карначук и Е. С. Гвоздевой (1998) наибольший выход морфогенных каллусов пшеницы, формирующих растения и побеги, отмечен на зеленом свету. Важное значение играет также сочетание спектрального состава света и гормональных факторов среды. Температура культивирования обычно варьирует в интервале 22 – 26оС днем и 18 – 22оС ночью. В некоторых случаях понижение температуры ведет к повышению эффективности размножения. Для повышения коэффициента размножения необходимо каждому виду с учетом его естественного ареала произрастания подбирать индивидуальные условия культивирования. Относительная влажность воздуха – 65 – 70%. Вопросы для самоконтроля: 1.Клональное микроразмножение растений и его преимущества. 2.Методы клонального микроразмножения растений. 3. Этапы размножения Список использованнои литературы 1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, 1996. 2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе. М..ФБК-ПРЕСС, 1999. 3. Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 52 из 74 Лекция № 12,13 Тема: Основы генетической инженерии Содержание лекционного занятия: 1. Сущность и задачи генетической (генной и геномной) инженерии. 2. Принцип клонирования фрагменотов ДНК. Генетическая инженерия представляет собой удивительное явление в науке, когда разработка новой методологии дает мощный импульс развитию нашего понимания окружающей природы, ее сокровенных глубин. Бурному прогрессу генетической инженерии способствовало то, что уже в начале 1970-х гг., сразу после первых, еще робких экспериментов по рекомбинации in vitro негомологичных молекул ДНК, научной общественностью была осознана огромная важность и перспективность данной методологии. Это привлекло к ней широкие круги биохимиков, биологов, химиков и исследователей ряда других специальностей. Генно-инженерные эксперименты, выполненные в лабораториях разных стран, привели к такому фейерверку открытий, какого биологическая наука до тех пор не знала. В огромном потоке публикаций по генетической инженерии регулярно появляются работы, восхищающие дерзостью замысла и элегантностью методики. Генно-инженерные исследования вносят уникальный вклад в изучение структурно-функциональной организации геномов различных организмов. Методология генетической инженерии постоянно совершенствуется, и все больше исследователей используют ее при решении самых разных задач биологической науки. Методами генетической инженерии созданы штаммы бактерий, дрожжей, линии клеток, с высокой эффективностью продуцирующих биологически активные белки человека и животных. Это позволяет получать эукариотические полипептиды в огромных по сравнению с недавним прошлым количествах, что упрощает процедуру их очистки вплоть до индивидуального состояния. Работы по созданию штаммов-продуцентов имеют очень важное значение для медицины и ветеринарии и революционизируют бурно развивающуюся отрасль промышленности — биотехнологию. Чрезвычайно интересны исследования по созданию трансгенных животных и растений, содержащих и экспрессирующих чужеродную генетическую информацию. Среди отечественной литературы имеется ряд обзорных материалов и монографий по различным разделам генетической инженерии. В то же время ощущается недостаток в учебной литературе, достаточно подробно и на современном уровне рассматривающей достижения, проблемы и УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 53 из 74 перспективы развития данной области молекулярной биологии. В 1994 и 1997 гг. были изданы 1-я и 2-я части учебного пособия С.Н. Щелкунова «Генетическая инженерия», которое получило много положительных отзывов от научных сотрудников и преподавателей вузов. За прошедшие годы сформировались новые экспериментальные подходы, получен ряд принципиальных результатов, расширился спектр задач, решаемых методами генетической инженерии. В связи с этим возникла потребность в доработке и переиздании данного пособия. В основу учебно-справочного пособия «Генетическая инженерия» положены лекции по генетической инженерии, которые автор читает в Новосибирском государственном университете начиная с 1980 г. Ссылки на большинство экспериментальных работ, выполненных до 1986 г., читатель сможет найти в монографиях С.Н. Щелкунова «Клонирование генов» и «Конструирование гибридных молекул ДНК» (Новосибирск:Наука, 1986, 1987). Раздел 1.12 написан известным специалистом в области химико-ферментативного синтеза генов А.Н. Синяковым. Автор книги «Генетическая инженерия» является выпускником Новосибирского государственного университета и работает в области генетической инженерии с 1975 г. Первые генно-инженерные эксперименты выполнены им под руководством Н.И. Матвиенко и Л.П. Тихомировой в отделе академика А.А. Баева (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, Путино). С 1976 г. он и его коллеги в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор», возглавляемом академиком Л.С. Сандахчиевым, выполнили многочисленные исследования с привлечением методов генетической инженерии на таких системах, как бактерии Escherichia coli, Bacillus subtilis, Agrobacterium tumifaciens, дрожжи Saccharomyces cerevisiae, культивируемые клетки млекопитающих и насекомых. В качестве молекулярных векторов использовались различные плазмиды, космиды, колифаги лямбда и М13, вирусы осповакцины и эктромелии, а также бакуловирусы. Все это позволило автору четко охарактеризовать различные генно-инженерные системы, выделить их особенности, а также обрисовать перспективы развития многих направлений исследований в современной биологической науке. Клонирование - один из методов выделения и идентификации фрагментов ДНК, а также получения их в неограниченном количестве. Выделенные и идентифицированные фрагменты могут быть использованы для молекулярного анализа, в качестве ДНК-зондов и для создания библиотек УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 54 из 74 генов. Метод был разработан на бактериях и свое название получил из-за того, что все производные одной бактериальной колонии содержат идентичные фрагменты ДНК, т.е. представляют собой клоны. Клонирование фрагмента ДНК включает несколько последовательных этапов: 1) встраивание клонируемого (чужеродного) фрагмента ДНК в векторную молекулу ДНК (образование химерной молекулы - рекомбинантной ДНК); 2) проникновение этой конструкции в бактериальную клетку-хозяина; 3) идентификация клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, и их отбор (как правило, осуществляется на селективной среде); 4) получение необходимого количества клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (собственно клонирование). При необходимости индуцируют экспрессию клонированного гена в клетках-хозяевах и получают кодируемый им белок. Итак, клонирование предполагает встраивание (инсерцию) экзогенной ДНК в векторную молекулу ДНК. Векторные системы, обеспечивающие доставку чужеродного фрагмента ДНК в клетку хозяина, для прокариот и эукариот различны. Для клонирования в прокариотических клетках используют плазмиды, фаги и космиды. В зависимости от типа векторной системы, используемой для доставки клонируемого фрагмента ДНК, процесс переноса генов носит название: при использовании плазмиды — трансформации; при использовании фага - трансдукции. Перенос экзогенной ДНК в эукариотические клетки называют трансфертен. В качестве векторов для переноса ДНК в эукариотические клетки используют дрожжевые плазмиды (единственные плазмиды, найденные в эукариотических клетках) и различные эукариотические вирусы (чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аденоассоциированные вирусы). В ряде случаев введение векторных конструкций в эукариотические клетки осуществляют путем котрансформацый — одновременного введения плазмиды и сегмента чужеродной ДН К. В клетках эукариот векторные конструкции сохраняются в виде эписом (суперскрученных кольцевых молекул) в течение нескольких дней, а иногда экзогенная ДНК интегрируется в хромосомную ДНК и устойчиво сохраняется в геноме клетки-хозяина. Конструирование клонирующих векторов подразумевает встраивание или удаление удобных для идентификации клонов генетических элементов (специфических сайтов рестрикции, инициации и регуляции транскрипции). Например, при создании плазмидных клонирующих векторов ослабляют систему контроля репликации и добавляют или вырезают гены антибиотикоустойчивости. При формировании фаговой векторной конструкции экзогенную ДНК встраивают в район локализации маркерного гена, позволяющего вести селекцию химерных фагов по экспрессии химерного белка (часть полипептидной цепи соответствует маркерному УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 55 из 74 белку, а часть -информации, заключенной во встроенном фрагменте ДНК). Определение химерного белка возможно при использовании антител к фрагменту маркерного белка или участку, кодируемому чужеродной ДНК, а также путем выявления функционально активного белка после протеолитического расщепления химерного полипептида. При конструировании искусственных дрожжевых хромосом YAC (от англ. yeast artificial chromosomes) используют плазмидные векторы, содержащие в своем составе известные центромерные и теломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые для поддержания репликации векторов в клетках хозяина. Характеристики клонирующих векторов представлены в таблице. Некоторое время идентификация нужных геномных клонов проводилась очень трудоемкими методами - «прогулки» и «прыжков по хромосоме». Их этапы схематически представлены на рисунке. «Прогулка по хромосоме», или скользящее зондирование, заключается в последовательном отборе клонов, несущих перекрывающиеся в концевых участках фрагменты ДНК из определенной области генома. Выделив клоны, например, путем скрининга библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцепленной с нужным геном, их используют в качестве ДНК-зондов для поиска других клонов с перекрывающимися последовательностями. В результате получают набор фрагментов, полностью перекрывающих область поиска гена, - контиги. С помощью методов физического картирования устанавливают размер перекрывающихся участков (в п.н.) и строят физическую карту данной области. Несмотря на то, что прогулку можно осуществлять в двух направлениях, при использовании рестрикциониой карты, эффективность этого метода мала. При использовании космидных библиотек каждый шаг зондирования в одном направлении равен 20 т.п.н. (0,02Мб), а из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей можно пройти около 200-300 т.п.н. (0,2-0,3 Мб). Вопросы для самоконтроля: 1. Сущность и задачи генетической (генной и геномной) инженерии. 2. Принцип клонирования фрагменотов ДНК. Список использованнои литературы 1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, 1996. 2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе. М..ФБК-ПРЕСС, 1999. 3. Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998 Лекция № 14,15 Применение генетической инженерии в растениеводстве УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 56 из 74 Содержание лекционного занятия: 1.Применение методов генетической инженерии в защите растений. 2. Агробактерии как переносчики информации геном двудольных растений. 3. Создание векторов на основе Ti-плазмид ,Ri-плазмид. Метод кокультивации с агробактерией является одним из самых распространенных методов получения трансгенных двудольных растений. Он основан на трансформации растительных эксплантов агробактериями, несущими векторную конструкцию, содержащую чужеродный ген, встроенный в область Т-ДНК. Его популярность связана с относительной простотой проведения трансформации и довольно высоким выходом трансгенных растений (10-60%, в зависимости от вида растения). В качестве исходного материала необходимо иметь штамм агробактерии с векторной конструкцией (бинарной, коинтегративной или другой, приемлемой для этого типа трансформации). Вектор должен содержать последовательность гена, который необходимо ввести в геном растения. Происхождение гена (прокариотической или эукариотической) не столь важно для трансформации, одного он должен находиться под контролем промотора, способного экспресироваться в растительной клетке. Кроме функционального гена вектор должен содержать селективный маркер трансформации. В качестве такого маркера обычно используются гены устойчивости к антибиотикам канамицину (ген прt) гигромицину (генhpt) и /или гербицидам хлорсульфорону (ген ALS), фосфинотрицину (BASTA) (ген bar). Кроме того, должны быть подобраны сорта растения-реципиента. В качестве эксплантов для трансформации обычно берут стерильные листовые диски. Однако можно брать и молодые корешки (арабтдопсис), гипокотили (томаты), семядоли (томаты, баклажаны), междоузлия (картофель). Экспланты инокулируют жидкой средой, содержащей агробактерию с векторной конструкцией. Время инокуляции подбирается для каждого вида растений индивидуально. При этом происходит заражение клеток раневой поверхности эксплантат, и после 24-48 ч кокультивирования в некоторых клетках происходит встраивание в растительный геном фрагмента Т-ДНК с чужеродным (выбранным) геном. Далее экспланты переносят на среду с антибиотиком (карбенициллин или цефотаксим), что приводит к избирательной гибели клеток агробаетерий. Кроме того, в среду добавляют соответствующие фитогормоны (для прямой регенерации или каллусообразования) и антибтотик/гербицид для проведения селективного отбора трансформированных клеток. Такие трансгенные растения, экспрессирующие ген устойчивости к антибиотику или к гербициду, будут расти на среде с добавлением селективного агента, в то время как нетрансгенные растения погибнут. Через 2-5 недель на трансформированном УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 57 из 74 экспланте развиваются побеги, которые в дальнейшем отсаживают или переносят в почву для проведения дополнительного молекулярного анализа. Сходным образом трансформируют протопласты, однако такого рода трансформация значительно менее эффективна из-за низкой способности к регенерации самих протопластов. Методом кокультивирования с агробактериями к настоящему времени получены трансгенные растения практически всех сельскохозяйственных двудольных растений. Этот метод применим также и для некоторых однодольных (пшеница, кукуруза, рис). Вопросы для самоконтроля: 1.Применение методов генетической инженерии в защите растений. 2. Агробактерии как переносчики информации геном двудольных растений. 3. Создание векторов на основе Ti-плазмид ,Ri-плазмид. Список использованнои литературы: 1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, 1996. 2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе. М..ФБК-ПРЕСС, 1999. 3. Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998 УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 58 из 74 3 ЛАБОРАТОРНОЕ ЗАНЯТИЕ Лабораторное занятие № 1,2 Приготовление питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей растений. Работа № 2 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ IN VITRO Объяснение. Компоненты среды для выращивания растительных клеток и тканей можно разделить на 6 основных групп, что обычно отражает порядок приготовления концентрированных маточных растворов: макроэлементы, микроэлементы, источники железа, витамины, источники углерода, фитогормоны. Основой для всех питательных сред для культивирования растительных эксплантов является смесь минеральных солей. Это соединения азота в виде нитратов, нитритов, солей аммония; фосфора – в виде фосфатов; серы – в виде сульфатов; а также растворимых солей К+, Na+, Са, Мg. Железо используется в виде хелатов [Fe О 4 или Fe 2 O 4 + ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или её натриевая соль Na ЭДТА (трилон Б)] – наиболее доступной форме для усвоения растительными тканями. Азот, фосфор, сера входят в состав органических соединений: белков, жиров, нуклеиновых кислот. Железо, цинк, марганец, молибден, кобальт в сочетании с порфиринами образуют макромолекулы пигментов фотосинтеза (хлорофилла), окислительно-восстановительных ферментов (каталазы, пероксидазы, полифенолоксидазы). Следовательно, все эти соединения выполняют в клетках и тканях структурную функцию. В то же время ионы К+, Na+, Са++, Cl –, Н + необходимы для регуляции pH среды и поддержания физиологических градиен-тов клеток (тургора, осмотического давления, полярности). В качестве источника углерода для биологических макромолекул, а также при культивировании гетеротрофных тканей (каллусов и суспензий) в питательные среды добавляют углеводы в концентрации 20–60 г/л. Обычно это дисахариды (сахароза), моносахариды (гексозы: глюкоза и фруктоза, пентозы: ксилоза и другие). Полисахариды в питательных средах практически не используются. Только некоторые типы тканей (опухолевые), содержащие гидролитические ферменты, выращивают на средах с крахмалом, рафинозой, целлобиозой. Для стимуляции биохимических реакций в клетке используют биологические катализаторы – витамины группы В (В1, В6, В12), С (аскорбиновую кислоту), РР (никотиновую кислоту), мезоинозит. Тиамин (В1) входит в состав пируватдекарбоксилазы, участвует в превращениях углеводов. Тиаминпирофосфат входит в состав ферментов окислитель-ного декарбоксилирования кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой), является коферментом транскетолазы. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 59 из 74 Пиридоксин (В6) в виде фосфорнркислого эфира входит в состав ферментов декарбоксилирования и переаминирования аминокислот. Никотиновая кислота (РР) в виде амида входит в состав дегидрогеназ НАД и НАДФ, катализирующих донорно-акцепторную цепь Н+ (отнятие Н+ от моле-кул органических веществ). Для управления процессами формообразования в культуре тканей необходимы биологические регуляторы роста и развития – фитогормоны. Эти вещества влияют на дифференциацию и дедифференциацию клеток и тканей, инициируют гистогенез, индуцируют деление и растяжение клеток, участвуют в процессах старения и созревания, либо стимулируют, либо ингибируют рост и развитие клеточных культур, обуславливают формирование пола. В биотехнологических исследованиях чаще используют гормоны, стимулирующие рост и развитие: ауксины, цитокинины, гиббереллины. Ауксины: ИУК – b-индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-масляная кислота, НУК – a-нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота. Цитокинины: кинетин – 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенилмочевина, 6-БАП – 6-бензиламинопурин. Гиббереллины: гиберрелловая кислота. В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10–15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину. В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений-регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики-поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов. Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6–6,0. иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P10 и P200. Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при -20оС в небольших по 5–10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы). Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10–40 раз, микросолей – в 100–1000 раз, витаминов – УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 60 из 74 в 1000 раз. Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами. Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка). Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей. Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно. Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5– 2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5–1 н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества). Ход работы. 1. В химический стакан емкостью 2 л поместить 20 г сахарозы, долить дистиллированной водой до 400 мл и растворить. 2. Добавить к раствору сахарозы 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл микросолей, 5 мл хелата железа, 5 мл хлористого кальция. 3. Приготовить агар: навеску 7 г поместить в стакан и залить водой до 200 мл, растворить, нагревая плитке или газовой горелке, при постоянном помешивании. Готовый агар долить к раствору солей. 4. Питательную среду довести до нужного объема (1 л) дистиллированной водой. Измерить pH среды: если pH превышает 5,5–6,0 добавить несколько капель 0,1 н HCl, если ниже этого значения – 0,1 н КОН. 5. Готовую питательную среду разлить в пробирки на 1/3 объема, закрыть пробирки ватными пробками, поместить пробирки в металлические штативы. 6. Штативы с пробирками завернуть в целлофановую бумагу (чтобы в автоклаве не открылись пробки). 7. Поместить штативы с пробирками в автоклав и проавтоклавировать. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 61 из 74 Работа № 4 Приготовление растворов солей (макро и микро элементы), витаминов, фитогормонов. Объяснение. Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, калии, кальций, серу, магний, железо), микроэлементы (бор, цинк, медь, марганец и др.), а также витамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Углеводы – независимые компоненты питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей, так как в большинстве случаев последние не способны к автотрофному питанию. Чаще всего в качестве источника углерода используют сахарозу или глюкозу в концентрациях 2-4%. Полисахариды, как правило, не применяют, но поскольку некоторые ткани, например опухолевые, содержат активные гидролитические ферменты (амилазу и др.), они могут расти на средах с растворимым крахмалом. Фитогормоны необходимы для дедифференцировки клеток и индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред следует обязательно включать ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление дедифференцированных клеток. Для приготовления первичного каллуса и реже – для поддержания его пролиферативной активности в состав питательной среды иногда входят растительные экстракты или соки. Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агарполисахарид, получаемый из морских водорослей. С целью рационального использования времени растворы макро -и микросолей, витаминов и фитогормонов готовят более концентрированными, что дает возможность их многократно использовать. Концентрированные (маточные) растворы хранят в холодильнике (растворы витаминов хранят при отрицательной температуре). УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 62 из 74 Порядок выполнения работы. Приготавливают питательную среду Мурасиге-Скуга (МС). Маточные растворы солей готовят на дистиллированной воде. Каждую из макросолей растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, а затем сливают в колбу и оббьем доводят до 1 л, причем раствор MgSO4.7H2О влияют последним без нагревания в охлажденную смесь, что предотвращает выпадение осадка. Соль CaCI2 готовят и хранят отдельно. Хелат железа (раствор FeSO4и NaЭДТА)готовят при нагревании и хранят отдельно. Каждую соль микроэлементов растворяют отдельно и сливают в общий стаканчик, а объем доводят до 100 мл. полученные растворы макро- и микроэлементов сливают в колбы с притертой пробкой (хелат железа – в колбу из темного стекла), наклеивают этикетку и помещают в холодильник. Для приготовления концентрированных растворов витаминов берут 10кратные навески и растворяют их (каждый витамин в отдельности) в 10мл воды; 1мл содержат концентрацию витамина, необходимую для приготовления 1л раствора по прописки Мурасиге-Скуга. Хранят растворы во флакончиках из-под пенициллина в замороженном состоянии. Растворы фитогормонов готовят следующим образом. Берут 10мг вещества и растворяют: ауксин (2,4-Д, ИУК, НУК) в 0,5…2,0 мл этанола; цитокинин (кинетин, зеатин, БАП,) в небольшом количестве0,5н. НСI или КОН, (абсцизовую кислоту (АБК) в 70%-ном этаноле. Затем растворы подогревают (кроме АБК) и доливают водой до объема 100 мл (1мл содержит1мл гормона). В холодильнике их можно хранить при температуре 4Сне более 1 мес. На основе маточных растворов готовят питательную среду МС, которую используют в других работах. Материалы и оборудование. Стаканы химические на 1 л (4шт.), мерные цилиндры на 500 мл и 1л (2шт.), колбы с притертыми пробками для хранения маточных растворов (на 1л-3шт., на 100мл-1шт.), флаконы из-под пенициллина (10шт.), мерные пипетки на 10 и 1 мл, весы технические, весы торсионные или аналитические, электроплитка, химреактивы. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 63 из 74 Работа № 5 Приготовление жидкой и агоризованной питательной среды МурасигеСкуга. Для приготовления питательной среды в химический стакан вместимостью 1л помещают 30г сахарозы, доливают дистиллированной водой примерно до 400 мл и после растворения сахарозы вносят необходимые количества маточных растворов макросолей, микросолей, витаминов и гормонов, после чего проверяют рН раствора. Если рН превышает 5,5-5,6, в питательную среду вносят 0,1%-ный раствор КОН. Одновременно в другом стакане нагревают предварительно замоченный для набухания агар-агар, осторожно помешивая до полного растворения. Его смешивают с приготовленными растворами и доводят объем до 1л. Приготовленную питательную среду разливают в пробирки, стеклянные банки или колбы (примерно на треть объема), закрывают ватными пробками или алюминиевой фольгой и стерилизуют в автоклаве. Состав маточного раствора по МС для приготовления питательной среды. Компоненты KNO3 NH4NO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCI2 . 2HO H2BO2 MnSO4..2H2O ZnSO4.7H2O KI Na 2MoO4.2H2O CuSO4.5H2О CoCI2.6H2О навеска Количество маточного раствора для приготовления 1л питательной среды, мл. Макросоли, г на 1 л маточного раствора 38 50 33 3,4 7,4 8,8 5 Микросоли, мг на 100мл маточного раствора 620 2230 860 83 25 2,5 1 2,5 УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 FeSO4 Na2ЭДТА Редакция №2 01.09.2011г Страница 64 из 74 Хелат железа, мг на 100 мл маточного раствора. 557 745 5 Материалы и оборудование. Стаканы химические на 1 л (4шт.), мерные цилиндры на 500 мл и 1л (2шт.), колбы с притертыми пробками для хранения маточных растворов (на 1л-3шт., на 100мл-1шт.), флаконы из-под пенициллина (10шт.), мерные пипетки на 10 и 1 мл, весы технические, весы торсионные или аналитические, электроплитка, химреактивы. Лабораторное занятие № 3,4 Методы стерилизации растительных объектов и оборудования. Работа № 3 СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ В БИОТЕХНОЛОГИИ Объяснение. Все работы с культурой клеток и тканей in vitro проводят в стерильных (асептических) условиях в стерильном боксе или ламинарбоксе, стерильными инструментами, в стерильной посуде, на стерильных питательных средах. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие рост растительных эксплантов. Чаще всего для стерилизации помещений (боксов для пересадки тканей, культуральных комнат) используют ультрафиолетовое облучение в течение 0,5–2 часов (в зависимости от площади помещения). Работы в облученном помещении начинают через 15–20 минут после отключения бактерицидных ламп, так как под действием ультрафиолетового излучения двухатомный кислород воздуха становится трехатомным озоном – газом, токсичным для человека. Для достижения максимальной стерильности перед обработкой УФ все поверхности тщательно отмываются моющими средствами, водой и растворами хлорсодержащих веществ, поверхности ламинар-бокса обрабатывают 96 % спиртом. Посуду, халаты, вату, бумагу, дистиллированную воду, питательные среды стерилизуют в автоклавах под давлением пара 1–2 атмосферы и температурой 120оС в течении 20–60 мин, в зависимости от объёма стерилизуемого материала. Колбы, штативы со средой, вату, бумагу, халаты перед автоклавированием заворачивают в целлофановую бумагу, либо помещают в биксы. Металлические инструменты автоклавировать нельзя, так как под действием пара образуется ржавчина. Поэтому их стерилизуют сухим жаром в термостатах с температурой 170–250оС в течении 1–2 часов. Ход работы. 1. Металлические инструменты завернуть в плотную бумагу и поместить УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 65 из 74 в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при to 170–200oС в течение 2 часов. 2. Чашки Петри, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой) завернуть в целлофановую бумагу и поместить в автоклав. 3. Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить конденсат в течении 10 минут, при этом давление пара в стерилизационной камере должно быть на уровне 0,1–0,2 атм. Довести давление в стерилизационной камере до 1 атм., включить автоматический режим. 4. Автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 1–1,2 атм. 5. Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до 0 атм. 6. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи. Лабораторное занятие № 5,6 Получение стерильных эксплантов из семян огурца и зерновой мягкой пшеницы. Получение стерильных эксплантов из семян огурца и зерновок мягкой пшеницы. Объяснение. Получить стерильный материал из семян огурца и пшеницы селекционных образцов часто бывает достаточно трудно, что связано с необходимостью правильного выбора стерилизующего агента. Наиболее распространены в культур invitro стерилизаторы, содержащие активный хлор: гипохлориты кальция и натрия в концентрации 35 г/л; стерилизующие растворы, содержащие ртуть (сулема и диаксид), в концентрации 0,1%; периоксид водорода в концентрации 10-12 %; антибиотики в концентрации 4-5 мг/л. Как правило, стерилизующее вещество должно обеспечивать наибольший процент неповрежденных тканей под семенной оболочкой, способных к росту и новообразованиям при наименьшем проценте инфекции. Продолжительность стерилизации эсплантов следует также тщательно подбирать. Порядок выполнения работы. Отбирают по 10семян огурца и пшеницы, тщательно промывают в мыльном растворе, а затем под проточной водой. Помещают в марлевые мешочки и в ламинар-боксе погружают на 10с в 96%ный этиловый спирт, потом в 0,1 %-ный раствор сулемы или диацида на 10- УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 66 из 74 15 мин. После этого семена промывают в 3-5 объемах стерильной дистиллированной воды и слегка подсушивают. Пинцетом раскладывают по 10 семян в чашки Петри на один-два слоя фильтровальной бумаги и добавляют по 10-15 мл стерильной воды, закрывают крышками и парафилмом. Подготовленные в чашках Петри Объекты проращивают в термостате при 25 С или в световой комнате в течение 2-3сут. В рабочей тетради зарисовывают схему процесса стерилизации и заполняют таблицу, выполненную по форме 1, с указанием стерилизующего агента, его концентрации и экспозиции для стерилизации семян огурца и пшеницы. Характеристика методов стерилизации семян огурца и пшеницы. Метод стерилизации Стерилизующ ее вещество Концентраци я, % (мл) Экспозици я, мин и с Цель стерилизаци и Предстерилизац ия Стерилизация Постстерилизаци я Материалы и оборудование. Семена огурца и пшеницы (20шт); стерильные чашки Петри с одним – двумя слоями фильтровальной бумаги, химические стаканы (3шт0, пробирки, пинцеты, ножницы, марлевые мешочки; колбы на 250мл со стерильной дистиллированной водой (3шт); 0,1 %-ный раствор сулемы; 96№-ный этиловый спирт; спиртовка; спички. Контрольные вопросы 1. как устроена биотехнологическая лаборатория? 2. как постерилизовать питательные среды, посуду, дистиллированная воду, инструменты, помещение лаборатории? 3. какие стерилизующие растворы используются для растительных эксплантов? 4. какие вещества входят питательных сред, и какую функцию они выполняют в культуре клеток т тканей invitro? Лабораторное занятие № 7,8 СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ КАЛЛУСОВ. Объяснение. В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный онтогенез: растут растяжением, дифференцируются и деградируют. Рост каллуса внешне отражает образная кривая. Ростовой цикл начинается с посадки экспланта на среду (начало культивирования), а завершается в момент прекращения митозов (стационарная фаза). УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 67 из 74 В лагфазе (латентной фазе) клетки не делятся, не увеличиваются в размере, имеют низкую метаболическую активность. В экспоненциальной фазе (фазе логарифмического роста) клетки активно делятся митозом. В ранней экспоненте увеличивается количество митохондрий (синтезируется АТФ), рибосом, всех видов РНК, синтезируются белки, активизируется метаболизм, интенсивно поглощается кислород. Поздняя экспонента или фаза латентного роста, характеризуется снижением удельной скорости роста, замедлением клеточного деления, увеличением среднего размера клеток за счет растяжения. В стационарной фазе размер клеток продолжает увеличиваться, а их деление прекращается. В поздней стационарной фазе (фаза деградации) за счет истощения среды клетки стареют и умирают. Продолжительность ростового цикла каллусных клеток 21–28 дней. В процессе культивирования каллус пассируют (пересаживают на свежую питательную среду) каждые 4–6 недель. Масса транспланта (фрагмента ткани, который пассируют на свежую питательную среду) составляет 60–100 мг на 20–40 мл среды. Материалы и оборудование. Пробирки с каллусами, пробирки с питательной средой для культивирования каллусов, инструменты: пинцеты, препарировальные иглы, флакон с 96 % спиртом, ламинар-бокс, спиртовка. Ход работы. 1. В асептических условиях извлечь каллусы из пробирок и поместить на стерильную поверхность (столик ламинар-бокса, обработанный 96 % спиртом и УФ-излучением), стерильной препарировальной иглой выделить зоны меристематической активности (белые мелкие клетки). 2. Транспланты величиной 2–3 мм поместить на поверхность питательной среды (МС+ИУК – 0,5 мг/л + кинетин – 0,5 мг/л). 3. Результаты культивирования зарисовать через 2–4 недели, по результатам взвешиваний через 1–2-3–4 недели построить график роста каллуса. Контрольные вопросы к теме II 1. Назвать основные способы культивирования каллусов. 2. Что такое дедифференциация и пролиферация клеток? 3. Чем характеризуются основные фазы ростового цикла каллуса? 4. Отличаются ли по морфологии каллусы различных видов растения? 5. Для каких целей используют культуру каллусов в биотехнологии, генетике и селекции? 6. Какие питательные среды используют для индукции каллусогенеза и культивирования каллусов? УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 68 из 74 Лабораторное занятие № 9,10 Получение и культивирование каллусной ткани из зрелых и незрелых зародышей пшеницы. Объяснение. Каллусы из различных органов пшеницы на искусственных питательных средах впервые были получены в 1968 году. Их можно использовать для изучения солеустойчивости, устойчивости к температурному стрессу, получения суспензий и протопластов. Для индукции каллусогенеза обычно используют стерильные пробирочные растения, выращенные из зародышей на средах без гормонов. Растения для получения каллусов можно вырастить в теплице. Для этого набухшие семена помещают на 5 недель в холодную камеру на яровизацию при 2оС, проростки высаживают в вегетационные сосуды и выращивают до достижения молочною спелости. Незрелые зародыши выделяют и переносят на питательные среды. Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательной средой, пробирки со стерильными растениями, колосья пшеницы в стадии молочной спелости, инструменты: препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, стерильная бумага, 6% раствор хлорамина, стерильная дистиллированная вода, спиртовки, флаконы с 96 % спиртом. Ход работы. 1. Незрелые зерновки поместить в стерилизующий раствор на 5 минут. 2. Промыть 3 раза стерильной дистиллированной водой. 3. Простерилизовайные зерновки поместить на стерильные бумажные мостики. 4. Препарировальной иглой вычленить зародыши и перенести в пробирки с питательными средами. 5. Пробирки с зародышами закрыть пробками и поставить в штатив. 6. Пробирочные растения пшеницы выложить на стерильные бумажные матрасики и разрезать на небольшие части по 5–10 мм, выделить междоузлия с участками листового влагалища. 7. Перенести экспланты на питательные среды МС + 2,4 Д в концентрации 4мг/л. 8. Зарисовать каллусы через 2–4 недели, сделать выводы о морфологии каллусов, рассмотреть каллусные клетки под микроскопом. Лабораторное занятие № 11,12 Работа 1. ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ СУСПЕНЗИИ. Объяснение. Суспензионные культуры – это одиночные клетки, мелкие, средние и крупные агрегаты (группы клеток), выращиваемые в жидкой питательной среде при постоянной аэрации (доступ кислорода) в асептических условиях. Суспензии получают из каллусов. Для инициации УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 69 из 74 суспензионной культуры необходимо 2–3 г свежей рыхлой массы каллусных клеток на 60–100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию культивируют в колбах с жидкой питательной средой на круговых качалках со скоростью 100–120 об./мин. Модельная кривая роста суспензии имеет S-образную форму и включает: лагфазу, экспоненциальную фазу, стационарную фазу и фазу деградации. Форма реальных ростовых кривых отличается продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы колеблется от 15 до 70 суток. Суспензии используют для получения важных химических веществ: органических кислот, ферментов, алкалоидов, красителей, белков, аминокислот, которые применяются в фармакологии, парфюмерии, пищевой и химической промышленности, сельском хозяйстве. Суспензионные культуры имеют большое значение для генетики и особенно молекулярной биологии: из суспензионных клеток получают протопласты, не-обходимые для соматической гибридизации, генетической инженерии, а также для изучения метаболизма клеток. Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с рыхлыми каллусами табака (среда МС+2,4-Д 2 мг/л), колбы с питательной средой для инициаций суспензии, магнитные мешалки, стерильные инструменты, флакон с 96 % спиртом. Ход работы. 1. В асептических условиях извлечь каллус из пробирки и поместить в колбу с питательной средой, из расчета 2–3 г на 100 мл среды: 1. МС+2,4-Д, 2. МС+ИУК, 3.МС+ИУК+6-БАП, 4. МС без гормонов. 2. Колбы с суспензией поместить на круговые качалки при 100–120 об./мин. и оставить на 2 недели. 3. Результаты культивирования суспензии на различных по составу средах зарисовать и сделать выводы. Лабораторное занятие № 13,14 Высев суспензионной культуры на твердую агаризованную питательную среду (метод Плейтинга). Высев суспензионной культуры на твердую агаризованную питательную среду (метод плейтинга). УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 70 из 74 Объяснение. Для приготовления работ по клеточной селекции мелкоагрегированную суспензионную культуру высевают на агаризованную питательную среду. При этом одиночные клетки и клетки, входящие в состав мелких агрегатов, делятся и образуется каллусная ткань, из которой в дальнейшем формируются растения - регенеранты. Материалы и оборудование. Суспензионная культура; стерильные чашки Петри, цилиндр, среда для роста клеточной суспензии с двойным содержанием агара (1,2-1,4%). Ход работы. Клеточную суспензию переливают в стерильный цилиндр и оставляют на 5 мин. Пипеткой отбирают 5мл верхней фракции суспензии (она обогащена одиночными клетками) и смешивают в стерильном цилиндре с 5 мл теплой (36 С) питательной среды для роста каллусной ткани. Эта среда должна содержать двойное количество агара, т.е. 1,4 %. Содержимое цилиндра быстро разливают в чашки Петри, дают остыть, закрывают крышками и парафилмом. Через 3-5 нед. подсчитывают колонии клеток диаметром более 1 мм. Эффективность высева, %, рассчитывают по формуле ЭВ= количество образовавшихся колоний . 100 Количество высеянных клеток Плотность высева обычно оставляет 1.105 клеток на 1 мл. Этот показатель не должен быть очень высоким, чтобы растущие колонии не сливались. Через 3 нед подсчитывают количество колоний в каждой чашке Петри. Контрольные вопросы 1. что такое суспензионные культуры, и каковы основные способы их получения? 2. как определить степень агрегированности и жизнеспособности суспензий? 3. как подсчитать плотность суспензии? 4. каковы основные способы культивирования одноклеточных суспензий? Лабораторное занятие № 15 Клональное микроразмножение растений. Культура изолированных клеток и тканей в селекции растений. Работа № 1 культура изолированных зародышей Общие сведения. При отдаленной гибридизации наблюдается так называемая постгамная несовместимость, в результате чего зародыш остается недоразвитым, он неспособен к нормальному прорастанию. Даже у щуплой зрелой зерновки можно извлечь зародыш и культивировать его на питательной среде без добавления гормонов, например, на среде МС. При УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 71 из 74 более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша иногда наблюдается уже на ранних этапах, что выражается в замедлении темпов роста, отсутствии дифференцировки. Процесс культивирования такого зародыша состоит из двух этапов – эмбрионального роста, во время которого продолжается дифференциация, и его прорастания. Для первого этапа требуется питательная среда более сложного состава. Незрелые зародыши изолируют обычно через 2 нед. после опыления, но этот срок может быть другим в зависимости от комбинаций скрещивания и погодных условий. Целесообразнее начать наблюдение за развитием гибридных зерновок уже с 9-10 дня после опыления и, обнаружив замедление или остановку роста, ухудшение внешнего вида зерновок, немедленно приступить к изолированию и высадке зародышей на питательную среду. Порядок выполнения работы. Всю работу проводят в ламинар-боксе. Предварительно замоченные семена стерилизуют спиртом в течение 2-3 мин, затем помещают по 10-20 шт.в марлевые мешочки и стерилизуют в растворе диацида или сулемы 15 мин. раствор сливают во флакон для повторных стерилизаций, а семена промывают 3-5 раз стерильной дистиллированной водой в том же стакане, в котором проводили стерилизацию. Пинцетом переносят зерновки на стерильный матрасик или в чашку Петри. Зерновку кладут бороздой вниз и, придерживая пинцетом, остро отточенным скальпелем или иглой рассекают оболочку и выделяют зародыш. Зародыш, повернутый щитком вниз, переносят в пробирку или чашку Петри со средой МС без гормонов. Через 2-3 нед зарисовывают проростки, образовавшиеся из зародышей. Материалы и оборудование. Зрелые пшеницы, замоченные в воде за 1 сут до занятия; пробирки со стерильной питательной средой МС; стерильный пинцет, скальпель, матрасики или чашки Петри, марлевые мешочки; колба со стерильной водой; спиртовка; спирт; спички. Контрольные вопросы 1.В чем причина прогамной несовместимости и как она проделывается? 2. Почему погибает гибридный зародыш? 3. От каких факторов зависит успешное культивирование изолированных зародышей? 4 Самостоятельная работа студента УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 72 из 74 4.1 Методические рекомендации по организации самостоятельной работы студента. Прежде чем приступить к работе, нужно осмыслить значение и цель работы, внимательно прочитать и уяснить, что нужно делать, как ее оформить, затем изучить теоретический материал по рекомендуемой литературе. Выполните задания, опишите ход работы и сделайте соответствующие выводы. В конце работы ответьте на контрольные вопросы. Практические занятия оформляются в рабочей тетради студента: -введение (цель работы, оборудование и материалы, исследуемые объекты); -некоторые пояснения к работе; -ход работы; -результаты (данные); -ответы и выводы на контрольные вопросы и задания. При оценке учитывается логичность, последовательность, информативность. В рамках СРС студенты должны посещать библиотеку, работать с литературой по данной дисциплине. Итоги самостоятельной работы студентов над курсом представляются в письменном виде и также могут быть обсуждены на занятиях. Часть вопросов предусматривает подготовку студентом устного ответа. Оценивание работы студентов в рамках СРС, будет производиться с учетом наличия у студентов всех видов самостоятельных работ по указанным заданиям и устных ответов на контрольные вопросы во время занятий. 4.2 Перечень тем рефератов и контрольные вопросы для текущего и входного контроля знаний студентов. № 1 Тематика аудиторная № внеаудиторная Спонтанные мутации, 1 Тотипотентность самоклональные вариации и их растительных клеток, ее практическое значение в селекции. природа 2 Клональное размножение овощных, 2 плодово-ягодных и декоративных растений. Техника культивирования органов, тканей, клеток и протопластов растений на искусственных питательных средах. 3 Фитогормоны как метилирования ДНК. Получение и культивирование каллусных тканей из стеблей табака и картофеля, корнеплодов моркови, семядолей сои. 4 Генетические и регуляторы 3 эпигенетические 4 Получение растений- УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 изменения признаков вариантов растений. Редакция №2 01.09.2011г хозяйственно-ценных сомаклональных сельскохозяйственных Страница 73 из 74 регенерантов из каллусной ткани. клеток 5 Подготовка растительного 5 материала к замораживанию. Генетические основы толерантности к действию низких температур. Получение суспензионной культуры у картофеля, табака, моркови. 6 Роль транспозонов в генов. Ферменты инженерии. переносе 6 генной Применение селективной среды в суспензионной культуре картофеля. 7 Способы переноса индивидуальных 7 генов или групп генов в реципиентные клетки. Проблемы экспессии трансформированных генов. 8 Клонирование белков. Выделение растительных генов для целей генетической инженерии. генов стрессовых 8 Контрольные вопросы по курсу: 1 Использование культуры клеток для решения теоретических вопросов биологии растений 2 Факторы, влияющие на накопление вторичных метаболитов в культуре клеток растений 3 Факторы, влияющие на процесс клонального микроразмножения растений 4 Применение клонального микроразмножения и его перспективы 5 Клеточная селекция 6Генетическая инженерия растений 7 Криосохранение клеток 8 Методы анализа ДНК 9 Получение векторов 4.3 Список учебно – методических пособий, методических указаний, книг и т.д. 1. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, 1996. 2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе. М..ФБК-ПРЕСС, 1999. 3. Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998. 4. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989. УМКД 042-14.4.01.20.01/03-2011 Редакция №2 01.09.2011г Страница 74 из 74 5. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.Н., Прокофьев М.И.. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., ВО Агропромиздат, 1990. 6. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. М., Наука, 1983. 7..Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. Киев, Наукова думка, 1984.