Изучение активности Na /K магнитных полей in vitro.
advertisement
Изучение активности Na+/K+-АТФ-азы эритроцитов при действии слабых магнитных полей in vitro. ДЕМЧЕНКОВ Егор Леонидович Научные руководители: Зленко Владимир Яковлевич, кандидат физ.-мат. наук, инженер кафедры физики и электроники СевКавГТУ. Будкевич Роман Олегович, кандидат биологических наук, доцент кафедры прикладной биотехнологии СевКавГТУ Ставропольский край, г. Ставрополь Ставропольский Дворец детского творчества, МАН, МОУСОШ №22 , 11 класс Изучение активности Na+/K+-АТФ-азы эритроцитов при действии слабых магнитных полей in vitro. Проблема влияния магнитного поля на биологические объекты рассматривается в различных областях биологии. Это обусловлено интенсивным использованием технических средств, вызывающих излучение магнитного поля, естественной флюктуацией магнитного поля Земли и периодическими магнитными бурями. Согласно выводам рабочей группы научных экспертов Международного агентства по исследованию рака (МАИР, IACR) Всемирной Организацией здравоохранения, слабые низкочастотные электромагнитные поля можно рассматривать как фактор, обладающий канцерогенным действием. Эти выводы были сделаны на основе результатов широкомасштабных эпидемиологических исследований заболеваемости лейкемии в детском возрасте. Результаты других исследований свидетельствуют о наличии корреляции между числом вызовов скорой помощи по поводу инфаркта миокарда и гипертонического криза, а также смертностью людей с сердечно – сосудистыми заболеваниями и суммарной продолжительностью низкочастотных геомагнитных пульсаций типа Рс1 (pulsation continuous 1). С другой стороны, успешное использование слабых магнитных полей в медицине, например, для ускорения процессов регенерации мягких и костных тканей, ставит вопрос о создании новых эффективных методов магнитотерапии, в том числе, для лечения социально – значимых заболеваний. В работе Беловой Н.А.(2011) [1] показано влияние слабых и крайне слабых переменных магнитных полей с амплитудой 0-200 мкТл. Данные магнитные поля модулируют (активируют и ингибируют) протекание таких биопроцессов, как регенерация планарий, гравитропическая реакции в стеблях растений, образования активных форм кислорода в нейтрофилах. Выявлено, что величина биоэффектов комбинированных магнитных полей сравнимых по амплитуде с земным полем, при настройке на резонансные условия для ионов кальция, магния и калия зависит от частоты переменной компоненты поля и от соотношения амплитуд переменной и постоянной компонент поля и имеет резонансный характер. В тоже время известно о линейном увеличении осмотической устойчивости эритроцитов, коррелирующим со степенью ослабления геомагнитного поля. Это связано с работой Na,K-АТФазы (натриево-калиевая аденозинтрифосфатаза, Na+/K+ насос) - фермента, расположенного в плазматической мембране во всех живых клетках. Функции Na,K-АТФазы достаточно разнообразны за счет поддержания градиента Na+ и K+. Натрий-калиевый насос за счет АТФ поддерживает в клетке относительно высокие концентрации ионов калия и низкие концентрации ионов натрия. При воздействии дигоксина (ингибитора данного фермента) осмотическая резистентность эритроцитов достоверно снижалась. При одновременном воздействии на эритроциты ослабленного геомагнитного поля, получаемого в специальной гипомагнитной камере при увеличении коэффициента экранирования, дигоксин компенсирует возрастающую в этих условиях резистентность эритроцитов. Предполагается, что именно активность Na,K-АТФазы является точкой приложения факторов гелиогеофизической природы, которые за счет этого механизма активно участвуют в регуляции энергетического метаболизма клеток и регуляции водно-солевого обмена организма в целом [2]. Целью работы было изучение действия слабых магнитных полей на активность Na,K-АТФазы эритроцитов крыс in vitro. Материалы и методы. Экспериментальная установка для создания магнитного поля. Экспериментальная установка представляла из себя магнитную катушку. Катушка была сконструирована так, что поле в ней было практически однородное. Она состояла из пяти секций, расположенных по длине симметрично средней (третьей). Ширина каждой секции была равна 6 см. Все секции были квадратными. Сторона квадрата составляла 40 см. Число витков в этих секциях было равным 785, 231, 385, 231, 785. Ток во всех секциях был одинаковым и составлял 1А (рис.1.) Рис. 1. Экспериментальная установка. Фактически в катушке было две составляющих магнитного поля, первая, постоянная составляющая магнитного поля создаваемая током в 1 А (при напряжении в 22В) была равна 5683 мкТл. Учитывая, что нормальное геомагнитное поле в г. Ставрополе составляет 5515 мкТл, то магнитное поле в катушке было больше геомагнитного поля всего на 3%. Ток на катушку подавался от выпрямителя, а как известно, выпрямитель не дает идеальный постоянный ток, в нём присутствуют незначительные пульсации. В нашем случае присутствовали пульсации частотой 50 Гц, амплитудой 40 мВ. Эти пульсации создавали в катушке вторую составляющую магнитного поля, а именно переменное магнитное поле амплитудой 232,2 нТл частотой 50 Гц. Учитывая, что постоянная составляющая магнитного поля в экспериментальной установке практически не отличалась от геомагнитного поля, в наших экспериментах воздействие на активность Na,K-АТФазы оказывала переменная составляющая. Используя формулу, которая приводится в работе [1], для нахождения биологически эффективных частот переменной компоненты поля для различных ионов, мы можем найти приблизительную массу иона, на который оказывало воздействие магнитное поле. fn 1 q B DC n 2m где fn - резонансная частота, (Герц); q - заряд иона (Кулон); m - масса иона (килограмм); BDC - магнитная индукция постоянной компоненты КМП (Тесла), n целое число, равное 1, 2, 3…. В нашем случае имеем: fn =100 Гц , BDC = 5683*10-6 Тл, и приблизительно известно q, а точнее его порядок, например для иона с зарядом +1 его заряд будет равен заряду электрона , а именно 1,602*10-19Кл , таким образом при зарядах не превышающих +3 или -3 показатель степени будет оставаться равен 10-19 Кл. Имея эти значения, мы можем найти примерную массу иона, на которую действовало магнитное поле в нашем эксперименте, а именно получается приблизительно 1 килодальтон. Оценка активности Na,K-АТФазы эритроцитов крыс in vitro. Использована кровь белых крыс (Вистар). В работе с животными соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (1964, 2000 ред.). Кровь получали из хвостовой вены под легким эфирным наркозом в пробирку с гепарином. Эритроциты отмывали 3 раза охлажденным раствором 0,145 М NaCl и 0,02 М трис-HCl-буфер. Для оценки действия магнитного поля на эритроциты остаток клеток после отмывания разбавляли буферным раствором в 10 раз и помещали в магнитное поле на 30 минут. Контрольные пробирки находились в аналогичных условиях без действия магнитного поля. После действия магнитного поля суспензию центрифугировали и определяли активность Na,K-АТФазы в цельных эритроцитах крысы как описано ранее [4]. Оценивали активность Na,K-АТФазы по приросту неорганического фосфата (Pi). Активность фермента выражали в мкмоль/ч на 1 мл эритроцитов. Оценка стресс-резистентности крыс. Поведение животных оценивали в открытом поле в соответствии с методикой описанной [3]. Оценивали коэффициент стресс-резистентности (КСР) по формуле КСР= ГА/ЛП+ЛПц, где ГА - горизонтальная активность (горизонтальные амбуляции количество пересеченных периферических и центральных квадратов), ЛП - латентный период первого перемещения и ЛПц - латентный период выхода из центра (рис. 2). Нормальность распределения данных определялась по критерию Шапиро-Уилка. Данные обрабатывались параметрическими и непараметрическими методами с использованием пакета «STATISTICA 6.0» [5]. Рис.2. Определение стресс-резистентности животного в тесте «Открытое поле». Результаты и обсуждение. Первоначально выявляли активность Na,K-АТФазы эритроцитов полученных от трех животных. В контроле значения медианы составили 22,4 – 22,8 мкмоль/ч на 1 мл эритроцитов без значительных отклонений. После 30 минутного пребывания эритроцитов в магнитном поле выявлен достоверный рост активности фермента только у двух животных (рис.3). Во втором эксперименте оценивали активность фермента после действия магнитного поля на эритроциты, полученные от группы животных (n=7). Анализ результатов выявил разнонаправленные изменения в работе Na,K-АТФазы. мкмоль/ ч на 1 мл эритроцитов 40 * 35 * 30 25 20 15 10 5 0 контроль 1 Рис.3. МП 1 контроль 2 МП 2 контроль 3 МП 3 Изменение активность Na,K-АТФазы эритроцитов трех животных до (светлые столбцы) и после (темные столбцы) действии магнитного поля на кровь in vitro.; *- достоверные отличия от контроля. Так у одних животных отмечался рост ферментативной активности, достигая 53%, а у других снижение активности изучаемого фермента до 26% в сравнении с эритроцитами без воздействия магнитного поля. Результаты представлены на рис.4. Исходя из данных литературы, активность Na,K-АТФазы взаимосвязана с устойчивостью к стрессу и изменяется при стрессорных воздействиях [6,7]. Это позволило предположить, что выявленная индивидуальная изменчивость активности фермента после действия магнитного поля взаимосвязана с устойчивостью животного к стрессу. Для этого проведен дополнительный эксперимент по изучению активности Na,K-АТФазы в эритроцитах резистентности (КСР). крыс с определением коэффициента стресс- % 60 50 40 30 20 10 0 -10 кр 1 кр 2 кр 3 кр 4 кр 5 кр 6 кр 7 -20 -30 -40 Рис.4. Индивидуальные изменения активность Na,K-АТФазы эритроцитов при действии магнитного поля in vitro. В группе самцов крыс выявлено изменение КСР от 0,55 (низкая устойчивость к стрессу) до 16,25 (высокая устойчивость к стрессу). У животных с высокой устойчивостью к стрессу (КСР≥7) средняя активность фермента в группе была на 40% выше, что соответствует данным литературы [6,7]. При анализе корреляции по Пирсону выявлялась положительная зависимость между КСР и активностью Na,KАТФазы (r=0,73). Действие слабого магнитного поля на эритроциты выявило изменение активность изучаемого фермента эритроцитов в зависимости от устойчивости животного к стрессу. У «устойчивых» крыс реакция Na,K-АТФазы была не однородной, однако средние значение в группе было снижено. У животных с низкой устойчивостью к стрессу действие магнитного поля на эритроциты приводило к повышению активности фермента в среднем на 30%. Корреляционный анализ между КСР и активностью Na,KАТФазы показал, что после воздействия магнитного поля зависимость стала отрицательной (r=-0,9). Таким образом, показана индивидуальная изменчивость активности Na,KАТФазы эритроцитов крыс. Активность данного фермента положительно коррелирует с коэффициентом стресс-резистентности, выявляемом в тесте «открытое поле». Слабое магнитное поле при действии на эритроциты изменяет активность Na,K-АТФазы в зависимости от коэффициентом стресс-резистентности стресс-резистентности животного. действие У слабого животных магнитного с низким поля на эритроциты повышает активность Na,K-АТФазы, что проявляется в отрицательной корреляционной между данными показателями. Полученные данные указывают на необходимость учета индивидуальных особенностей при действии слабых магнитных полей. ЛИТЕРАТУРА 1. Белова Н.А. Первичные мишени во взаимодействии слабых магнитных полей с биологическими системами: автореферат дис. ... доктора биологических наук. – Пущино, 2011. – 43c. 2. Куликов В.Ю., Козяева Е.А., Тимофеева Ю.С., Емельяненко Т.А. Осмотическая резистентность эритроцитов в условиях различной напряженности геомагнитного поля и при действии дигоксина в условиях IN VITRO [Электронный ресурс] // Медицина и образование в Сибири: электронный научный журнал. – 2010. – № 3 – Режим доступа: (http://www.ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=432). 3. Коплик Е.В. Метод определения критерия устойчивости крыс к эмоциональному стрессу // Вестник новых медицинских технологий. – 2002 – Том IX, №1 – С. 16–18. 4. Казеннов А.М., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Исследование активности Na,K-АТФазы в эритроцитах млекопитающих // Биохимия. – 1984. – №7. – С. 1089– 1094. 5. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. – М. МедиаСфера, 2006. – 312 с. 6. Маслова М.Н. Молекулярные механизмы стресса // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 2005. – №11. – С. 1320–1328. 7. Маслова М.Н. Активность мембранных ферментов эритроцитов при при различных срессорных воздействиях // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 1994. – №7. – С. 76–80.
